Способ получения смеси милбемицинов @ , @ , @ , @ и @

 

Использование: фармацевтическая промышленность , ветеринария и медицина. Сущность способа заключается в том, что штамм Streptomyces hygroscopicus subsp. aureolacrimpsus.. SANK 6028 PERM BP- 1190 культивируют в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, в течение 5-15 дней при 22-30°С и выделяют целевой продукт из фильтрата культуральной жидкости. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

<5»s С 12 Р 19/54

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ он (21) 4203955/13 (22) 10.12.87 (31) 61 — 295542 (32) 11.12.86 (33) ) Р (46) 23;08.93. Бюл. f4 31 (71) Санкио Компани Лимитед (JP) (72) Такао Оказаки, Судзи Танахаси, Сейго

Ивадо, Кейдзи Танака, Тосиаки Янаи и Хисаки Кадзино (JP) (56) Патент США М 3950360, кл. 549-264, 1975.

Изобретение касается способа получениясмесимилбемицинов а«, а12, а1э. а14, Q15, веществ, которые обладают ценными акарицидной, инсектицидной и противогельминтной активностями, Эти вещества представляют собой макролиды, химически родственные известным милбемицинам, авермектинам и другим подобным соединениям. Они имеют структуру, основанную на шестнадцатичленном макролидном цикле, и получаются путем ферментации различными микроорганизмами или полусинтетически, путем получения производных таких ферментационных продуктов.

Для того, чтобы избежать недоразумений, далее в тексте приводятся ссылки на формулу(А) гипотетического родового вещества, в которой дана нумерация некоторых атомов углерода: о

Q з

„„ Ж „„1836426 АЗ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИЛБЕМИЦИНОВ а«.а а,а з,а д иа >5 (57) Использование: фармацевтическая промышленность, ветеринария и медицина, Сущность способа заключается в том, что штамм Streptomyces пудгоэсор!сов subsp.

aureoiacrirnosus, ЯАМК 6028 FERIA ВР—

1190 культивируют в аэробных условиях в. питательной среде, содержащей источники углерода, азота, в течение 5 — 15 дней при

22 — 30 С и выделяют целевой продукт из фильтрата культуральной жидкости. 3 табл.. Все различные классы известных макролидных соединений, родственных милбемицину, обладают одним или несколькими типами активности в качестве антибиотика, антигельминтного, эктопаразитицидного, акарицидного или другого пестицидного агентов. Однако, пока еще существует необходимость в обеспечении веществ с моди- ф фицированной активностью против одного или нескольких классов паразитов, Целью изобретения является предоставление макролидных веществ, имеющих С9 модифицированную паразитицидную ак- (д тивность, и обеспечение способа получения (, таких веществ. фь

Было обнаружено, что активность производных милбемицина может быть моди- р фицирована путем введения ненасыщенной сложноэфирной группы в положение-4, вместо 4 — метильной группы. Конкретно, настоящее изобретение обеспечивает 26-алкеноилокси-производные милбемицина и родственных макролидов.

Таким образом, изобретение обеспечивает вещества, имеющие формулу (i) 1836426 сн сн в которой: -Х-Y-представляет собой -СН2СН2, - CH2 CHOH СН СН или СН

С(=О)81аредставляет собой метильную группу, этильную группу, вторичную бутильную группу или группу формулы -С(СНз)=СНОБ, в которой RG представляет собой метильную группу, этильную группу или изопропильную группу: R2 представляет собой группу формулы . (Сн2) c(Rg)=c{R7}(RQ), в «отарой fl представляет собой О, 1 Или 2, Re и Вт каждый представляет собой атом водорода или метильную группу, и Rs является атомом водорода, алкильной группой С1-С4, фенильной группой, или фенильной группой, замещенной одним или более атомов галогена, метильной или нитрогруппами; Йз представляет собой атом водорода, метильную группу, гидрокси-защищающую группу или остаток, образующий сложный эфир карбоновой кислоты, или кислотный остаток; и 84 представляет собой атом водорода или альфа-1-олеандросил-альфв+олеандросилокси-группу, при условии, что Я4 представляет собой атом водорода, когда группа

R1 представляет собой метильную группу, этильную группу, или группу формулы—

С(СНз)=СНИь в которой Rg является метильной группой, этильной группой или изопропильной группой.

Вещество по изобретению может использоваться 8 паразитицидной композиции, которая может иметь антигельминтную, акарицидную, инсектицидную или прочую активность. Эта композиция включает вещество формулы (1) в смеси с фармацевтически, сельскохозяйственно; ветеринарно или садоводчески приемлемым носителем или разбавителем.

