Способ иммунодиагностики инфекции

 

Использование: изобретение относится к медицине и может быть использовано для иммунодиагностики инфекций. Цель: повышение точности и уменьшение трудоемкости способа. Сущность изобретения: указанная цель достигается тем, что диагностическое исследование производят только с кровью больного, при этом исследуют 2 .- ,. 2 . . ... ...,.,,..,.,...,., пробы крови больного: при различном времени экспозиции с объектами фагоцитоза или при одном времени экспозиции, но с добавлением в одну из проб крови растворимой специфической субстанции микробов и рассчитывают величину отношения фагоцитоза двух объектов (индекс) по формуле Йндекс Величина соотношения специфического и неспецифического объектов в пробе с добавлением растворимой микробной субстанции (с большей экспозицией)/Величина соотношения фагоцитоза специфического и неспецифического объектов в пробе без добавления растворимой микробной субстанции (с меньшей экспозицией) и при величине отношения меньше 0,75 диагностируют инфекцию . 3 табл. -5 fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4866935/14

{22) 11.09.90 (46) 23.01.93. Бюл. М 3 (71) Пермский государственный медицинский институт (72) В.Н.Каплин, Е.И.Самоделкин и В.Ф.Коломойцев (56) Авторское свидетельство СССР

М 1627992, кл. 6 01 и 33/53, 1989.

{54) СПОСОБ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ (57) Использование: изобретение относится к медицине и может быть использовано для иммунодиагностики инфекций. Цель: повышение точности и уменьшение трудоемкости способа. Сущность изобретения: указанная цель достигается тем, что диагностическое исследование производят только с кровью больного, при этом исследуют 2

Изобретение отйосится к медицине и может быть использовано для иммунодиагностики инфекций.

Известен способ иммунодиагностики путем одновременного определения фагоцитарной актйвности лейкоцитов (ФАЛ) крови больного и контрольных лиц с использованием в качестве объектов фагоцитоза эритроцитов из специфического и неспецифического. эритроцитарных диагностикумов, По этому способу исследуют ФАЛ со смесью специфических и неспецифических объектов фагоцитоза. и производят сопряженный учет фагоцитоза обоих объектов, Специфические изменения ФАЛ больного определяют по соотношению уровней специфического и неспецифического объектов в сопоставлении с их соотношением у конт Ж„„1789927 А1 пробы крови больного: при различном времени экспозиции с объектами фагоцитоза или при одном времени экспозиции, но с добавлением в одну из проб крови растворимой специфической субстанции микробов и рассчитывают величину отношения фагоцитоза двух объектов (индекс) по формуле

Индекс= Величина соотношения специфического и неспецифического объектов в пробе с добавлением растворимой микробной субстанции (с большей экспозицией)/Величина соотношения фагоцитоза специфического и неспецифического объектов в пробе беэ добавления растворимой микробной субстанции (с меньшей экспозицией) и при величине отношения меньше 0,75 диагностируют инфекцию, 3 табл. рольных лйц. Достоверным считают сдвиг величины соотношения более 1,50 или менее 0,66.

Недостаток укаэанного способа заключается в необходимости проведения дополнительного исследования у контрольных лиц и в недостаточной точности, связанной с тем; что в качестве контрольных лиц используются здоровые лица с разными уровнями ФАЛ, что определяет возможность дополнительной погрешности исследования фагоцитоза. В частности, при низком абсолютном уровне ФАЛ у контрольных лиц погрешность метода возрастает. Вследствие этого невозможно достоверно определить специфический сдвиг соотношения фагоцитоза при изменении велйчины соотношения фагоцитоза двух обьектов меньше, 1789927 чем в 1,5 раза в сравнении с контролем тельного исследования фагоцитоза конт(индекс меньше 0,67 или более 1,5 раза). рольных лиц, а наличие специфических изКроме того, у больного возможны различ- менений ФАЛ определяют по изменению ные изменения крови, что ведет к различно- соотношения уровней фагоцитоза специфиму окрашиванию мазка крови у больных и 5 ческого и неспецифического объектов -при контрольных лиц. У больного и контрольных - "различном времени экспозиции смеси кролиц должна быть одинаковая экспозиция ви больного собъектамифагоцитоза, или до крови с объектами фагоцитоза и модуляции и после дополнительного контакта крови времени не допустимы. больного с растворимой специфической

