Способ получения щелочной фосфатазы

 

Изобретение относится к биотехнологии. Цель - повышение удельной активности фермента, упрощение способа и увеличение выхода. Ферментный препарат щелочной фосфатазы получают гомогенизацией тонкого кищечнмка тюленя экстракцией н-бутанолом, осаждением этанолом при конечной концентрации 55 - 65 об.% и хроматографичей<им разделением на иммобилизованных моноклональных антителах против щелочной фосфатазы тюленя, продуцируемых ияаммом гибридных культивируемых клеток АРР.1.ВКК(П) 377. причем элюирование проводят растворами с рН 9,5 - 11.5. Удельная активность щелочной фосфатазы равна 19000 - 20800 ед/мг белка Выход по активноаи равен 90 -94%.

COIO3 СОВЕТСКИХ сОциАл1тст11 1ескнх РеспуБлик

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕПТ11ОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) IC АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4787201/13 (22) 30.01.90 (46) 15.12.93 Бюл NII 45-46 (71) Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов (72) Сахаров И.IOÄ Степанова И.Е. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФА ТАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, Цель — повышение удельной активности фермента, упрощение способа и увеличение выхода. Ферментный препарат щелочной фосфатазы получают гомоге(19) SU (1Ц 1713265 А1 (5Ц 5 C 12 N 9 16 низацией тонкого кишечника тюленя, экстракцией н-бутанолом, осаждением этанолом при конечной концентрации 55 — 65 об.% и хроматографическим разделением на иммобилизованных моноклональных антителах против щелочной фосфатазы тюленя, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток APP.1.ÂÊÊ(Ï) 377, причем элюирование проводят растворами с рН 95 — 11.5. Удельная активность щелочной фосфатазы равна 19000—

20800 ед/мг белка. Выход ло активности равен 90, — 94%, 1713265

Изобретение относится к получению . очищенной щелочной фосфатазы животного происхождения, которая находит применение в генной инженерии, иммуногистохимических процедурах и иммуноферментном анализе, научно-исследовательской работе, Известна хроматографическая очистка щелочной фосфатазы на ионообменниках, несущих диэтиламиноэтильные и фосфатные группировки. Однако получаемый про- 10 дукт обладает низкой активностью, что сужает область его использования, Более перспектйвным, методом очистки является аффинная хроматография. Одним иэ примеров аффинной хроматографии является им- "5 муносорбция на иммобилизованных антителах против щелочной хроматографии на нерастворимых лектинах, Используя тот факт, что щелочная фосфатаза животного происхождения является гликопротеидом, 20 для очистки щелочной фосфатазы был при менен иммобилиэованный конканавалин А.

Хотя последние два способа имеют очевидные преимущества перед остальными, удельная активность целевого продукта не- 25 достаточно высока и не превышает 20003000 единиц. на 1 мг белка. Разумным сочетанием известных приемов можно повысить эту величину.

В качестве прототипа выбран способ 30 получения щелочной фосфатазы, который позволяет получить наиболее высокую удельную активность целевого продукта.

Данный способ .включает следующие операции: печень быка отмывали от крови 35

0„9 -ным раствором NaCI и гомогенизировали в 100 мМ трис-HCI, pH 7,6, содержащем 1мМ CaClg, 1 мМ М9С12, 0,02 мМ ZnS04 и 1 мМ МпС1з. К гомогенату добавляли рав. ныйобъемохлажденногодо-20 Сн-бутана- 40 ла при постоянном перемешивании. По прошествии 40 мин смесь центрифугировали, к водному раствору добавляли ацетон (-20 С) до его конечной концентрации 30%.

После центрифугирования осадок отбрасы- 45 вали, а концентрацию ацетона в растворе повышали до 50%. Осадок растворяли в 100 мМ трис-HCI, рН 7,6, содержащем 1 мМ

СаОз, 1мМ М9СЬ, 0,02 мМ ZnSO< и 1 мМ

МпС12 и наносили на колонку с сефадексом 50

G-150. Белок, обладающий фосфатазной активностью, очищали затем на колонке с DE

Нугелем. В дальнейшем щелочную фосфатазу смешивали с конканавалин А-сефароэой

4В, а фермент элюировали с.помощью а-ме- 55 тил-D-манопираноэида, Дальнейшая очистка - щелочной фосфатазы включала ионообменную хроматографию на моно 0 колонке (HR 5/5) и высокоэффективную обратнофаэную хроматографию на дифенилкремнеземе (размер пор 50 нм). В результате получили препарат щелочной фосфатазы с удельной активностью 7440 единиц на 1 мг белка; выхода 7-стадийной очистки составил 10Д.

Недостатком известного способа является невысокая удельная активность целевого продукта. Кроме того, существенным ограничением данного метода является его многостадийность и низкий выход.

Целью предлагаемого изобретения является повышение удельной активности препарата щелочной фосфатазы, упрощение способа и увеличение выхода.

