Штамм бактерий bacillus вrеvis - продуцент рестриктазы в @ 12 i

 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения - выявление штамма Bacillus brevis, синтезирующего рестриктазу Bbv 12 I, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 - G(A/T) GC (А/Т)С - 3 с более высоким выходом фермента . Предлагаемый штамм выделен в результате систематического поиска штаммов - продуцентов рестриктаз и хранитсячво ВКПМ ВНИИгенетика под регистрационным номером В-4906. Штамм продуцирует рестриктазу Bbv 12 I, имеющую сайт узнавания, идентичный рестриктазе Hgl A I, и может полностью заменить известный во всех генно-инженерных работах . Преимуществом предлагаемого штамма является повышение выхода целевого фермента, вдвое большего чем у известного штамма. Выход фермента Bbv 12 (составляет 6000ед./гсырой биомассы. Штамм неприхотлив к питательным средам. для определения молекулярных весов фрагментов ДНК. Данная рестриктаза является удобной моделью для излучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий. Известен штамм Bacillus brevis - продуцент рестриктазы Bbv II, Однако культивирование штамма трудоемко , выход рестриктазы составляет 667 ед/r сырой биомассы. Кроме того, рестриктаза , продуцируемая этим штаммом, не способна узнавать и расщеплять послеЁ О ю Јь о &

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

rio изОБРетениям и ОткРытиям

ПРИ ГКНТ СССР с

1 с

1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

О

Д ( фь

«4 (21) 4783329/13 (22) 16.01.90 (46) 30.11.91. Бюл. hk 44 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ и Институт микробиологии АН АрмССР (72) В.Е.Репин, Н,И.Речкунова, С.Х.Дегтярев, А,А.Хачатурян, К.В.Читчян и Э.Г.Африкян (53) 577.14 (088.8) (56) Matvienko Ю., Pachkinov D.M., Kramarov

V.M. The recognitlon sequence of sitespeclfIc endonuclease ВЬч И from Bacillus

Brevis 80. FEBS Letters, 1984, ЧЛ77, р.23-26, Brown N.L, Mc. CIelIand М., Whitehead РЯ.

Hgl Al: А. restriction endonuclease from

Herpetosiphon giganteus HP 1023, Gene, 1980, ч.9, р.49-68.

Bickle Т.A„Plrotta V„ lmber R. А simple, general procedure for purifying restriction

endonucleases. — Nucleic Acids, Res, 1977, v.4, N. 88, р.2561 — 2572.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению штамма. используемого для получения сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 -6(А/T)GC(A/T)C-3 .

Рекстриктаза данной специфичности может быть использована для работ по клонированию, физическому картированию генов, гидролиэат ДНК фага л,рестриктаэой

Bbv 12 I может служить удобным маркером,, Ц„, 1694647 Al (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS BREVIS — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ Bbv 12 I (57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения — выявление штамма Bacillus brevis, синтезирующего рестриктазу Bbv 12, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 — G(A/T) GC (А/T)C — 3 с более высоким выходом фермента. Предлагаемый штамм выделен s реэультате систематического поиска штаммов — продуцентов рестриктаз и хранится, во ВКПМ ВНИИгенетика под регистрационным номером В-4906, Штамм продуцирует рестриктазу Bbv12 1, имеющую сайт узнавания, идентичный рестриктазе Hgl А I, и может полностью заменить известный во всех генно-инженерных работах. Преимуществом предлагаемого штамма является повышение выхода целевого фермента, вдвое большего чем у известного штамма. Выход фермента ВЬч 12 I составляет

6000 ед./г сырой биомассы. Штамм неприхотлив к питательным средам. для определения молекулярных весов фрагментов ДНК. Данная рестриктаза является удобной моделью для излучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий. юаеЪ

Известен штамм Bacillus brevis — продуцент рестриктазы ВЬч II, Однако культивирование штамма трудоемко, выход рестриктазы составляет 667 ед/г сырой биомассы..Кроме того, рестриктаза, продуцируемая этим штаммом, не способна узнавать и расщеплять после1694647

10

20

25 названа 12 l согласно общепринятой, но- 30 мен клатуре.

Штамм Bacillus brevis характеризуется

40 довательность нуклеотидов 5 — G(A/Т)

G С(А/Т) СЗ .