Цель изобретения — повышение точно- "0 микробной субстанцией(способной навести сти и уменьшение трудоемкостй способа, специфическую реакцию крови контрольУказанная цельдостигаетсятем,чтоди- ных лиц), тогда как в известном способе агностическое исследование производят необходимо дополнительное исследование только с кровью больного, при этом иссле- ФАЛ у контрольных лиц. дуют 2 пробы крови больного при различ- 15 .Способосуществляютследующимобраном времени экспозиции с объектами - зом. Исследование ФАЛ производят с равфагоцитоза или при одном времени экспо- ной смесью 1 g,-ных взвесей специфических эиции, но с добавлением в одну из проб инеспецифическихэритроцитов; В качестве кроаирастворимойспецифическойсубстан- специфического объекта используют ции микробов и рассчитывают величину от- .20 предварительно окрашенную голубым ношения фагоцитоза двух объектов (индекс) анилиновым красителем 1O/-ную взвесь анпо формуле . - — . тигенного эритроцитарного диагности ума .Индекс= Величина соотношения для РПГА или фиксированный на эритроциспецифического и неспецифического объек- те сложный комплекс антиген-антитело-спетов в пробе с добавлением растворимой 25 цифический микробный поли- или микробной субстанции (с большей липополисахарид. С целью микроскоэкспозицией)/Величинасоотношенияфаго- пического различения от эритроцитов, цитоэа специфического и неспецйфи- . содержащих специфический антиген, неческого объектов в пробе без добавления специфические эритроциты также заранее раствормой микробной субстанции (с мень- З0 окрашивают анилиновым красителем бордо шей экспозицией) и при величине отноше- или черным и готовят 1%-ную взвесь эритния меньше 0,75 диагностируют инфек- роцитов. В качестве растворимой специфицию.. ческой микробной субстанции используют

Основанием к применению этого спосо- элюировавшую в физраствор с эритроциба служат два момента. Первый момент за- З5 тарного диагностикума специфическую расключается в том, что у здоровых лиц или лиц, творимую микробную субстанцию (суперлиц) не имеющих специфической реакции, при или вакцину в разведении 10 -10 (также

-6 различном времени экспозиции крови со: способную наводить специфическую реаксмесью двух обьектов происходит пропор- .. цию клеток крови контрольных лиц). циональное увеличение их фагоцитоза, а 40 Проколом пальца больного набирают при наличии специфической реакции соот- . 0,1 мл крови и смешивают с 0,1 мл раствора ношение уровней фагоцитоза специфиче- Тлюгицира" (или другого антикоагулянта) ского и неспецифического объектов во избежание свертывания крови. Концент меняется в зависимости от временй экспо- рируют лейкоциты, производя центрифугиэиции. Второй момент связан с возможно- 45 рование в течение 10 мин при 500 об/мин и стью наведения ин витра специфического основную массу плазмы с консервантом повышения ФАЛ прй воздействии специфи- удаляют, затем кровь тщательно перемешической растворимой микробной субстанции вают. на кровь контрольных лиц и лиц, не имев- - Применяют 2 варианта постановки рещих специфического процесса, тогда как у 50,акции, больных со специфической инфекцией про- В йервам варианте при определении является подавляющее действие этой суб- - специфической реакции в зависимости от станции на фагоцитоз специфического времениэкспозициикровьбольноговобъеобьекта, что также можно выявить по измене- ме 10 мкл вносят в пробирку и добавляют 10 нию соотношенйя уровней фагоцитоза специ- 55 мкл равной смеси однократно отмытых физфического и неспецифического объектов. раствором 1; -ных взвесей специфического

