Способ получения 1,2-дегидропроизводных кортикостероидов
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения дегидропроизводных стероидных соединений. Цель изобретения повышение эффективности процесса трансформации за счет снятия ингибирования субстратом при увеличении его исходной концентрации. Сущность способа сводится к тому, что исходный субстрат кортикостероид трансформируют с помощью штамма Arihrobacter globiformis ИБФМ 193 в присутствии 
-циклодекстрина и вещества, снимающего трансмембранный потенциал. В качестве последнего используют аминокислоту или a -кетоглутаровую кислоту, или никотинамид, или ацетат ретинола, или их сочетания. Это позволяет увеличить количество трансформируемого субстрата до 5 10 г/л среды, степень превращения до 99,5% Для трансформации с целью повышения технологичности способа можно использовать иммобилизованные клетки микроорганизма. 2 з.п. ф-лы.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения дегидропроизводных стероидных соединений. Цель изобретения повышение эффективности процесса трансформации за счет снятия ингибирования субстратом при увеличении его исходной концентрации, а также повышение технологичности способа. Одним из факторов, регулирующих скорость дегидрирования гидрокортизона микробной клеткой, является активность дыхательной цепи, находящейся в свою очередь под контролем трансмембранного потенциала. В присутствии гидрокортизона повышается не только трансмембранный потенциал клеток, но и уровень восстановленных пиридиннуклеотидов. Это позволяет предположить, что при трансформации гидрокортизона создаются условия для протекания обратной реакции 1,2-восстановления преднизолона даже у клеток с эндогенным дыханием, близким к нулю. Это и приводит к постоянному присутствию в продукте остаточного субстрата гидрокортизона. В связи с этим регуляцию реакции (сдвиг равновесия в сторону образования преднизолона) можно осуществить путем уменьшения трансмембранного потенциала ( 
) или уменьшая общий энергетический потенциал клетки путем добавления в реакционную среду веществ, первые этапы метаболизма которых, включая транспортные процессы, сопряжены с потреблением энергии в виде трансмембранного потенциала, НАД(Ф)Н или АТФ. В числе таких веществ могут быть аминокислоты (глицин, глутаминовая, цистеиновая, оксипролин, аминоадипиновая), кетокислоты ( 
-кетоглутаровая кислота), витамин А или их сочетания -кетоглутарат и глицин, никотиновая и глутаминовая кислоты). Использование этих веществ для повышения эффективности (интенсификации) процесса 1,2-дегидрирования стероидов позволяет, не оказывая токсичного действия, понижать трансмембранный потенциал микробных клеток. Несмотря на то, что поступление указанных веществ в клетку сопряжено с потреблением энергии, эти вещества или продукты их превращения могут быть в дальнейшем использованы клеткой для конструктивного метаболизма, что способствует увеличению стабильности при длительном использовании иммобилизованных клеток для проведения повторяющихся процессов трансформаций. П р и м е р 1. Культуру Arthrobacter globiformis ИБФМ 183 выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 мл на кукурузно-глюкозной среде (глюкоза 1% кукурузный экстракт 1%) в присутствии индуктора 3-кетостероид-1-ен-дегидрогеназы ацетата кaртизона (20 мг%) в течение 16 ч при перемешивании 200 об/мин и температуре 29оС. Клетки отделяют от среды центрифугированием при 4500 g, дважды отмывают 0,01 М Na-фосфатным буфером, рН 7,2, и готовят суспензию клеток 10 мг/мл. Полученную суспензию клеток инкубируют в течение 24 ч в фосфатном буфере при 30оС, 220 об/мин, после чего центрифугиpуют, готовят новую суспензию 20 мг/мл, которую используют в работе. Трансформацию гидрокортизона осуществляют следующим образом. В колбы объемом 250 мл, содержащие 50 мл буферного раствора, добавляют 750 мл -циклодекстрина, 