Штамм бактерий bacillus амylоliquеfасiеns-продуцент @ - амилазы bacillus liснеnifоrмis

 

Использование: биотехнология, генетическая инженерия, микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: плазмиду рВАТАМ2. несущую ген термостабильнбй а-амилазы B.licheniformis, вводят в штамм В.amylollquefaclens ВКПМ В-4899, который лишен собственной мезофильной а -амилазы. Полученный штамм-продуцент ВКПМ В-5208 при культивации на промышленных средах выделяет значительные количества термостабильной ог-амилазы. Поскольку кодирующая фермент плазмида рВАТАМ2 стабильно поддерживается в B.amyloliquefaciens, нет необходимости добавлять в среду антибиотик. Заявляемый продуцент секретирует в среду а-амилазу в количестве 250-280 ед. ГОСТ/мл. Фермент по качеству не уступает препарату термостабильной а-амилазы фирмы Sigma с температурным оптимумом 90°С. 2 табл. ел с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 N 1/21

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4912479/13 (22) 18.02.91 (46) 15.01.93. Бюл. N. 2 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) B.Á,Áaåâ, Д.Г.Попов. М.Н,Орлова, Ю.В.Йомантас, А.В,Сорокин, А.П.Болотин, Н.Ф.Рябченко. В.А.Народицкая, Ю.И.Козлов, В.Э.Стеркин, В.Г,Дебабов и Л,Д,Вольфович (73) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (56) M.Sibakov, Eur jorn. Bioch., ч.155, 1986, 577 — 581. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS

AMYL0LIQUEFACIENS-ПРОДУЦЕНТ аАМИЛАЗ Ы BACILLUS LI CHENIFORMIS

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и микробиологической промышленности и представляет собой штамм Bacillus

amyloIiquefaciens amy-, содержащий рекомбинантную плаэмиду, кодирующую синтез термостабильной а -амилаэы Bacillus

licheniaormls, — продуцент термостабильной а-амилаэы. а -Амилаза — фермент, разлагающий амилозную компонен"у крахмала, используется в пищевой промышленности для разжижения крахмал-содержащего сырья с целью получения глюкозо-фруктозных сиропов. Другое важное применение а-амилазы —.текстильная прОмышленность, где ее

„„SU „„1788966 АЗ (57) Использование: биотехнология, генетическая инженерия, микробиологическая промышленность, Сущность изобретения: плазмиду рВАТАМ2, несущую ген термостабильн0й а -амилазы В, licheniformis, вводят в штамм B.amyloliquefaciens ВКПМ В-4899, который лишен собственной мезофильной а -амилазы. Полученный штамм-продуцент

ВКПМ В-5208 при культивации на промышленных средах выделяет значительные количества термостабильной а-амилазы, Поскольку кодирующая фермент плаэмида рВАТАМ2 стабильно поддерживается в

В.amylollquefaciens, нет необходимости добавлять в среду антибиотик. Заявляемый продуцент секретирует в среду а-амилазу в количестве 250-280 ед. ГОСТ/мл. Фермент по качеству не уступает препаратутермостабильной а-амилазы фирмы "Sigma" с температурным оптимумом 90 С. 2 табл. используют для расшлихтовки тканей. Эти процессы протекают при весьма высоких температурах (до 105 С), что обуславливает необходимость повышения стабильности фермента при высоких температурах. Лучшими продуцентами бактериальных разжижающих а -амилаз являются в настоящее время штаммы Bacillus amylollquefaciens или штаммы Bacillus subxills. содержащие фрагмент ДНК, кодирующий а-амилазу из

Bacillus amyloliquefaciens. Однако, термоинактивация этой а -амилаэы происходит уже при температуре 70 С.

Известны штаммы-продуценты термостабильной а-амилазы ВасШиз subtilis, содержащие плаэмиду с геном а-амилазы

1788966

Bacillus llcheniformis. Однако использование таких штаммов в промышленности затрудняется относительно низкой продуктивностью, Штамм

В.amyloilquefaciens amy-Sm-(pBATAM2) (В5207) выбран в качестве прототипа. Этот штамм производит а-амилазу с необходимыми свойствами, «о обладает недостаточной продуктивностью секретируемой термостабильной а-амилазы. Именно поэтому. повыаение продукции термостабильной а -амилазы представляет собой важную задачу, Цель изобретения — повышение уровня продукции секретируемой термостабильной а-амилазы Bacillus licheniformis.

