Способ определения фактора виллебранда в плазме крови

 

Использование: в медицине, в клиниколабораторной практике. Цель: повышение точности способа. Сущность изобретения: приготовление взвеси отмытых формалинизированных донорских тромбоцитов 2-4 х 10 л, которые добавляют в инкубируемую смесь, содержащую 1,9 мл 0,1%-ного раствора ристомицина и 0,1 мл бестромбоцитарной цитратной плазмы, пробу центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин с последующим определением в супернатанте количества единичных тромбоцитов и расчетом относительной разности их содержания в опыте и контроле, при этом в качестве контроля используют буфер Михаэлиса. Положительный эффект: при использовании способа точность определения фактора Виллебранда повышается на 15-20 %. 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4811800/14 (22) 09,04.90 (46) 15.07.93. Бюл. ¹ 26 (71) Алма-Атинский государственный медицинский институт (72) А,М.Лившиц (56) Weiss Н.J., Hoger L.W. et al, // J.Clin, Invest. — 1973. — Vol. 53. — р, 2708. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАКТОРА

ВИЛЛЕБРАНДА В ПЛАЗМЕ КРОВИ (57) Использование; в медицине, в клиниколабораторной практике. Цель: повышение точности способа. Сущность изобретения: приготовление взвеси отмытых формалиниИзобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики заболеваний, связанных с нарушением функции форменных элементов крови и плазменных факторов свертывания и их исследования, и может быть использовано для диагностики болезни Виллебранда и гиперагрегационных синдромов.

Цель изобретения — повышение точности исследования.

Способ иллюстрируется чертежом, Способ осуществляется следующим образом.

Приготовление суспензии отмытых формалинизированных донорских тромбоцитов. Венозную кровь доноров стабилизируют 1% раствором ЭДТА — Na c

1% формалином на буфере Михаэлиса (рН

7,4) в соотношении 9:1. Кровь центрифугируют в течение 7 мин при 1500 об/мин, Полученную богатую тромбоцитами плазму центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин.

Бестромбоцитарную плазму разводят буфе. Ы, „1827624 А1 зированных донорских тромбоцитов 2-4 х

10 л, которые добавляют в инкубируемую смесь, содержащую 1,9 мл 0,1%-ного раствора ристомицина и 0,1 мл бестромбоцитарной цитратной плазмы, пробу центрифугируют при 4000 об/мин в течение

15 мин с последующим определением в супернатанте количества единичных тромбоцитов и расчетом относительной разности их содержания в опыте и контроле, при этом в качестве контроля используют буфер Михаэлиса. Положительный эффект; при использовании способа точность определения фактора Виллебранда повышается на 15-20

%,1ил. ром Михаэлиса от 1:2 до 1:128 и используют в качестве стандарта для построения калибровочной кривой, Тромбоцитарный осадок ресуспендируют в 1% растворе ЭДТА-Na без формалина на буфере Михаэлиса и дважды отмывают с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 4000 об/мин, Затем надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в буфере

Михаэлиса таким образом, чтобы в полученной взвеси содержалась 4 — 8 х 10 /л тром12 боцитов. Полученная взвесь в пластикатном контейнерехранится при+4 Свтечение2 — 3 месяцев.

0,3 мл полученной из пальца крови смешивают в пластиковой пробирке с 0,05 мл

3,8 раствора цитрата натрия. Пробирку закрывают пластиковой пробкой, перемешивают без встряхивания и центрифугируя

20 мин при 3000 об/мин (200g). В две пластиковые пробирки наливают по 1,8 мл 0,1% раствора ристомицина и 0,1 мл взвеси отмытых формалинизированных донорских

1827624 тромбоцитов, Затем в опытную пробирку вносят 0,1 мл плазмы обследуемого, в контрольную — 0,1 мл буфера Михазлиса. Пробирки закрывают пластиковыми пробками, перемешивают путем переворачивания, инкубируют 10 мин при комнатной температуре и центрифугируют в течение 2 мин при

1500 об/мин (150g) для осаждения тромбоцитарных агрегатов. Из среднего слоя полученных супернатантов подсчитывают количество единичных тромбоцитов на автоматической системе "Лаборскель" при следующих параметрах; диаметр измерительного капилляра — 70 мк, режимы ID, 70,I4, М. Устанавливаются пороги дискриминации: нижний — 0,4 В, верхний — 10 В, Вычисление индекса ристомициновой агрегации отмытых формалинизированных донорских тромбоцитов (ИРАТ); а — в

ИРАТ =, где а — количество едиа ничных тромбоцитов в супернатанте контрольной пробы, в — количество единичных тромбоцитов в супренатантной опытной пробы.

