Вещество, обладающее бактерицидным и репаративным действием

 

Использование: медицина, экспериментальная биология. Сущность изобретения: применяют экстракт хвои густой в качестве вещества, обладающего репаративным действием на язву желудка и антибактериальной активностью в отношении грамположительной флоры и Pseudomonas aeruginosa.2 табл. (Л С личные препараты, которые могут взаимодействовать между собой, уменьшая терапевтическое воздействие, или обладая односторонним действием, ослаблять одни звенья в патогенезе заболевания, стимулируя другие. Особенно необходимы для практического здравоохранения препараты одновременнорепаративного и антибактериального действия, так как обычно язвенная болезнь сопровождается микробной пролиферацией. Из природных соединений, обладающих репаративной активностью, применяvi со VI fc о

СОЮЗ COBETi.КИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ОО

Ф (21) 4876378/14 (22) 23,10,90 (46) 15,01.93, Бюл. N 2 (71) Рижский медицинский институт и Научно-производственный кооператив "Биофитекс" (72) Ю.П.Рубенс, С.Ю.Кузнецов, В,И,Рощин, M.0.ÄàóãàBèåTèñ, P.À.Òðåéìàíå и Ю.В,Селезнев (56) Логинов А.С.. Миронов B,А., Амиров

Н,Ш. и Аруин Л.И, Влияние препаратов из плодов облепихи на заживление экспериментальной язвы желудка. - Патологическая физиология и экспериментальная терапия—

1983, N. .6, с, 67 — 70

Машковский М.Д. Лекарственные средства. - M.; Медицина, 1985, т, 2. с.47.

ГОСТ 21769 — 84. Зелень древесная. Технические условия. М„1984, ГОСТ 21802 — 84, Паста хвойная хлорофилло-каротиновая. М., 1984.

Дмитриев В.С., Семенов С,М. Микробиологический контроль активности антибактериальных препаратов. M.. 1965, с. 943.

Изобретение относится к химии биологически активных соединений л касается создания лекарственных препаратов. обладающих комплексным воздействием на различные звенья патологического процесса, в том числе репаративными свойствами в отношении язвы желудка и антибактериальной активностью на грамположительные бактерии.

Поиск новых биологически активных соединений, обладающих комплексным воздействием на язвенный процесс в желудке — актуальная научно-практи еская задача, так как обычно вле,чении и=пользуют раз„„ А „„1787440 А1 (я)5 А 61 К 35/78 (54) ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ 6АКТс

РИЦИДН6!М И РЕПАРАТИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ. (57) Использование: медицина, экспериментальная биология, Сущность изобретения; применяют экстракт хвои густой в качестве вещества, обладающего репаративным действием на язву желудка и антибактериальной активностью в отношении грамположительной флоры и Pseudomonas

aeruginosa. 2 табл, личные препараты, которые могут взаимодействовать между собой, уменьшая терапевтическое воздеиствие, или обладая односторонним действием, ослаблять одни звенья в патогенезе заболевания. стимулируя другие.

Особенно необходимы для практического здравоохранения препараты одновременно репаративного и антибактериального действия, так как обычно язвенная болезнь сопровождается микробной пролиферацией.

Из природных "".îåäèíåíèé, обладающих репаративной активностью. применя1787440

15

25

35

55 ется для лечения язвы желудка или 12-перстной кишки облепиховое масло

/Ol,Hippopheaei, Поэтому оно выбрано в качестве аналога изобретения.

Однако широкое производство облепихбвого масла невозможйо из-за ограниченной, сырьевой базы. Кроме того, облепйховое масло не обладает действием на трамположительную и грамотрицательную флору. Поэтому поиск новых биологически активных соединений на основе доступного растительного сырья, обладающих многосторонним терапевтическим действием, является актуальной практической задачей.

Целью изобретения является разработка средства, обладающего репаративным действием на язву желудка и антибактериальной активностью в отношении грамположительной флоры и Pseudomonas

ae rug in os a.

Это достигается тем. что в качестве биологически активного вещества, обладающего репаративным действием на язву желудка и антибактериальной активностью в отношении грамположительной флоры и

Pseudomonas aeruginosa (синегнойную палочку), применяют экстракт хвои густой, Экстракт хвои густой получают из древесной зелени хвои и молодых побегов сосны обыкновенной Pinus silvesftis.