Наиболее близким к предлагаемому является штамм — продуцент рестриктазы Hgl

А1, узнающей и расщепляющей последовател ьность 5 G(A/Т)6С(А/T)C-З . Штамм выращивают на среде, содержащей 1% бактоказитон (Dlfco), 0,5%-ный дрожжевой экстракт. Культивирование осуществляют в термостатированных качалках при 30 С.

Недостатками данного штамма (по литературным данным) являются низкий выход фермента, составляющий 3000 ед/г сырой биомассы, а также требовательность к богатым и дорогостоящим питательным средам (выход биомассы не указан).

Цель изобретения — выявление штамма

Bacillus brevis — продуцента, синтезирующего рестриктаэу Bbv 12 1, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 G(A/T)GC(A/Т)С-3 с более высоким выходом фермента.

Штамм выделен из бурой окультуренной почвы в результате систематического поиска штаммов — продуцентов эндонуклеаз рестрикции в роде Bacillus и хранится в

BKllM под регистрационным номером В4906.

Рестриктаза иэ Bacillus brevis В-4906 следующими признаками.

Кул ьтурал ьно-морфологические и ризнаки. На МПА и PA колонии кремовые, плоские, гладкие, блестящие. Клетки палочковидные, размеры: длины 1,6 — 2,5 и ширина 0,6 — 0,8 мкм. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные в основном центрально или парацентрально. Отмечается некоторое раздувание спорангия.

Аэробы, температурный оптимум роста 27—

30 С, растет при PH 7,0 — 9,0.

Физиолого-биохимические свойства.

Образует каталазу, протеазу, крахмал не гидролизует, ацетоинотрицательные, нитраты не восстанавливает, в 7%-ном NaCI не растет, кислоту из глюкозы, арабинозы, ксилозы, маннита не образует, утилизирует цитрат. Из источников азота использует пептон и соли аммония.

Предлагаемый штамм в отличие от известного хорошо растет в агаризованной питательной среде отечественного производства, приготовленной на основе

3,7® гидролизата кильки.

Биомасса легко лиэируется лиэоцином.

Хранение штамма осуществляют под ваэелиновым маслом или в 30%-ном глицерине при 70 С, 45

Для глубиного культивирования

Bacillus brevis В-4906 применяют питательную среду следующего состава, г/л:

Рыбный гидролизат 37

Вода Остальное

Культивирование проводят при 30 С с хорошей аэрацией до достижения фазы замедления роста. Выход рестриктаэы ВЬч 12

1 6000 ед/г сы рой биомассы.

Определяющие отличия предлагаемого штамма Bacillus brevis следующие: штамм содержит одну сайт-специфическую рестриктазу ВЬч 12! способную узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность 5 -G(A/T)G С(А/Т)С-3 : продуктивность штамма в 2 раза превосходит по целевому ферменту известный штамм.

Предлагаемый штамм способен к культивированию в недорогой питательной среде отечественного производства.

П р и м е. р; Культуру хранят в косяках под вазелиновым маслом. Перед началом работы клетки пересевают бактериологической петлей на твердую агаризованную среду (3,7% СПА).

Чашки Петри помещают в термостат на

30 С.

После 24-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из 3,7% гидролизата кильки, и помещают в термостат на ночь. Ночную культуру штамма

Bacillus brevis засевают в жидкую питательную среду, состоящую иэ 3,7% рыбного гидролизата, остальное — вода, Культивируют в термостатированных качалках при температуре 30 С при 200 об/мин до достижения фазы замедления роста. Клетки осаждают центрифугированием при 4 С.

Выделение осуществляют по известной методике Bickle, Pirotta lmber. Выход фермента составляет 6000 ед/г сырой биомассы.

Фермент хранится при 20 С в глицерине.

Полученный штамм обладает следующим преимуществами по сравнению с известным; содержит сайт-специфическую рестриктазу Bbv12! с высоким выходом фермента (6000 ед/г вместо 3000 ед/г у известного, Способен расти на простых недорогих отечественных средах.

Поскольку рестриктаза Bbv l2 1 имеет сайт узнавания, идентичный сайту узнавания Hgi А 1, а выход фермента более высок, то Bbv12 I может заменить известный во всех генно-инженерных работах.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus brevis ВКПМ

В-4906- продуцент рестриктаэы Bbv12 1.