Способ определения фосфора в биологических объектах

 

Использование: аналитическая химия. Сущность: смешивают исследуемую пробу с цветореагентом, состоящим из соли молибденовой кислоты, малахитового зеленого, минеральной кислоты с последующим фотометрированием раствора, в качестве соли молибденовой кислоты используют молибденовокислый натрий, а в качестве минеральной кислоты - серную кислоту, при следующем соотношении компонентов, мас.%: малахитовый зеленый 0,10 - 0,15; натрий молибденовокислый 2,8 - 3,0; кислота серная 12,5 - 17,5, вода дистиллированная остальное. 3 табл. ел с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 21/78

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (1ОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4908444/04 (2 ) 06.02.91 (46) 15.02,93. Бюл. М 6 (71) Украинский научно-исследовательский институт птицеводства (7 ) Е.М.Белецкий (56) Fisne С. Subbarous J, Лабораторные методы исследования в клинике./ Под ред. проф. В,В.Меньшикова. M,: Медицина, 1987, c,271 — 272.

Каракашов А,В.;, Вичев Е.П, Микрометоры в клинической лаборатории, София:

Медицина и физкультура, 1968, c,198 — 203.

Грибанов Г,А., Базанов Г.А. Модификация ультрамикроопределения общего и неорганического фосфора с помощью малахитового зеленого, — Лабораторное дело, 1976, N 9, с.527 — 530. Аликаев В.А„Петухова ЛД. и др, Справочник по контролю кормления и содержания животных. M,: Колос, 1982, с.179 — 185.

Изобретение относится к лабораторны я методам анализа и предназначено для лабораторных и клинических исследований в области сельского хозяйства, медицины, ветеринарии, зоотехнии, Наибольшее распространение колориметрическими способами определения фосфора являются: способ с использованием эйконогена хлористого олова, малахитового зеленого, гидрохинона (амидола) или ванадо-йолибдатный способ, Определение фосфора с эйконогеном им ет чувствительность 0,2 — 2,0 мкмоль фосфора, однако способ трудоемкий (предварительное осаждение белка, центрифугировэние, термостатирование) и длительный, „, Я2,, 1795357 Al (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРА В

БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ (57) Использование: аналитическая химия.

Сущность; смешивают исследуемую пробу с цветореагентом, состоящим из соли молибденовой кислоты, малахитового зеленого, минеральной кислоты с последующим фотометрированием раствора, в качестве соли молибденовой кислоты используют молибденовокислый натрий, а в качестве минеральной кислоты — серную кислоту, при следующем соотношении компонентов, мас."-,ь; малахитовый зеленый 0,10 — 0,15; натрий молибденовокислый 2,8 — 3,0; кислота серная 12,5 — - 17,5, вода дистиллированная остальное. 3 табл.

Способ с применением хлористого олова требует для анализа 0,1 мл сыворотки крови, достаточно трудоемкий и длительный (1 ч на пробу).

Способы определения фосфора в кормах еще более длительные и трудоемкие, затраты времени на их выполнение составляют 4 — 24 часа.

Для определения фосфора в сыворотке крови заслуживают особого внимания микрометоды, позволяющие определять исследуемый элемент в объемах 0,02 — 0,05 мл сыворотки, Наиболее доступным и легковыполнимым является способ с использованием молибдата аммония и малахитового зеленого, позволяющий без предваритель1795357 к анализу, так и за счет увеличения количества проб на одну серию определений (до 30 — 50 вместо 5 — B).

Срок годности цветного реактива составляет, по крайней мере, несколько месяцев (реактив хранился 3 месяца без снижения качества), Способ осуществляется следующим образом: 0,5 r малахитового зеленого растворяют в 250 мл дистиллированной воды, одновременно. растворяют 14,5 r молибденовокислого натрия двухводного в 250 мл

25%-ной серной кислоты. Оба раствора смешивают, дают отстояться и фильтруют. Цвет готового реактива желто-коричневый.

Построение калибровочной кривой.

439.03 мг высушенного до постоянной массы однозамещенного фосфорнокислого калия (КН РО4) растворяют в 1 л дистиллированной воды. Концентрация фосфора в основном растворе составляет

100 мг/л. Для приготовления рабочего раствора к 10 мл основного раствора прибавляют 990 мл дистиллированной воды, получая концентрацию фосфора 1 мг/л. Берут 0,3;

0,6; 0,9 и 1,2 мл рабочего раствора, содержащих соответственно 0,3; 0,6; 0,9; и 1,2 мкг фосфора, доводят дистиллированной водой до 1,5 мл, добавляют 2 мл цветореагента и через 10 — 20 мин колориметрируют при 600 — 650 нм. Строят график, где по оси абсцисс отмечают концентрацию фосфора в мкг, по оси ординат — зкстинцию калибровочных проб, Ход определения: 0,01 мл сыворотки крови вносят в 1,5 мл дистиллированной воды, добавляют 2 мл цветореагента и-через 10 — 20 мин колориметрируют при 600 — 650 нм против холостого опыта без сыворотки крови, Толщина рабочей части кюветы — 5 мм.

Для определения фосфора в органах или тканях к навеске ткани (1 r) приливают

10 мл концентрированной серной кислоты и минерализуют до обесцвечивания, объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл. Для определения фосфора берут

0,025 — 0,050 мл раствора и дальнейшие операции проводят так же, как и при опре0,10 — 0,15

50 делении фосфора всыворотке крови,,В табл.1 показано определение оптимального соотношения компонентов, Из табл,1 следует, что наиболее оптимальными соотношениями компонентов являются; малахитовый зеленый - 0,10—

0,15%; молибденовокислый натрий 2,8—

3,0 ; кислота серная 12,5 — 17,5;,.

