Способ определения эффективности гемосорбции

 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии. Цель изобретения - повышение точности способа. Цель достигается за счет того, что в анализируемую пробу добавляют перекись водорода и соль двухвалентной меди, разбавляют плазму, проводят флуориметрическое исследование контрольной и анализируемой пробы, находят показатель соотношения интенсивности флуоресценции анализируемой и контрольной проб и при динамическом снижении показателя в пробе, взятой после гемосорбции, по сравнению с пробой до гемосорбции считают процедуру эффективной . 3 ил.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)э G 01 N ЗЗ/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4684155/14 (22) 25.04.89 (46) 30.05.93. Бюл. Гя 20 (71) Институт биохимии AH БССР и Гродненский государственный медицинский институт (72)И.И.Степуро, В.В.Спас и Н.А.Чайковская (56) Тезисы докладов XI Международного симпозиума анестезиологов и реаниматологов соц. стран. Внутривенная общая анестезия, Методы детоксикации, Киев: 1986, с.140 — 142, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕМОСОРБЦИИ

Изобретение относится к биохимии и медицине, касается определения снижения уровня эндогенной интоксикации при про ведении гемосорбции и может быть HGAollbзовано при проведении биохимических анализов в лабораторной медицинской практике при определении степени интоксикации после проведения детоксикационной терапии, Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности способа.

На фиг.1 показаны спектры флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного, взятой до и после гемосорбции при молярном соотношении плазмы крови: перекись водорода: сульфат меди, равном 1:400:5, при длине волны возбуждающего света 330 нм; на фиг.2 — спектры флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного, взятой до и после гемосорбции при молярном соотношении („) 5LJ „„1818586 А1 (57) Изобретение относится к медицине. а именно к биохимии. Цель изобретения — повышение точности способа. Цель достигается за.счет того, что в анализируемую пробу добавляют перекись водорода и соль двухвалентной меди, разбавляют плазму, проводят флуориметрическое исследование контрольной и анализируемой пробы, находят показатель соотношения интенсивности флуоресценции анализируемой и контрольной проб и при динамическом снижении показателя в пробе,.взятой после гемосорбции, по сравнению с пробой до гемосорбции считают процедуру эффективной. 3 ил. плазма крови:перекись водорода:сульфат меди, равном 1:800:5, при длине волны возбуждающего света 330 нм; на фиг.З вЂ” спектры флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного, взятой до и после гемосорбции при молярном соотношении плазма крови: перекись водорода: сульфат меди, равном 1:3000:5, при длине волны возбуждающего света 330 нм.

Спосо0 осуществляется следующим образом, Производят забор крови у больного до и после гемосорбции и центрифугируют при

3000 об/мин в течение 15 мин, отделяют плазму. Отделенную плазму крови (концентрация 10 М), взятую до и после гемосовбции, помещают в четыре пробирки по f00 мкл. В первые две пробирки к плазме крови, взятой до и после гемосорбции, добавляют перекись водорода и соль двухвалентной меди при молярном соотношении плазма

1818586 крови: перекись водорода: соль двухвалентной меди, равном 1:400...3000:5, а во вторые две пробирки с плазмой крови, взятой до и после гемосорбции (контроль) добавки перекиси водорода и соли двухвалентной меди не производят. Затем все четыре пробирки с пробами плазмы крови ставят на инкубацию в водяную баню при 37 С. После . 30-минутной инкубации пробы, включая и контрольные, разбавляют до концентрации белков в плазме крови, равной 10 М, т.е. в

1000 раз, добавляя 100 мл 0,05 М натрийфосфатного буфера, рН 7, Разбавление пробы позволяет уменьшить обьем используемой для анализа плазмы, обеспечивая при этом точное измерение последующей интенсивности флуоресценции, работая с низкой концентрацией плазмы крови (до 10 M), Затем измеряют интенсивность флубресценции проб на длине волны

390-410 нм при длине волны воэбуждающего света 325 — 335 нм, Оценку снижения уровня эндогенной интоксикации делают,по интенсивности флуоресценции, сравнивая результаты измерения флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови, взятой до и после гемосорбции.