Древесную зелень сосны обыкновенной, соответствующей требованиям ГОСТ

21669 — 84 1 3 1,загружают в экстрактор оросительно-дефлегмационного типа, и экстрагируют экстракционным бензином с температурой кипения 70 — 80 С, Экстрагирование древесной зелени проводят в течение 4,5 — 5 ч. После этого бензиновый экстракт подается в отстойник, где отстаивается в течение 20 ч при 10 + 2 С, температура в отстойнике поддерживается подачей в рубашку отстойника холодной воды. После отстаивания бензиновый слой экстракта подается на специальный фильтр для отделения механических примесей и остатков воска. После фильтрации бензиновый экстракт подает я в перегонный куб для отгонки раствори1еля и эфирных масел. В перегонный куб подается острый партемпературой 110 — 120 С, отгонку растворителя и эфирных масел ведут в течение 4 ч. Очищенный экстракт сливается в нейтрализатор, поэтому при этом отбирается проба для определения кислотного числа и влажности экстракта. В нейтрализатор добавляются необходимые для получения рН 8,0 — 9,0 количества 40 / водного раствора гидроокиси натрия, перемешивая в течение 3 ч, проводят нейтрализацию экстракта. После окончания нейтрализации в экстракт добавляют дистиллированную воду до влажности экстракта 40 : 1 /. После определения соответствия качества требованиям ФС производят разлив экстракта хвои густого в соответственно подготовленную тару.

Полученный экстрактдолжен иметь следующие физико-химические показатели по

ГОСТ 21802 — 84 1 4 1: pH = 7,0, влажность не более 40, производные хлорофилла 326 мг, каротина 449 +. 0,8 мг /,, воскообразных веществ 8,2 /.

Экстракт хвои густой относится к категории нетоксичных веществ для теплокровных животных. При пероральном введении белым беспородным мышам экстракта хвои густого, выделенного из древесной зелени

LDso не выявлена в дозе более 10,000 мг/кг.

Исследование репаративных свойств экстракта хвои густого.

Экспериментальное изучение репаративных свойств экстракта хвои густого проведено по общепринятой методике на белых беспородных крысах. В экспериментальном исследовании использовали модель "ацетатной язвы" желудка, приближенной по механизму возникновения и патогенезу к клинической форме хронической язвы желудка, надежно воспроизводимой на живо тн ых.

Язву получали введением в подсерозный слой желудка 0,05 мл 10 / раствора уксусной кислоты после соответствующего оперативного вмешательства в асептических условиях под эфирным наркозом

Препаратом сравнения служило облепиховое масло, отвечающее требованиям фармакопеи, Экспериментальных животных разделили на три группы. B контрольной групп» вводили в желудок зонд без препарата, во второй группе — 1 мл экстракта хвои густого по 100 мл/кг веса через зонд, а в третьей—

1 мл облепихового масла по 100 мг/кг вес» через зонд. Препараты вводились через 10 суток после произведения экспериментальной модели хронической "ацетатной язвы".

Курс лечебного действия препаратов составил для всех групп животных 21 день. Крынс забивали методом декапитации под эфирным наркозом на 5, 10, 20 день лечения, Желудок извлекали; вскрывали по большой кривизне, промывали в холодном физиологическом растворе, подсчитывали число деструкций слизистой. При оценке язвы измеряли длину и ширину язвенного дефекта.

Степень заживления язвы определяли по

"язвенному индексу" — площади язвенного поражения.

1787440

В каждой группе использовали 8 — 9 самцов крыс с массой тела 180 — 230 г.

Установлено, что экстракт хвои густой и облепиховое масло оказали значимое действие на заживление язвы желудка у крыс.

Площадь язвенного поражения — "язвенный индекс" достоверно снижается на 10 и 20 день лечебного введения (см.табл., 1) "Язвенный индекс" группы контроля составил соответственно 52,8 +. 6,1 и 28,1:" 5,2 на

10 и 20 день эксперимента, При введении облепихового масла "язвенный индекс" на

10 день лечения составил 25,4:" 3,2 к 20 дню 10,4 +. 0,9, а экстракта хвои густого на

10деньлечения 29,0 ч- 4,6до13,3 + 2,1 на

20 день лечения, При морфологической оценке контрольного материала установлено, что к 10 суткам после воспроизведения патологии зона некроза дна язвы была представлена слоем некротических масс, Собственно мышечная оболочка спаялась с серозной оболочкой, В

10 о случаев наблюдались случаи прободения дна язвы и спайки с брюшиной. В более поздние сроки наблюдения (на 20 сутки) в случаях перфоративного процесса спайки сопровождались отложением больших масс фибрина, образованием абсцессов брюшной полости.

