Способ дифференциальной диагностики системной красной волчанки и острого бактериального воспаления

 

Использование: изобретение может быть использовано в терапии для дифференцирования системной красной волчанки и острого бактериального воспаления. Цель: ускорение и повышение точности способа. Сущность изобретения: у пациента исследуют НСТ-реакцию моноцитов крови при добавлении в нее гепарина и добавлении цитрата натрия и, сравнивая процентное содержание НСТ-положительных клеток в первом и втором вариантах проб, проводят диагностическое дифференцирование. Положительный эффект: на проведение теста требуется всего 1,0-1,5 ч, он является весьма специфическим и чувствительным.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) (si)s G 01 N 33/80

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ф

Ос

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4868930/14 (22) 25.09.90 (46) 15.01,93, Бюл, N 2 (71) Казанский государственный институт усовершенствования врачей им. В.И.Ленина (72) М,И,Арлеевская, О,Е.Тихонов и А.П.Шибулькин (56) Демина А.А., Матрохина В.Е, Терапевтический архив, 1984, ¹ 11, с, 44-99, (54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАККИ И ОСТРОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО

ВОСПАЛЕНИЯ

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики системной красной волчанки (СКВ) и острого бактериального воспаления (ОБВ).

В практике довольно часто возникает необходимость в дифференциальной диагностике аутоиммунного и острого бактериального воспаления, Речь идет прежде всего о синдроме лихорадки неясного генеза и часто сочетающихся с ней общих симптомах слабости, недомогания, потери массы тела, "воспалительных" сдвигах в крови.

Считают, что в основе синдрома чаще всего — в 75% случаев — оказывается "большая тройка"; инфекция (в 40 случаев), опухоли (в 20%), коллагено. ы (15%), причем из коллагенозов на первом месте стоит СКВ (Бочоришвили В,Г, и соавт. Вестн. хирургии.—

1989. — ¹J 8, — С. 107-110). Довольно часто трудности диагностики усугубляются необходимостью быстрого выбора адекватной терапии; так, при одном из заболеваний

"большой тройки" - молниеносном сепси(57) Использование: изобретение может быть использовано в терапии для дифференцирования системной красной волчанки и острого бактериального воспаления. Цель: ускорение и повышение точности способа.

Сущность изобретения: у пациента исследуют НСТ-реакцию моноцитов крови при добавлении в нее гепарина и добавлении цитрата натрия и, сравнивая процентное содержание НСТ-положительных клеток в первом и втором вариантах проб, проводят диагностическое дифференцирование. Положительный эффект: на проведение теста требуется всего 1,0 — 1,5 ч, он является весьма специфическим и чувствительным. се -оптимальный срок постановки диагноза и назначения лечения — 8 ч, допустимый—

24 ч (Бочоришвили В.Г, и др. Вестн,хирургии. — 1989. — ¹ 8, — С. 107 — 110), при этом заболевание своевременно диагностируется лишь в 8,08% случаев, Диагностический алгоритм при синдроме лихорадки неясного генеза предполагает следующий набор лабораторных исследований для исключения аутоиммунного заболевания (СКВ) и острого бактериального воспаления. Методы объединены нами е две группы. Ю

В первую группу входят исследования общего анализа мочи с окраской осадка по

Граму, общего анализа крови с подсчетом тромбоцитов, белковых фракций.

Во вторую группу входят посевы крови и мочи на стерильность, определение антинуклеарных факторов (АНФ), антител к нативной ДНК, поиски Le -клеток, биопсия поврежденных тканей.

Методы первой группы достаточно просты, общедоступны и позволяют быстро

1788468 получить результаты, однако они малоспецифичны. Так, лейкоцитоз считается характерным признаком бактериального воспаления, однако он обнаруживается лишь у 20 больных, почти так же часто — в

17,5 случаев обнаруживается лейкопения, более характерная для СКВ. При сепсисе часто встречаются такие специфические для

СКВ признаки, как анемия (в 68 случаев), лимфопения — в 87 случаев, В то же время при CKB гематологический синдром, являющийся одним из диагностических критериев заболевания, обнаруживается у 59 больных, в частности, анемия — в 75 случаев, лейкопения — в 50 случаев, (чаще лимфопения, реже — гранулоцитопения), тромбоцитопения — лишь в 30 случаев. Ускорение

СОЭ при СКВ отмечается в 100 случаев, при сепсисе в 87, Исследование мочи также малоспецифично; так, волчаночный нефрит диагностируется значительно чаще не с помощью клинических методов исследования, а с помощью исследования биоптата почек.