Поставленная цель достигается созданием нового штамма Bacillus

amyloliquefaciens amy-(рВАТАМ2) — продуцента термостабильной а -амилазы, имеющего регистрационный номер ВКПМ В-5208 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и секретирующего 220250 ед. активности фермента на 1 мл культуральной жидкости. Активность а-амилазы определяют, как описано в методике Госстандарта ГОСТ 20264. 4-74, Штамм продуцент Bacillus

amyloliquefaclens amy- (pBATAM2) (B-5208) получают путем введения рекомбинайтной плазмиды рВАТАМ2, которая кодирует синтез термостабильной а-амилазы

В.licheniformis, в протопласты бесплазмидного штамма Bacillus amyloliquefaciens

amy-(В-4899) известным методом трансформации (FEMC Mlcrobiol. Letters, 1988, ч,48, 101 — 105), Выбор штамма Bacillus

amylollquefaciens amy-ВКПМ (В-4899) обусловлен тем, что этот штамм имеет мутацию в гене мезофильной а-амилазы íà хромосоме и, соответственно, не сек,ретирует собственной активной а-амилаэы. Штамм может продуцировать только термостабильную аамилазу В.licheniformis, кодируемую введенной в штамм плазмидой рВАТАМ2.

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, размером 2,5 — 4,0 х 0,5 — 0,8 мкм, подвижные, грамположительные, спорообразующие.

Размер спор 1,0 — 1,2 х 0,6 — 0,7 мкм, Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептонном агаре, агаре Хоттингера — колонии шероховатые, круглые, матовые, желтова- то-серые, край неровный, лопастной, При росте в жидких средах; мясопептонном бульоне, LB-бульоне без аэрации образуют сухую пленку без помутнения среды, а при аэрации интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут при 20 — 45 С при оптимуме рН 6,8-7,5, В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: D-глюкозу, D-фруктозу, лактозу. Не усваивают ацетат, галактозу, 10 В качестве источника азота используют тона, аминокислот.

15 как минеральные соли в аммонийной форме, так и в органической форме в виде пепЖелатину разжижают.

Индол не образуют.

Уреазную активность не обнаруживает.

Пример 1, Конструирование штаммапродуцента Bacillus amyloliquefaciens amy(рВАТАМ2). (ВКПМ-5208).

20 Для трансформации B.amyloliquefaciens аау- плазмидой рВАТАМ2 используют метод, описанный Vehmaanpera J. (FEIVlS

Mlchrobiol Letters, 1988, v.49, 101). Трансформация . протопластов клеток

В.amylollquefaciens amy (В-4899) проводят следующим образом: 1 мл суспензии ночной культуры В.amyloliquefaciens amy вносят в 9 мл питательного бульона РС и выращивают до титра 10 кл/мл. Клетки собирают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин,20 С), 30 дважды промывают специальной средой

SMMP (Vehmaanpera, FEMS

M)croblolЛ etters, ч.49,101), а затем ресуспендируют а среде SMMP, содержащей 100 мг/мл лизоцима, и инкубируют 30 мин при

42 С. Образовавшиеся протопласты промывают средой SMMP с добавлением 0,1 -ного бычьего сывороточного альбумина и используют для трансформации Плазмидную ДНК рВАТАМ2 (2-10 мкг) инкубируют 2 мин при О С с протопластами клеток

В.amyloliquefaciens amy и 22 /-ным полиэтиленгликолем 6000, приготовленном на буфере SMMP. После десятикратного разве35

40 дения средой SMMP с 0,1 -ным альбуми45 ды рВАТАМ2 в штамме Bacillus

amyloliquefaciens amy (рВАТАМ2) (ВКПМ В5208) проводят следующим образом: ном трансформированные протопласты высаживают центрифугированием (2000 об/мин, 10 мин, 20 С), суспендируют в 1 мл той же среды, инкубируют 2 ч при 30 С и

50 высевают на агаризованную среду ОМЗ с эритромицином(5мкг/мл). Отбортрансформантов производят через 48 ч роста при

37 С. Отбирают клоны, устойчивые к эритромицину 10 мкг/мл и гидролизирующие

55 амилопектиназур (0.15 ) или крахмал (0,11-), Анализ генетических маркеров плазми1788966

С вЂ” О О 01

20

40

1. Устойчивость к эритромицину клеток

В.amyloliquefaciens (В-5208). содержащих плаэмиду рВАТАМ2, анализируют на среде с содержанием эритромицина 5 — 20 мкг/мл. Данные клетки растут на средах с такой концентрацией эритромицина.

