Штамм бактерий bacillus sтеаrотнеrморнilus - продуцент рестриктазы bss ti

 

союз советских социАлистических

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

IiAYEITI%, T>r3@qyp „- j :ЩЯтг рА

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4768118/13 (22) 11.12.89 (46) 23.10.91. Бюл. М 39 (71) Научно-исследовательский и конструкторско-технологический институт биологически активных веществ Научнопроизводственного объединения "Вектор" (72) Г.Д.Серов, Т.А.Терещенко, Л.И.Пучкова, Н.И.Речкунова и С.Х.Дегтярев (53) 577.15 (088.8) (56) Roberts R,Т. Restrlctipns enzymes and

their isoschlzomers. — Nucl. Acids Res., 1988, ч. 16, р. 271 — 313.

Mise К. and Nakajima К. Purification of a

new restriction endonuclease, Sty 1, from

Escherlchla coll carrejlng hsd minlplasmld.—

Jene, 1985, ч. 33, р. 357-361. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS

STEAROTHERMOPHILUS — ПРОДУЦЕНТ

РЕСТРИКТАЗЫ BSS Tl

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к обнаружению микроорганизма, способного синтезировать сайт-специфическую рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов СС (А/T)(A/Т)66 и названную Bss Tl.

Целью изобретения является выявление штамма продуцента Bacillus

stearothermophllus, обеспечивающего получение рестриктазы Bss Tl c более высоким выходом.

Штамм бактерий B. stearothermophllus получен в результате поиска и отбора при

„, Ж„„1686000 Al (54) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является выявление штаммапродуцента Bacillus stearothermophilus, обеспечивающего получение рестриктазы

Взз Tl с более высоким выходом. Штамм получен в результате поиска продуцентов рестриктаз среди почвенных микроорганизмов, растет на простой дешевой питательной среде, непатогенен. Из 1 r влажной биомассы выделяют 10000 ед. фермента с активностью 10000 ед/мл, Штамм

Bacillus stearothermophiIus (360) ВКПМ В4893 продуцирует рестриктазу Bss Tl, имеющую сайт узнавания СС(А/T) (А/T)GG, идентичный сайту узнавания Sty I, и может заменить Sty I во всех генноинженерных работах, экстремальных условиях культивирования (68 — 70 С) и родуцентов рестриктаз среди почвенных микроорганизмов.

Штамм депонирован в ВКПМ ВНИИ гене гики под редакционным номером B-4893 (коллекционный номер депозитора 360), а продуцируемая им зндонуклеаза рестрикции названа Взз Tl, Морфолого-культуральные признаки, Клетки, выращенные в жидкой питательной среде, представляюттонкие, с закругленны- ми концами грамположительные подвижные палочки, одиночные или в коротких цепочках. Размер клеток 3 — 4.0,5 — 1,0 мкм, 1686000

Через 18-24 ч на плотной крахмала-аммиачной среде клетки образуют терминально расположенные овальные споры, расширяющие ее тело, На рыбном питательном агаре — плоские округлые с неровным краем беспигментные колонии, 2,0 — 2,5 мм в диаметре, легко снимаются бактериологической петлей, Водорастворимый пигмент в среде не обнаружен.

Строгий аэроб, Клетки в жидкой среде растут диффузно, без образования пленки и осадка, Температурные границы роста 40—

70 С. Растет в присутствии 5 хлористого натрия, при 10% — не растет. Рост отсутствует также в средах с 0,001% лизоцима и

0,02% азида натрия. Тесты на каталазу и оксидаэу положительные, на индол, сероводород и ацетоин отрицательные. Восстанавливает нитраты, синтезирует щелочную фосфатазу. Усваивает глюкозу и галактозу с образованием кислоты. Не ферментирует арабинозу, лактозу, сахарозу, ксилозу, маннит и глицерин.

Штамм чувствителен к пенициллину, ампициллину, мономицину, тетрациклину, стрептомицину, левомицетину, оксациллину, карбеницилину, гентамицину, устойчив к налидиксовой кислоте. Штамм не патогенен.

Культивирование проводят в питательной среде, содержащей 1% бактотриптона, 0,5 дрожжевого экстракта, 1% натрия хлористого, рН 7,0 в колбах на качалке со скоростью перемешивания 200 — 250 об/мин при 68 — 70 С. Выход биомассы 3,0 — 3,5 г влажных клеток на 1 л среды, Выход фермента Bss Т! не менее 10000 ед. акт,/г влажной биомассы.

