Способ определения липополисахаридного антигена

 

Способ определения липополисахаридного антигена. Использование: для количественного определения липополисахаридного антигена в сыворотке крови. Сущность изобретения: для определения липополисахаридного антигена получают липосомы, нагруженные флуоресцентным маркером, в качестве которого используют кальцеин в концентрации 0,17 М, включают липополисахаридный антиген на стадии получения липосом, сенсибилизируют твердую поверхность антителами, после инкубации липосом производят их разрушение детергентом, регистрируют величину флуоресценции , вычисляют процент относительного ингибирования иммуносорбции и определяют концентрацию липополисахарида по калибровочной кривой. Способ позволяет повысить чувствительность анализа. 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (s1)s G 01 N 33/53

ГОСУДАPCTBEННЫЙ КОМИТЕТ (21) 4886383/14 (22) 28.10.90 (46) 23.09.92, Бюл, М 35 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) С.И.Третьяков, С.П.Ярков и С.Н.Скопинская (56) Патент США

4 4743560, кл. Н КИ 436-501, 10.05.88. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА (57) Способ определения липополисахаридного антигена. Использование; для кол ич ественного on редел ения липополисахаридного антигена в сыворотке крови.

Изобретение относится к иммуноанализу.

Наиболее близким к предлагаемому способу является гетерогенный липосомальный способ определения высокомолекулярного антигена — человеческого хорионического гонадотропина (ХГТ). Способ осуществляется следующим образом: получают липосомы, внутренний объем которых содержит флуоресцентный маркер; на поверхность липосом ковалентно при-. шивают антитела (AT) против ХГТ. На нитроцеллюлозный диск диаметром 1 см, предварительно сенсибилизированный АТ против ХГТ (10-40 мкг/см ), обработанный раствором бысьего сывороточного альбумина (БСА), помещают исследуемый или контрольный образец биологической жидкости, содержащей ХГТ, и выдерживают 1 ч при комнатной температуре. После промывки диска буфером добавляют липосомы (330 нмоль липида на диск), инкубируют 1

Сущность изобретения: для определения липополисахаридного антигена получают липосомы, нагруженные флуоресцентным маркером, в качестве которого используют кальцеин в концентрации 0,17 М, включают липополисахаридный антиген на стадии получения липосом, сенсибилизируют твердую поверхность антителами, после инкубации липосом производят их разрушение детергентом, регистрируют величину флуоресценции, вычисляют процент относительного ингибирования иммуносорбции и определяют концентрацию липополисахарида по калибровочной кривой. Способ позволяет повысить чувствительность анализа, 1 ил, ч при комнатной температуре и, облучая диск ультрафиолетовым светом, визуально наблюдают флуоресценцию маркера, По интенсивности флуоресценции судят о результатах анализа. В качестве маркера используют сульфородамин Б. Чувствительность анализа 10 г/мл (10 М) ХГТ. Недостатком прототипа является большой расход сенсибилизирующих AT и липосом, сложность и длительность получения липосом, сенсибилизированных антителами, качественное определение ХГТ, невысокая чувствительность анализа.

Цель предлагаемого изобретения — повышение чувствительности анализа.

Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе получают липосомы, нагруженные маркером, сенсибилизируют твердую поверхность антителами, инкубируют раствор исследуемого соединения, в качестве флуоресцентного маркера используют кальцеин в концентрации

1763984

20

40

0,17 М, липополисахаридный антиген включают в мембрану липосом на стадии их получения, после инкубации липосом их разрушают ратвором Тритона Х-100 с концентрацией не менее 2%, регистрируют величину флуоресценции, вычисляют процент относительного ингибирования иммуносорбции известным способом и определяют концентрацию липополисахарида по калибровочной зависимости. На чертеже представлена калибровочная зависимость относительного ингибирования иммуносорбции от логарифма концентрации антигена.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Получение липосом, Липидную смесь, содержащую яичный лецитин;холестерин:дицетилфосфат в молярном соотношении 2;1,5:0,22, растворяют в смеси хлороформ:метанол 2:1 м помещают в круглодонную колбу на 50 мл, На роторном испарителе при давлении 9,8 кПа получают липидную пленку, которую растворяют в 1,5 мл диэтилового эфира и объединяют с 0,5 мл 0,17 М раствора кальцеина, в котором растворяют липополисахаридный антиген из расчета 300 мкг антигена на

1 мкмоль суммарного липида,. Полученную двухфазную систему подвергают действию ультразвука частотой 22 кГц 3-4 раза по

40-60 с. Полученную эмульсию помещают в круглодонную колбу на 50 мл и упаривают на роторном испарителе при давлении 4050 кПа до образования липосом, На конечной стадии получения липосом, для более полного удаления органического растворителя, давление доводят до 10 к Па, Не включившийся кальцеин удаляют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50, уравновешенной трис-солевым буфером (ТСБ), а затем центрифугированием при 100 000 g, Полученные липосомы в ТСБ хранят в концентрированном состоянии при+4 С. ЛПС антиген получают модифицированным методом Вестфаля путем водно-фенольной экстракции ацетон-высушенной бактериальной массы. Концентрацию включенного маркера кальцеина выбирают равной 0,17 М,.поскольку более низкие концентрации дают низкий прирост сигнала флуоресценции после разрушения липосом детергентом, а более высокие приводят к интенсивному вытеканию кальцеина из липосом за счет осмоса.