Кроме того, это изобретение обеспечивает также обработку или защиту животных (в том числе людей) или растений от повреждения паразитами, выбранными из акаридов, гельминтов и насекомых, причем этот способ включает применение или назначение вещества формулы (1) названным животным, указанным растениям или семенам указанных растений, или на место обитания указанных животных, растений или семян, Некоторые из веществ формулы (l) могут быть получены как ферментационные продукты.

Изобретение обеспечивает способ получения вещества формулы (1), в которой — Х вЂ” 1

Y- представляет собой группу -СН2 — СН2-, Вз и R4 каждый представляет собой агом водорода; и 1) Я1 является метильной группой, а В2 представляет собой 2-метил-1-пропенильную группу, 2) R1является метильной группой, и R2 представляет 2-метил-1-бутенильную группу, или 3) R1является этильной группой, à R2 представляет собой 2-метил-1пропенильную группу, Здесь такие вещества называются ми:".бемицинами альфа11 (возможность 1), приведенная выше), альфа1з (возможность 2), приведенная выше) и альфа14 (возможность

20 3), данная выше). Они могут быть получены путем культивирования t :poäóêòèâíûx микроорганизмов рода Streptomyces. Такой микроорганизм представляет собой штамм

SANK 60286, принадлежащий к роду

25 Streptomyces, который был выделен из почвы города Миура, префектура Канагава, Япония.

Милбемицины альфа11, альфа1з и альфа14 образуют часть ряда веществ, которые

30 выделены из ферментационного бульонаStreptomyces штамм SANK 60286 и названы милбемицинами от альфа11 до альфа 15, как показано ниже;

R1 R2

3 альфа11 метил 2-метил-1-пропенил ал ьфа 12 мстил изобутил альфа1з метил 2-метил-1-бутенил альфа14 атил 2-метил-1-пропенил альфа15 атил изобутил

40 Характеристики Streptomyces SANK

60286

Микологические свойства актиномицетов штамма SANK 60286 приведены ниже.

1. Морфологические характеристики.

4 Этот штамм, как показано микроскопически, имеет разветвленный от светло-желтого до желтовато-коричневого основной мицелий, из которого удлиняется от белого до желтовато-серого аэриальный мицелий

60 со спиральными терминалами. В растущей цепочке спор наблюдаются 10 или более спор в линию, причем споры имеют бородавчато-морщинистую поверхность. Этот штамм образует в некоторых типах сред прозрачную золотую слизь на поверхности аэриального мицелия, причем эта слизь изменяется до желтоватых пятен в процессе культивирования. Иногда образуются чер1836426 новатые пятна вследствие влажности на поздней стадии культуры.

2. Рост на различных средах

Этот штамм проявляет свойства, которые показаны в табл. 1 после культивирова- 5 ния при 28 С в течение 14 суток на различных средах. Использованные здесь названия цветов и номера были приписаны на основании "Правила по стандарту цвета", — справочника, опубликованного фирмой "Ниппон Шикисай Кенкюшо".

После культивирования при 28 С в течение 14 суток на среде Придхам-Готтлибова

arapa, для штамма SANK 60286 отмечено использование источником углерода, как показано ниже.

Сахар Использование

0-глюкоза ++

L-арабиноза

++

D-ксилоза + изо инозитол ++

D-маннитол ++

D-фру кто за

++

L-рамн оза

++ сахароза

++ раффин оза

++ контроль

++ хорошо используется

+ используется — не используется

4, Клеточные компоненты

Стенка клеток штамма SANK 60286 была исследована в соответствии со способом, описанным В,Becker с сотрудниками в журнале(АррНед Microbiology 12, 421 (1964). Так как 1, 1-диаминопимелиновая кислота и глицин могут быть детектированы, было пока- 40 зано, что клеточная стенка относится к стенке типа 1. Затем сахарные компоненты во всех клетках были исследованы согласно методу, описанному М, P.Lecheva-Lier в журнале (J; of Laboratory and Clinical Medicine, 45

1968, том; 71, 934). Не наблюдалось никаких характеристичных структур.

В итоге, было показано, что этот штамм принадлежит к роду Streptomyces актиномицетов. 50

Идентификация Streptomyces штамм

SANK 60286 была осуществлена в соответствии со стандартом ISP (Международная

Программа Streptomyces); Бергеевским справочником определительной бактерио- 55 логии; восьмое издание; книгой S .À.Waksman, "Actinomycetes"; и другими недавними работами по актиномицетам.

Когда свойства штамма SANK 60286 были сопоставлены с таковыми для других известных видов рода Streptomyces, то морфологические и физиологические свойства были почти идентичны таковым для

Streptomyces hygroscopicus субспоры

aureo-lacrimosus (J. Antibiotics, том. 36, 438 (1983).

