Способ получения иммобилизованной холинэстеразы

 

Изобретение относится к способам получения иммобилизованной холинэстеразы. Цель изобретения - повышение удельной активности и стабильности целевого продукта. Для этого связывают холинэстеразу с частично гидролизованным сополимером на основе акриламида, активированным карбодиимидом. Процесс иммобилизации ведут при 0 - 4°С при PH 4,5 - 8,5 предпочтительно в условиях 0,1 М фосфатного буфера с PH 7,0. 1 з.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„.Я0„„ 17 (51)5 С 12 N 9/16 11/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР! (21) 3565000/30- 13 (S6) PCT/Н U 81/00047 (23.12.81) (22) 16.03.83 (31) 2088/81 (32) 17.07.81 (33) HU (46) 15.06.90. Бюл. h - 22 (71) Реанал Финомведьсердьяр (HU) (72) Ласло Борош, Бела Саяни и Камилла Ковач (HU) (53) 577.15.07 (088,8) (56) Biochimica et Biophysica, 1970, 212, 362.

Anal. Biochem., 1960, 33, 341.

Изобретение относится к способам, получения иммобилизованной холинэсте-. разы, которая может быть применена при непрерывном функционировании систем измерения, например, с целью об- . наружения нейротоксинов типа сложных эфиров фосфата, сложных эфиров карбамата и сульфата, а также для определения количества нейротоксинов в воздухе или воде.

Цель изобретения — повышение удельной активности и стабильности целевого продукта.

Способ основан на использовании .полимерных носителей, содержащих

5,4-6,8 мэкв/г функциональных СООНгрупп. Для этого сначала получают сшитый полимер из акриламида и/или метакриламида с использованием сшивающих агентов акрилового или аллилового типа, а группы амида кислоты по-. лученного таким образом полимера подвергают затем частичному гидролизу

2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И!"!МОБИЛИЗОВАННОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ (57) Изобретение относится к способам получения иммобилизованной холинэстеразы. Цель изобретения — повышение удельной активности и стабильности целевого продукта. Для этого связывают холинэстеразу с частично гидролизованным сополимером на основе акриламида, активированным карбодиимидом. Процесс иммобилизации ведут ври 0 — 4 С рН 4,5-8,5 предпочтительно в условиях О,! И фосфатного буфера с рН 7,0. 1 з ° п,ф-лы. с тем, чтобы получить необходимое количество — СООН функциональных, групп. Носители фермента типа Акрилекс С, полученные в результате частичного гидролиза шарикового сополимера акриламида и N,N -метилен-бисI акриламида типа Акрилекс P (например, Акрилекс P-30, P-100 или P-200) кислотой (например, соляной кислотой или другой сильной кислотой) или основанием (например, гидратом окиси натрия, карбонатом натрия т.ли другим сильным основанием), относятся к этому последнему типу носителей-полимеров. В этих материалах примерно

50Х содержащихся -C0NH функциональных групп превращаются в результате гидролиза в карбоксигруппы, в то время как оставшиеся — C0NH группы не гидролиэуются даже при более жестких реакционных условиях. Немодифицированные — CONH, — группы расположены между карбоксигруппами гид1 5 72418 ролизованного сополимера, что обеспечивает фиксирование карбоксигрупп в необходимых стереопозициях, При связывании фермента с карбоксигруп5 пами с помощью карбодиимидного активирования функции отдельных молекул иммобилизованного фермента не препятствуют одна другой благодаря стереопозициям карбоксигрупп, в результа-!О те достигается высокая удельная активность. Полимеры, содержащие мономеры акриловой и/или метакриловой кислоты и акриламида и/или метакриламида, связанные друг с другом через !5 бифункциональный сшивающий мономер и содержащие не менее 0,1 мэкв/г СООН функциональных групп, и полученные другими методами, обладают аналогичными благоприятными свойствами. Эти 20 полимеры имеют форму шариков, поэтому они позволяют использовать значительную скорость сквозного потока и в то же время химически инертны и обладают абсолютной стойкостью против 25 воздействия микроорганизмов, Полимеры типа Акрилекс С могут быть применены с некоторыми преимуществами в качестве носителей для холинэстеразы. ЗО

Холинэстераза любой природы, выделенная любым методом, может быть использована в качестве фермента в соответствии.с предлагаемым способом.

При осуществлении данного способа в результате возникновения ковалентной связи между ферментом и носителем повьш ается удельная активность и стабильность (включая и термостабильность) получаемой иммобилизован-< щО ной холинэстеразы.