250 мг порошка гидрокортизона, 40 мг (сухой вес) клеток, 37,5 мг (10 мм) глицина. Процесс проводят при 28оС при 200 об/мин. Превращение заканчивается за 4 ч, при этом по данным тонкослойной хроматографии в реакционной среде содержится 99% преднизолона, 1% остаточного гидрокортизона. Удельная активность клеток составляет 0,28 мкмоль мин-1 мг-1 клеток, тогда как в отсутствии глицина 0,18 мкмоль мин-1 мг-1 клеток (в отсутствие как глицина, так и -циклодекстрина эта величина равна 0,14 мкмоль мин-1 мг-1 клеток). П р и м е р 2. Выращивание клеток и трансформацию гидрокортизона осуществляют, как указано в примере 1, за исключением того, что в реакционную смесь вместо глицина вносят 30,8 мг (5 мМ) никотиновой кислоты. Превращение заканчивается за 6 ч, при этом в реакционной смеси по данным тонкослойной хроматографии содержится 99% преднизолона и 1% гидрокортизона. П р и м е р 3. Выращивание клеток и трансформацию гидрокортизона осуществляют, как указано в примере 1, за тем исключением, что в реакционную смесь вместо глицина вносят 73,5 мг Д-глютаминовой кислоты (10 мМ). Превращение заканчивается за 6 ч. В реакционной среде по данным тонкослойной хроматографии содержится 98% преднизолона, 1,5% гидрокортизона, следы 20 -оксипроизводного преднизолона. П р и м е р 4. Выращивание клеток осуществляют, как описано в примере 1. Иммобилизацию проводят следующим образом. В предварительно охлажденную полимеризационную камеру вносят 22 мл раствора, содержащего 3,8 г акриламида и 0,2 г метиленбисакриламида, 6 мл раствора персульфата аммония (10 мг/мл) и 12 мл суспензии клеток (50 мг/мл). Общий объем смеси 40 мл. Смесь тщательно перемешивают, добавляя по каплям 0,2 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина. После начала гелеобразования (через 2-3 минуты) полимеризационную камеру переносят в холодильник (минус 18оС) и выдерживают 10 мин до завершения процесса гелеобразования. Образовавшийся блок геля фрагментируют, продавливая его через сито 1,25 мкм. Полученные гранулы тщательно промывают стерильной водопроводной водой декантацией 5-8 раз. Получают около 80 мл гранул, содержащих 4,5 мг клеток (сухой вес), мл-1 гранул. Трансформацию гидрокортизона осуществляли следующим образом. В колбу объемом 250 мл помещали 50 мл буфера, 20 мл гранул, 750 мг -циклодекстрина, 250 мг гидрокортизона, 37,5 мг глицина (10 мМ). Условия реакции описаны в примере 1. Превращение завершается за 1,5 ч. По данным тонкослойной хроматографии в реакционной среде содержится 96,5% преднизолона, 1,5% гидрокортизона и 2% 20 -оксипроизводного преднизолона. Культуральную жидкость экстрагируют этилацетатом. Экстракт упаривают. Остаток (0,29 г) растворяют при кипении в 7 мл смеси хлороформа:метанол (10: 1, V/V) и пропускают через угольную подушку. Растворитель упаривают, отгоняя метанол в виде азеотропной смеси с хлороформом до остаточного объема хлороформа 0,5 мл, выдерживают 12 ч при 5оС. Осадок отфильтровывают, промывают 1,5 мл охлажденного хлороформа. Получают 0,215 г преднизолона (86% от теоретического), удовлетворяющего требованиям фармакопеи. Содержание примесей 3% остаточный гидрокортизон 1,5% П р и м е р 5. Выращивание клеток осуществляют, как описано в примере 1. Иммобилизацию клеток и трансформацию гидрокортизона проводят, как описано в примере 4, за исключением того, что в реакционную смесь вносят 500 мг гидрокортизона (10 г/л), 3 г -циклодекстрина и 75,1 мг глицина (20 мМ). Превращение проходит за 3 ч. По данным тонкослойной хроматографии в реакционной смеси содержится 97% преднизолона, 2% гидрокортизона, 1% 20 -оксипроизводного преднизолона. Без потери активности в указанных условиях иммобилизованные клетки могут быть использованы для получения преднизолона по крайней мере 40 раз. П р и м е р 6. Выращивание клеток осуществляют, как указано в примере 1. Иммобилизацию проводят, как указано