Однако наблюдалось небольшое различие в свойствах культур между этими двумя штаммами. Хорошо известно, что свойства актиномицетов изменяются в некоторой степени даже для того >ке самого штамма после нескольких последовательных выращиваний. Поэтому штаммы не всегда могут быть дифференцированы таксономически из-за небольшого различия в свойствах культуры, По этим причинам, штамм SANK 60286, который продуцирует милбемицины альфа1, альфад, альфа э, альфаи и альфа1, был идентифицирован как Streptomyces

hygroscopicus субспоры aureolacrimosus

SANK 60286. Этот штамм был депонирован в соответствии с постановлением Будапештского Договора от 20 октября 1986 r., при

Исследовательском институте ферментации, Япония, причем ему присвоен вступительный номер ГЕРМ BP — 1190. Образцы этого штамма могут быть доступны по соответствующим постановлениям Будапештского Договора.

Актиномицеты,включающие Streptomyces

hygroscoplcus субспоры aureolactimosus SANK

60286, легко претерпевают мутацию как в результате естественных факторов, так и в результате искусственных обработок, таких как ультрафиолетовое облучение, радиационная обработка и химическая обработка.

Настоящее изобретение охватывает все продуктивные мутанты штамма SANK

60286, Эти мутантные штаммы также включают любые штаммы, которые получают генным манипулированием, таким как генная рекомбинация, трансдукция и трансформация, Иными словами. это изобретение включает все такие штаммы, которые могут производить один или несколько милбемицинов альфа11, альфа1з и альфа14, N особенно штаммы, которые не могут быть четко дифференцированы от штамма SANK 60286 или его мутантов.

Милбемицины альфа11, альфа1з и альфа14 могут быть получены путем культифирования штамма SANK 60286 в подходящей среде и путем отбора милбемицинов из этой среды. В качестве питательных веществ могут быть использованы традиционные соединения, которые обычно применяются для выращивания микроорганизмов рода

1836426

Streptomyces. Например, источником углерода может быть глюкоза, сахароза, крахмал, глицерин, густой солодовый сироп, моляссы или соевое масло. Кроме того для примера, источником азота может быть соевый порошок, пшеничные зерна, мясной экстракт, пентон, дрожжевые клетки, жидкость для замачивания кукурузы, сульфат аммония или нитрат натрия. В случае необходимости, в подходящем сочетании могут быть использованы органические и неорганические добавки, которые промотируют рост микроорганизмов и активиру1от производство милбемицинов альфэ11, альфа1з и альфа 14, а также неорганические соли, такие как карбонат кальция, хлорид натрия и фосфаты.

Наиболее пригодным для культивирования микроорганизмов является жидкостное выращивание, в особенности глубокая жидкостная культура, которая используется таким же способом, как M в традиционнЫх способах получения антибиотиков. Выращивание проводится аэробно. Подходящая температура для выращивания составляет от 22 С до 30 С, причем в большинстве случаев выращивание проводится около 28 C.

Производство милбемицинов альфа11, альфа1з и альфа14 обычно достигает максимума через 5-15 суток или при выращивании со встряхиванием, или при выращивании в емкости, Получение милбемицинав альфа11, альфа1з и альфа14 может быть прослежено с помощью следующей методики. Один миллилитр культивируемого материала отбирают в небольшую пробирку и добавля от 9 мл

80 -ного водного метанола. Пробирку встряхивают и центрифугируют. Используют жидкостную хроматографию высокого разрешения (такую как Эйч — 2151, колонка с обратной фазой Оу-Ди-Ос размером 6 х 150 мм, фирма Сеншу Ко, и насос фирмы Хитачи, модель 655). Вводят дозу 5 мкл образца и элюируют ее смешанным растворителем из ацетонитрила и воды (80: 20) при скорости потока 1,5 мл/мин. Милбемицины альфа11, альфа1з и альфа14, регистрируются с помощью блока обработки данных (такого как

Эм-Си-Пи-Ди-350 Йи-Си фирмы Юнион

Тех, Инструм.).

Для отбора милбемицинов вльфа11, альфа1з и альфа14 из культурной среды может использоваться адсорбент, такой как активный углерод, оксид алюминия или силикагель; синтетический адсорбент, такой как

Диаион Эйч-.Пи-20 (фирма Мицубиши Хем.