Данные, полученные с помощью электрофореза белков сыворотки крови, "не вполне характерны" гипер- у-глобулинемия появляется в основном при хроническом течении СКВ, гипер- а -глобулинемия возникает как при острой СКВ (или обострении хронической), так и при ОБВ (при сепсисе— в 84,5 случаев). аа -глобулины, в том числе входящий в эту фракцию фибриноген, а также С-РБ — т.н, "белки острой фазы" — служат не для постановки диагноза, а для оценки тяжести патологиЧеского процесса (в т,ч, аутоиммунного и бактериального воспаления), Методы, отнесенные к второй группе, являются специфичными и служат для подтверждения диагноза либо аутоиммунного, либо бактериального воспаления, однако и они обладают некоторыми недостатками.

Так, специфичность их тоже не абсолютна. я -клетки при СКВ даже высокой степени активности и при развернутой картине болезни обнаруживаются в 70-80 случаев.

Тест на выявление АНФ обладает большей чувствительностью — 897,, однако специфичность умеренная — 78 (Клиническая иммунология и аллергология). АНФ обнаруживается у здоровых женщин, пожилых людей, появляются в крови при таких распространенных ситуациях, как прием антибиотиков; антиритмиков, противосудорожных и гипотензивных препаратов, причем появляются они и при атипично протекающем инфекционном процессе (Gale А. Mc. Carty // Ап и, Allergy, — 1985, — v.

25, трехкратные посевы крови — каждый посев

35

55

55 — 1Ф 3. — Р, 421-435). При использовании иммунофлуоресцентного метода доля ложноположительных результатов составляет

4 (там же). Le -клетки по наиболее пессимистическим заключениям обнаруживаются при 30 заболеваниях, в том числе не относящихся к аутоиммунным. Тест на определение антител к нативной ДНК наиболее специфичен для CKB (98 ), однако чувствительность его составляет всего 38 .

Методы исследования иммунологических показателей обладают еще одним недостатком — они трудоемки (исследование

Ls -клеток, определение АНФ иммунофлуоресцентным методом), дорогостоящи (РИМ), требуют специально оборудованных лабораторий и поэтому доступны только специализированным клиникам.

Посевы крови и мочи для определения стерильности, сделанные однократно, могут дать положительные результаты при аутоиммунной патологии вследствие преходящих бактериемии и бактериурии. В то же время даже при явном сепсисе повторные в парные среды могут не выявить бактериемию в 30 случаев.

Существенным недостатком бактериологического исследования является и его длительность — на него уходит от 4 до 20 дней, тогда как состояние больного часто требует немедленного вмешательства.

Для выполнения черезвычайно информативного исследования — исследования биоптата пораженных тканей — также требуется не менее 3 — 4 дней.

Таким образом, для дифференциальной диагностики CKB u OEB применяются либо быстро выполнимые, доступные, однако, к сожалению, малоспецифичные, либо высоко специфичные исследования, требующие однако значительных затрат времени, труда, а также специально оснащенных лабораторий, дорогостоящего оборудования и реактивов.

Следует отметить также, что кроме случаев синдрома лихорадки неясного генеза необходимость в дифференциальной диагностике CKB и ОВВ возникает при развитии пневмонитов, а также абдоминального синдрома у больных с СКВ, Клиническая иммунология и аллергология. Под ред. Г!.Йегера.—

1990). В последнем случае приходится решать трудный вопрос о наличии у больного острой хирургической патологии.

Цель — создание метода дифференциальной диагностики СКВ и ОВВ, сравнимого по специфичности и чувствительности (и даже более чувствительного) с методами, обь1788468

45 моноцитов;

55 единенными нами во вторую группу, и в то же время позволяющего быстро получить ответ и такого же дешевого, простого и общедоступного, как методы первой группы.