в примере 4. Трансформацию гидрокортизона (10 г/л) проводят, как указано в примере 5, за тем исключением, что в реакционную среду вместо глицина вносят 146,1 мг (20 мМ) кетоглутаровой кислоты. Реакция проходит за 3 ч. По данным тонкослойной хроматографии в реакционной смеси содержится 97% преднизолона, 2% гидрокортизона и 1% 20 -оксипроизводного преднизолона. П р и м е р 7. Выращивание клеток осуществляют, как описано в примере 1. Иммобилизацию клеток проводят, как указано в примере 4. Трансформацию гидрокортизона (10 г/л) проводят как в примере 5, за тем исключением, что в реакционную смесь вместо глицина вносят 169,2 мг (20 мМ) L-цистеиновой кислоты. Реакция проходит за 3 ч. По данным тонкослойной хроматографии в реакционной среде содержится 99% преднизолона, 1% гидрокортизона. П р и м е р 8. Выращивание клеток осуществляют, как указано в примере 1. Иммобилизацию проводят, как указано в примере 4. Трансформацию гидрокортизона (10 г/л) проводят как в примере 5, за тем исключением, что реакционную смесь вместо глицина вносят 15000 МЕ (5 капель масляного раствора) витамина А. Превращение заканчивается за 5 ч, при этом в реакционной смеси по данным тонкослойной хроматографии содержится 99% преднизолона и 1% гидрокортизона. П р и м е р 9. Выращивание клеток осуществляют, как описано в примере 1. Трансформацию 6 -метилгидрокортизона осуществляют следующим образом. В колбы объемом 250 мл, содержащие 47 мл буфера добавляют 150 мг -циклодекстрина, 100 мг 6 -метилгидрокортизона, растворенного в 1 мл метанола, 18,7 мг (5 мМ) глицина и 2 мл суспензии клеток, 40 мг (сухой вес). Трансформацию проводят, как указано в примере 1. Превращение заканчивается через 4 ч. По данным хроматографического анализа в реакционной среде содержится 99,5% 6 -метилпреднизолона, 0,5% остаточного 6 -метилгидрокортизона. Удельная активность клеток составляет 0,09 мк моль 
мин-1 мг-1 клеток. В отсутствии глицина эта величина составляет лишь 0,04 мкмоль мин-1 мг-1 клеток, а превращение заканчивается за 7 ч. В отсутствие и -циклодекстрина и глицина превращение 6 -метилгидрокортизона осуществляется лишь на 20% П р и м е р 10. Выращивание клеток осуществляют, как указано в примере 1. Трансформацию 6 -метилгидрокортизона проводят следующим образом. В колбы объемом 250 мл помещают 43 мл буфера, 500 мг -циклодекстрина, 500 мг 6 --метилгидрокортизона, растворенного в 4 мл метанола, 37,5 мг глицина и 4 мл (20 мг/мл) суспензии клеток. Превращение заканчивается за 10 ч. При этом по данным тонкослойной хроматографии в реакционной среде содержится 99% 6 -метилпреднизолона и 1% 6 --метилгидрокортизона. П р и м е р 11. Выращивание культуры осуществляли, как описано в примере 1. Иммобилизацию проводят, как описано в примере 3. Трансформацию 6 -метилгидрокортизона (10 г/л) иммобилизованными клетками проводят следующим образом. В колбу, содержащую 90 мл буфера, вносят 6 г -циклодекстрина, 30 мл гранул полиакриламидного геля с иммобилизованными клетками, 37,5 мг (10 мМ) глицина и 1 г 6 -метилгидрокортизона в 8 мл метаноле. Реакцию проводят, как указано в примере 1. Трансформация заканчивается за 12 ч. По данным тонкослойной хроматографии в реакционной среде содержится 98% 6 -метилпреднизолона, 1% 6 -метилгидрокортизона и 1% 20 -оксипроизводного 6 -метилпреднизолона. К ферментационной среде прибавляют 50 мл этилацетата, перемешивают 1 ч при 40оС. Охлаждают до комнатной температуры. Выпавший циклодекстрин, содержащий незначительное количество 6 метилпреднизолона, отфильтровывают. Вес высушенного осадка 3,68 г. Этилацетат упаривают в вакууме. Получают 0,87 г технического 6 -метилпреднизолона. Смесь циклодекстрина и 6 -метилпреднизолона (3,68 г) кипятят 10 мл смеси хлористый метилен:метанол (1:1). После упаривания с меси растворителя осадок отфильтровывают и получают дополнительно 0,18 г технического 6 -метилпреднизолона. Вес