Пример 1, 100,6 мг ксерогеля

Акрилекс С-100 с содержанием СООНгрупп 6 мэкв/г суспендируют в 5,0 мл

0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0) 45 и в суспензию при О С при равномерном перемешивании добавляют раствор

102,5 мг N-этил-N †(3-диметиламинопропил)-карбодиимид хлоргидрата в

2,5 мл холодного (4 С) буферного

50 раствора. В реакционную смесь после

10 мин перемешивания добавляют

47,4 мг холинэстеразы, растворенной в 2,5 мл холодного буферного раствора (4 С). Смесь поддерживают при О

4 С в течение 48 ч. В течение этого периода суспензию дважды перемешивают каждый pas по 6 ч. Гель выделяют фильтрацией, трижды промыьают порциями по 10 мл 0,1 M буфера фосфата ка(pH 7,0)

10 мл 0,1 M буфера фосфата калия (рН 7,0), содержащего также 0,5 моль хлорида натрия, а затем трижды порциями по 10 мл 0,1 М буфера фосфата калия (pH 7,0). Затем гель промывают четыре раза порциями по 25 мл дистиллированной воды, а затем гель, не содержащий солей, подвергают сушке замораживанием. Получают 106,2 мг композиции иммобилизованной холинэстераэы. Активность: 120 мкмоль бутирилйодид тиохолина/мин/г сухого материала. Анализ термостабильности полученной иммобилизованной холинэстеразы о показал, что при 57 С в течение

80 мин теряет 50ь активности, в то время как растворенный фермент — более 67 . При хранении при 4 С в течео ние года потеря активности составила соответственно 1О и 15% для иммобилизованной и нативной холинэстеразы.

Пример.2. 102 мг ксерогеля

Акрилекс С-100 (согласно примеру 1) суспендируют в 5,0 мл 0,1 M буфера фосфата калия (рН 7,0) и в суспензию при О С при равномерном перемешивании добавляют раствор 202 мг NI циклогексил-N -(-(N-метилформолино)этила-карбодиимид пара-толуолсульфоката в 2,5 мп холодного (4 С ) буфера.

После 10 мин перемешивання в реакционную смесь добавляют 49 мг холинэстеразы, растворенной в 2,5 мп холодного (4 С) буферного раствора. Смесь поддерживают при 0 — 4 С в течение

48 ч, В течение этого периода суспензию дважды перемешивают, по 6 ч каждый раз. Гель выдепяют фильтрацией, трижды промывают порциями по

10 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0), трижды порциями по 10 мл

0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0), содержащего также 0 5 моль хлорида натрия, а затем трижды порциями по

10 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,0}. Затем гель промывают четыре раза порциями по 25 мл дистиллированной воды, а затем гель, не содержащий солей, подвергают сушке замораживанием. Получают 110 мг иммобилизованной холинэстеразы. Активность: гидролиз 110 мкмоль смеси бутирилйодид тиохолина/мин/г сухого материала. Испытания термостабильности иммо билиэованной холинэстеразы показали анапогичные примеру 1 результаты. При

5 15724 хранении при 4 С в течение года активность иммобилизованной холинэстеразы снизилась на 8Х, а активность растворенной — на 15Х, Пример 3, 99,2 мг ксерогеля

Акрилекс С-100 (содержание СООНгрупп 6,84 мэкв/г, степень гидролиза 50Х) суспендируют в 10,0 мл охлажденного 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,0), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 19,8 мг гидрохлорида

N-этил-N (3-диметиламинопропил)-карбодиимида в 5,0 мл охлажденного буферного раствора (рН 7,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют 20,1 мг холинэстеразы (удельная активность

17,0 мкмоль гидролизованного бутирил- 20 тиохолинйодида /мин/мг белка), растворенной в 5,0 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 7,0).

Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дваж- 25 ды перемешивают, каждый раз по 6 ч, Гель отделяют, трижды промывают охлажденным 0,1 M буферным раствором

-фосфата калия (рН 7,0) порциями по

20 мл, три раза буферным раствором .30 (рН 7,0) порциями по 20 мл, причем

I раствор дополнительно содержич

0,5 моль хлЬристого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 20 мл, После этого гель четыре раза промывают порциями по 50 мл холодной дистиллированной воды, Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ни- 4р же О С. Получают 107,0 Ml HMMoGHJIHso ванного холинэстеразного препарата.

