Стимулятор индукции перитонеальных макрофагов для экспериментального животного

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л G 09 В 23/28

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

4 о

Ql

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ! (21) 4838673/14 (22) 13.06.90 (46) 07.10.92. Бюл. № 37 (71) Институт иммунологии (72) З,А.Макарян (56) Keller R — Brit, J. Cancer, 1974, 30, 40. (54) СТИМУЛЯТОР ИНДУКЦИИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ ДЛЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЖИВОТНОГО (57) Изобретение касается состава стимулятора индукции перитонеальных макрофагов. Цель изобретения — усиление индукции

Изобретение относится к медицине, биологии и ветеринарии, а именно к способам, повышающим уровень индукции перитонеальных макрофагов и может быть использовано в различных иммунологических исследованиях, где находят применение пе- ритонеальные макрофаги, Известно множество стимуляторов для получения перитонеальных макрофагов (ПМФ). Для увеличения сбора клеток используют различные вещества, введенные внутрибрюшинно и вызывающие в брюшной полости лабораторных животных стерильный экссудативный процесс, С этой целью применяют мясо-пептонный, казеиновый или комбинированный бульон, тиогликоллятовую среду, крахмал, минеральное масло, гликоген, неполный адъювант Фрейнда.

Однако выход ПМФ, получаемых с помощью известных ирритантов незначителен, при этом требуется длительное время для их выделения.

Наиболее активным из известных ирритантов для стимуляции индукции перитоне„„!Ж„„1767517 А1 перитонеальных макрофагов, Состав представляет смесь следующих ингредиентов, об.% гель гидроокиси алюминия 17 — 23, 20%-ный раствор поливинилпирролидона с молекулярной массой 280 — 360 килодальтон

16-24; 10%-ный раствор кальция хлорида

8 — 12; 10%-ный рас1 вор пепсина 4 — 6; 0,25%ный раствор трипсина (100 — 128 единиц) коммерческий 55 — 35. При введении мышам индуктара на 10 суток после введения возрастет по сравнению с прототипом количество перитонеальных макрофагов в 2 — 2,7 раза. альных макрофагов (ПМФ) является 2 — 10%ный раствор пептона, Способ его применения заключается в выполнении следующих операций: полученную навеску пептона растворяют в дистиллированной воде и при постоянном перемешивании доводят до кипения. При остывании раствора пептона до 35-37 С, стерильным шприцем осуществляют интраперитонеальное введение.

После применения ирританта на 3 — 4 сутки осуществляют получение ПМФ следующим образом: после умерщвления животного, внутрибрюшинно вводят среду N 199 или раствор Хенкса, содержащие 5 — 20 ед/мл гепарина. Объем жидкости, используемой для промывания брюшной полости, зависит также от вида животных: для мышей он составляет 2 — 5 мл, для крыс и морских свинок—

10 — 20 мл, для кролика — более 200 мл, Полученный смыв перитонеального экссудата помещают на с1ерильные пластиковые чашки Петри, При этом ПМФ прикрепляются к поверхности пластика -через 30-60 минут, после чего культуральную среду удаляют и заменяют на среду ¹ 199 с 10% сыворотки

1767517 гель гидроокиси алюминия 17 мл (014 мг/мл) коммерческий, выпускается предприятием вакцин и сывороток, Петрово-Дальнее

20 -ный водный раствор поливинилпирролидона, M.ì 280000

10 -ный раствор хлорида

10 -ный раствор пепсина

0,25 -ны" раств«р трипсина до 100 мл коммерческий, 100 ЕД, выпускается Московским предприятием по производству бактерийный препаратов

16 мл

8 мл

4мл

Состав I!, гель гидроокиси алюминия (0,14 мг/мл) коммер-, ческий 20 -ный водный раствор поливинилпирролидона

M.м, 36 0000

10 -ный раствор кальция хлорида

10 -ный водный раствор пепсина

0,25 -ный раствор

23 мл

24 мл

12 мл

6мл крупного рогатого скота для получения роста ПМФ. Полученную культуру ПМФ далее используют в зависимости от поставленных целей исследования.

Однако использование 2-10 -ного раствора пептона не обеспечивает быстрого и значительного стимулирования индукции

ПМФ.

Целью изобретеняя является усиление индукции перитонеальных макрофагов и сокращение времени их выработки, Получают предлагаемый состав следующим образом: предварйтельно готовят водные растворы поливинилпирролидона, хлорида кальция и пепсина, для чего 20 r поливинилпирролидона (фирма Merc) растворяют в 100 мл дистиллированной воды, 10 г хлорида кальция также растворяют в

100 мл воды и 10 r пепсина (коммерческий порошок) растворяют в 100 мл теплой воды.

