Способ супрессии иммунного ответа

 

Использование: медицина, биология для подавления формирования гуморального иммунного ответа (ГИО) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в экспериментальных исследованиях на животных . Сущность изобретения: трехкратно внутрибрюшинно вводят сингенные прогретые эритроциты, обработанные папаином в дозе 10 мкг. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

llO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ у

2 (21) 4847748/14 (22) 02.07.90 . (46) 30.05.92. Бюл. М 20 (71) Курский государственный медицинский институт (72) Л.Г,Прокопенко и Л.Е.Сипливая (53) 612.015(088.8) (56) Г,А.Космидиади,Григорьева П.П., Голубцов Г.М,. Влияние инъекций папаина на иммунологическую реактивность больных остеохондрозом позвоночника, — Применение протеолитических энзимов растений

Carica Fapaua (лекозим, лекопаин) в широкой медицинской практике, M„1978, с. 67 — 71.

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для подавления формирования гуморального иммун ного ответа (ГИ 0) и ги перчувствител ьности замедленного типа (ГЗТ) в экспериментальных исследованиях на животных, Известно применение имммунодепрессивных средств, например циклофосфана, азатиоприна, 5-фторурацила, метотрексата в качестве препаратов, подавляющих формирование ГИО, Однако применение иммунодепрессивных средств вызывает нежелательные побочные эффекты, в том числе лейкопению, лимфопению, агранулоцитоз, нарушение функции печени, Известно влияние инъекции папаина на иммунологическую реактивность больных остеохондрозом позвоночника.

Однако при введении протеолитических ферментов (папаина) могут наблюдаться отрицательные побочные эффекты; изменение свертываемости крови, аллергические реакции. (s1>s G 01 N 33/80, 33/48, А 61 В 5/00 (54) СПОСОБ СУПРЕССИИ ИММУННОГО

ОТВЕТА (57) Использование; медицина, биология для подавления формирования гуморального иммунного ответа (ГИО) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в экспериментальных исследованиях на животных. Суц1ность изобретения; трехкратно внутрибрюшинно вводят сингенные прогретые эритроциты, обработанные папаином в дозе 10 мкг, 2 табл.

Целью изобретения является повышение физиологичности способа за счет снижения побочных эффектов.

Цель достигается тем, что животным перед иммунизацией трехкратно с интервалом 24 ч внутрибрюшинно в дозе 2 10 клеток на 100 г массы тела вводили сингенные эритроциты, предварительно прогретые в течение 15 мин при 42 С и обработанные папаином в дозе 10 мкг. Первую инъекцию при трехкратном введении сингенных эритроцитов проводили в день введения сенсибилизирующей дозы антигена, Для изучения развития ГИО антиген, например эритроциты барана (ЭБ), вводили в дозе (1,9-2,1)-10 клеток на 100 г массы тела.

Через 5 дней после введения антигена животных умерщвляли под эфирным наркозом и в селезенке определяли количество клеток, образующих антитела к ЭБ (АОК), и клеток, образующих розетки с ЭБ (POK).

Для изучения ГЗТ сенсибилизирующую дозу эритроцитов (10 клеток в 0,3 мл

1737341

0,15 M хлористого натрия) вводили внутрибрюшинно. Через 4 сут вводили разрешающую дозу эритроцитов (10 клеток в 0,1 мл

0,15 M хлористого натрия) в подушечку правой лапки задней конечности. В подушечку левой лапки вводили 0,1 мл 0,15 M хлористого натрия, Выраженность ГЗТ определяли через сутки после введения разрешающей дозы ЭБ по разнице веса и количества карриоцитов регионарного и контралатерального лимфатических узлов.

Наибольшим иммуносупрессорным эффектом обладают сингенные эритроциты, прогретые 15 мин при 42 С, обработанные папаином (доза 10 мкг) и введенные трехкратно, внутрибрюшинно, в разовой дозе 2.

10 клеток на 100 г массы тела.

Пример 1, Эритроциты интактных крыс обрабатывали папаином по следую8 щей схеме: к,15 мл осадок эритроцитов (25 10 клеток) добавляли 1 мл раствора фармацевтического препарата папаина, содержащего 10 или 50 мкгактивного вещества, и инкубировали в термостате при 37 С в течение 3 ч, встряхивая каждые 0,5 ч. Затем эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором и центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин, Сингенные эритроциты, обработанные папаином, вводили однократно или трехкратно с интервалом 24 ч внутрибрюшинно в дозе 2 10 клеток на 100 г массы

8 тела здоровым крысам. В последний день введения сингенных эритроцитов животных внутрибрюшинно иммунизировали ЭБ в дозе 2 10 клеток на 100 г массы тела. Через 5 дней курс умерщвляли и определяли в селезенке количество АОК и РОК, О степени подавления иммунного ответа судили по сравнению с соответствующими показателями контрольных групп животных, получивших однократные или трехкратные инъекции нативных эритроцитов.