Построение калибровочной кривой, Используя полученные бестромбоцитарные плазмы доноров и приготовленные из их смеси стандартные разведения, определяют в каждом из них ИРАТ по описанной выше методике, Полученные данные наносятся нэ билогарифмическую систему координат, в которой кривая имеет вид прямой линии, отражающей зависимость ИРАТ от концентрации фактора Виллебранда в плазме, Полученная кривая может быть описана формулой: ФВ / = е . х 100/, где у — индекс ристомициновой агрегации тромбоцитов (ИРАТ). По данной формуле может быть построена таблица, использование которой, на наш взгляд, удобнее, чем нахождение нужных значений фактора

Виллебранда на ее графическом аналоге— калибровочной кривой, Пример 1. Больная В„19 лет, история болезни N 113, поступила s гематологическое отделение Республиканской клинической больницы 12.01.90 г с диагнозом:

"Коагулопатия неясного генеза", На коже предплечий, голеней единичные подкожные кровоизлияния, Менструации по 6 — 7 дней обильные. У родной сестры также отмечаются длительные и обильные менструальные кровотечения, синяки на коже. При исследовании системы гемостаза; длительность кровотечения по Шитиковой — свыше 8 мин, легкая гипокоагуляция по внутреннему механизму (АПТ — 48 сек при норме — 40 сек).

После прокола мягких тканей пальца у больной получено 0,3 мл крови, которая немед5

55 ленно была смешана с 0,05 мл 3,8 / раствора цитрата натрия в пластиковой пробирке.

Проба была отцентрифугирована 20 мин при 3000 об/мин (200g), По описанному методу был определен ИРАТ вЂ” 0,44, По формуле определено содержание фактора

Виллебранда — 11,8%. У больной была диагностирована болезнь Виллебранда средней степени тяжести.

Пример 2, Больной С„29 лет, история болезни N 242, поступил в гематологическое отделение Республиканской клинической больницы 29,01,90 г, с диагнозом:

"Геморрагический васкулит, кожно-суставная форма 2. На коже голеней у больного была обильная, сливная, симметричная геморрагическая сыпь, беспокоили сильные боли в голеностопных суставах, При исследовании системы гемостаза выявлены гиперкоагуляция, тромбинемия, депрессия фибринолиза. По описанному методу был определен ИРАТ вЂ” 0,915, что соответствовало содержанию фактора Виллебранда в плазме — 160/о. У больного был диагностирован выраженный гиперагрегационный синдром, связанный с распространенным поражением зндотелия мелких сосудов и повышенным выбросом в кровоток фактора

Виллебранда, что приводило к сильной и необратимой агрегации тромбоцитов и ухудшению микроциркуляции.

Таким образом, в результате проведенных экспериментальных и клинических исследований установлено, что эффект, достигаемый при использовании заявляемого способа определения фактора

Виллебранда в плазме крови, заключается в повышении точности исследования в связи с уменьшением ошибки метода, повышении его чувствительности и воспроизводимости, а также в уменьшении объема крови, необходимой для исследования, что может быть использовано для повышения качества диагностики болезни Виллебранда и гиперагрегационных синдромов при различных заболеваниях, протекающих с поражением сосудистого зндотелия.

Формула изобретения

Способ определения фактора Виллебранда в плазме крови, включающий приготовление взвеси отмытых формалинизированных донорских тромбоцитов, получение бестромбоцитарной цитратной плазмы и инкубацию в течение 10 мин при комнатной температуре с 0,1 /-ным раствором ристомицина, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, в 1,9 мл инкубационной смеси, содержащей 2-4 10 /л донорских тромбоци11 тов в 0,1/-ном растворе ристомицина, 1827624

0,9

0,8

0,7

0,и

0,5

0,4

0,З

О, ".

0,:,0 wag

40

Составитель А.Лившиц

Техред М.Моргентал Корректор Г.Кос

Редактор

Заказ 2357 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Ра шская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 добавляют 0,1 мл бестромбоцитарной плазмы, пробу центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин с последующим определением в супернатанте количества единичных тромбоцитов и расчетном относительной разности их содержания в опыте и контроле, при этом в качестве контроля используют буфер Михаэлиса.