Способ выделения кислой фосфатазы

 

Изобретение относится к биохимии и медицине, касается выделения кислой фосфатазы и может быть использовано для создания иммунодиагностикумов. Целью изобретения является повышение удельной активности фермента. Способ заключается в следующем. Из эякулята получают спермоплазму путем центрифугирования. Затем кислую фосфатазу, содержащуюся в полученной спермоплазме, очищают хроматографией с последовательным использованием фенилсефарозы 4В, сефадекса G-200 и целлюлозы ДЕАЕ-52. Полученная таким образом кислая фосфатаза обладает удельной активностью до 1200 ед/мг.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (l9) (1И щ) С 12 N 9/16, С 12 N 9/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

fl0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ I IIL EyTPg t ;1 БЛ И(К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (56) Lam W.Ê.W. et al. Clin Chem, 1979, 25, F, 1285-1289, (21) 4371270/30-13 ,(22) 28.01 ° 88 (46) 07,07.90. Бюл. Р 25 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического прибсрбстроения (72) Л.П.Евсеев, В.В.Евдокимов, В.В.Светличкин, А.В ° Соколов и К.М.Ледян (53) 577.15(088.8)

I (54) СПОСОБ ВБЩЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОЙ ФОСФАТАЗЫ

Изобретение относится к биохимии и медицине и касается выделения кислой фосфатазы и может быть использовано для создания иммунодиагностикумов, Целью изобретения является повышение удельной активности фермента, Способ заключается в следующем.

Из эякулята получают спермоплазму путем центрифугирования эякулята. Затем кислую фосфатазу, содержащуюся в полученной спермоплазме, очищают хромотографией с последовательным использованием фенилсефарозы 4В, сефадекса С-200 и EAE-52-целлюлозы.

Центрифугирование позволяет отделить кислую фосфатазу от клеточного дебри-. са и сконцентрировать кислую фосфатазу в малом объеме. Предлагаем последовательность операций очистки с использованием указанных наполнителей позволяет наиболее полно провести очистку кислой фосфатазы от сопутст2 (57) Изобретение относится к биохи-. мии и .медицине, касается выделения кислой фосфатазы и может быть использовано для создания иммунодиагностикумов. Целью изобретения является повьш ение удельной активности фермента.

Способ заключается в следующем. Из эякулята получают спермоплазму путем центрифугирования. Затем кислую фосфатазу, содержащуюся в полученной спермоплазме, очищают хроматографией с последовательным использованием фенилсефарозы 4В,сефадекса G-200 и целлюлозы ДЕАЕ- образом кислая фосфатаза обладает удельной активностью до 1200 ед/мг. вующих белков ° Полученная таким образом кислая фосфатаза обладает удель ной активностью до 1200 ед/мг.

Пример 1. Берут 150 мл эякулята. Удельная активность кислой фосфатазы в общем объеме исходного материала составляет 4,3 МЕ/мл. Затем этот объем центрифугируют 15 мин при

3000 g для отделения спермоплазмы от клеточных элементов эякулята. Далее спермоплазму, содержащуюся в надосадочной жидкости, хроматографируют в колонке с фенилсефарозой CL-4Â (50 110 мм)> уравновешенной 1М сернокислым аммонием в ацетатном буфере

0,005М, рН 5,0 с 0,15М хлористого натрия. Скорость элюции 15 мл/ч, фракции по 15 мл. Собранные фракции ,проверяют на содержание КПФ в иммунодиффузионном анализе. Фракции, содержащие КПФ в области 0,2М (NH+) SO,, концентрируют ультрафильтрацией на

15?6564

О, 1И раствором хлористого натрия.

Эти фракции сливают вместе и проводят анализ. Концентрация белка в полученном материале 760 мкг/мл, а титр в тест-системе на КПФ 1 ;800, Определяют концентрацию КПФ с помощью радиоиммунного анализа на простатическую кислую фосфатазу. КПФ составляет 760000.

10 Полученная кислая фосфатаза обладает высокой удельной активностью до

1200 ед/мг.

Формула изобретения 5

Составитель В.Варламов

Корректор А.Обручар

Редактор Н,Рогулич Техред Л.Сердюкова

Заказ 1830 Тираж 486 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина,101 фильтре УИ-10 до 90 мл. Чистота препарата составляет около 907.

Полученный материал хроматографируют в колонке с сефадексом G-200

150х1100 мм, уравновешенно ацетатным буфером 0,005И, рН 5,0 с 0,1 И хлористого натрия ° Скорость элюции

15 мл/ч, фракции по 15 мл. Собранные фракции проверяют иа содержание КПФ в иммунодиффузионном анализе. Этот материал имеет концентрацию белка

1,45 Ml /ìë, а концентрация КПФ составят 1,3 мг/мл.

Таким образом, чистота препарата составляет около 907.. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия выявляются несколько минорных компонентов (2-3), но иммунозация кроликов этим материалом позволяет получать хорошую моноспецифическую антисыворотку. Иатериал после гельфильтрации на сефадексе G-200 буфера, рН 7,4, вводят в колонку с ДЕАЕ-52-целлюлозы. Скорость элюции 30 мл/ч, фракции по 10 мл. Элюции проводят ступенчатым градиентом возрастающих концентраций хлористого натрия в трис-НС1 буфере, рН 7,4, КПФ обнаружена во фракциях, элюированных с колонки

Способ выделения кислой фосфатазы, предусматривающий получение эякулята, экстракцию из него суммарной белковой фракции и ее хромсграфическую очистку, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности фермента, из эякулята перед его экстракцией выделяют спермоплазму центрифугированием, а хроматографическую очистку проводят последовательно на фенилсефарозе GL-4B с злюцией снижающимся градиентом сульфата аммония от 1 до О, 1М, на сефадексе

G-200 и на целлюлозе ДЕ-52 — с элюцией возрастающим градиентом хлористого натрия от 0 05 до iM.