Поставленная цель достигается тем, что определяется состояние моноцитов периферической крови с помощью НСТ-теста в присутствии гепарина и в присутствии цитрата натрия и вычисляется соотношение долей (в ) НСТ-положительных клеток в гепаринзависимом (Г) и в цитратном (Ц) вариантах теста, при соотношении Г > 4Ц вЂ” 33 предполагается СКВ, при соотношении Г <

< 4Ц вЂ” 33 — острое бактериальное воспаление.

Техническое решение соответствует критерию "положительный эффект", т.к. предлагаемый тест позволяет ускорить диагностику, при этом он при одинаковой специфичности более чувствителен, чем наиболее специфичный из используемых показателей (наличие антител к нативной

ДНК), в то же время простота и дешевизна метода делают его общедоступным.

В основе способа лежит методика постановки НСТ-теста Park В.Н. и соавт. в модификации M,Å,Âèêñìaíà и А.Н.Маянского (Виксман M,E„Ìaëícêèé А.Н. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия. Внесены следующие изменения: тест ставится одновременно в двух вариантах — со стабилизацией крови раствором гепарина активностью

100 ед/мл и со стабилизацией крови 3,8 ным раствором цитрата натрия; раствором гепарина обмываются микропипетки и лунки планшета, раствором цитрата натрия также обмываются микропипетки перед взятием крови, затем его добавляют в лунки планшета в соотношении с кровью 1:9; в мазке крови вместо нейтрофилов подсчиты ва ют кол иче ство Н СТ-пол ожител ь н ых моноцитов на 100 попавших в поле зрения конечный результат определяется соотношением долей (в ) НСТ-положительных моноцитов в гепаринзависимом (Г) и цитратном (Ц) вариантах теста. Способ оценки результатов будет приведен ниже.

Перед взятием крови стенки микропипеток и лунки планшета для серологических реакций обрабатывают стабилизатором крови (цитрат натрия, гепарин), Палец обрабатывают смесью спирт-эфир и делают обычный прокол. Первую каплю крови удаляют, затем набирают в две микропипетки (цитратную и гепариновую) и вносят в соответствующие лунки по 0,05 мл крови. Добавляют 0,05 мл изотонического фосфатного

40 буфера и 0,05 мл 0,2 раствора НСТ, Плавными круговыми движениями кровь тщательно перемешивают, планшет покрывают фильтровальной бумагой, смоченной в фосфатном буфере, и сверху оргстеклом и ставят в термостат на 30 минут. После инкубации содержимое лунок вновь перемешивают и готовят мазки средней плотности, которые, высушив на воздухе, фиксируют 5 мин в метаноле и красят 7 мин метиловым зеленым. Учет результатов проводят как указано.

Воспаление аутоиммунной и бактериальной природы, как типовая патологическая реакция, развивается согласно определенным общим законам независимо от факторов, его вызвавших . Очерки патологии и экспериментальной терапии, — М., 1979). Этим объясняется наличие общих клинических и лабораторных признаков, обуславливающих необходимость дифференциальной диагностики двух видов воспаления. Однако, учитывая разницу в их патогенезе, можно предположить существование некоторых различий в функциональной активности клеток и систем организма при аутоиммунной и острой бактериальной патологии.

Так, в аутоиммунной и бактериальной воспалительных реакциях активно участвуют моноциты — макрофаги, однако характер участия этих полифункциональных клеток в развитии двух видов патологии различен.

При воспалении бактериальной природы мононуклеарные фагоциты прежде всего участвуют в фагоцитозе и переваривании микробов и продуктов распада тканей и лишь на более поздних этапах процесса взаимодействуют с лимфоцитами при выработке специфического ответа на чужеродный агент, а затем с фибробластами при формировании рубца.

При аутоиммунных заболеваниях ревматического круга ведущим является участие моноцитов — макрофагов в межклеточных взаимодействиях, приводящее к подавлению функции Т-супрессоров, активации В-лимфоцитов и T-хелперов, избыточному синтезу коллагена фибробластами; причем эти процессы развиваются уже в самом начале болезни, иногда до появления клинических симптомов. Относительно меньшее значение имеет участие этих клеток в фагоцитозе, к тому же эти реакции носят более локальный характер.