Затем проводят смешение всех жидких компонентов в количествах, указанных в формуле изобретения. При этом получают опалесцирующую жидкость, которую затем стерилизуют автоклавированием при 1,5 атм в течение 30 мин. Срок хранения 12 — 18 меся цев и ри +3...+5 С.

Таким образом были получены следующие составы:

Состав !, трипсина 128 ЕД коммерческий до 100 мл

20 мл

5 мл

Состав! !!.

5 гель гидроокиси алюминия 20 мл (0,14 мг/мл) коммерческий 20 -ный водный раствор поливинилпирролидона

M.ì. 300000

10 -ный раствор кальция хлорида 10 мл

10 -ный водный раствор пепсина

0,25 -ный раствор трипсина 110ЕД до 110 мл.

Применяют вышеуказанные составы следующим образом: перед введением ирританта состав взбалтывают, набирают в стерильный шприц и проводят внутрибрюшинн;:o инъекцию лабораторным животным в следующем объеме: мышам — 0,3 — 0,5 мл, крысам и морским свинкам — 0,8 — 1,0 мл и

25 кроликам — 3 — 5 мл на одно животное, Пример 1. Цель исследования— показать преимущество предлагаемого состава А — 2ПТК в плане стимуляции образования ПМФ по сравнению с 2/-ным раствором пептона в динамике, Для этого мышей линии СВА, массой

20-22 г разделили на 3 группы по 60 голов в каждой:

I группе вводили внутрибрюшинно ирритант А-2ПТК в объеме 0,3 мл (состав I);

II группе вводили 2 -ный раствор пептона в объеме 5 мл, III группе вводили 0,9 -ный раствор хлорида натрия. Через 1,5,10,15,20,25 и 30 суток прово40 дили дренаж брюшной полости животных охлажденной средой N 199 с 10 ед/мл гепарина, Затем полученный смыв центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин, супернатант сливали, а к осадку клеток экс45 судата добавляли 1 мл среды 199. В полученной взвеси определяли качественный состав клеток экссудата в процентах и количество ПМФ известными методами, Эксперименты проведены с 3-кратными

50 повторными исследованиями.

Через сутки в опытной (I группе) количество ПМФ было в 2,7 раза больше в сравнении с прототипом (II группа) и в 3,6 раза по сравнению с контролем. Максимальный пик индукции наблюдался на 5 сутки, В этом случае относительное количество ПМФ в

on ытной группе (А-2АТК) доходило до 100, в прототипе — до 95 /, а в контроле — до 29, На этот период исследования при подсчете

ПМФ в камере Горяева их абсолютное коли1767517 чество в опытной группе превосходило прототип в (8 8 х 10 клеток/мл) 2,7, а контроль в 17,6 раз, Дальнейшие динамические исследования по подсчету ПМФ и относительному клеточному составу перитонеального экссудата позволило определит фон постепенного уменьшения ПМФ в опытной группе по сравнению с прототипом и контролем. Так, в частности, на 30 сутки исследования количества П МФ в группе мышей, индуцированных препаратом А — 2ПТК, было больше в 2,3 раза по сравнению с прототипом и в 3 5 раза больше по сравнению с контролем.

Необходимо также отметить тот факт, что при введении препарата А — 2ПТК индуцируется сравнительно большее количество лимфоцитов, обнаруживаемых в мазках перитонеального экссудата, по сравнению с прототипом и контролем.

На 7-10 сутки после внутрибрюшинного введения ирританта А — 2ПТК, образуются зерна белого цвета, восковой консистенции, сохраняющиеся в течение 85-90 суток.

На следующем этапе в сравнительных исследованиях изучались такие свойства, как скорость роста и образование монослоя

ПМФ. Перед помещением перитонеального смыва на стерильные, пластиковые чашки

Петри, определяли процентное содержание жизнеспособных ПМФ. Для этого в 1 мл смыва вносили 0,1 — 0,3 мл 0,1 -ного водного раствора трипановой сини бромфенолового, или бромтимолового синего, или генцианвиолета. Через 10 — 15 минут инкубации при комнатной температуре в присутствии красителя вносили образец смыва в камеру Горяева и подсчитывали количество неокрашенных (жизнеспособных) ПМФ по общепринятому способу и определяли их процентное содержание.