Поставленная цель достигается тем, что ферментный препарат получают гомогенизацией тонкого кишечника тюленя, после экстракции н-бутанолом осаждают этанолом при конечной концентрации 55-65 об.%, хроматографическое разделение осуществляют на иммобилизованных моноклональных антителах против щелочной фосфатазы тюленя, секретируемых гибридными клетками APP.1, причем элюирование проводят растворами с рН 9,5-11,5.

В предложенном способе активность целевого препарата щелочной фосфатазы увеличивается до 19000-20800 единиц на 1 мг белка при одновременном сокращении числа стадий до трех и повышении выхода до 90-94%.

Верхняя граница конечной концентрации этанола при осаждении 65 об.% обусловлена тем, что при более высокой концентрации этанола, когда вся фосфатаза уже осаждена, происходит осаждение бал- . ластных белков, что приводит к уменьшению степени очистки.

Нижняя граница конечной концентрации этанола при осаждении 55 об.% обусловлена тем, что при более низкой концентрации зтанола значительная часть фосфатазы остается в растворе, что приводит к уменьшению выхода.

Верхняя граница рН элюции обусловлена тем, что при рН 11,5 наблюдается количественная десорбция фермента с иммуносорбента. а дальнейшее повышение рН только приводит к денатурации как фермента, так и иммобилизованных антител.

Нижняя граница рН элюции обусловлена тем, что при рН ниже 9,5 резко понижается степень десорбируемости фермента с иммуносорбента, что приводит соответственно к низкому выходу очистки целевого продукта.

Предлагаемый способ заключается в следующем: 25 г свежезамороженного тонкого кишечника тюленя раэмельчают и гомогенизируют в 25 мл 0,05 M трис-HCI, рН

7,4, содержащем 2,5 мМ MgSO<. К гомогена- деляли ферментативную активность по отту добавляют 80 мл н-бутанола и проводят ношению к и-нитрофенилфосфату и коно экстракцию при 37 С в течение 1,5 ч. Буга- центрацию белка по Лоури. Данный способ нольнуюфазуотбрасывают, а 45мл водного позволяет получать препараты щелочной раствора диализуют против 1 л 0,05 М трис- 5 фосфатазы с удельной активностью равно ! н и

НС, рН 7,4, содержащего 2,5 мМ MgS04, в 19000 ед/мг белка, выход по активности ратечение 20 ч при 4 С. Буфер заменяют све- вен 90о . жим через 10 ч. К полученному диализату при перемешивании добавляют этанол (4 С) Пример 2. 25 г свежезамороженного до конечной концентрации 55 — 65 об., вы- 10 тонкого кишечника тюленя размельчали и держивают 30 мин при 4 С и осадок центри- гомогенизировали в 25 мл 0,05 М трис-HCI, фугируют. Полученный осадок растворяют в рН 7,4, содержащем 2,5 мМ MgS04. К гомо20 мл 0,02 М трис-НС!,, рН 7,4. содержащем генату добавляли 80 мл н-бутанола и прово10 мМ MgCIz и 0,5 М NaCI. Раствор наносят дили экстракцию при 37ОС в течение 1,5 ч. на колонку (Ч=10 мл) с иммобилизованны- 15 Бутанольную фазуотбрасывали, а 45 мл водми моноклональными антителами, секрети- ного раствора диализовали против 1 л 0,05 руемыми гибридными клетками АРР,1 . м трис-НС!, рН 7,4, содержащего 2,5 мМ (коллекция клеточных культур Института ци- Mg50q, в течение 20 ч при 4 С. Буфер заметологии АН СССР, Ленинград, номер 377Д), няли свежим через 10 ч. К полученному дипредварительно уравновешенными тем же 20 алиэату при перемешивании добавляли буфером. После нанесения фермента гель этанол (4 С) до конечной концентрации 65 отмывают 0,02 M трис-НС!, рН 7,4, содержа- об.%, выдерживали 30 мин при 4 С и осадок щим 10 MM МоС!2 и 0,5 М NaCI, до Арво, центрифугировали.Полученныйосадокрасравной 0,03-0,05. Фермент элюируют рас- творяли в 20 мл 0,02 М трис-HCI, рН 7,4, творами с рН 9,5-11,5. Активные фракции 25 содержащем 10 мМ MgCIz и 0,5 M NaCI. объединяли и определяли ферментативную Раствор наносили на колонку (v 10 мл) с активность. Данный способ позволяет пол- иммобилизованными моноклональными учать препараты щелочной фосфатазы с антителами, секретируемыми гибридными удельной активностью, равной 19000-20800 клетками APP..1 (коплекция клеточных кульед/мг белка; выход по активности равен 90- 30 тур Института цитологии АН СССР, Ленинг94 ° рад, номер 377Д), предварительно

Пример 1. 25 г свежезамороженного уравновешенными тем же буфером. После тонкого кишечника тюленя размельчали и нанесения фермента гель отмывали 0,02 М гомогенизировали в 25 мл 0,05 М трис-HCI, трис-НС1, рН 7,4, содержащим 10 мМ MgCIz рН 7.4, содержащем 2,5 мМ MgSO<. К гомо- 35 и 0,5 М NaCI, до Арво, равной 0,03-0.05. Фергенату добавляли 80 мл н-бутанола и право- мент элюировали 0,5 М триэтиламином, рН дили экстракцию при 37 С в течение 1,5 ч. 11,5. Активные фракции объединяли и опреБутанольнуюфазуотбрасывали,а 45мл вод- деляли ферментативную активность по отного раствора диализовали против 1 и 0,05 ношению к и-нитрофенилфосфату и