У животных, получивших экстракт хвои густого, зона некроза значительно хуже, Эпителизация по краям язвы шла с формированием слизистых желез. Полная эпителизация поверхности язвы наблюдалась при экспериментальной терапии к 20 дню для экстракта хвои густого в 25 случаев, для контрольного препарата — облепихового масла — в 27 случаев. Воздействие экстракта хвои густого отмечалось значительным уменьшением абсолютного числа перфораций, крупных многокамерных кист и гнойных абсцессов. На основании полученных результатов видно, что действие экстракта хвои густого сопоставимо с репаративным действием облепихового масла, Экстракт хвои густой оказывает репаративное воздействие на экспериментальную язву желугка, снижая число осложнений.

Метод определения бактерицидных свойств экстракта хвои густого проведен согласно с "Микробиологическим контролем активности антибактериальных препаратов",основан на диффузии исследуемого вещества в агар и сравнении угнетения роста текст-микроорганизмов определенными концентрациями испытуемого препарата с угнетением роста известными концентрациями стандартного антибактериального препарата, В чашки одинакового размера разливают предварительно засеянную соответствующей тест-культурой среду определенного состава в один слой, После застывания засеянного агара на поверхность его расставляют 6 стерильных цилиндров из нержавеющей стали. В цилиндры каждой чашки одновременно специальной пипет5

10 кой наносят по 0,1 мл стандартного раствора и испытуемого раствора препарата, чередуя их друг с другом. Чашки выдерживают 2 ч при комнатной температуре для диффузии препаратов в агар, 15 дартном служит препарат нистатин в кон55 центрации 40 ЕД в 1 мл.

Тест-культуру Pseudomonas aeruginosa засевают в среду МПА. Посевная доза тесткультуры составляет 30.10 микробных тел в б

1 мл среды. Стандартом служит препарат

Растворы стандартного и испытуемого препаратов готовят в соответствующих стерильных растворителях из расчета 1000 ЕД в 1 мл.или 1 мл, Испытуемые растворы пол20 учают разведением основного раствора (1 мл в 1 мл) до нужных концентраций, Чашки инкубируют при 36 — 38 в течение 16 — 18 ч. Диаметры угнетения зон роста тест-микроба, образуемые испытуемыми

25 концентрациями растворов стандартного и исследуемого препаратов, измеряют с возможно большей точностью. После измерения зон задержки роста для каждой концентрации выводят среднюю величину

30 зоны из 3 чашек, Также выводят среднюю величину контрольного раствора.

Тест-культуру Staphilococcus aureus

209Р засевают на чашки со средой МПБ (рН . 7,2 — 7,4) посевная доза микробных клеток

35 10000 на 1 мл среды Стандартным раствором служит К вЂ” соль пенициллина в концентрации 1 Ell в 1 мл.

С тест-микробом Eschet Ichia coli 675 активность определяют в среде. содержа40 щей панкреатический гидролизат мяса по

Хоттингеру, Посевная доза тест-культуры

Е.coli 675 составляет 30-10 микробных тел на 1 мл среды. Стандартом служит препарат блеомицетин в концентрации 805 ЕД в 1 мл.

45 Тест-микроб Bacillus subfilis АТСС

6633 засевают в среду. содержащую бульон

Хоттингера с содержанием 30 — 36 мг аминного азота. Микробная нагрузка тесткультуры 10 микробных тел в 1 мл среды.

50 Стандартом служит препарат блеомицетин в концентрации 3 мкг/мл.

Тест-культуру Candida albicaus засевают в сусло-агар с микробной нагрузкой

800000 микробных тел в 1 мл среды. Стан1787440 карбвнициллин в концентрации 65 мкг в 1 мл, Экстракт хвои густой оказывает бактерицидное воздействие на грамположительную флору. Так зона угнетения Sf.aureus 209

P К-солью пенициллина — 21 мм (берем за

100 /). то экстракта хвои густого концентрацией от 50 — 100 мг/мл — 14 мм (66,6 от величины зоны угнетения стандартом). Зона угнетения тест-культуры Вас,subtilis АТСС блеомицетином — 18 мм (берем за 100о ), то у экстракта хвои густого концентрацией от

50 — 100 мг/мл — 16 — 17,5 мм (88,8 — 97% от величины зоны угнетения стандартом).

Экстракт хвои густой оказывает бактерицидное воздействие на грамотрицательные бактерии Pseudomonas aeruginosa,òàê как ее зона угнетения тест-культуры карбенициллином — 15,0 мм (берем за 100 ), а экстракта хвои густого концентрацией от 50 до 100 мг/мл — 14-15 мм (80 — 100% от величины зоны угнетения стандартом), Экстракт хвои густой не действует на грамотрицательные бактерии Е.coll так как он не давал зоны угнетения роста тест-культуры, а стандарт блеомицетин дал зону угнетения — 18 мм.