Отличие заявляемого способа от изве- (голубого цвета) и неспецифического(черностного заключается в том, что в заявляемом го цвета) обьектов фагоцитоза, После тщаспособе определение фагоцитоза произво- тельного перемешивания пробирку дят только с кровью больного без дополни- помещают в термостат при температуре

1789927

37 (; при периодическом встряхивании. Готовят мазки в виде узких ровных мазков на одном предметном стекле в поперечном направлении с помощью Устройства для изготовления мазков, либо обычным способом— один мазок на одном предметном стекле через 5-10 мин (меньшая экспозиция) и 2030 мин (большая экспозиция).

Во втором варианте, осуществляемом путем дополнительного воздействия на кровь растворимой специфической субстанции, кровь больного в объеме по 10 мкл вносят в две пробирки. В первую (контрольную) вносят 5 мкл физраствора, а во вторую—

5 мкл растворимой специфической микробной субстанции и после тщательного перемешивания обе пробы помещают в термостат при 37 С на 20 мин. Затем в обе пробы добавляют по 10 мкл равной смеси специфического и неспецифического диагностикумов, тщательно перемешивают и вновь помещают в термостат на 10 мин при периодическом встряхивании, После этого - готовят мазки из обеих проб одномоментно на предметном стекле. Мазки высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе. При этой окраске неспецифические эритроциты приобретают черный цвет и хорошо отличаются от специфических, которые окрашиваются в синий цвет. Под иммерсионным объективом определяют фагоцитарную способность 100 нейтрофилов. Фагоцитоз учитывают только в изолированно лежащих лейкоцитах, избегая подсчета в конгломератах клеток. В каждой клетке учитывают количество фагоцитиро. ванных специфических (синего цвета) и неспецифических (черного цвета) объектов.

Затем вычисляют среднее число фагоцитированных специфических и неспецифических зритроцитов на лейкоцит (фагоцитарное число). Изменения фагоцитоза специфического и неспецифического объектов при меньшей экспозиции принимают за

100 и выражают в процентах к ним показатели пробы при большей экспозиции . По. казатели пробы без воздействия специфической микробной субстанции также принимают за 100 и выражают в процентах к ним показатели пробы после воздействия специфической растворимой, микробной субстанции, Полученную от деления величину обозначают как индекс специфического сдвига фагоцитоза (ИСФ).

Диагностически значимым признают понижение величины индекса ниже 0,75. Повы- шение индекса выше этой величины указывает на отсутствие указанной инфекции.

35 лена у 57 человек (83,8 p) и у 11 (16,2 ) 40

45 отметить, что 11 из этих детей поступили с подозрением на корь, однако диагноз был

50 . впоследствии снят.

5

<

Пример осуществления способа при диагностике кори.

В качестве специфического объекта фагоцитоза использовали 1 -ную взвесь зритроцитарного антигенного сухого коревого диагностикума для РПГА производства Ленинградского НИИЭМ им. Пастера. В качестве неспецифических использовали

1 -ную взвесь гриппозных антигенных эритроцитов типа А для РН ГА производства

Одесского предприятия по производству бактерийных препаратов.

Для диагностики использовали применение варианта определения специфической реакции путем воздействия на кровь больного растворимой специфической микробной субстанции — супернатанта.

Поданным исследования в контрольной пробе (с физраствором) фагоцитарное число в отношении специфического объекта составило 0,28, а в отношении неспецифического

-0,36. В пробе после воздействия растворимой специфической субстанции (супернатанта коревого диагностикума) показатели составили 0,09 (32 ) и 0,25 (69 ) соответст32 4 венно. ИСФ= — =0,46, 69 %

Заключение: У больного имеется коревая инфекция.

Всего было обследовано 68 больных корью в различные сроки заболевания (от периода инкубации до 6-8 дня высыпания).