2. Наличие секретируемой термостэбильной а -амилазы в клетках

В.amyioliquefaciens (В-5208), содержащих плазмиду рВАТАМ2, устанавливают следующим образом: клетки из отдельных клонов наносят микробиологической петлей на чашку Петри с твердым В-агаром, содержащим 0,15% амилопектиназура, в виде точек или полос и инкубируют при 37 С 18 — 24 час. Вокруг выросшей массы клеток образуется прозрачная зона гидролизованного амилопектиназура. Клетки исходного штамма — реципиента B.amyloliquefaciens (В4899), не содержащие плазмиды рВАТАМ2, зон гидролиза амилопектинэзура не образуют, так кэк не содержат собственной секретируемой а-амилазы.

Определение активности термостабильной а-амилазы.

Активность тер лостабильной Q -амилазы определяют по методике Госстандарта

СССР (Методы определения амилолитической активности ГОСТ 20264.4-74).

Активность термостабильной а-амилазы в культуральной жидкости определяют во время ферментации определяют по гидролизу 1%-ного растворимого крахмала в 10

MM Na-К-фосфатном буфере, рН 6,0, содержащем 1mM CaClz и 33 мМ NaCI. Реакционная смесь содержит 10 мл 1%-ного раствора растворимого крахмала, растворенного в 15 мМ Na-К-фосфатном буфере рН 6,0, и 5 мл исследуемого образца (разведенного в 2 м М ацетатном буфере, рН 6,0, 3 мМ CaCly, 100 мМ NaCI супернатанта культуральной жидкости бактерий иэ ферментации), Контроль вместо исследуемого образца содержит 5 мл буфера для разведения фермента, Пробы инкубируют при 30 С 10 мин. Реакцию останавливают добавлением к 1 мл реакционной смеси 10 мл 0,1 fvl раствора HCI. Иэ полученной смеси отбирают 1 мл и переносят в 10 мл раствора йода, содержащего

0.0025% и 0,025% Kl. Реакционные смеси выдерживают при 20 С 20 мин и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 656 нм. Полученные растворы приобретают окраску; контрольный раствор — синий цвет, опытный раствор — фиолетовую окраску различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизованного крахмала, Контрольным раствором при колориметрировании является дистиллированная вода, Количество прогидролизованного крахмала определяют по формуле где 01 — оптическая плотность контрольного раствора, D2 — оптическая плотность опытного раствора, 0,1 — количество субстрата, взятое для испытания в качестве субстрата, г, Если количество прогидролизованного крахмала меньше 0,02 г или больше 0,06 r, то испытание повторяют, подбирая разведение фермента.

Амилолитическую активность (АС), ед/мл, определяют по формуле

5,8Г5 х С -- 0.00 67

АС хп, где С вЂ” количество гидролизованного крахмала, г: и — величина разведения, 3а единицу активности амилолитических ферментов (AC) принято такое количество ферментов, которые при строго определенных температуре. рН и времени действия гидролиэуют до декст! инов различной молекулярной массы 1 г г астворимого крахмала, что составляет 30% от введенного в реакцию.

Полученн. и штамм имеет максимальную активность 287 ед/мл ч::рез 77 ч, что соответствует 5 г/л.

Пример ы 2 — 8. Получ.:ние термосгабильной а-амилазы с помощью рекомбинантного штамма Bacillus amyioliquefaclens

amy (pBATAM2) (ВКПМ В-5208).

Накопление термостабильной а-амилазы В.iicheniformis в культуральной жидкости штаммов В.amylo! Iquefaciens àmy(рВАТАМ2) (ВКПМ В-5208) — заявляемый штамм и (В КП М В-5207) — и рототип изучают при культивировании их в промышленных ферментационных средах следующего состава, г/л: картофельный крахмал, осахаренный а -амилазой — 200, кукурузный экстракт — 18, дрожжевсй экстракт — 2,4, лактоза — 0,6, (NH4)zHPO4 8,4; К2304 — 3.