При сравнении устойчивости цветного реактива, приготовленного на растворах с ного осаждения белков определять фосфор в 0,02 мл сыворотки крови. Этот способ является наиболее близким по технической сущности и принят зэ прототип. Сущность способа заключается s тTоoм, что в присутствии неорганического фосфора молибденовая кислота образует фосфорномолибденовую гетерополикислоту, которая, реагируя с основным красителем малахитовым зеленым, дает зеленовато-синее окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству фосфора. Белок не мешает проведению данной реакции, поэтому депротеинизацию не проводят, для обеспечения коллоидной устойчивости образовавшегося комплекса в раствор добавляют твин-20.

Недостатки способа, принятого за прототип, следующие: неустойчивость окраски холостой и опытной пробы во времени, вследствие чего снижается точность опре- 20 деления; необходимость приготовления нового цветного реактива каждые 2-3 недели, что достаточно трудоемко.

Целью предлагаемого изобретения является сокращение длительности способа, повышение точности и чувствительности

его.

Поставленная цель достигается тем; что в известном способе определения фосфора в биологических объектах путем обработки 30 анализируемой пробы цветореагентом, содержащим соль молибденовой кислоты, ма- . лахитовый зеленый и минеральную кислоту с последующим фотометрировэнием раствора, согласно изобретению, в качестве со- 35 ли молибденовой кислоты используют молибденовокислый натрий, а в качестве минеральной кислоты — серную кислоту при следующем соотношении компонентов, мас,%: 40

Малахитовый зеленый

Молибденовокислый натрий 2,8 — 3,0

Кислота серная 12,5 — 17,5

Вода дистиллированная Остальное

Наиболее существенным преимуществом заявляемого способа является повышение точности определения содержания общего или неорганического фосфора за счет стабилизации окраски полученной фосфорно-молибденовой гетерополикислоты во времени и чувствительности за счет использования молибденовокислого натрия.

Кроме того, при использовании данного способа производительность труда лаборанта при определении фосфора повышается в 1,2 — 1,5 раза как за счет уменьшения количества операций при подготовке пробы серной и соляной кислотами, установлено

1795357 (табл.2), что в то время как реактив с соляной кислотой постоянно менял свою окраску во времени в присутствии твина-20 или без него, реактив с серной кислотой был полностью устойчив в течение всего исследуемого

Промежутка времени. Использование твина-20 в цветном реактиве с соляной кислотой замедляло интенсивность развития окраски, но не устраняло ее, В цветном реактиве с серной кислотой нет необходимости применить тви н-20 в качестве стабилизатора. В табл.2 показано сравнение устойчивости цветного реактива с различными кислотами, При сравнении точности обнаружения фосфора с помощью цветного реактива с различными кислотами установлено, что при использовании цветореагента с соляной кислотой ошибка в точности определения на 11-й и 30-й мин составила 34, в то время как при использовании серной кислоты данные в указанном временном интерва ле совпали.

Замена молибденовокислого аммония на молибденовокислый натрий привела к

Способ определения фосфора в биологических объектах путем обработки анализируемой пробы цветореагентом, содержащим соль молибденовой кислоты, малахитовый зеленый, минеральную кислоту и воду с последующим фотометрированием раствора, отличающийся тем, что, с целью сокращения длительности способа, повышения точности и чувствительности

2,8 — 3,0

12,5 — 17,5

Таблица 1

Соде жание компонентов в смеси, мас

Компонент

0,150

3,0

12,5

О, t5

2,80

12,5

0,15

3,0

15,0

100

0,300

3,0

12,5

0,15

3,00

12,5

0,15

3.0

20,0

100

0,200

3,0

12,5

0,15

2,90

12,5

0,15

3,0

17,5

100

0,100

3,0

12,5

0,15

2,70

12,5

96,4

0,15

3,0

12,5

100

0,050

3,0

12,5

95,5

0,15

2,60

12,5

92,0

0,15

3,0

10,0

97,7

0,025

3,0

12,5

62,4

0,15

2,50

12,5

82,3

0,15

3,0

7,5

61,1

Ф ормула изобретения

Малахитовый зеленый

Молибденовокислый натрий

Кислота серная

Определение фосфора, Малахитовый зеленый

Молибденовокислый натрий

Кислота серная

Определение фосфора, Малахитовый зеленый

Молибденовокислый натрий

Кислота серная

On еделение ос о а, повышению чувствительности способа в 2,0 — 2,5 раза без снижения точности определения фосфора.

Для сравнительного изучения предло5 женного способа с прототипом было определено количество общего фосфора в 5 опытных образцах сыворотки крови кур в тканях яйцевода и яичника индеек-несушек.

Как видно из табл,3, совпадение результатов при использовании предлагаемого способа через 10 и 20 мин измерения составляет практически 100, в то время, как

15 в прототипе через 20 мин эта величина составляла 80 — 83 от количества фосфора, измеренного через 10 мин. Совпадение результатов при использовании обеих способов через 10 мин после приготовления

20 растворов во всех случаях удовлетворительное (4,5 для сыворотки крови кур и 0,45—

3,91 для тканей яйцеводэ), Способ прост в использовании, хорошо воспроизводим и не требует сложного обо25 рудования и дефицитных реактивов, его, в качестве соли используют молибденовокислый натрий, в качестве минеральной кислоты — серную кислоту при следующем соотношении компонентов мас. ;

35 Малахитовый зеленый 0,10 — 0,15

Молибденовокислый натрий

Серная кислота

40 Дистиллированная вода Остальное

1795357

Таблица 2

Таблица 3

Составитель Е,Белецкий

Техред М,Моргентал Корректор С.Патрушева

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина. 101

Заказ 426 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5