Из них при применении известного способа положительная реакция на корь была выявреакция не выявилась. Однако при обследовании этих 11 детей по заявляемому способу еще у 5 больных была выявлена положительная реакция на корь, что в сумме составило уже 62 из 68. Таким образом, диагностически значимый результатбыл выявлен у 91,2 больных.

С целью дифференциальной диагностики исследование было проведено у 20 больных с краснухой и с аллергическими реакциями кожи. У всех этих больных реакция на корь была отрицательной. Следует

Пример осуществления заявляемого способа при диагностике гриппа.

В качестве специфического объекта фагоцитоза использовали 1 -ную взвесь гриппозных антиге нных эритроцитов типа А для РКГА производства Одесского предприятия по производству бэктерийных препаратов, в качестве контрольных — 1 -ную взвесь эритроцитов сухого коревогь анти1789927

20

35

50 ставлены в табл. 2

55 генного диагностикума для РПГА производства Ленинградского НИИЭМ им. Пастера.

Для диагностики испольэовали применение варианта определения специфической реакции путем воздействия на кровь больного растворимой специфической микробной субстанции. — супернатана специфического диагностикума.

Поданным исследования в контрольной пробе(с физраствором) фагоцитарное число в отношении специфического обьекта составило 0,15, а в отношении неспецифического — 0,10. В пробе после воздействия. растворимой специфической субстанции (супернатана) показатели фагоцитоза спе- 1 цифического объекта составили 0,07(47%) и неспецифического — 0,10 (100%), ИСФ=

47 о

= 1ОО о — 0,47, Заключение: у больного имеется гриппозная инфекция.

Всего было обследовано 170 больных с подозрением на грипп. По известному способу специфическая реакция была выявлена у 134 (78,8%). При обследовании по заявля- 2 емому способу у 20 из оставшихся 36 человек были выявлены специфические для гриппа изменения ФАЛ и таким образом диагностически значимый результат был выявлен у 154 из 170 больных (90,6%).

С целью дифференциальной диагностики исследование было произведено у 36 детей, поступивших с подозрением на энтеровирусную инфекцию. Ни у одного из них специфических для гриппа изменений

ФАЛ выявить не удалось.:

Пример осуществления заявляемого способа при диагностике дизентерии Зон- . не.

В качестве специфического объекта фа- 4 гоцитоза использовали 1%-ную взвесь ан- тигенного эритроцитарного сухого диагностикума для РНГА из шигелл Зонне" производства Ленинградского НИИ вакцин и сывороток, а в качестве неспецифических — 4

1%-ную взвесь антигенного эритроцитарного сухого дизентерийного диагностикума из шигелл Флекснер того же НИИ вакцин и сывороток.

Наличие специфической реакции определяли при различных сроках экспозиции.

Пробы крови больного смешивали с равным объемом 1%-ных взвесей двух обьектов фагоцитоза и готовили мазки после 5 и 20-минутной экспозиции.

Па данным исследования при меньшей экспозиции фагоцитарное число в отноше-. .нии специфического обьекта составило

0,42, а в отношении неспецифического—

0,25, В пробе при большей экспозиции no-

8 казатели фагоцитоэа специфического обьекта составили 0,51 (121%) и 0,55 (220%) неспецифического соответственно, Индекс =

- — =0,55.

220 %.

Заключение: у больного имеется дизентерия Зонне. Бактериальное подтверждение было получено значительно позднее.

Учитывая, что основным методом диагностики таких вирусных заболеваний, как корь и грипп, является серологическое обследование, результаты которого имеют лишь ретроспективное (исследование титров антител в парных сыворотках на 10-12 день от начала заболевания), а заявляемый способ иммунодиагностики позволяет уточнить диагноз заболевания в день исследования, прост. нетрудоемок и не требует специального оборудования, он может быть использован как для диагностики уквзанных заболеваний, так и для их дифференциальной диагностики от сходных с ним по клиническим признакам заболеваний.

