Способ получения пенициллина

 

Использование: медицинская и микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: культивирование продуцента в питательной среде в аэробных условиях с дробной подачей сахаров и поддержанием концентрации аммонийного азота и водородного показателя на постоянном уровне. Подачу сахаров осуществляют через 12 ч от начала культивирования по следующей схеме: 12 - 20 ч - 0,16 г/л. ч, а начиная с 81 ч - с учетом потребности продуцента. Водородный показатель поддерживают равным pH 6,8 и проводят контроль его величины через каждые 8 ч с одновременным прекращением подачи сахаров. При отклонении водородного показателя через 5 мин после прекращения подачи увеличивают дозу подаваемого сахара на 10%. При отклонении водородного показателя через 10 мин снижают дозу подаваемого сахара на 12% от исходной. 3 табл.

Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и касается способа получения пеницилина. Известны способы получения пенициллина путем культивирования продуцента в питательной среде в аэробных условиях с дробной подачей легкоокисляемых сахаров, поддерживанием концентрации предшественника, аммонийного азота и водородного показателя культуральной жидкости на постоянном уровне с последующим сливом и выделением целевого продукта. Указанные способы не обеспечивают высокой производительности процесса, а применение жесткой возрастающей схемы подачи дозы легкоокисляемых сахаров приводит к большому расходу питательного субстрата. Наиболее близким к заявляемому способу как по технической сущности, так и по достигаемому результату является способ получения пенициллина методом полунепрерывного регулируемого биосинтеза. Указанный способ включает проведение процесса биосинтеза по ферментационной среде с постоянным дозированием углеводов по возрастающей схеме. В качестве источников аммонийного азота используют сернокислый аммоний и аммиачную воду. Водородный показатель поддерживают на определенном уровне щелочью и аммиачной водой. Целью предлагаемого способа является повышение производительности процесса и снижение сырьевых затрат. Поставленная цель достигается способом биосинтеза пенициллина, в котором подачу сахаров через 12 ч от начала культивирования производят по следующей схеме, г/л.ч. 12-20 ч 0,16; 21-37 ч 0,56; 38-61 ч 0,66; 62-80 ч 0,76. Начиная с 81 ч подачу сахаров производят с учетом потребности продуцента. При этом, поддерживая в течение всего процесса культивирования значение водородного показателя равным 6,8 рН, осуществляют контроль его величины через каждые 8 ч с одновременным прекращением подачи сахаров. При отклонении водородного показателя через 5 мин после прекращения подачи увеличивают дозу подаваемого сахара на 10% от исходной, а при отклонении водородного показателя через 10 мин снижают дозу подаваемого сахара на 12% от исходной. Отличительным признаком заявляемого способа является контроль величины водородного показателя через каждые 8 ч и одновременное прекращение подачи сахаров. Достижение положительного эффекта в заявляемом способе оказалось возможным за счет применения гибкой схемы подачи сахаров, создающей оптимальные концентрации этого субстрата и не ингибирующей биосинтез целевого продукта. Схема подачи сахаров (в г/л.ч.) через 12 ч от начала культивирования: 12-20 ч 0,16; 21-37 ч 0,56; 38-61 ч 0,66; 62-80 ч 0,76 обеспечивает интенсивный рост и накопление влажной массы, необходимой для интенсивного синтеза пенициллина. С 81 ч роста в стадии интенсивного синтеза подачу сахаров ведут с учетом потребности культуры в источнике углеводного питания снижая или увеличивая скорость подачи сахаров, т.