М трис-HCI, рН 7,4, содержащего 2,5 мМ 40 концентрацию белкапоЛоури.ДанныйспоМ9304, в течение 20 ч при 4 С. Буфер заме- соб позволяет получать препараты щелоч. няли свежим через 1.0 ч. К полученному ди- ной фосфатазы с удельной активностью, ализату при перемешивании добавляли равной 19460 ед/мг белка; выход по активэтанол (4ОС) до конечной концентрации 55 ности равен 91 . об., выдерживали 30 мин при4 С иосадок 45 центрифугировапи. Полученный осадок рас- Пример 3. 25 г свежезамороженного творяли в 20 мл 0,02 М трис-НС!, рН 7,4; тонкого кишечника тюленя размельчали и содержащем 10 мМ MgClz и 0,5 M MaCI. гомогенизировали в 25 мл 0,05 M трис-НС!, Раствор наносили на колонку (Ч=10 мп) с рН 7,4, содержащем 2,5 мМ MgS04. К гомоиммобилиэованными моноклональными ан- 50 генату добавляли 80 мл н-бутанола и провотителами, секретируемыми гибридными дили экстракцию при 37 С в течение 1,5 ч. клетками APP.1 (коллекция клеточных куль- Бутанольную фазу отбрасывали, а 45 мл водтур Института цитологии AH СССР, Ленинг- ного раствора диализовали против 1 л 0,05 рад, номер 377 Д), предварительно М трис-HCI, рН 7,4, содержащего 2,5 мМ уравновешенными тем же буфером. После 55 MgSOa, втечение 20ч при 4 С. Буфер заменанесения фермента гель отмывали 0,02 М няли свежим через 10 ч. К полученному дитрис-HCf, рН 7,4, содержащим 10 мМ MgCl2 ализату при перемешивании добавляли и0,5 MNaCI,äîÀ2ao, равной 0.03-0.05. Фер- этанол (4 С) до конечной концентрации 60 ментэлюировали 0,05 M триэтиламином, рН об. выдерживали 30 мин при 4 С и осадок

9 5. Акти ,5. Активные фракции объединяли и апре- центрифугировали. Полученный осадок рас8

1713265

Составитель Н.Афанасьева

Техред М.Моргентал Корректор Н. Милюкова

Редактор

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3353

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, l01 творяли в 20 мл 0,02 M трис-HCI, рН 7,4, содержащем 10 мМ MgClz и 0,5 M NaCI.

Раствор наносили на колонку (ч - 10 мл) с иммобилизованными моноклональными антителами, секретируемыми гибридными клетками APP.1 (коллекция клеточных культур Института цитологии АН СССР, Ленинград, номер 377 Д), предварительно уравновешенными тем же буфером. После нанесения фермента иммуносорбент отмывали 0,02 М трис-HCI, pH 7,4, содержащим

10. мМ М9Оз и 0.5 М NaCI, до А во, равной

0,03-0.05. Фермент элюировали 0,05 М триэтиламином рН 10,3. Активные фракции объединяли и определяли ферментативную активность по отношению к и-нитрофенилфосфату и концентрацию белка по Лоури, Данный способ позволяет получать препараты щелочной фосфатазы с удельной акФормула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ

ФОСФАТАЗЫ, предусматривающий гомогенизацию сырья животного происхождения, экстракцию н-бутанолом, осаждение органическим растворителем и аффинную хроматографию, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности фермента, упрощения способа и увеличетивностью. равной 20800 ед/мг белка; выход по активности равен 94%.

Таким образом, технико-экономический эффект предлагаемого способа заключается в

5 увеличении активности целевого продукта— щелочной фосфатазы, резком сокращении стадий очистки и повышении выхода. Это позволяет создать простой и легко масштабируемый процесс выделения и очистки щелоч10 ной фосфатаэы тюленя при небольших затратах материалов. рабочегоитехнологического времени и сырья. (56) Авторское свидетельство СССР

15 N- 1426089, кл. С 12 N 9/16, 1986.

Авторское свидетельство СССР

М 1554377, кл, С 12 N 9/16, 1988.

Ноа J. — С., Garattlni Е., Рап Y. — С.Е. etal.

Arch. Btochem. Blophyç., 1985, ч. 241, р, 20 380-385 — прототип, ния выхода, в качестве сырья:-используют тонкий кишечник тюленя, осаждение ведут этанолом при конечной концентрации 5565 об., аффинную хроматографию осуществляют на иммобилизованных моноклональных антителах, продуцируемых

30 штаммом гибридных культивируемых клеток APP.1 BKK (П) Д 377, а элюирование проводят раствором с рН 9,5- 11,5.