Инд. Лтд.) адсорбент, такой как Авицел

50 (Теюапусйнз), цитрусового красного клещика (Рапопусйнз), Европейского красного клещика и ржавчинных клещиков, которые являются паразитами для фруктовых деревьев, овощей и цветущих растений и против ixod, Dermanysside, Sarcoptidae u других паразитов, которые паразитируют на животных. Кроме того, эти вещества обладают активностью против Оезтгнз, Ыссйа, Hypoderma, Gautraphlius, блох и вшей, среди которых другие являются паразитами в

Отношении животных и птиц; домашних на(фирма Асахи Хем. Инд. Ко, Лтд) или фильтровальная бумага; ионообменная смола; или фильтрующий материал ионообменного геля, Наиболее эффективна следующая ме5 тодика, Культивируемый материал фильтруется с использованием фильтрующего средства, такого как диатомит. Полученная при фильтровании лепешка экстрагируется метано"0 лом, для того. чтобы растворить целевые соединения в водном метаноле, Добавляют воду, и смесь экстрагируют гексаном. Гексановый раствор выпаривают при пониженном давлении, получая маслянистое вещество, которое содержит милбемици,: . альфа11, альфа1з и альфам, Это маслянистое вещество, содержащее милбемицины альфа11, альфа1з и альфа14, адсорбируют на колонке Лобар Si 60 (фирм;: Мерк. размер Би) и эл1оируют его смешанным растворителем из гексана и этилацетата (80: 20), отбирая фракции, каждая из которых содержит милбемицины альфа11. альфа1з или альфа14, Каждую фракцию, содержащую любой иэ милбемицинов, выпаривают при пониженном давлении, получая маслянистое веще.ство. Это масло смешивают с небольшим количеством метанола, адсорбируют раствор на колонке Лобар Ap — Ми-8 (фирма

Мерк, размер Би) и элюируют смешанным растворителем из ацетонитрила и воды (80:

20). Собирают фракции, каждая из которых содержит одно из целевых веществ, и после отгонки ацетонитрила при пониженном давлении экстрагируют этилацетатом. Окончательно каждый из милбемицинов альфа11, альфа1з и альфа14 может быть получен в аиде порошка методом жидкостной хрома40 тографии высокого разрешения (колонка с обратной фазой). Милбемицины альфа12 и альфа1в также могут быть получены аналогичным образом.

Вещества формулы Щ этого изобрете45 ния обладают превосходной акарицидной активностью против взрослых особей и яиц двупятн истого паутин ного клещика

1836426

10 секомых, такие как тараканы, домашние мухи и других насекомых; и различных насекомых, вредоносных для сельскохозяйственных и садовых культур, таких как тля, капустная моль и гусеница Lepidoptera. Кроме того, вещества этого изобретения обладают активностью против Ме!о1бо9упе, Вцгsaphelettchus, Phlzoqlyphus и других видов в почве.

Кроме того, вещества этого изобретения обладают превосходной паразитицидной активностью против эндопаразитов животных и человека. В особенности эти вещества являются эффективными не только против нематод, паразитирующих на домашних животных и домашних птицах и животных, таких как свинья, овцы, козы, крупный рогатый скот, лошади, собаки, кошки и пернатая дичь, но также против паразитов. обнаруженных в пищеварительных трактах, крови и других тканях и организмах людей и паразитов, принадлежащих к роду

Filariidae или Setariidae.

Когда вещества этого изобретения предназначаются для использования в сельскохозяйственных или садоводческих целях. они могут составляться в виде препаратов, которые традиционно использовались для сельскохозяйственных химикалиев, таких как дусты, увлажняющиеся порошки, эмульгирующиеся концентраты, водные или маслянистые суспензии и аэрозоли, путем смешивания их с носителями или другими вспомогательными агентами в случае необходимости. Носители могут быть природными или синтетическими и неорганическими, или органическими веществами, которые вводятся в сельскохозяйственные рецептуры для того, чтобы способствовать достижению цели активным компонентом исделать его более удобным для хранения, транспорта и обращения с активным ингредиентом, Что касается удобных твердых носителей, здесь могут быть упомянуты неорганические вещества, такие как глины (например, каолинит, монтмориллонит и аттапульгит) тальк, слюда, пирофилит, пемза, вермикулит, гипс, карбонат кальция, доломит, диатомитовая земля, карбонэт магния, апатит. цеолит, кремниевый ангидрид и синтетический силикат кальция; растительные органические вещества, такие как соевый порошок. табачная пыль. ореховая пыль, пшеничная мука, древесная мука, крахмал и кристаллическая целлюлоза; синтетические или природные высокомолекулярные вещества, такие как кумароновые смолы, нефтяные смолы, алкидные смолы, поливинилхлорид, полиалкиленгликоли, кетоновые смолы, 5

55 сложноэфирные смолы, смолы камеди и даммаровые смоль.; воски, акие как воск карнаубы и пчелинный воск; и мочевина.

