Штамм асinетовастеr @ р.-продуцент гидролазы n-карбамоил-5- фенилглицина

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению штамма-продуцента гидролазы N-карбамоил-5-фенилглицина, который может быть использован для получения D-фенилглицина, необходимого для производства синтетического антибиотика ампицилина. Цель изобретения - получение штамма, обладающего более высокой активностью гидролазы N-карбамоил-5-фенилглицина. Штамм ACINETOBACTER SP. ВКПМ В-4388 выделен из почвы. Штамм синтезирует фермент с активностью 49,8±0,7 мкмоль<SP POS="POST">.</SP>мин<SP POS="POST">-1</SP> г<SP POS="POST">-1</SP> при 40°, концентрации субстрата 5 мкл в 0,1 М фосфатном буфере, PH 7,25. 1 табл.

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

433 А1 (19) (П) (51)5 С 12 N 9/16, 1/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ I

) йй,"з) ;".

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬГИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

И А ВТОРСКОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4600145/30-13 (22) 31 ..10.88 (46) 15.10.90, Бюл. )) 38 (71) Научно-прпизводственное объединение "Фермент" (72) А..К..Вайткявичюс, A À. Маслинскеие и А.К,. Масайте (53) 663.15(088 ° 8) (56) 0iivieri R. Fascetfi L.

Degen ),. Fnzimatic conversion of

N-сагЪашоу1-D-aminoacids to D-aminoacids. — Fnzym. Nicrobiol.- Technol, 1979, Р 1, р. 201-204, (54) !ТГАММ АСПЖТОВАСТЕК-ЯР-ПР0,ПУПРНТ

ГИДРОЛА%1 N-КАРБАМ0ИЛ-5-ФЕНИЛГЛИПИНА (57) Изобретение относится к микроr

Изобретение относится к микробио. логической промьппленности, в част ности к получению нового штамма— продуцента гидролазы N-карбамоил-5фенилглицина, который может быть использован для получения 0-фенилглициня.

Цель изобретения — получение штамма с более высокой активностью гидролазы Е-карбамоил-Б-фенилглицина.

Штамм Acinetobacter зр. ВКПМ

В-4388 (N4) выделен из почвы. Выделение карбамоилазного продуцента проводили в 3 этапа.

1. Селекция микроорганизмов, Пробы из природных источников культивировали при 30 С три недели в качалочных колбах с селективной средой (пересевы делали через неделю) следующего состава, г/л: D-карбамоилфенилглицин 1; М8804. 7Н О 0,2; К<РР0 4 1;

2 биологической промышленности, в частности к получению штамма — продуцента гидролазы N-карбамоил-5-фенилглицина, который может быть использован для получения 1)-фенилглицина, необходимого для производства синтетического антибиотика ампицилина. Пель изобретения — получение штамма, обладающего более высокой активностью

-гидролазы N-карбамоил-5-фенилглицина. 1)!тамм Acinetohacter sp. ВКПМ

В-4388 выделен из почвы. 1)(тамм синтезирует фермент с активностью

49,8+0,7 мкмоль мин- г - при 40 С, концентрации субстрата 5 мкл в 0,1 М фосфатном 6yhepe, рН 7„25. 1 табл.

Мп С1 4Н 0 0,01; СаС1, ° 2H 0 0,02;

pR 7,0. Полученную смесь, богатую микроорганизмами, способными усваивать

D-карбамоилфенилглицин, высевали в

1 чашки Петри с агаризованной средой такого же состава. При пересевах отдельных колоний получили 43 чистые микробные культуры, которые использовали для определения карбамоилазы.

2. Качественное определение карбамоилазы хроматографическим способом. (истые культуры культивируют в качалочных колбах с жидкой питатель ной средой следующего состава, г/л: мясной экстракт 1; дрожжевой экстракт 2; пептон 5; Na01 5; D-карбамоилфенилглицин 1. После суточной инкубации при 30ОС биомассу центрифугируют, лиофилизуют. 20 мг сухих клеток инкубируют с 1,5 мп 0,5Х-ного

f599433

D-карбамоилАенилглицина в 0,1 N фосфатном буАере (рН 8,0).при 40 Г в течение 60 мин на магнитной мешалке, В начале и в конце реакции берут пробы по 5 мкл и наносят на хроматограАическую пластинку с силикагелем.