Активность: гидролиз 1110 мкмоль йодида бутирилтиохолина /мин/г сухого вещества. 45

Стабильность ферментного препарата и исходного фермента исследуют следующим образом.

Фиксированный ферментный препарат и соответственно, растворимую исход- 5р ную холинэстеразу выдерживают в течение 60 мин при 57 С в 0,05 M водном буферном растворе фосфата калия (рН 8,0), затем определяют остаточную активность фиксированного фермент- 55 ного препарата и, соответственно, растворимого исходного фермента. Остаточную активность выражают в процентах активности перед термообработ18 6 кой. При таких условиях остаточная ак-. тивность растворимого фермента составляет ОХ, в то время как остаточная активность фиксированного ферментного препарата — 76,li. Исходное вещество, следовательно, совершенно неактивировано, в то время как ферментный препарат от воздействия предлагаемой согласно изобретению иммобилизации сохраняет 76,1Х своей первоначальной активности, что доказывает черезвычайно значительное повышение стабиль ности.

Пример 4. 100,2 мг ксерогеля

Акрилекс С-100 (содержание -COOHгрупп 5,40 мэкв/г, степень гидролиза ЗОХ) суспендируют в 10,0 мл охлажденного 0,1 M буферного раствора фосфата калия (рН 7,0), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 20,9 мг гидрохлорида Nэтил — N †(3-диметиламинопропил)-карбодиимида в 5,0 мл охлажденного буферного раствора (рН 7,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 20,0 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 3)в 5 0 мл охлажденного раствора фосфата калия (рН 7,0). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным О,! М буферным раствором фосфата калия (рН 7,0) порциями по 20 мл, три раза буферным раствором (рН 7,0) порциями по 20 мл, причем раствор дополнительно содержит

0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 20 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по 50 мл. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже 0 С. В результате получают а

128,5 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз 407 мкмоль йодида бутирилтиохолина/мин/г сухого вещества. Остаточная активность полученной иммобилизованной холинэстеразы определена в соответствии с примером 3 и составляет 65,5Х.

Пример 5. 259,1 мг ксерогеля

Акрилекс С-100 (содержание -СООН групп 6,84 мэкв/г, степень гидролиза

1572418

50X) суспендируют в 5,0 мл охлажденного 0,1 M раствора фосфата калия (рН 4,0), после чего к.приготовленной суспензии прибавляют раствор

126,9 мг гидрохлорида N-этил-N -(3-! диметиламинопропил)-карбодиимида в

2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 4,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси при- 10 бавляют 49,6 мг холинэстеразы (удельная активность 3,7 мкмоль гидролизованного бутирилтиохолинйодида/мин/мг белка) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора калия (рН 4,0). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным

0,1 M буферным раствором фосфата ка- 20 лия (pH 4,0) порциями по 10 мл, три раза буферным раствором (рН 4,0) порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит 0 5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по

l0 мп. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по 25 мл. Полученный в результате этого и свободный от 30 присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже 0 С. В ре— зультате получают 280,1 мг иммобилизованного.холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз 13 мкмоль йодида бутирилтиохолина/мин/г сухого вещества, Остаточная активность

39,2 (для исходной ХЗ составляет

29,5X).

Пример 6. 252,5 мг ксерогеля 40

Акрилекс С-100 (содержание -COOH групп 6,84 мэкв/г, степень гидролиза

50X) суспендируют в 5,0 мл 0,1 M .охлажденного раствора фосфата калия (рН 4,56), после чего к приготов- 45 ленной суспензии прибавляют раствор

124 2 мг гидрохлорида N-этил-N -(3диметиламинопропил)-карбодиимида в

2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 4,56). После перемешивания в 50 течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 52,9 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 4,56). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором фосфата калия (рН 4,56) порциями по 10 мл, три раза буферным раствором (рН 4,56) порциями по 10 мл причем раствор дополнительно содержйт

0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по

25 мл. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре о ниже 0 С. Получают 2S0,8 мг иммобилизов анно го холинэ стер аз но го препарата .

Активность: гидролиз 102 мкмоль йодида бутирилтиохолина/мин/г сухого вещества. Остаточная активность иммобилизованной и растворенной холинэстеразы соответственно равна 37,3 и 28,2ь.