В предлагаемом способе определения снижения уровня эндогенной интоксикации при проведении гемосорбции íà этапе отработки оптимальных его параметров было установлено, ч-о наилучший эффект от использования заявляемого способа регистрировался при добавлении к плазме крови перекиси водорода и соли двухвалентной меди в молярном соотношении плазма крови:перекисьводорода:сольдвухвалентной меди, равном 1:400...3000;5 при концентрации пробы плазмы крови 10 -10 М и при измерении интенсивности флуоресценции на длине волны регистрации 390 — 410 нм, при длине волны возбуждающего света 325335 нм, Высший предел концентрации белков в плазме крови (10 М) обусловлен их естественной концентрацией, а нижний предел концентрации (10 М) — зоной чуцст-6 вительности способа.

Избытки перекиси водорода меньше

400-кратного по отношению к белку плазмы в присутствии соли двухвалентной меди и плазмы крови не приводят к эффекту возгорания флуоресценции. А избытки перекйси водорода больше 3000-кратного по отношению к белку плазмы в присутствии соли двухвалентной меди и плазмы крови приводят к денэтурации белков плазмы. Возгорание флуоресценции белков плазмы в присутствии перекиси водорода и 5-кратного избытка соли двухвалентной меди на 400

HM (г еоз6,330 нм) максимально, При избытках соли двухвалентной меди менее 5-кратного эффект возгорания флуоресценции менее значителен (в присутствии перекиси водорода). А при избытках соли двухвэлент5 ной меди более, чем 5-кратные в комплексе с перекисью водорода наблюдается деструкция белка.

Измерение флуоресценции на длине волны ниже 390 нм при длине волны возбуж10 дающего света ниже 325 нм ведет к недостаточной интенсивности свечения, а измерение флуоресценции на длине волны выше 410 нм при длине волны возбуждающего света 335 нм не приводит к увеличе15 ние интенсивности свечения.

Ввиду того, что интервал длин волн регистрации и возбуждающего света невелик и возможность проведения измерения интенсивности флуоресценции при его гра20 ничных значениях очевидна, авторы приводят все три примера осуществления способа с наиболее, оптимальными параметрами длины волны регистрации и длины волны возбуждающего света, а именно: дли25 на волны регистрации — 400 нм, а длйна волны возбуждающего света — 330 нм.

Примеры, подтверждающие воэможность осуществления изобретения с получе-нием положительного эффекта при

30 использовании всей совокупности существенных признаков изобретения, указанной в его формуле.

Пример 1. Больная С., 53 года, мед. карта М 3276 поступила на стационарное ле35 чение в Гродненскую областную клиническую больницу 24.02.88 r. c диагнозом: Состояние после аппендэктомии. Перитонит. Сепсис.

После клинико-лабораторных исследований б-ной С. с целью детоксикации орга4О ниэма был проведен сеанс гемосорбции.

Снижение уровня эндогенной интоксикации при проведении гемосорбции у больной определяли путем сравнения значения отношений интенсивности флуоресценции

45 анализируемой и контрольной проб с плазмой крови, взятой до и после гемосорбции.

Для этого у больной до проведения гемосорбции и последнее будет кровь (по 500 мкл).

Отделяют плазму центрифугированием при

50 3000 об/мин в течение 15 мин, Отделенную плазму (концентрация 10 a M) помещает в четыре пробирки по 100 мкл в каждую. В первые две пробирки с плазмой крови больной (no 100 мкл, концентрация 10 М), пол55 ученной до и после гемосорбции добавляют

5 мкл перекиси водорода, исходная концен. трация 7,94 М, что соответствует моля рному соотношению плазма крови; перекись водорода; сульфат меди, равному 1:400:5. Во. вторые две пробирки с плазмой крови боль1818586 ной (по 100 мкл, концентрация 10 М), hollученной до и после гемосорбции (контроль) добавки перекиси водорода и сульфата меди не производят. Затем все чвтыре пробирки с пробами плазмы крови ставят на 5 инкубацию в водяную баню при 37 С. Через

30 мин инкубации ко всем пробам добавляег no 100 мл натрий-сульфатного буфера, концентрацией 0,05 M, pH 7. разбавляя таким образом пробу в 1000 раз и получая при 10 этом концентрацию белков плазмы крови в пробе, равную 10 М, что позволяет уменьшить количество используемой для анализа плазмы. После разбавления проб прописываютт спектры флуоресценции при длине 15 волны возбуждающего света 330 нм.