Что касается жидких чосителей, то здесь могут быть упомянуты парафиновые или нафтеновые углеводороды, такие как керосин, минеральные масла, веретенное масло и белые масла; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол, ксилол, этилбензол, кумол и метилнафталин; хлорированные углеводороды, такие как четыреххлористый углерод, хлороформ, трихлорэтилен, монохлорбенэол и ортохлортолуол; простые эфиры, такие как диоксан и тетрагидрофуран; кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, диизобутилкетон, циклогексанон, эцетофенон и изофорон; сложные эфиры, такие как зтилацетат, амилацетат, этиленгликоль-ацетэт, ацетат диэтиленгликоля, дибутилмалеат, диэтилсукцинат; спирты, такие как метанол, H-гексанол, этиленгликоль, диэтиленгликоль, циклогексанол и бензиловый спирт; простые эфиры спиртов,. такие как этиловый эфир этиленгликоля, фениловый эфир этиленгликоля, этиловый эфир диэтиленгликоля и бутиловый эфир диэтиленгликоля: полярные растворители, такие как диметилформамид и диметилсульфоксид; и вода, Что касается подходящих газообразных носителей, то могут быть упомянуты воздух, диоксид углерода и фреон (торговая марка), Эти газы могут быть смешаны для распыления.

Для того чтобы улучшить такие свойства рецептуры, как диспергирование, змульгирование, распространение, проникновение и прилипание, в случае необходимости могут быть добавлены различного типа поверхностно активные агенты и высокомолекулярные соединения, посредством которых могут быть усилены увлажняемость, адгезия и адсорбция рецептуры на животных и растениях для повышения их эффективности.

Что касается поверхностно-активных агентов, которые мо -ут применяться для эмульгирования, диспергировэния, увлажнения, распространения. связывания, регулирования измельчения, стабилизации активных компонентов, улучшения текучести и предотвращения образования ржавчины, то могут использоваться любые неионные, анионные, катионные и амфотерные типы, но среди них обычно используются неионные и/или анионные поверхностно-активные агенты. Что касается пригодных неионных поверхностно-активных агентов, то здесь могут бытьупомянуты, например, полимериза1836426

12 ционные аддукты оксида этилена с высшими спиртами, такими как дуариловый спирт, стеариловый спирт и олеалиловый спирт; полимеризационные аддукты оксида этилена с алкилфенолами, такие как изо-октилфенол и нонилфенол, полимериэационные аддукты оксида этилена с алкилнафтолами, такими как бутилнафтол и октилнафтол; полимеризационные аддукты оксида этилена с высшими жирными кислотами, такими как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и Олеиновая кислота; полимеризационные аддукты оксида этилена с моно- и диалкилфосфорной кислотой, такой как стеарилфосфорная кислота и дилаурилфосфорная кислота; полимеризационные аддукты оксида этилена с аминами, такими как додециламин и стеариламин;„сложные эфиры

Высших жирных кислот и многоатомных спиртов, таких как сорбит и их полимеризационные аддукты с оксидом этилена; и полимеризационные аддукты оксида этилена с оксидом пропилена. Что касается подходящих анионных поверхностно-активных агентов, то здесь могут быть упомянуты, например, соли алкилсульфата (сложный эфир), также как натрийлаурилсульфат и аминовые соли сложного эфира олеилового спирта и серной кислоты; алкилсульфонаты, такие как натриевая соль диоктилового эфира сульфоянтарной кислоты и натрий-2этилгексенсульфонат; и арилсульфонаты. такие как натрий-изопропилнафталинсульфонат, натрий-метилен-биснафталинсульфонат. натрий-лигнинсульфонат и натрий-додецилбензолсульфонат.

Для того, чтобы улучшить свойства рецептуры и усилить биологический эффект, композиции этого изобретения могут использоваться в сочетании с высокомолекулярными соединениями или другими вспомогательными веществами, такими как казеин, желатин, альбумин, клей, альгинат .натрия, карбоксиметилцелл олоза, метилцеллюлоза, гидроксиэтилацеллюлоза и поливиниловый спирт, Упомянутые выше носители и различные вспомогательные вещества могут быть использованы как таковые или в любом желаемом сочетании, в зависимости от типа рецептуры, цели применения и тому подобных факторов.

Дусты могут содержать, например, от.1 до 25 мас. 0 активного компонента, вооб- ще, причем твердый носитель .составляет остальное.

Увла>княемые порошки могут содержать. например, от 10до 90 мас, % активного компонента, вообще, причем твердый

55 носитель и диспергирукиций и увлажняющий агент составляют Остальную часть, В случае необходимости, могут быть добавлены защитный коллоидный агент, тиксотропный агент и противовспенивающий агент.

Эмульгирующиеся концентраты могут содержать, например, от 5 до 50 мас, g, активного компонента, вообще, и от 5 до 20 мас. эмульгирующегося агента, причем жидкий носитель составляет остальное, В случае необходимости, может быть добавлен антикоррозионный агент, Маслянистые рецептуры вообще могут содержать, например, от 0,5 до 5 мас, % активного компонента, причем жидкий нь. ситель, такой как керосин, составляет остальную часть.