Как показали проведенные исследования, процент жизнеспособности ПМФ, полученных с применением препарата А — 2ПТК, составил 92,3 +. 0,8, по прототипу

72,8» 0,4, а в контроле 68,2 +0,3%. Таким образом, ПМФ, полученные с применением предлагаемого препарата в 1,3 раза превосходило по своей жизнеспособности клетки, полученные по прототипу и в 1 3 раза — в контроле.

После подсчета количества ПМФ взвесь клеток, полученных в результате дренажа брюшной полости, в стерильных условиях помещали на 2 ч в пластиковые чашки Петри диаметром 90 — 100 мм, Затем смыв удаляли с чашек, в адгезированные ПМФ заливали средой N- 199 с 20 сыворотки крупного рогатого скота. Как показали проведенные нами исследования ПМФ, полученные с применением А — 2ПТК, через 6 — 8 ч образо5

55 вывали монослой, занимающий 95,4 — 98,3 поверхности чашки, тогда как в прототипе и контроле монослой формировался через

18 — 24 ч на поверхности в 82,3 и 71,5 соответственно, Нами проводилось также и культуральное изучение перитонеального экссудата, полученного от мышей вышеуказанных групп. Для этого, перед помещением перитонеального смыва на стерильные пластиковые чашки Петри 100 мм, определяли процентное содержание жизнеспособных

ПИФ, При этом, в 1 мл смыва вносили 0,1—

0,3 мл 0,1 водного раствора трипанового синего и генцианвиолета. Через 10 мин инкубации при комнатной температуре в присутствии красителя вносили образец перитонеального смыва в камеру Горяева и подсчитывали количество неокрашенных

ПМФ по известному способу и определяли процентное содержание клеток. На основании полученных результатов было отмечено, что процентжизнеспособных ПМФ, полученных в 1 группе, составил 95,8»- 0,72, во

11 группе — 71,5»0,2 „а в III группе—

65,2»-0,17, После определения количества ПМФ перитонеальный экссудат помещали на 2 часа в пластиковые чашки Петри, Затем смыв удаляли, а адгезированные ПМФ заливали средой N 199 с 20 сыворотки крупного рогатого скота, Проведенные исследования показали, что ПМФ, полученные от группы мышей, уже через 6 — 8 ч образовали монослой занимающий 96,1 — 99,2 поверхности чашки, в то время, как по данным, полученным от мышей II u III групп, монослой ПМФ формировался через 18-24 ч на поверхности 82,5 и 70,2, соответственно, Нами были апробированы три состава стимулятора, но, поскольку для состава III со средними значениями количества ингердиентов при проведении испытаний получались сходные данные, мы представили результаты, полученные при использовании стимулятора с граничными значениями.

Таким образом, на основании полученных результатов можно отметить, что разработанный нами состав для стимулированной индукции ПМФ вЂ” А-2ПТК., позволяет значительно сократить время формирования оптимального количества

ПМФ, необходимого для получения монослоя, f(poMe того, ПМФ, полученные с применением ирританта А-2ПТК, способны за значительно короткий промежуток времени формировать монослой клеток.

Оптимальное количество ПМФ при использовании А 2П ТК для получения монослоя удается получить, спустя 1 сутки, тогда

1767517 окиси алюминия, коммерческий 20 -ный раствор поливинилпирролидона М.м.

280000 — 360000 Дальтон, 0,25%-ный раствор трипсина коммерческий и 10%-ный

5 раствор кальция хлорида при следующем соотношении компонентов, об.%: гель гидроокиси алюминия коммерческий 17 — 23

20%-ный раствор по10 ливинилпирролидона с мол, м, 280000-360000

Дальтон 16-24

10%-ный раствор кальция хлорида

15 10%-ный раствор пепсина 4 — 6

0,25%-ный раствор трипсина (100 — 128 единиц) коммерческий Остальное как в прототипе этот результат достижим через 5 суток.

То есть внутрибрюшинное введение предлагаемого соединения А-2ПТК позволяет сэкономить 4 суток, что является важным моментов в процессе получения ПМФ, при этом выход перитонеальных макрофагов увеличивается в 2 — 2,7 раза.

Формула изобретения

Стимулятор индукции перитонеальных макрофагов для экспериментального животного, содержащий высокомолекулярный белок, отличающийся тем, что, с целью усиления индукции перитонеальных макрофагов, в качестве высокомолекулярного белка используют 10%-ный раствор пепсин, а состав дополнительно содержит гель гидро8 — 12

25

35

45

Составитель Э.Макарян

Техред М,Моргентал Корректор З,Салко

Редактор С.Кулакова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3550 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5