В качестве контрольнагo раствора берут 5 мкл О, 1Х-ного Аенилглицина в 0,1 М АосАатном буфере„ ХроматограАическую пластинку высушивают н погружают в носитель (1:4 = NH

:Ft ОН). Проявляют опрыскиванием

0,57,-ным спиртовым раствором нингидрина. Образование Аенилглицина обна.ружено у 18 бактериальных культур.

3. Количественное определение карбамоилазы.

Определение проводят по методике, отработанной в лаборатории техноло- щ0 гии биокаталитических процессов НПО

"Фермент".СпектроАотометрически карбамоилазную активность показали 8 ,культур . Наиболее активный штамм 1

iAcinetobacter зр. М4 имеет показа- 25 тели активности 49,8Ю,7 мкмоль/мин г.

Морфологические признаки: палочковидные клетки размером 1,0-1,5 мкм. одиночные или парами, неподвижные, грамотрицательные, спор не образует.

Физиологические признаки: колонии на МПА после суточной инкубнции при

37 С рН 7,0 непигментированные, блестяшие, выпуклые, край ровный, размер 1-2 мм при 25 и 45 С рост слаУ

35 бый; сахаров до кислом продуктов не метаболизирует, желатину не разжижает, крахмал не гидролизует, молоко не свертывает, на картошке не растет, нитратов не усваивает; из источников 40 азота лучше всего использует пептон, гидролизат дрожжей, Культура хранится в лиоАилизированном состоянии в ампулах.

Пример. Биомассу штамма Acinetobacter зр. М4 получают при выdD ° ч (v1 + vs) (v +

dt- m Я т ° v где ClD - разница ОптическОй плОтнОсти во время реакции 3t (в данном случае 10 мин);

m — - количество клеток, г;

Я - молярный коэфАициент экстинкции продукта реакции с 2, 4,6-тринитробензолсульАокислотой, E= 9400 м -см - ;

v — объем инкубируемого раствора, мл; разливании в качалочных колбах объемом 750 мл (количество среды 100 мл) при 37 Г с ?40 об./мин. Используют питательную среду следуюшего состава, г/л: мясной экстракт 1; гидролизат дрожжей 2; пептон 5; натрий хлористый 5; М-карбамоилАенилглицин 1; рН 7,0. После стерилизации при 120 Г

30 мин петлей засевают суточную культуру, Колбы инкубируют на качалках

20 ч. Биомассу отделяют центрифугироанием при 10 000 об./мин, промывают 0,87,-ным раствором хлористого натрия и лиоАильно высушивают, Карбамоилазную активность измеряют по начальной скорости образования фенилглицина, определяемого по цветной реакции с 2,4,б-тринитробензолсульАокислотой. Для этого проводят ферментативный гидролиз при 40 С в термостативных кюветах при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Берут 20 мг (m) сухих клеток, добавляют 1,5 мл (у,) 0,5Х-ного D-карбамоилАенилглицина, растворенного в

0,1 М Аосфатном буАере (рН 7,?5). Из перемешиваемой магнитной мешалкой смеси после 5 и 15 мин от начала реакции отбирают пробы объемом по

0,01 мл (т,) и вливают в пробирки с 2,5 мл (v ) боратно-фосАатного буАера (7,6 г !a R О7. 10НО/1 л Н>О

+ КН РО концентрированный раствор до рН 8,5). Смесь центрифугируют

10 мин при 10 000 об./мин, Осторожно берут ? мл (v <) надосадочной жидкости и добавляют 0,1 мл (v ) pacTвора 0,77-ной 2,4,б-тринитробензолсульфокислоты. Инкубируют 30 мин при 40 С. Разницу оптической плотности (d D) между пробами определяюг при 420 нм спектрофотометрически.

Карбамоилазную активность вычисляют по Аормуле

vs-) 1 10 мкмоль/мин г

В таблице приведены данные о карбамоилазной активности штамма Acinetohacter зр. М4 и прототипа — Aprobacterium radiobacter.

Формула изобретения

111тамм Acinetobacter sp.BKITY В-4388- продуцент гидролазы М-карбамоил-5-фенилглицина.

Карбамоилазная активность, мкмоль мин г

Пр одуце н т

Acinetobacter sp. М4*

A1robacterium ridiobacter*+ данных но образованию Э-фенилглицина.

Составитель Е. Воробьева

Техред M.Ìîð-ентал Корректор Н, Король

Редактор Л. Веселовская

Заказ 3123 Тираж 484 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауш"кая ньб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Приведено стандартное отклонение 3

**

Значение вычислено из кинетических

49,8+0,7

12,3 опытов (в колбах),