Полученная рестриктаза Взз TI характеризуется следующими свойствами; узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов СС(А/7)(А/T)QQ, оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5 — 8,0, оптимальная температура действия 50-55 С, оптимальная концентрация NaС! 50 мМ.

Определяющие отличия предлагаемого штамма В. зееагойеггпорЫ!цв (360) В-4893: высокое содержание рестриктазы Hss TI, составляющей 10000 ед.акт./r влажной биомассы (в 5 раз выше), отсутствие патогенности штамма, использование для культивирования микроорганизмов ilpoстой дешевой среды.

Пример 1. Получение биомассы.

Клетки В. steannhermophilus (360), хранящиеся под слоем вазелинового масла при

4 С, высевают на скошенный питательный агар и инкубируют при 68-70 С в течение

18 ч. Затем клетки вносят в; 50 мл жидкой питательной среды и выращивают инокулят на качалке со скоростью вращения

200 — 250 об/мин при 68-70 С 18-20 ч. Полученную культуру из расчета 5-10 используют для засева 250 мл среды. содержащей

1% бактотриптона, 0.5 дрожжевого экстракта. 1% натрия хлористого, Дальнейшее культивирование проводят 16-18 ч на качалке в этих же условиях. Биомассу собирают

10 центрифугированием в течение 30 мин при

5000 об/мин на центрифуге "М!ига!", Выход сырой биомассы 3,5 г/л культурал ьной жидкости.

Пример 2. Выделение и очистка

15 рестриктазы Bss Tl, 10 r клеток суспендируют в 30 мг 0,02 M трис-НС! буфера, рН 7,5, содержащего

1х10 МР-меркаптоэтанола и 0,1% тритойа

Х-100, разрушают на ультразвуковом дезин20 теграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием и надосадочную жидкость наносят на колонку с биогелем А-0,5 M объемом 500 мл, уравновешенную 0,02 М калийфосфатным буфером, содержащим 1х10 М

25 Р-меркаптоэтанола, 5x10 M ЭДТА, 0,8 М

NaCI, 0,1% тритона Х-100 (буфер А), Фермент элюируют тем же буфером со скоростью 20 мл/ч. Фракции объемом 10 мл собирают и анализируют на присутствие

30 фермента. Фракции, содержащие ректриктазную активность, объединяют и диализуют против 2 л 0,02 M калий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 1x10 M Pмеркаптоэтанола и5x10 M ЭДТА(буфер В), 35 меняя буфер дважды. Диализат наносят на колонку объемом 50 мл с ДЕАЕ-целлюлозой, уравновешенную буфером В. Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюируют 500 мл градиента NaCI

40 (0,1-0М) в буфере В, Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюируют 500 мл градиента. NaCI (0,1 — OM) в буфере В. Фракции, элюированные при

0,40 — 0,55 М NaCI, содержащие рестриктазу, 45 объединяют и диализуют против 2 л буфера

В, меняя егодважды, Фермент последиализа наносят на колонку с фосфоцеллюлозой

Р-11 объемом 20 мл, уравновешенную буфером В. Элюацию фермента проводят 300 мл

50 градиента NaCI (0-1,OM) в буфере В. Фракции, содержащие максимальную активность рестриктаэы, элюируемые при 0,66-0,7 М

NaCI, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего 0,1 M NaCI и 50 глице55 рина, За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимого для полного расщепления 1 мкг ДНК фага 1 в течение 1 ч при 50 С. Ферментный

1Р86000 препарат хранится при -20 С. Выход фермента 10000 ед./г биомассы, активность

10000 ед./мл.

Составитель И.Привалова

Редактор И.Шмакова Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Т Палий

Заказ 3576 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой

Bss Tl, проводят гидролиз ДНК фага рестриктазами Bss Tl u Sty! по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами. Наблюдаемая картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Bss Tl u Sty

l порознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза Bss Tl является изомером Sty l, узнает и расщепляет последовательность СС(А/Т)(А/T)GG.

Полученный штамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известным; растет на более доступной, дешевой среде без антибиотиков, обеспе5 чивает повышенный выход рестриктазы

Bss TI.

Поскольку рестриктаза Bss Tl имеет сайт узнавания СС(А/T)(A/T)GG, идентичный сайту узнавания Sty!, она может заме10 нить Sty 1 â экспериментах по фрагментации

ДНКА по этим сайтам.

Формула изобретения

Щ.тамм бактерий Bacillus зсеаго15 thermophifus ВКПМ В-4893 — продуцент рестриктазы BSS Tl.