Аэрозоли вообще могут содержать, например, от 0,1 до 5 мас, активного компонента, и необязательно душистое вещество, причем маслянистый и/или жидкий носитель составляет остальную часть, Распылители, такие как сжиженный нефтяной газ, фторуглеродный газ и диоксид углерода могут быть загружены в рецептуру.

После того, как различным образом составлена рецептура, как упомянуто выше, композиция этого изобретения может быть эффективно нанесена на культуры и на домашних животных, на которых паразитируют вредные насекомые или клещи, на рисовых полях, фруктовых садах и нагорных полях, путем обработки стеблей и листьев культурных растений, почвы или домашних животных при концентрациях от 0,5 до 100 ч, на миллион активного компонента.

Когда вещества этого изобретения предназначаются для использования на животных или людях в качестве противогельминтного агента, то эти вещества могут быть заданы перорально в виде напитка.

Обычно напиток является раствором, суспензией или дисперсией с подходящим нетоксичным растворителем или водой, вместе с суспендирующим агентом, таким как бентонит и увлажняющий агент, или любым другим носителем. В общем, напиток также содерх<ит противовспенивающий агент. Обычно в состав напитка входят приблизительно от 0,01 до 0,5, предпочтительно от 001 до 0,1 мас. активного компонента, Когда вещества этого изобретения предназначаются для подачи животным в виде пищи. то эти вещества могут использоваться путем их гомогенного диспергирования в пище, путем подкормки или в виде

1836426

14 таблеток. Для того чтобы получить желаемый противогельминтный эффект, активные компоненты должны присутствовать, в общем, в виде окончательной концентрации в .,пище от 0,0001 до 0,02 . 5

Вещества этого изобретения также могут назначаться парэнтерально для животных путем инъекции в передний отдел желудка, мышцу, трахею или путем подкожной инъекции в виде раствора или дисперсии в жидком носителе, Для парзнтерального назначения активные вещества, предпочтительно, могут быть смешаны с подходящим растительным маслом, таким как масло земляного ореха или хлопковое масло. Обычно рецептура такого типа содержит от 0,05 до 50 мас. 7, активного компонента.

Вещества, этого изобретения также могут назначаться локально, посредством смешивания их с подходящим носителем, таким как диметилсульфоксид или. углеводородный рэстворитель. Этот тип рецептуры может наноситься непосредственно на поверхность тела животного при использовании струи или посредством непосредственной инъекции.

Наиболее подходящая пероральная дозировка для получения наилучшего результата зависит от вида животного, подлежащего лечению, и от типа и степени инфекции паразитом. Вообще дозировка составляет от 0,01 до 100 мг, предпочтительно от 0,5 до 50,0 мг на 1 кг веса тела живо- 35 тного, Дозировка может быть задана однократно или несколько разделенными дозами в течение относительно короткого периода, например, от 1 до 5 суток.

Настоящее изобретение более подроб- 40 но иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Милбемицин а11, а 1з и а 4 (соединения N 1, 2 и 3).

В каждой из десяти 500-мл колб Эрлен- 45 мейера инокулировали до 100 мл предкультуральной среды, содержащей сахарозу. полипептон и К2Н Р04(1 jo, 0,35 или 0,05%) соответственно с одной колонией

Streptomyces hygroscoplcus subsp 50

aureotocrimosus SANK 60286, После культурирования на вращающемся встряхивателе . в течение 48 часов при 28 С, 1 литр культуральной жидкости трансплантировали в два

30-литровых ферментерах, каждый из кото- 55 рых содержал продуцирующую -среду в количестве 20 литров (сахароза 8, соевый порошок 1, сливки 1, дрожжевой экс,тракт 0,1 j, мясной экстракт 0,1, карбонат кальция 0,3)„К2НРО40,037, MgS04 7Н20

0,17ь. FeS04 7Н20 0,005ф„рН перед стерилизацией 7,2).

Культурирование было осуществлено при 28 С в течение 12 дней в ферментерах при потоке стерильного воздуха 0,5 ччгп при внутреннем давлении 0,5 кг/см, при скорости вращения 40 — t80 об/мин и величине

D0-4 — 7 ч/млн. Тридцать два литра культурального материала смешали с 1,8 кг цеолита, и отфильтровали. Мицелиальное отложение промывали 5 литрами воды и фильтрат и промывные воды отбросили. Мицелиальное отложение смешивали с 20 л метанола в течение 1 ч и после фильтрования снова промывали 5 л метанола.