Кривой 1 на фиг.1 показам спектр флу-! оресценции контрольной пробы с плазмой крови больмого, взятой до гемосорбции, а кривой1 — спектр флуоресцемции контроль- 20

II ной пробы с плазмой крови того же больного, взятой после гемосорбции. Кривой 2 на фиг.1 показан спектр флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного, взятой до гемосорбции при молярном соот- 25 ношении плазма крови: перекись водорода

: сульфат меди, равном 1:400:5. Кривой 2 спектр флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови того же больного, взя- той после гемосорбции при молярном 30 соотношении плазма крови: перекись водорода: сульфат меди, равном 1:400:5. Как видно из фигуры 1, по сравнение с контрольными пробами(кривые 1 и 1 !) в пробах, к которым добавляли перекиг(ь водорода и 35 сульфат меди (кривые 2 и .2 ), наблюдают увеличение интенсивности флуоресценцмм проб. Для определения снижения уровня интоксикации у больной С. при проведении гемосорбции находят по спектрам флуорес- 40 ценции на фиг.1 отношения значений интенсивности флуоресценции (в относительных единицах) анализируемой пробы к контрольной, с плазмой крови больной, взятой до и после проведения гемосорбции, при этом ис- 45 пользуют длину волны возбуждения 330 нм, а регистрацию ведут на максимуме флуоресценции — 400 нм. Значение интенсивности флуоресценции (кривая 2 фиг.1) анализируемой пробы с плазмой крови больной С., взятой 50 до гемосорбции, равно 23,5 отн.ед., а значение интенсивности флуоресценции (кривая

1 фиг.1) контрольной пробы с плазмой крови той же больной С„взятой также до гемосорбции, равно 5 отн.ед. Отношение 55 найденных значений интенсивности флуоресценции анализируемой пробы к контрольной, с плазмой крови взятой до гемосорбции, равно — = 4,7.

23,5

Аналогичным образом находят значение интенсивности флуоресценции аналмзируемой пробы и контрольной с плазмой крови, взятой у той же больмой С. после проведения гемосорбции. Для аналмзируемой пробы (кривая 2!! фиг.!) зто значение равно 4,8 отн.вд.. а для контрольмой (кривая

1 фиг.1) — 4,2 отн.ед.. Отсюда отношение найденных значений интенсивности флуо-, ресценции анализируемой llp00bl и контрольной с плазмой крови, взятой у 6-мой С. после гемосорбции, равно 4 - 1,14. По раз4,8 ностИ значений отношений (4.70-1,14)

3,56) интенсивности флуоресцемции анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови, взятой у больной до и после проведвмия гемосорбции, судят о снижении уровня .. мнтоксикации при проведении гемосорбции.

П ри м е р Z. больной Г.,59 лет, мед.кэрта М 6541 поступил ма стационарное лечение в Гродненскую областную климмческую больницу 14.04;88 г с диагнозом: Двуксторомняя пневмония. Сепсис. Токсическая энцефэлоп эти я.

После клинико-лабораторных мсследований больному Г. с целью детоксикации организма был проведем сеанс гемосорбции. Снижение уровня зндогемной интоксикации при проведении гемосорбции у больного определяли путем сравнения значений интенсивности флуоресцемцми анализируемой и контрольной проб с плазмой крови, взятой до м после гемосорбции. Забор крови осуществляли аналогично, как описано в примере 1. Полученную плазму помещают.в четыре пробирки по 100 мкл. В первые две пробирки с плазмой крови больного Г. (по 100 мкл концентрация 103 M), получений до и пое!ле гемосорбции добавляют 10 мкл перекиси водорода, исходная концентрация 7,94 М и 50 мкл сульфата меди, исходная концентрация 10 М, что соответствует молярному соотношению плазма крови: перекись водорода: сульфат меди, равному 1:800:5. Во вторые две пробирки с плазмой крови больного (по 100 мкл концентрация 10 М), полученной до и после гемосорбции (контроль), добавки перекиси водорода и сульфата меди не производят.