Пример 7, 252,6 мг ксерогеля

Акрилекс С-100 (содержание — СООН групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в

5,0 мл охлажденного 0,1 M раствора фосфата калия (рН 5,0), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 125 мг гидрохлорида Nэтил-N -(3-диметиламинопропил)-карбодиимида в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 5,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 50,5 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (pH 5,0), Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 M буферным раствором фосфата калия (рН 5,0) порциями по 10 мл, три раза буферным раствором (рН 5,0) порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит 0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по

10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по 25 мл. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже 0 С. В результао те получают 239,9 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз 163 мкмоль йодида бутирилтиохолина /мин/г сухого вещества, 45!

5724

Остаточная активность для иммобилизованной и растворенной холинэстеразы соответственно равна 41,5 и 32,3Х.

Пример 8. 255,6 мг ксерогеля

Акрилекс С-IОО (содержание — СООН

5 групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в

5,0 мл охлажденного 0,1 M раствора фосфата калия (pH 5,5), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 123,8 мг гидрохлорида Nэтил-N -(3-диметиламинопропил)-карбодиимида в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 5,5). После переме- шивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 51,9 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфа- та калия (рН 5,5).Общее время реакции 20

48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый

I раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным О,! И буферным раствором фосфата калия (рН 5,5) пор-; циями по 10 мл, три раза буферным раствором (pH 5,5) порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит

- 0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата 30 калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой, применяя каждый раз по 25 мл последней. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергао ют сушке при температуре ниже О С.

В результате получают 283,8 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз . 4О

172 мкмоль йодида бутирилтиохолина

/мин/г сухого вещества. Остаточная активность иммобилизованной и растворенной холинэстеразы соответственно равна 42,1 и 29,5Х.

Пример 9. 249,2 мг ксерогеля

Акрилекс С-100 (содержание — СООН групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в

5,0 мл охлажденного 0,1 M раствора фосфата калия (рН 6,0), после чего 50 к приготовленной суспензии прибавляют раствор 127,2 мг гидрохлорида

N-этил-N1-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 6,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор

51,9 мкг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) 18 !О в 2,5 мл охлажденного буферного раст-. вора фосфата калия (рН 6,0). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором фосфата калия (рН 6,0), применяя каждый раз по 10 мл этого раствора, три раза буферным раствором (рН 6,0) порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит 0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по 25 мл. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают cymке при температуре ниже ООС. Получают 277,8 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата, Активность: гидролиз 165 мкмоль йодида бутирилтиохолина /мин/г сухого вещества. Остаточная активность для иммобилизованной и растворенной холинэстеразы составляет соответственно 42,4 и 31,8Х.

Пример 10. 251,5 мг ксерогеля

Акрилекс С-100 (содержание — СООН групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в

5 О мл охлажденного О,! И раствора фосфата калия (рН 6,5), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 127 мг гидрохлорида N-этилN -(3-диметиламинопропил)-карбодиимиI да в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (pH 6,5), После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 51,9 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 6,5). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 И буферным раствором фосфата калия (pH 6,5), применяя каждый раз по 10 мл указанного раствора, три раза буферным раствором (рН 6,5) порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит

0 5 моль хлористого .натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой порциями по 25 мл Полученный в результате

18

12 ют раствор 132 мг гидрохлорида Nэтил-N1-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида в 2,5 мл охлажденного буферного раствора (рН 7,5). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 50,5 мг холинэстераэы в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 7,5). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раэ по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 M буферным раствором фосфата калия (pH 7,5), применяя каждый раз по 10 мл указанного раствора, три раза буферным раствором (рН 7,5) порциями по 1О мл, причем раствор дополнительно содержит

0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой, применяя каждый раз по 25 мл последней. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже

О С. Получают 336 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность. гидролиз 75 мкмоль йодида бутирилтиохолина /мин/г сухого вещества, Остаточная активность иммобилизованной и растворенной ХЭ состав-. ляет соответственно 37,1. и 27,4Х.

Пример 13. 250,6 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание -СООН групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в

5,0 мл охлажденного 0,1 М раствора фосфата калия (рН 8,0), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 122,7 мг гидрохлорида

N-этил-N — 3-диметиламинопропил)карбодиимида в 2.5 мл охлажденного буферного раствора (pH 8,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор 51,5 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру

5) в 2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (pH 8,0) ° Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6;ч.

Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором фосфата калия (рН 8,0) порциями по 10 мл, три раза буферным раствором (рН 8,0) порциями по 1О мл, при11 15724 этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже 0 С. Получают 175,0 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз

5 ! 70 мкмоль йодида бутирилтиохолина

/мин/г сухого вещества. Остаточная активность иммобилизованной и растворенной холинэстеразы составляет соответственно 38,2 и 28,9ь.