Для изучения ГЗТ сингенные эритроциты, обработанные раствором папаина, содержащего 10 или 50 мкг активного вещества, вводили однократно или трехкратно внутрибрюшинно с интервалом 24 ч в дозе 2 10 клеток на 100 г массы тела здоровым крысам. В первый день введения сингенных эритроцитов животным внутрибрюшинно вводили сенсибилизирующую дозу ЭБ (10 клеток в 0,3.мл 0,15 М хлористого натрия). Через 4 сут в подушечку правой лапки задней конечности вводили разрешающую дозу эритроцитов барана (10 клеток в 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия). В подушечку левой лапки вводили 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия. О выраженности ГЗТ судили через сутки после введения разрешающей дозы ЭБ по разнице веса и внутрибрюшинно с интервалом 24 ч, в дозе

2 10 клеток на 100 г массы тела здоровым крысам.

40 В первый день введения сингенных эритроцитов животным внутрибрюшинно б вводили сенсибилизирующую дозу ЭБ (10 клеток в 0,15 мл хлористого натрия). Через

4 сут в подушечку правой лапки задней ко45 нечности вводили разрешающую дозу эритроцитов (10 клеток в 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия), Напряженность ГЗТ определяли через сутки после введения разрешающей дозы эритроцитов по разнице веса

50 и количества карриоцитов регионарного и контралатерал ьного лимфатических узлов, О степени подавления развития ГЗТ судили по сравнению с соответствующими показателями групп животных, получивших инъек55 ции нативных эритроцитов. . Полученные данные свидетельствуют о том, что введение сингенных прогретых эритроцитов не влияет на развитие ГИО и

ГЗТ по сравнению с контрольными группами (табл.1).

35 количеству ядросодержащих клеток регионарного и контралатерального лимфатических узлов.

Установлено, что как однократное, так и трехкратное введение нативных эритроцитов, обработанных папаином в дозах 10 или

50 мкг, не приводит к достоверному изменению показателей ГИО и ГЗТ по сравнению с группами животных, получавших инъекции нативных необработанных эритроцитов (табл.1).

Пример 2. Эритроциты интактных крыс прогревали в термостате по следующей схеме: 0,15 мл осадка эритроцитов взвешивали в 1 мл среды 199 и прогревали

15 мин при 42 С. После прогревания эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором и центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин.

Для изучения развития ГИО сингенные прогретые эритроциты вводили однократно или трехкратно с интервалом 24 ч внутрибрюшинно в дозе 2 10 клеток на 100 г массы

8 тела здоровым крысам. В последний день введения сингенных эритроцитов животных внутрибрюшинно иммунизировали ЭБ в дозе 2 10 клеток на 100 г массы тела. Через 5 дней крыс умерщвляли и определяли в селезенке количество АОК и POK. О степени подавления иммунного ответа судили по сравнению с соответствующими показателями контрольных групп, получавших однократно или трехкратно инъекции нативных эритроцитов. Для изучения влияния на развитие ГЗТ сингенные прогретые эритроциты вводили однократно или трехкратно

1737341

Пример 3. Эритроциты интактных крыс прогревали в термостате по схеме (см. пример 2), трижды отмывали физиологическим раствором, центрифугировали при

2500 об/мин в течение 15 мин, Затем про- 5 гретые эритроциты обрабатывали раствором папаина, содержащего 10 или 50 мкг активного вещества по схеме(см. пример 1).

Выраженность ГИО оценивали по количеству АОК в селезенке по сравнению с со- 10

oTBåTñTBóþùèMè показателями групп животных, получивших нативные эритроциты, сингенные эритроциты, обработанные папаином, или эритроциты, подвергнутые прогреванию, О напряженности ГЗТ судили 15 по разнице веса и количеству карриоцитов регионарного и контралатерального лимфатических узлов по сравнению с контрольными группами.

il ри испол ьзован ии и редла гаемой мо- 20 дели следует избегать изменения доз папаина, т.к, низкая доза папаина 0,1 и 1 мкг не вызывает иммуносупрессорного эффекта; высокая доза папаина 100 и 150 мкг в отдельных случаях может вызвать стимуля- 25 цию иммунного ответа за счет пирогенного эффекта (1,2 — 1,5% случаев), Перегревание эритроцитов (45 15 мин или 42 25 мин) вызывает значительный гемолиз эритроцитов и, как следствие, отсут- 30 ствие иммуносупрессорного эффекта (табл.2). Эффективность прецлагаемой мог Док, тыс/орган

Условия опыта

7,2+1,6

9,7ч2,1

41,5+4,9

25, 7+2,4

27,1+3,2

",,4+1,8

9,5+1,9

44,0+ 55,3

10 3+2 4

7,7+1,6

45,6+5,7

28,3+3,4

9,4+2,4

40,2+-4,6 7,0+1,3

24,0+2,5

8,84-1,8

23,6 -2,4 39,7+4,1 7,1+1,5

25,1+4,0, 39,6+4,7 6,9+1,8

10, 1+ 1,9

4,,8i, l

9, 1 -1, 2

?6,2+3 1

7,3 2,0

10,4 2,2

7,5+1,4

42,8+4,3

27,8+3,3

9,4 1,7

7,6 1,6

43, 44-4, 5

6,6+1,2+

18,5+2,!11 32,5+3,9 4,"+0,8»