С целью выявления различий в состоянии кислородного метаболизма моноцитов периферической крови при аутоиммунном и остром бактериальном воспалении нами исследовалась спонтанная НСТ-реакция кле1788468

20

30

55 ток в цитратном и гепаринзависимом вариантах теста у 181 больной классическим ре матоидным артритом (PA), 8 больных системной склеродермией (ССД), 28 больных СКВ, 25 больных ОБВ. Контролем служили 23 донора и 10 больных с деформирующим остеоартрозом, осложнившимся синовитом (ДОА).

Диагноз СКВ ставился в соответствии с критериями APA (Насонова В.Н. Системная красная волчанка. — M„1972). В группу вошли 27 женщин и 1 мужчина с достоверной и вероятной СКВ с давностью болезни от недели до 20 лет. У мужчины диагноз подтвержден на вскрытии, У 20 (73,3%) человек болезнь носила первично-хронический характер, у 5 (16,7%) — подострый, у 3 (10%) больных, начавшись остро, за время наблюдения под влиянием терапии приняла хроническое течение. В 9 случаях (33,3%) активность процесса соответствовала I степени, в 15 (53,4%) — II, в 4 (13,3%) — III степени, В группу больных с ОБВ вошли пациенты с сепсисом, острым пиелонефритом, острой хирургической патологией, осложнившейся перитонитом.

Для каждой из групп обследованных были сосчитаны выборочные средние (Mr и

Мц) и стандартные отклонения (Яц и Яг) показателей активности моноцитов в гепаринзависимом (Г) и цитратном (Ц) вариантах спонтанного НСТ-теста, а также выборочные коэффициенты корреляции (г) между значениями Г и Ц, Обнаружилось, что, во-первых, гепарин активируют моноциты у всех обследованных, во-вторых, существует три вида реакции клеток: при обменно-дистрофическом процессе с реактивным воспалением (ДОА) в обоих вариантах теста их активность не отличается от нормальной (рг > 0,05, pu >

0,05); при ОБВ оба варианта теста свидетельствуют об активации мононуклеарных фагоцитов (р «0,002); при аутоиммунном воспалении избыточная активность кислородного метаболизма моноцитов проявляется только в присутствии гепарина у больных PA (рг < 0,002, рц > 0,05) и преимущественно при контакте с гепарином у больных с СКВ (рг < 0,002, рц < 0,01) и с ССД (pr < 0,002, рц < 0,002), В последних двух группах активность клеток в цитратном тесте хотя и является достоверно более высокой, чем в норме, но фактически речь идет о разнице в 2 — 3%, в то время как ошибка метода составляет 2%.

Таким образом, обнаружены существенные различия в состоянии кислородного метаболизма моноцитов больных с ОБВ и с аутоиммунной патологией, На основании этих различий выработан критерий для дифференциальной диагностики ОБВ и СКВ.

Индивидуальные значения Г и Ц наносят на плоскость. По вертикальной оси откладывали значения Г, по горизонтальной— соответствующие им значения Ц. Приведены эллипсы рассеивания, отражающие местоположение индивидуальных показателей для двух групп (ОБВ, СКВ). Центральные точки эллипсов точки с координатами, равными средним значениям Г и Ц. Размеры и наклоны эллипсов отражают значения стандартных отклонений и коэффициентов корреляции. В дальнейшем характеристики, полученные в предположении, что показатели Г и Ц удовлетворяют двумерному нормальному распределению с параметрами, совпадающими с выборочными значениями, будем называть теоретическими, а найденные непосредственно по выборочным данным — эмпирическими. Отметим, что теоретические вероятности попадания значений Г и Ц в построенные эллипсы равны

86,5%.

Далее построили прямую, наилучшим образом разделяющую области, в которых сосредоточены показатели Г и Ц двух групп, — дискриминантную прямую. Она описывается уравнением Г = 4Ц вЂ” 33. Диагностический критерий, основанный на прямой, состоит в следующем: если у больного для показателей Г и Ц выполнено условие Г >

> 4Ц вЂ” 33, это свидетельствует в пользу СКВ, если Г < 4Ц вЂ” 33, то — в пользу ОБВ.