е. избегают избытка или недостатка подаваемого субстрата. Поэтому каждые 8 ч корректируется доза подаваемого сахара. Оптимальный уровень водородного показателя для синтеза пенициллина 6,8 рН. Это значение строго поддерживается в течение всего процесса. Отклонение водородного показателя от величины рН 6,8 при кратковременном отключении подачи сахаров указывает на избыток или недостаток подаваемого субстрата. Если водородный показатель изменил свое значение от величины рН 6,8 через 5 мин после отключения подачи сахаров требуется увеличить дозу подаваемого сахара на 10% т.е. промежуточных продуктов недостаточно для синтеза пенициллина. Изменение водородного показателя от величины рН 6,8 через 10 мин после отключения подачи сахаров показывает то, что доза подаваемого сахара велика и ее необходимо снизить на 12% Если водородный показатель не изменил своего значения по истечении 10 мин, значит подается оптимальное количество сахара. Заявляемый способ можно осуществлять штаммами Penicillium chrysogenum 9741 "бежевый" 19.207 А (Италия), а в качестве источников углеводов использовать глюкозу, сахарозу, матозную патоку. Сравнительные данные по получению пенициллина представлены в табл. 1. Использование заявляемого способа получения пенициллина по сравнению с прототипом позволяет увеличить производительность процесса на 7,4% с одновременным снижением времени роста, а также снизить материальный индекс на 33,6% Производительность процесса: по заявляемому способу 0,303 млрд.ед./м³ ч по известному способу 0,189 млрд.ед./м³ ч. П р и м е р 1. Вегетативный посевной материал продуцента Penicillium chrysogenum 9741 "бежевый" с массовой долей влажной биомассы 39% и значением водородного показателя рН 5,85 вносят в количестве 14% по объему в аппарат вместимостью 10 л, содержащей 7,2 л ферментационной среды следующего компо- нентного состава (массовая доля, в): Кукурузный экстракт 3,0 Глюкоза 1,0 Аммоний сернокислый 0,5 Магний сернокислый 0,07 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,4 Натрий серноватистокислый 0,5 Мел 1,0 Масло подсолнечное 0,15 Пропинол Б-400 0,0125 Водородный показатель среды после стерилизации 5,9. Культивирование осуществляют при следующем режиме. Температура 24^оС; аэрация культуральной жидкости ступенчатая; в течение первых 12 ч расход воздуха составляет 0,7 об. на 1 об. среды в 1 мин, затем расход воздуха увеличивают до 1,2 об. на 1 об. среды в 1 мин; мешалка работает постоянно с частотой вращения 400 мин^-1 до 12 ч роста, с 12 ч до конца 650 мин^-1. Водородный показатель культуральной жидкости поддерживают на уровне 6,8 рН посредством 10%-ного раствора едкого натра. Уровень аммонийного азота в пределах 0,1-0,4 г/л посредством дозирования 10% -ного раствора сульфата аммония. Массовую концентрацию предшественника поддерживают на уровне 0,8-1,2 г/л непрерывной подачей 10%-ного раствора натриевой соли фенилуксусной кислоты. Подсолнечное масло дозируют в течение всего процесса ежечасно по 0,1 г/л. Через 12 ч культивирования начинают подавать 40%-ный раствор глюкозы по следующей программе (в г/л ч) 12-20 ч 0,16; 21-37 ч 0,56; 38-61 ч 0,66; 62-80 ч 0,76; с 81 ч культивирования, каждые 3 ч проводят корректировку дозы подачи 40%-ного раствора глюкозы. Потребность культуры в источнике углеводов определяют следующим образом: отмечают исходную дозу подачи раствора глюкозы; отмечают подачу раствора глюкозы;
ведут наблюдение за отклонением водородного показателя культуральной жидкости по рН-метру с записью показаний на КСП-087г. водородный показатель увеличивается через 5 мин корректируют дозу подачи раствора глюкозы в сторону увеличения на 10% от исходной дозы;
водородный показатель увеличивается через 10 мин, корректируют дозу подачи раствора глюкозы в сторону снижения на 12% от исходной дозы;