Пример 2. Количественное определение липополисахаридного антйгена:

В лунки полистирольного планшета для иммуноанализа, предварительно сенсибилизированные моноклональными антителами (МКАТ) в ТСБ в концентрации 1 мкг/мл, вносят 200 мкл сыворотки крови на 1 ч при комнатной температуре, затем лунки промывают ТСБ и вносят 200 мкл суспензии липосом, полученных по методу, приведенному в примере 1, инкубируют 3-4 ч, промывают ТСБ и заливают 200 мкл раствором

Тритона Х-100 в концентрации не менее 2%, необходимого для эффективного разрушения фосфолипидного бислоя липосом и высвобождения флуоресцентного маркера в объем раствора. Более низкие концентрации детергента недостаточны для эффективного разрушения фосфолипидного бислоя липосом. После 10 мин лизирования регистрируют величину флуоресценции при длине волн возбуждения и эмиссии 492 и 520 нм соответственно. Регистрацию флуоресценции можно проводить непосредственно в лунках планшета. Величину процента относительного ингибирования иммуносорбции липосом (А) определяют с учетом контролей по формуле

А=(Г;-Рь)х100%(Р.-Fb), где F — величина флуоресценции анализируемого образца, F< — величина флуоресценции образца, в котором отсутствует определяемый антиген; Fb — величина фоновой флуоресценции, обусловленной неспецифической сорбцией липосом. Для различных образцов, содержащих ЛПС-АГ, получены значения величины флуоресценции, представленные в табл,1, Концентрация вычислена по калибровочной зависимости (см. чертеж), Сравнение чувствительностей предлагаемого метода и прототипа правомерно, поскольку: ЛПС и ХГТ являются полимерными, высокомолекулярными антигенами (молекулярный вес ХГТ составляет 100 кД, а молекулярный вес ЛПС по данным гельфильтрации составляет 1000 кД), обладающими множественными участками связывания с антителами; и в том и другом случае используются в качестве вещества, сенсибилизирующего твердую подложку антитела, и избыток липосом, несущих флуоресцентный маркер, константы диссоциации комплексов

АГ-АТ для высокомолекулярных антигенов достаточно близки(10 -10 М ), следовательно, эффективность процесса связывания и последующего маркирования липосомами анализируемого антигена в обоих способах близки. Однако при постановке анализа предлагаемым способом увеличивается соотношение максимального сигнала флуоресценции от иммуносорбированных липосом (F<>) к сигналу фоновой флуоресценции (Fb), обусловленному неспецифи1763984

Пример 4. Уменьшение расхода - реагентов "в йроцессе анализа. При использовании предлагаемого способа расхо10

Таблица ческой сорбцией липосом на и оверхности твердого носителя, что приводит"к yif6- личению чувствительности анализа. Это позволяет достоверно регистрировать незначительное уменьшение величины флуоресценции, вызванное присутствием в исследуемом растворе антигена. По сравнению с прототипом чувствительность анализа увеличивается за счеттого, что снятие концентрационного самотушения флуоресценции кальцеина, который включают липосомы в большой концентрации, после лизиса липосом приводит к увеличению величины флуоресценции (Fi). Сравнение полученных данных показывает, что чувствительность предлагаемого способа при сравнении молярных концентраций анализируемого вещества в 10-40 раз выше, чем у прототипа.

Пример 3. Построение калибровочной зависимости.

Для построения калибровочной зависимости готовят ряд разведений ЛПС-АГ в

ТСБ. Анализ проводят по методике, приведенной в примере 1. Диапазон используемых для построения калибровочной зависимости концентраций Л ПС-АГ 50-1500 нм/мл, На основании результатов анализа строят калибровочную зависимость процента относительного ингибирования (А) иммуносорбции липосом от десятичного логарифма концентрации ЛПС-АГ в нг/мл раствора, Из полученных величин А в % (как в примере 2) с помощью калибровочной зависимости находят концентрацию ЛПС антигена. Наиболее целесообразно с точки зрения точности анализа проводить определение концентрации ЛПС антигена на линейном участке калибровочной кривой (см. чертеж). В том случае, если исследуемая сыворотка крови содержит количество ЛПС иное, чем линейный диапазон калибровочной зависимости, рекомендуется разбавить ее ТСБ таким образом, чтобы определяемые величины концентрации укладывались на калибровочную зависимость, Результаты определения концент

45 ды сенсибилизирующих твердую подложку антител и липосомальных иммунореагентов в сравнении с прототипбм йредставлены в табл.2.

Как видно из таблицы, расход иммунореагентов для проведения анализа предлагаемым способом значительно ниже, что важно при применении дорогостоящих моноклональных антител и липосом, сенсибилизированных труднодостуйными ЛПС антиге нами, Повышение чувствительности определения липополисахаридных антигенов микроорганизмов важно для более ранней диагностики инфекционных заболеваний по содержанию указанных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови и других биологических жидкостях человека и животных.

Изобретение может быть использовано в практике здравоохранения и научных исследованиях в области иммунобиологии и медицины для количественного определения

ЛПС антигенов в сыворотке крови человека и животных, контроля за динамикой инфекционного процесса.

Формула изобретения

Способ определения липополисахаридного антигена в сыворотке крови, включающий получение липосом, нагруженных маркером, сенсибилизацию твердой поверхности антителами, инкубацию липосом с сывороткой крови и регистрацию результатованализа, отл ича ющи йся тем,что, с целью повышения чувствительности анализа, в качестве флуоресцентного маркера используют кальцеин в концентрации

0,17 М, липополисахаридный антиген включают в мембрану липосом на стадии их получения, липосомы разрушают раствором

Тритона Х-100 с концентрацией не менее

2%, регистрируют величину флуоресценции, вычисляют процент относительного ингибирования иммунной сорбции липосом антигеном.

1763984

Таблица 2

Сравнение расходов иммунореагентов

Я,O

3,0 ф ERG, Hr/ìï

Составитель С. Ярков

Техред М.Моргентал Корректор Л, Филь

Редактор Т. Куркова

Заказ 3454 Тираж, Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101