Последующую инкубацию и разбавление проб производят аналогично, как описано в примере 1. После разбавления проб прописывают спектры их флуоресценции и ри длине волны возбуждающего света 330 нм.

Кривой 1 на фиг,2 показан спектр флуI оресценции контрольной пробы с плазмой крови больного Г., взятой до гемосорбции, а кривой 1 — спектр флуоресценции конт11

1818586 рольной пробы с плазмой крови того же мой и контрольной проб с плазмой крови, больного, взятой после гемосорбции. Кри- взятой до и после гемосорбции. вой 2 на фиг,2 показан спектр флуоресценI

Забор крови осуществлялся аналогичции анализируемой пробы с плазмой крови . но. как описано в примере 1. Полученную больного, взятой до гемосорбции при мо- 5 плаэмупомещаютвчетырепробиркипо100 лярном соотношении плазма крови: перв- мкл. 8 первые две пробирки с плазмой крокись водорода сульфат меди, равном ви больного Б. (no 100 мкл, концентрация

1:800:5. Кривой 2 — спектр флуоресценции 10 М), полученной до и после гемосорбции, . аналиэируемойпробысплазмойкровитого добавляют 38 мкл перекиси водорода, исже больного, взятой после гемосорбции при 10 ходная комцентрация 7,94 М и 50 мкл срьмолярном соотношении плазма крови: пе- фата меди, исходная концентрация 10 М, рекись водорода: сульфат меди, равном чтосоответствуетмолярмомусоотношению

1:800:5. Значение интенсивности флуорес- плазма крови: перекись водорода: сульфат ценции (кривая 2 фиг.2) анализируемой меди, равному 1:3000:5. Во вторые две проI пробы с плазмой крови больного Г., вэятрй 15 бирки с плазмой коови больного(по 100 мкл, до гемосорбции, равно 26,5 отн,ед., а значе- .концентрация 10 М), полученной до и поние интенсивности флуоресцемции (кривая сле гемосорбции (контроль), добавки пере1 фиг.2)контрольнойпробысплазмойкро- киси водорода и сульфата меди не ви того же больного Г., взятой также 40 производят. Последующие имкубацию и гемосорбции, равно 6,4 отн.ед. Отношение 20 разбавление проб производят аналогично, найденных значений интенсивности флуо- как описано в примере 1. После раэбавлересценции анализируемой пробы к конт- ния проб прописывают спектры их флуоресрольной с плазмой крови. взятой до ценции при длине волны возбуждающего со б ии но 26,5 414 света 330 нм.

6,4 25 Кривой 1 на фиг.3 показан спектр флуАналогичным образом находят значе-. оресценции контрольной пробы с плазмой ния интенсивности флуоресценции эмали- крови больного, взятой до гемосорбции. а зируемой пробы. и контрольной с плазмой кривой 1 — спектр флуоресценции конт-и крови, взятой у того же больного Г. после рольной пробы с плазмой крови того же проведения гемосорбции. Для анализируе- 30 больного, взятой после гемосорбции. Кримой пробы (кривая 2п фиг;2) это значение вой 2 на фиг.3 показан спектр флуоресценравно 12,5 отн.ед., а для контрольмой (кри- ции анализируемой пробы с плазмой крови вая,1 фиг.2) — 6отн.ед. Отсюда, отношение больного, взятой до гемосорбции при моI найденных значений интенсивности флуо- лярном соотношении плазма крови: перересценции анализируемой пробы и конт- 35 кись водорода: сульфат меди, равном рольмой с плазмой крови, взятой у больного, .1 3000:5. Кривой 2 — спектр флуоресценции

П

12,5 2 анализируемой пробы с плазмой крови того

6. ™ жебольного,взятой послегемосорбциипри разности значений отношений (4,14-2,08 молярном соотношении плазма крови: пе-2,06) интенсивности флуоресценции анали- 40 рекись водорода: сульфат меди, равном зируемой пробы и контрольной с плазмой 1:3000:5. Значение интенсивности флуорескрови, взятой у больного до и после прове- ценции (кривая 2 фиг,3) анализируемой

1 дения гемосорбции судят о снижении-уров- пробы с плазмой крови больного Б., взятой ня. интоксикации при проведении до гемосорбции, равно 22 отн,ед., а эначегемосорбции. 45 ние интенсивности флуоресценции (кривая