водородный показатель не изменился через 10 мин, исходную дозу не изменяют. Экспериментальные данные представлены в табл. 2. В последующие часы роста периодическое изменение дозы подаваемого раствора ведут аналогичным образом. Начиная с 60 ч культивирования проводят ежесуточные отливы культуральной жидкости в количестве (6 ± 2)% от рабочего объема. Через 253 ч культивирования получают 7,7 л культуральной жидкости, содержащей 4700 ед/мл пенициллина. Производительность процесса составляет 0,203 млрд. ед/м³ ч. Расход глюкозы на 1 млрд.ед. пенициллина в культуральной жидкости 2,9 кг. Материальный индекс по сырью на 1 млрд.ед. пенициллина в культуральной жидкости составил 5,21 кг. П р и м е р 2. Вегетативный посевной материал продуцента пенициллина Penicillium chrysogenum штамм 207 А (Италия) с массовой долей влажности биомассы 36% и значением водородного показателя 5,9 рН вносят в количестве 10% по объему в аппарат вместимостью 10 л, содержащий 7,0 л питательной среды следующего компонентного состава (массовая доля в): Кукурузный экстракт 3,0 Глюкоза 0,43 Аммоний сернокислый 0,4 Кальций гидрата окиси 0,13 Сернокислый натрий 0,026
Натрий фосфонокислый однозамещенный двухводный 0,32 Мел 0,076 Масло подсолнечное 0,168
Водородный показатель среды после стерилизации 6,1 рН. Процесс культивирования и отлива культуральной жидкости ведут в условиях приведенных в примере 1. В качестве источника углеводов используют 38%-ный раствор сахарозы, который начинают подавать через 12 ч. культивирования по следующей программе (в г/л ч): 12-20 ч 0,16; 20-37 ч 0,56; 38-60 ч 0,66; 61-80 ч 0,76. Подачу раствора сахарозы с 81 ч культивирования ведут аналогично примеру 1. Через 236 ч культивирования получают 7,0 л культуральной жидкости, содержащей 41 200 ед/мл пенициллина. Производительность процесса составляет 0,190 млрд. ед/м³ ˙ ч. Расход сахарозы на 1 млрд.ед. пенициллина в культуральной жидкости 2,6 кг. Материальный индекс по сырью на 1 млрд.ед. пенициллина в культуральной жидкости 5,09 кг. П р и м е р 3. Процесс культивирования пенициллина осуществляют аналогично примеру 1. Штамм продуцента пенициллина, источники углеводов, продолжительность процесса, активность культуральной жидкости, производительность процесса, расход углеводов на 1 млрд.ед. пенициллина в культуральной жидкости приведена в табл. 3. Примеры 3,4 показывают возможность использования для штамма 9741 "бежевый" таких источников углеводов как сахароза, мальтозная патока. Примеры 5-7 иллюстрируют возможность использования сахарозы, глюкозы, мальтозной патоки для штамма 19. Расход мальтозной патоки приведен в пересчете на 100% основного вещества.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНА путем культивирования Peniccilium chrysogenum в питательной среде в аэробных условиях с дробной подачей сахаров, поддержанием концентрации предшественника, аммонийного азота и рН на постоянном уровне с последующим сливом культуральной жидкости и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности, подачу сахаров через 12 ч от начала культивирования осуществляют по следующей схеме: 12 20 ч 0,16 г/л·ч, 21 37 ч - 0,56 г/л·ч, 38 61 ч 0,66 г/л·ч и 62 80 ч 0,76 г/л·ч, начиная с 81 ч подачу сахаров производят с учетом потребности продуцента, при этом в течение всего процесса культивирования поддерживают рН равным 6,8, после 80 ч культивирования через каждые 8 ч осуществляют контроль величины рН с одновременным прекращением подачи сахаров и при отклонении рН через 5 мин после прекращения подачи увеличивают дозу подаваемого сахара на 10% от исходной, а при отклонении рН через 10 мин снижают дозу подаваемого сахара на 12% от исходной.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 10-2002

Извещение опубликовано: 10.04.2002        

---