Способ выделения 1,4-3-кетостероидов из культуральной жидкости

 

Изобретение касается способа выделения Δ^1,4-3-кетостероидов из культуральной жидкости процесса микробиологического дегидрирования Δ⁴-3-кетостероидов в присутствии циклодекстринов. Цель изобретения - упрощение процесса, улучшение его экологической характеристики, повышение степени регенерации циклодекстрина. Изобретение основано на применении таких неполярных апротонных несмешивающихся с водой растворителей, которые бы обладали способностью разрушать молекулу включения стероид-циклодекстрин, образуя с циклодекстрином труднорастворимый комплекс. 2 з. п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение касается производства Δ^1,4 -3-кетостероидов, получаемых микробиологическим дегидрированием Δ⁴-3-кетостероидов в присутствии циклодекстринов, а именно к способам выделения Δ^1,4 -3-кетостероидов из культуральной жидкости упомянутого процесса. Целью изобретения является упрощение процесса, улучшение его экологической характеристики и повышение степени регенерации циклодекстрина. Культуральную жидкость после завершения процесса дегидрирования Δ⁴-3-кетостероида обрабатывают при перемешивании 0,05-0,15-кратным (по отношению к объему культуральной жидкости или 5-15-кратным по отношению к массе стероида) количеством специфически подобранного несмешивающегося с водой, апротонного, неполярного органического растворителя. Такие растворители могут быть выбраны из ряда галоидсодержащих углеводородов (хлороформ, хлористый метилен), ароматических углеводородов (толуол) и циклических углеводородов (циклогексан). Выпавший осадок, содержащий смесь циклодекстрина со стероидом или его аддуктом с хлороформом, отфильтровывают и сушат. Стероид извлекают 20-кратным количеством (по отношению к массе стероида) смеси используемого ранее растворителя низшего спирта (например, метанол, этанол, изопропанол) 1:1 при кипении. Нерастворившийся циклодекстрин отфильтровывают, сушат и могут использовать повторно на ферментации. Стероид выделяют фильтрацией после упаривания смеси растворителя до 2-3-кратного объема к массе стероида. Отличительными особенностями способа являются: выделение стероида с помощью первоначального высаживания его из культуральной жидкости (в прототипе стероид выделяют экстракцией), что достигается использованием на выделение стероида минимального объема одного из вышеназванных растворителей, который, разрушая комплекс включения стероидциклодекстрин, сам образует труднорастворимый комплекс с циклодекстрином и стероидом, причем и стероид, и циклодекстрин высаживается из культуральной жидкости в виде осадка. При этом минимальный объем растворителя должен быть достаточным для полного высаживания и стероида, и циклодекстрина; в качестве органического растворителя может использоваться растворитель, удовлетворяющий следующим требованиям. Способностью образовывать с циклодекстрином труднорастворимый комплекс для осаждения последнего из культуральной жидкости. Способностью вытеснять стероид из комплекса включения с циклодекстрином, высаживая и стероид в виде осадка. Не образующий эмульсии в процессе высаживания стероида и циклодлекстрина, так как известно об образовании стабильной эмульсии в процессе осаждения β -циклодекстрина. Растворитель должен быть дешевым и доступным. Из отфильтрованной смеси циклодекстрина и стероида стероид извлекают 20-кратным количеством смеси соответствующего растворителя с низшим спиртом (метанол, этанол или изопропанол). Такое количество смеси является необходимым и достаточным для полного извлечения стероида из осадка. Причем выход целевого продукта составляет при этом 92-95% Меньшее количество смеси не обеспечивает полноты извлечения. Большее количество использовать нецелесообразно. Степень регенерации циклодекстрина также выше 90% П р и м е р 1. В культуральную жидкость после Δ¹-дегидрирования комплекса включения β-циклодекстрина и Δ⁴ -3-кетостероида в количестве 2,5 л (загружено 24,5 г 6 α-метил-гидрокортизона) заливают 250 мл хлороформа (0,1-кратное количество от объема культуральной жидкости) и смесь тщательно перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем выдерживают без перемешивания не менее 2 ч. Выпавший осадок, содержащий смесь комплекса циклодекстрина с хлороформом и стероида с хлороформом, отфильтровывают, сушат до постоянной массы. Получают 169 г. Полученный осадок извлекают при кипячении и перемешивании 500 мл смеси хлороформ-метанол (в количестве хлороформового слоя берут хлороформ, отделенный от культуральной жидкости после фильтрации из нее осадка). Нерастворившийся циклодекстрин отфильтровывают, промывают 2 раза по 50 мл горячей смеси хлороформ-метанол, сушат при 50^оС. Получают 117 г циклодекстрина (степень регенерации 90%). Фильтрат, содержащий стероид, обрабатывают 6 г угля при комнатной температуре. Уголь отфильтровывают, промывают смесью хлороформ-метанол 1:1. Растворитель упаривают при атмосферном давлении до температуры в погоне 61^о (температуры кипения хлороформа) и остаточного объема ≈50 мл (2-кратное по отношению к массе стероида). Выдерживают 2 ч при 0-5^оС. Осадок отфильтровывают, промывают охлажденным хлороформом. Сушат в шкафу при 50^оС. Получают 22,4 г (93% от теоретического с учетом 96% содержания 6 МГК). П р и м е р 2. Выделение 6 α-метилпреднизолона из культуральной жидкости проводилось по методу примера 1 с использованием вместо хлороформа толуола, из 1 г 6 α-метилгидрокортизона получено 0,9 г 6 α-метилпреднизолона, удовлетворяющего требованиям ВФС. Содержание примесей 2% Выход 90% от теоретического. П р и м е р 3. К культуральной жидкости после проведения процесса микробиологического дегидрирования метилтестостерона (объем культуральной жидкости 120 мл, содержание стероида 10 г/л) прибавляют 12 мл циклогексана и смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Выпавшую смесь стероида с аддуктом циклодекстрина с циклогексаном отфильтровывают, сушат. Полученную смесь кипятят 30 мин с 20 мл смеси циклогексан-метанол (1:1). Нерастворившийся аддукт циклодекстрина отфильтровывают, сушат в шкафу при 50^оС. Получают 1,4 г циклодекстрина (% регенерации 90). Фильтрат упаривают в вакууме досуха. Остаток кристаллизуют из 5 мл метанола. Получают 0,93 г метандростенолона, т.пл. 160-169^оС, сумма примесей 1% Для получения фармакопейного продукта его перекристаллизовывают еще раз из метанола. Остальные данные приведены в таблице.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ Δ^1,4 -3-КЕТОСТЕРОИДОВ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ после микробиологической трансформации в присутствии циклодекстрина, включающий стадии экстракции органическим растворителем, упаривания, фильтрации, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, улучшения его экологической характеристики и повышения степени регенерации циклодекстрина, культуральную жидкость предварительно обрабатывают 0,05 0,15-кратным по отношению к ее объему количеством хлороформа или хлористого метилена, или толуола, или циклогексана, выпавшую смесь циклодекстрина со стероидом или его аддуктом с хлороформом отфильтровывают и экстрагируют 20-кратным к массе стероида количеством смеси указанного выше растворителя с низшим спиртом в соотношении 1 1 при кипении, нерастворившийся циклодекстрин отфильтровывают, а из полученного фильтрата после упаривания выделяют целевой продукт. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение метилпреднизолона осуществляют с использованием хлороформа на стадии обработки культуральной жидкости. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение метандростенолона осуществляют с использованием циклогексана на стадии обработки культуральной жидкости.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 14-2002

Извещение опубликовано: 20.05.2002        

---