высушенного циклодекстрина 3,5 г. Технический продукт (1,05) растворяют в 38 мл кипящей смеси хлороформ метанол (10:1, V/V), фильтруют через слой угля (1 г). Растворитель упаривают, отгоняя метанол в виде азеотропной смеси с хлороформом. Остаточный объем хлороформа 1 мл. Суспензию выдерживают 12 ч при 5оС. Осадок отфильтровывают, промывают хлороформом. Получают 0,89 г (89,4%) 6 -метилпреднизолона со следующими характеристиками: содержание остаточного 6 -метилгидрокортизона 1,5% следы 20, -производного 6 -метилпреднизолона, температура пл. 231,5оС, Д + 81,4% содержание основного вещества 95% Полученный 6 -метилпреднизолон (0,89 г) повторно очищают следующим образом: растворяют при кипении в 2,7 мл смеси хлороформ-метанол (4:1), пропускают вторично через угольную подушку и к полученному раствору при перемешивании добавляют по каплям 9 мл воды. Перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Выпавший 6 -метилпреднизолон отфильтровывают, промывают охлажденным хлороформом, получают 0,83 г (85% от теоретического) 6 -метилпреднизолона, почти белого кристаллического продукта, с содержанием основного вещества 97% т.е. удовлетворяющего требованиям фармакопеи. П р и м е р 12. Выращивание клеток осуществляют, как описано в примере 1, иммунобилизацию как описано в примере 4. Трансформацию проводят следующим образом. В колбы объемом 250 мл помещают 50 мл буфера, 20 мл гранул геля с иммобилизованными клетками, 250 мл ацетата 6 -метилгидрокортизона, 1,5 г -циклодекстрина и 37,5 мг глицина, 73 мг кетоглутарата. Реакцию проводят при 28оС, 220 об/мин. Превращение заканчивается за 20 ч. По данным тонкослойной хроматографии в реакционной смеси содержится 90% ацетата 6 -метилпреднизолона, 6% 20 -оксипроизводного ацетата 6 -метилпреднизолона, 0% остаточного ацетата 6 -метилгидрокортизона. Данные, указанные в примерах, обобщены в таблице. В отсутствие -циклодекстрина и глицина превращение осуществляется лишь на 15% Таким образом, за счет совместного применения -циклодекстрина и веществ, нетоксичных для клетки, естественным образом понижающих трансмембранный потенциал, ускоряющих реакцию, способ позволяет повысить исходную концентрацию субстрата до 10 г/л (для гидрокортизона и преднизолона), уменьшить ингибирование субстратом, в случае дегидрирования 6 -метилгидрокортизона его исходная концентрация увеличивается от 1,4 до 10 г/л, повысить степень превращения субстратов: гидрокортизона от 85 до 99% 6 -метилгидрокортизона от 20 до 99% ацетата 6 -метилгидрокортизона от 15 до 90% увеличить скорость реакции в 2 раза, повысить технологичность процесса за счет использования иммобилизованных клеток (могут быть использованы до 40 раз).
Формула изобретения
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1,2-ДЕГИДРОПРОИЗВОДНЫХ КОРТИКОСТЕРОИДОВ путем трансформации кортикостероидов с помощью микроорганизма вида Arthrobacter globiformis в присутствии -циклодекстрина и вещества, снижающего трансмембранный потенциал, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса трансформации за счет снятия ингибирования субстратом при увеличении его исходной концентрации и увеличения степени превращения в качестве трансформирующего микроорганизма, используют штамм Arthrobacter globiformis ИБФМ 193, а в качестве вещества, снижающего трансмембранный потенциал, используют аминокислоту, или a -кетоглутаровую кислоту, или никотинамид, или ацетат ретинола, или их сочетания. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аминокислоты используют глицин, или оксипролин, или глутаминовую кислоту, или цистеиновую кислоту. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что, с целью повышения технологичности способа, трансформацию проводят иммобилизованными клетками микроорганизма.MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 16.12.2003
Извещение опубликовано: 20.10.2004 БИ: 29/2004