Экстракт хвои густой не действует на грибки рода Candida albicaus, так как он не давал зоны угнетения роста тест-культуры, а стандарт нистатин дал зонуугнетения — 14 мм, По результатам, приведенным в табл. 1 видно, что экспериментальная язва желудка заживает быстрее под воздействием экстракта хвои густого и облепихового масла.

Так, на 5 день лечения по сравнению с контролем, язвенный индекс во 2 группе, получавшей экстрактхвои густой, меньше в1,65 раза, в 3 группе, получавшей облепиховое масло, в 1,83 раза меньше. На 20 день лечения язвенный индекс по сравнению с контролем меньше во 2 группе в 2,11 раз, а в 3 группе в 2,7 раза меньше.

Репаративное воздействие экстракта хвои густого сопоставимо с облепиховым маслом, Так, язвенный индекс под влиянием экстракта хвои густого уменьшился с 5 по

20 день лечения почти в 3 раза, т.е, íà 66% (р < 0,001), а под влиянием облепихового

5 масла с 5-го по 20-й день лечение в 3,4 раза, т.е, на 70,5 (р < 0,001).

Как показывают результаты исследования, приведенные в табл. 2, экстракт хвои густой оказывает бактерицидное воздейст10 вие на грамположительную флору. Так, если зона угнетения тест-культуры Sf.aureus

209Р К-солью пенициллина — 21 мм (берем за 100%), то экстракта хвои густого концентрацией от 50 до 100 мгlмл — 14 мм (66,6о

15 OT величины зоны угнетения стандартом), Зона угнетения тест-культуры Bac.subtilis

АТС с блеомицетином — 18 мм (берем за

100 ), то у экстракта хвои густого концентрацией от 50 до 100 мг/мл — 16 — 17,5 мм

20 (88,8 — 97;1% от величины зоны угнетения стандартом).

Экстракт хвои густой оказывает бактерицидное воздействие на грамотрицательные бактерии Pseudomonas aeruginosa, Так, 25 ее зона угнетения тест-культуры карбенициллином — 15,0 мм (берем за 100 ), а экстракта хвои густого концентрацией от 50 до

100 мгlмл — 14 — 15 мм (80 — 100 от величины зоны угнетения стандартом).

30 -Экстракт хвои густой не действует на грамотрицательные бактерии Е,coll, так как он не давал зоны угнетения роста тест-культуры, а стандарт блеомицетин дал зону угнетения — 18 мм.

35 Экстракт хвои густой не действует на грибки Candida albicaus, так как он не давал зоны угнетения роста тест-культуры, а стандарт нистатин дал зону угнетения — 14 мм.

Формула изобретения

40 Применение экстракта хвои густого в качестве вещества, обладающего репаративным действием на язву желудка и антибактериальной активностью в отношении грамположительных бактерий и

45 Pseudomonas aeruginosa.

1787440

Таблица1

Сравнение репаративного действия экстракта хвои густого на модели хронической ацетатной язвы" со стандартным препаратом - облепиховым маслом

Язвенный ин екс

Число животных

Условия опыта

0,001

0,001

Лечебное действие на

10 день

0,001

0.001

Лечебное действие на

20 день

0,001

0,001

Таблиц а2

Сравнение антибактериального действия экстракта хвои густого со стандартными антибактериальными препаратами

001

01

Лечебное действие на 5 день

1.Контроль

2.Экстракт хвои густой

3. Облепиховое масло

1.Контроль

2.Экстракт хвои густой

3. Облепиховое масло

1.Контроль

2.Экстракт, хвои густой

3. Облепиховое масло

9

9

64,5 ч 5,1

39,2 +34

35,3 +4,2

52,8 6,1

29,0 + 4,6

25,4+ 3,2

28,1 5,2

13.3 + 2,1

104+ 09

1787440

12 1родолжение табл. 2

candida

albicaus

Е. coll 675 я. aureus 209 р

Bac. subtilis

АТСС 6633

Иссpseudomonas

aeruginosa ледуемый и репаат зона угнетения, мм ния, мм ния, мм

805ЕД 18,0 мл

0,001

3 мкг/

1 8,0

3. Нистатин!

40ЕД/ 0,001,15,0

65мкм мл

0,001

15

25

Составитель А,Агурив

Техред М,Моргентал Корректор О,Хрипта

Редактор

Заказ 21 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушскэя наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

2. Блеомицетин концентрация, мг/мл зона угнетения, мм концентрация, мг/мл зона угнетеконцентрация, мг/мл зона угнетекон- зона цент- угнерация, тения, мг/мл концентрация, мг/мл