Контроль (без введения нативных зритроцитов) Однократное введение нативных эритроцитов

Трехкратное введение нативных зритроцитов

Однократное введение эритроцитов, обработанных папзином в дозе 10 икг

Трехкратное введение эритроцитов, обработанных пзпаинои в дозе 10 икг

Однократное введение эритроцитов, обработанных папаинои в дозе 50 мкг

Трех"ðàòíîå введение эритроцитов, обработанных папаинои в дозе 50 мкг

Однократное введение прогретых эритроцитов

Трехкратное введение прогретых эритрэцитов

Однократное введение прогретых эритроцитов, обработанных папаином в дозе !О икг дели супрессии иммунного ответа 98—

98,5%.

Таким образом установлено, что максимальный иммуносупрессорный эффект наблюдается при трехкратном введении сингенных прогретых эритроцитов, обработанных папаином в дозе 10 мкг (табл.1).

Результаты исследования показали, что трехкратное введение прогретых сингенных эритроцитов, обработанных папаином, ингибирует не только развитие ГИО, но в значительно большей степени угнетает развитие ГЗТ,.что может способствовать значительному подавлению аллергических процессов в организме. Способ угнетения формирования иммунного ответа не вызывает вредных побочных эффектов, прост в исполнении, не токсичен и стабилен в получении результатов, Формула изобретения

Способ суп рессии иммунного ответа путем введения в организм животного иммунодепрессанта, отличающийся тем, что, с целью повышения физиологичности способа за счет снижения побочных эффектов, в качестве иммунодепрессанта используют син генные эритроциты, предварительно обработанные папаином в дозе 10 мкг на 0,15 мл осадка эритроцитарной массы, причем эритроциты вводят внутрибрюшинно трехкратно с суточным интервалом.

Ta6"",è à 1

РОК, 1 Разница массы, Разница количестмлн/оргач иг ва кариоцитов

1737341

РОК, Разница массы, Разница количест млн/орга". мг ва кариоцитов

Условия опыта

Трехкратное введение прогретых эритроцитов, обработанных папаином в дозе 10 мкг

10,61.1,4 18,4+2,2 1,7+0,5»

»-»

2,6+0,9

Однократно= ввсдение прогретых эритроцитов, обработанных папаином в дозе 50 мк>-, 35>313,1 6,111,2

„ 1.

7,3 1,8

21,2 1,9

Трехкратное введснис эритроцитов, обработанных папаином в дозе 50 мкг

6,4+1,7

5 2 1 4

31,4+2,9

20 >1 1,8

П р и м е ч а н и е. 1. Каждая средняя получен" на 10 крысах.

2. Значками т и обозначена существенность отличий средних (с вероятностью 95 „) по сравнению с группами >, 8, 12 соотвественно.

Таблица 2

Условия опыта

АОК > РОК, тыс/орган млн/орган

М и и/1 Контроль (введение нативных эритроцитов) 28,3 3,4 45,6 5,7 7,7+1,6

10,3+2,4

7,9+2,1

41,8+6,1

11,2 2,6

27,3+3,4

42,8+6,4

7,8+2,8

26,8» 4,6

10,8+3,1

37,8 6,8 (1,5 случаев) 16,814,1

58,9+6 1

8,8 2,4

61,?+6, D 9,2+3,1

17,9+4, 1

39,4+5,8 (124 случаев) 44,6+5,1 7,0 -1,4 10,1+3.1

26,8+2,8

P. р и м е ч а н и я. 8 каждой группе использовано 10 животных. Стимуляция иммунного ответа в 4 и 5 гр. отмечена у 1,5"1,2ь используемых животных.

Составитель А.Агуреев

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Л.Бескид

Редактор М,Циткина

Заказ 1887 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

2 Трехкратнбе введсние прогретых при 42 C 15 мин эритроцитов, обработанных папаином в дозе 0,1 мкг

3 Трехкратное введение прогретых при 42 С 15 мип эритроцитов, обработа".íûõ папаином в дозе 1 мкг

4 Трехкратное введение прогретых при 42 С 15 мин эритроцитов, обработанных папан ом в дозе 100 мкг

5 Трехкратное введение ;,рогретых при 42 С 15 мин эритроцитов, обработанных папаином в дозе

150 мкг

6 . Трехкратнос введение эритроцитов, прогретых при. 45 С 15 мин и обработанных папаином в дозе l0 мкг

"А,К

1 тыс/орган

Разница массы, Разница количества лимфоузлов, карриоцитов в лиммг фоузлах, 1 106