Заявляемый способ более точен, так как при исследовании ФАЛ одного и того же лица в динамике наблюдаются гораздо менее выраженные колебания соотношения фагоцитоза специфического и неспецифического объектов и соответственно меньше ввриации величины ИСФ, чем при одновременном исследовании ФАЛ у различных лиц, что подтверждается данными, приведенными в табл.1:

Очевидно, что колебания соотношений фагоцитоза у различных лиц при одной экспозиции более выражены, чем вариации у одного и того же лица при разном времени экспозиции.

Заявляемый способ менее трудоемок (на одну треть как минимум), поскольку для уточнения диагноза требуется исследование двух мазков. в отличие от известного способа, где необходимо исследование как минимум трех мазков(один мазок больного и два у контрольных лиц для вычисления средних величин уровней фагоцитоза.

Вариации величины соотношения фагоцитоза двух обьектов в серии проб крови одного обследованного донора (А) предВариации величины соотношения фагоцитоза двух обьектов в серии параллельных проб крови группы обследованных (Б) представлены в табл. 3.

Большая точность определения. ИСФ при исследовании проб крови одного человека в сравнении с определением ИСФ в пробах различных здоровых людей доказывают данные вариации величины ЙСФ в этих исследованиях, В серии исследований

1789927 венно этому диапазон колебаний величины

ИСФ в заявляемом способе меньше и диагностическим значением в заявляемом, способе является изменение величины ИСФ

5 при соотношении показателей фагоцитоза двух объектов меньше 0,75.

7 проб человека (А) вариации величины ИСФ были в пределах 0,84-1,18 и коэффициент вариации величины ИСФ составил 12,0 $.

При определении ИСФ в серии проб крови

8 здоровых людей (Б) вариации ИСФ были в пределах 0,74-1,31 и коэффициент вариации величины ИСФ составил 17,8 . Соответст10

Формула изобретения

Способ иммунодиагностики инфекций путем определения фагоцитарной активности лейкоцитов крови больного при инкубации ее со специфическим и неспецифическим объектами фагоцитоза с оценкой результатов реакции по величине индекса специфического изменения фагоцитоза, определяемого по соотношению уровней фагоцитоза двух объектов у больного в сопоставлении с их соотношением у донора, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, исследование фагоцитарной активности со специфическим и неспецифическим объектами

15 ведут в пробах крови больного при другом значении времени инкубации или при таком же значении времени с добаеленивм растворимой субстанции микробов, далве рассчитывают индекс специфического ие20 менения фагоцитоза по величинам соотно- шения фагоцитоза двух объектов во второй пробе к первой и при значении индекса меньше 0,75 диагностируют инфекцию.

Таблица 1

Вариации соотношения уровней фагоцитоза специфического (в числителе) и неспецифического (в знаменателе) объектов при различной экспозиции и при сопоставлении проб двух доноров

Таблица 2

Пробы крови

Индекс соотношения фагоцитоза двух объектов

Фаго ита ное число спе и ический объект неспе и и еский объект абсолютн. величина в (, кМв группе в кМв группе.абсолютн. Величина

1,00 0,06

100 4 3.9

2,24 «-0,13

101 й46 (81-116) 179 й0,06

М+е

Пределы колебаний

Коэффициент ва иа ии, (1,56-1,98 (87-1 l0) (1,82 — 2,61) (0,84-1,18) 13,1

12,0

8,4

8,7

10,0

2

5

1,98

1;97

1,82

1,74

1,62

1,72

1.56

102

9?

96

97

2,36

2,30

2,61

2,06

2,56

1,82

2.03

106

103

116

92

114

81

1,04

1,02

0,87

1,06

0,84

1,18

0,96

1789927

Таблица 3

Составитель В,Каплин

Техред М.Моргентау... - Корректор А.Моталь

Редактор А.Мельникова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 347 Тираж . .-., Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5