Критерий обладает высокой специфичностью и чувствительностью при определении как ОБВ, так и СКВ, его информативность — 0,93.

П ример, Больная Герасименко,37лет, поступила в терапевтическую клинику ГИДУВа в связи с ежедневными подъемами температуры до 38 С без ознобов, а также в связи с похуданием на 10 кг в течение месяца, арталгиями, выраженными миалгиями, множественными розеолезными высыпаниями до 5 мм на коже груди, спины, предплечий, Заболела за месяц до поступления в клинику после вторых нормальных родов.

После первых родов 6 лет назад были арталгии. Кроме указанных выше симптомов обнаружено увеличение подмышечных и паховых лимфоузлов, а также печени и селезенки. Лабораторные данные: Нв10,4 r/ë, эритроциты — 3,28 10 в 1 л, лейкоциты — 5,8 10 в 1 л, лейкоформуg ла; э — 0%, п/я — 16%, с/я — 60%, мон.—

S%, лимф, — 16%, СОЭ вЂ” 28 мм/ч, тромбоциты — 230400, формоловая проба отрицательная, ревматоидный фактор и L е -клетки не обнаружены, протеинограмма без отклоне1788468

50

Составитель М.Арлеевская

Техред М.Моргентал Корректор Э.Лончакова

Редактор

Заказ 71 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 415

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 ний, в моче-0,33% белка. Посеяна кровь на стерильность, Гинеколог патологии не обнаружил.

Клиническая картина болезни не позволяла однозначно высказаться ни в пользу 5

СКВ, ни в пользу сепсиса.

Спонтанный НСТ-тест: гепаринзависимый — 25% активных моноцитов, цитратный — 22%, т.е. Г < 4Ц вЂ” 33, результаты теста свидетельствуют в пользу ОБВ. Проводив- 10 шаяся ех juvantlbus эффективная терапия антибиотиками и полученные позднее положительные результаты посева крови на стерильность подтвердили наличие сепсиса.

Таким образом, предлагается критерий 15 для дифференциальной диагностики аутоиммунного (СКВ) и острого бактериального воспаления. Критерий основан на различиях в функциональном состоянии моноцитов, которые, вероятно, связаны с особенностя- 20 ми патогенеза этой универсальной патологической реакции, зависящими от причин ее возникновения.

По своей специфичности тест конкурирует и даже превосходит наиболее диагно- 25 стически ценные лабораторные методы, применяемые для дифференциальной диагностики двух групп заболеваний (исследование биоптата пораженных тканей, посевы мочи и крови на стерильность, определение 30

АНФ и антител к нативной ДНК). При этом для исследования биоптатов тканей, мочи и крови на стерильность требуется не менее

3-4 дней, для выполнения предлагаемого теста — 1-1,5 ч, что является его достоинст- 35 вом, так как состояние больного часто требует быстрого назначения адекватной терапии (иногда в течение 8-24 ч от начала болезни). Исследования АНФ и антител к нативной ДНК проводятся в течение нескольких часов, однако их чувствительность ниже чувствительности предлагаемого теста (при СКВ АНФ находят в 89% случаев, антитела к нативной ДНК вЂ” в 38% случаев, чувствительность предлагаемого теста для

ОБ  — 96%, для СКВ -96,4%), Следует отметить также, что выполнение указанных методов требует специально оснащенных лабораторий, дорогостоящего оборудования и реактивов, специально обученных лаборантов. Для выполнения предлагаемого теста требуются термостат, световой микроскоп, доступные и дешевые реактивы (нитросиний тетразолий производства НПКО

"Реакомплекс", г. Чита), тест может выполняться в условиях клинической лаборатории в любом неспециализированном медицинском учреждении.

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики системной красной волчанки и острого бактериального воспаления, включающий морфологическое исследование крови, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, исследуют

НСТ-реакцию моноцитов в гепаринизированной пробе крови и пробе цитратной крови, определяют уровень -в процентах

НСТ-положительных клеток в первом и втором вариантахтеста и при условии Г>4Ц-33 диагностируют системную красную волчанку, а при условии Г < 4Ц-33 — острое бактериальное воспаление, где à — процент

НСТ-положительных клеток в гепаринизированной крови; Ц вЂ” то же в цитратной крови.