Пример 3. Больной Б., 60 лет, мед, 1 фиг.3) контрольной пробы с плазмой крокарта М 5074 поступил на стационарное ви того же больного Б., взятой также до лечение Гродненской области клинической гемосорбции, равно 7,5 отн.ед. Отношение больницы 22.03.88 r с диагнозом: Ревма- найденных значений интенсивности флуотизм, акт, Н. Септический эндокардит. Аор- 50 ресценции анализируемой пробы к конттальмомитральный порок сердца. рольной с плазмой крови, взятой до Правосторонняя пневмония. Острая почеч— — 2

/ гемосорбции, равно — = 2,93. ная недостаточность. 7,5

После клинико-лабораторных исследо- . Аналогичным .образом находят значеваний был проведен сеанс гемосорбции. 55 ния интенсивности флуоресценции аналиСнижение уровня эндогенной интоксика- зируемой пробы и контрольной с плазмой ции при проведении гемосорбции у больно-,крови, взятой у того же больного Б, после

ro определяли путем сравнения значений проведения гемосорбции. Для анализируеинтенсивности флуоресценции анализируе- мой пробы (кривая 2 фиг.3) это значение

II равно 18,0 отн.ед.. а для контрольной (кри1818586

30

20 вая 1 фиг.3) — 6.5 отн.ед.. э отсюда отношеИ ние юйденных значений интенсивности флуоресценции анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови; взятой у больного Б. после гемосорбции, равно — 2,77. По разности значений отношений

18

6,5 (2.93-2,77-0,16) интенсивности флуоресценции анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови, взятой у больного до и после гемосорбции, судят о снижении уровня интоксикации при проведении гемосорбции.

Существенно, что добавление к плазме крови больного только одного из действующих реагентов - перекиси водорода или сульфата меди в указанных примерах молярных соотношений, не влияет иа интенсивность флуоресценции в первом случае, а во втором — ведет к незначительным изменениям интенсивности флуоресценции, затрудняя проиавести оценку снижения уровня интоксикации при проведении гемосорбции.

Предлагаемый способ позволяет, по сравнению с известным, сйизить исходную концентрацию плазмы крови в анализивуемой прббе до 10 М (в прототипе используется плазма крови с концентрацией 10 з М), при этом обеспечивается необходимая и достаточная для регистрации интенсивность флуоресценции анализируемой пробы при возбуждении флуоресценции светом с длиной волны 325 — 355 нм на длине волны регистрации 390 — 410 нм, что свидетельствует о повышении чувствительности определения уровня интоксикации более, чем на 2 порядка. Снижение концентрации плазмы крови

Э в анализируемой пробе позволяет .уменьшить количество используемой для анализа плазмы, Повышение специфичности предлагае5 мого способа по сравнению с известным достигается за счет использования в качестве добавляемых реагентов к плазме крови перекиси водорода и соли двухвалентной меди с последующим определением уровня, 10 интоксикации в относительных единицах по интенсивности флуоресценции на длине волны 390 — 410 нм при длине волны возбуж. дающего света 325-335 нм.

Ю Ф

15 . Формула изобретения

Способ определения эффективности гемосорбции, включающий забор крови до и после проведения гемосорбции, выделение . плазмы центрифугированием с последую20 щим спектрофотометрическим исследованием анализируемой и контрольной пробы, о т л и.ч а ю щ и и с-я тем. что, с целью повышения точности способа, после выделения плазмы в анализируемую пробу до25 бавляют перекись водорода и соль двухвалемтной меди при молярном соотношении 1:400 3000:5, разбавляют плазму Й

10-1000. раз, проводят флуориметрическое исследование контрольной и анализируе30 мой проб при длине волны 390-410 нм, находят показатель соотношейия интенсивности флуоресцемции анализируемой и контрольной проб и при динамическом снижении показателя в пробе, взятой

35 после гемосорбции. по сравмению с пробой до гемосорбции считают процедуру эффективной.

1818586

20 дуол(нн) 360

500 Я(нн) 500

Составитель И.Степуро

Техред М.Моргентал Корректор Н.Король

Редактор Л.Волкова

Заказ 1936 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раувская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101