NaCI — 0,3; MgS04x7HsO — 0,15; CuS04—

0,0039; рН 7,2, штаммы B.amylollquefaclens

В-5208 и В-5207, содержащие стабильно наследуемую плазмиду рВАТАМ2, выращивают нэ среде без антибиотика, процесс ферментации проводят в ферментере

Marubishi MD-150 с рабочей емкостью 0,75 л при 37 С. Активность фермента измеряют в ходе ферментации по методу, описанному выше. Данные по накоплению термоста1788966

Таблица 1

Накоплейие термостабильной а — амилазы B.licheniformls, продуцируемой штаммами В. amylollquefaclenc ВКПМ В-5208 и В, amyloliquefaciens ВКПМ В-5207 (штамм прототип ) so время ферментации

* ГОСТ 20264. 4-74 "Методы определения амилолитической активности. "

7 бильной а-амилазы В,llchenlformis в культуральной жидкости В,amylollquefaclens а my (рВАТАМ2) (В КП М В-5208) и

B.amytotlquefaclens amy- Sm (рВАТАМ2) (ВКПМ В-5207) во время ферментации суммируются в табл.1.

Предлагаемый в данной заявке рекомбинантный штамм-продуцент термостабилъной а -амилазы в 1,4-1,5 раэ более продуктивен, чем исходный штамм-.прототип (максимальная активность -172 ед/мл), Пример 9, Сравнение свойств Q-амилазы, продаваемой фирмой "Sigma", и аамилазы, полученной заявляемым штаммом-продуцентом.

Данные по свойствам термостабильной а-амилазы В.llcheniformts, секретируемой заявляемым рекомбинатным штаммом-продуцентом В.amyloilquefaclens amy(рВАТАМ2) (ВКПМ В-5208) и свойства термостабильной а -амилаэы B.licheniformis, продаваемой фирмой "Sigma" (а-Amylase, Туре Xll-А, bacterial, from Bacillus

licheniformls. No А3403) суммируются в табл,2.

Свойства термостабильной а-амилазы

В.licheniformls фирмы "Sigma" проверялись как в данной работе, так и описаны ранее

5 ($Л.Tomazic, А.M.Kttbanov, Journal of

Biological Chemistry. ч,263, No, 7. р.30923096, 1988).

Vla анализа данных, представленных в

10 табл.2, ясно, что предлагаемый в данной заявке рекомбинантный штамм-продуцент терм оста биль ной а -амилазы В.lichenlforml s, В.arnylollquefactens amy(pBATAM2) BKflM В5208 секретирует в культуральную жидкость

15 фермент, который по свойствам не уступает аналогичному ферменту фирмы "Sigma", а именно: молекулярная масса, оптимальные рН и температура, изоэлектрическая точка, термостабильность совпадают с таковыми

20 препарата а-амилазы фирмы "Sigma", Формула изобретения

Штамм . бактерий Bacillus

amylollquefaclens ВКПМ В-5208 продуцент а-амилаэы Васйвз licheniformls.

1788966

Таблица 2 а — амилаза В.ticheniformls фирмы "Sigma" Туре Xll — А а — амилаза B.llchenlformis из штамма В.

am loll uefaclens В-5207

Показатель

Молекулярная масса, kDa

Изозлектрическая точка р !

7,5

7.5 рН оптимум ферментативной активности

7,5

7,5

Температурный оптимум фементативной реакции, * С

90

Термостабильность при 90 С течение 1 ч, при рН 8, при инкубации фермента без субстрата (крахмала ) Сохранение 100 актив.

Сохранение 100% актив.

Удельная активность ** (ед.

ГОСТ / мг ). при рН 6,0, Т =

=30 С

54

Составитель В.Народицкая

Техред М,Моргентал Корректор В,Петраш

Редактор

Заказ 82 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

*Ферментативная активность термостабильной a — амилазы, измеряемая при 90 С (температурный оптимум ферментативной реакции) возрастает на 60-70 (в диапазоне рН

6-8) по сранению с активностью, измеряемой при 30 С по ГОСТ 20264. 4-74 методике (в том же диапазоне рН).

** При определении концентрации белка по удельной экстинкции термостабильной a— амилазы величина удельной активности составляет 30 ед. ГОСТ/мг.