Фильтрат и промывные воды отобрали и выпаривали при пониженном давлении с получением около 2 л водной остаточной жидкости. Жидкость экстрагировали три раза 2 л гексана. Слой гексвна промывали три раза 1 л 2 -ного раствора гидроокиси натрия. Слой гексана сушили над водным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат выпаривали с получением 38 грамм маслообразного вещества. Двадцать грамм этого маслообразного вещества растворили в 500 мл гексана. Раствор загрузили в колонку, которая была приготовлена из 300 г силикагеля (Matttnckrodt 1пс, Sitick Туре 60), обработали гексаном и проявили двумя литрами гексана, и затем смесью гексан/этилацетат (3:1).

С помощью мониторинга элюированных фракций с использованием высокоэффективной жидкостной. хроматографии (HPLC) отделили в видесмеси милбемицины а11. а 12, а13, а14 и а 15. Выпаривание растворителя привело к получению 1,9 r сырого продукта. Продукт полностью растворили в

10 мл смеси 50 -ной метанол/вода, Раствор загрузили в колонку, которая была приготовлена из 160 г силанированного силикагеля (Мегс1 Со., Art 7719), обработали

50/ ной смесью метанол/вода и проявили

607,-ной смесью метанол/вода, затем 70 ной смесью метанол/вода и, наконец, 80 ной смесью метанол/вода. С помощью мониторинга элюированных фракций

HPLC были получены в виде смеси милбемиЦины Q 11.й12,Я13,Q14 и(Х15 ..

Выпаривание растворителя привело к получению 840 мг маслообразного продукта. Весь продукт растворили в 20 мл ацетонитрила. Раствор ацетонитрила подвергли препаративной HPLC с использованием колонки с обращенной фазой (Sonshu Со., 1836426

0I3S. Н-5251, 20 х 250 мм). Каждый раз загружали образцы объемом 1 мл раствора и проявляли смесью 80% ацетонитрил/вода при скорости потока 9,9 мл/мин. С помощью мониторинга фракций с использованием УФ при 240 нм были получены фракции, содержащие продукт. Из каждой такой фракции отогнали растворитель. Лиофилизация остаточной водной жидкости привела к получению 128 мг а11, 11,7 мг

Q12,14Я мг а з, 43 мг аи и 3 мг а ь в порядке элюирования, и каждый получился в виде порошкообразного вещества. милбемицин а 11

Элементный анализ (%). С- 68,83, Н = 8,32

Молекул я рн ый . вес: 626 (измерен н ый по масс-спектру электронной бомбардировки.

То же, самое применяется и далее), Молекулярная формула, C ÍùOsI

Удельное вращение; (а) =+ 104.3 (С =

1,05, СНС!з).(измеренное с помощью натриевой 9-линии. То же самое применяется далее).

УФ-спектр поглощения: Л макс(СНзОН) нм (Е, см "): 230 (плечо), 238 (990), 244 (990), 252 (плечо).

ИК-спектр поглощения: м макс(КВг) см

3450, 2950, 1I715. 1650, 1450, 1380, 1330, 1270, 1220, il180, 1160, 1140, 1090, 1080, 1050, 1020, 990, 940, 850.

Спектр ядерно-магнитного.резонанса: (CI3C4, 270 мГц):

1,90 (3Н, синглет, транс-СНз-С(СНз)=CHC0OC-)

2,15 (ЗН, синглет, цис — СНз-С(СНз)=СНСОО-)

3,27 (1Н, дублет квартетов, С вН)

4,00 (1Н, дублет, J - 6 Гц, С6Н)

4,65-4,90 (4Н. мультиплет, Сжй, СпН)

Масс-спектр электронной бомбардировки:

m/z = 626 (М ), 558, 526, 508, 400, 181, 153.

Время удерживания в НР1 С: 13,4 мин. (ODS

Н-2151, 6 х 150 мм, Senshu, проявляющим растворителем является 80% ацетонитрил/вода, скорость потока 1,5 мл/мин, мониторинг при УФ 240 нм.

Такие же условия применяются далее. милбемицин Q 12

Элементный анализ (>). С = 67,04, Н = 8.01

Молекулярный вес: 628

Молекулярная формула: СзБНм09

Удельное вращение: (a) + 118.3 (С =

1 О, CHCIs)

УФ-спектр поглощения:

Л макс(СНзО Н) нм (Е, см ): 238 (750), 244 (810), 253 (плечо)

ИК-спектр поглощения; V макс(КВг) см;

3500, 2950, 1740, 1710, 1450, 1380, 1330, 1290, 1180, 1120, 1090, 1050, 990.