Пример 11. 257 4 мг ксерогеля

Акрилекс С-100 (содержание — СООПI групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в

5,0 мл охлажденного 0,1 М раствора фосфата калия (рН 7,0), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 127,8 мг гидрохлорида

N-этил-N -(3-диметиламинопропил)-карбодиимида в 2,5 мл охлажденного бу- 20 ферного раствора (рН 7,0). После перемешивания в течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор

51,9 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) в 25

2,5 мл охлажденного буферного раствора фосфата калия (рН 7,0) . Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель ЗО отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 М буферным раствором (рН 7,0), применяя каждый раз по 10 мл указанного раствора, три раза буферным .раствором (pH 7,0) порциями по 10 мл причем раствор дополнительно содержит 0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фос— фата калия порциями по 10 мл. После этого гель четыре раза промывают холод40 ной дистиллированной водой, применяя каждый раз по 25 мл последней. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже О С. 45

Получают 292,9 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз 108 мкмоль йодида бутирилтиохолина /мин/г сухого вещества. Остаточная активность для 50 иммобилизованной и растворенной холинэстеразы составляет соответственно

40,8 и 28,0Х.

Пример 12. 250,8 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание вЂ, СООН групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в

5,0 мп охлажденного О,1 М раствора фосфата калия (рН 7,5), после чего к приготовленной суспензии прибавля13

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованной холинэстеразы путем связывания ее с полимером на основе акриламида, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности и стабильности целевого продукта, I сополимер акриламида и N, N -метиленбис-акриламида, гидролизованный до

30 содержания групп СООН 5,4-6,8 мэкв/г, предварительно подвергают активации водорастворимым карбодиимидом, а по0 лученный продукт при Π— 4 С вводят во взаимодействие с растворенной в буферном растворе при рН 4,5-8,5 холинэстеразой °

2. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что используют холинэстеразу, растворенную в 0,1 M К-фос40 фатном буфере с рН 7,0, Составитель О. Скородумова

Редактор M. Петрова Техред М.Дидык Корректор M.Пело

Заказ 1524 Тираж 485 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101 чем раствор дополнительно содержит

0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 10 мл . После этого гель четыре раза промывают холодной дистиллированной водой, применяя каждый раз по 25 мл последней.

Полученный в результате этого и сво-< бодный от присутствия солей гель подвергают сушке при температуре ниже 0 С. Получают 300,3 г иммобилизо. ванного холинэстеразного препарата.

Активность: гидролиз 29,4 мкмоль йодида бутирилтиохолина /мин/г сухуо вещества. Остаточная активность иммобилизованной и растворенной холинэстеразы составляет соответственно

37,5 и 32,SX.

Пример 14. 252,1 мг ксерогеля Акрилекс С-100 (содержание — СООН групп 6,84 мэкв/г) суспендируют в

5,0 мп охлажденного 0,1 М раствора фосфата калия (рН 8,5), после чего к приготовленной суспензии прибавляют раствор 124,7 мг гидрохлорида

N-этил-N †(3-диметиламинопропил)-карбодиимида в 2,5 мл охлажденного бу- ферного раствора (pH 8,5). После перемешивания B течение 10 мин к реакционной смеси прибавляют раствор

51 0 мг холинэстеразы (удельная активность соответствует примеру 5) в 2,5 мл охлажденного буферного раст- вора фосфата калия (рН 8,5). Общее время реакции 48 ч, причем в течение этого периода суспензию дважды перемешивают, каждый раз по 6 ч. Гель отделяют, промывают три раза охлажденным 0,1 M буферным раствором

72418 14 фосфата калия (pH 8,5) порциями по

IO мл, три раза буферным раствором (рН 8,5) порциями по 10 мл, причем раствор дополнительно содержит

0,5 моль хлористого натрия, а затем три раза буферным раствором фосфата калия порциями по 25 мл. Полученный в результате этого и свободный от присутствия солей гель подвергают сушке о при температуре ниже 0 С. Получают

279,3 мг иммобилизованного холинэстеразного препарата. Активность: гидролиз 20,2 мкмоль йодида бутирилтиохалина /мин/г сухого вещества, 1

Остаточная активность иммобилизованной и растворимой ХЭ составляет соответственно 41,1 и 26,SX.