Масс-спектр электронной бомбардировки:

m/z 628, 556,548, 525,400, 382, 329, 181, 153, Время удерживания НР1 С: 14,5 мин, милбемицин а з

5 Элементный анализ (%): С = 67,41, Н = 8,12

Мол. м.:.640

Молекулярная формула: СзтНБ20в

Удельное вращение; (а)23 = + 91,6 (С =

0,89, СНС!з)

10 УФ-спектр поглощения, Лмакс(СНзОН) нм (Е" +, см ): 230 (плечо), 237 (805), 245 (795), 253 (плечо).

ИК-спектр поглощения:

Ума«(KBr) cM: 3500, 2950, 1720, 1650, 15 1450, 1380, 1340, 1310, 1270, 1180, 1140, 1115, 1095, 1050, 990, 960, 940, 860.

Спектр ядерного магнитного резонанса (СОС!з, 270 мГц).

1,07 (ЗН, триплет, СНзСН2 — С(СНз)=СН20 СОО-)

2,16 (3Н, синглет, CHg-С(СгНь)=СН вЂ” СОΠ— )

3,17 (1Н, дублет квартетов, СжвН)

4,00 {1 Н, дублет, J = 6 Гц, СвН)

4,65 — 4,90 (4Н; мультиплет, СыН, СртН)

25 Масс-спектр электронной бомбардировки:

m/z = 640 (М ), 526, 508, 276, 181, 153

Время удерживания НР1 С: 16,4 мин милбемицин а и

Элементный анализ (%): С = 67,62, Н = 7,84

30 Мол. м.: 640

Молекулярная формула: Сз7Н5209

Удельное вращение: (а) з =+ 96,1 {С =

1,14, CHCb)

УФ-спектр поглощения: Л макс (СНзОН) нм

35 (Е, см ): 230 (плечо), 237 (800), 244 (810), 253 (плечо)

Спектр ядерного магнитного резонанса (СОС!з, 270 мГц);

3,09 (1Н, дублет триплетов, J = 2,4, 9,3 Гц, 40. Cz5H)

4,00(1Н, дублет, J = 6,6 Гц, СвН)

4,64-4 88 (4Н, мультиплет, CmH, СпН)

5,81 {1 Н. широкий синглет, СзН)

ИК-спектр поглощения: м маркс(КВг) см

45 3450, 2950, 1720, 1650, 1450, 1380, 1340, 1270, 1220, 1180, 1140, 1100, 1060, 1030, 990, 960, 860.

Масс-спектр электронной бомбардировки:

m/z = 640, 540, 522, 276, 263, 195, 167

50 Время удерживания НР1 С: 18,0 мин. милбемицин а в

Мол.м.: 642

Молекулярная формула: Сз7Нв4Од

Масс-спектр электронной бомбардировки:

55 m/z = 642, 555, 540, 414, 396, 385, 356, 314, 264, 245, 195, 167

Время удерживания НР1 С: 19,6 мин.

Il p и м е р 2, 5-О-трет-бутилдиметилсилилмилбемицин а и (соединение М 13) 17

1836426

150 микролитров пиридина и 200 микролитров 3-метил-2-бутеноил хлорида добавили к раствору 319,3 мг 26-гидрокси-5-0-трет-бутилдиметилсилилмилбемицин А4 в 10 мл метиленхлорида, охлажденного до 0 С. Затем смесь перемешивали в течение 30 Мин. Реакционную смесь влили в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и экстрагировали метиленхлоридом. Экстракт сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали выпариванием, Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем с получением 326,2 мг целевого соединения (выход 91%).

Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, m/z):

754 (М ), 736, 715, 697, 654, 636, 597, 589

Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц CDCI3, ч/млн):

0,11 (ЗН. синглет, 5! СНз)

0,13 (ЗН, синглет, ЯСНз)

3,07 (1Н, дублет триплетов, J = 2,4, 9, 3 Гц, С2 Н)

3,85 (1 Н, дублет, J = 5,6 Гц, CsH)

5,78 (1Н, синглет, СзН)

Пример 3. Милбемицин а и (соединение N. 3).

2,5 мл 68% фтористого водорода в пиридине добавили к раствору 302,8 мг 5-0-третбутилдиметилсилилмилбемицина а 14 в 15 мл ацетонитрила, охлажденного при 0 С, затем смесь перемешивали в течение 2,5 ч, В- конце этого времени добавили по порядку

300 мг карбоната калия и воду к реакционной смеси и затем смесь экстрагировали хлороформом. Экстракт сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали выпариванием. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем с получением 232,2 мг целевого соединения (выход

90%), которое отвечало свойствам милбемицина а14, полученного в примере 1, Пример 4. 26-(2-бутеноилокси)милбемицин А4 (соединение М 5).

24 микролитра пиридина и 39 микролитров 2-бутеноимл хлорида добавили в раствору

150 мг 26-гидрокси-5-0-трет-бутилдиметилсилилмилбемицин А4 в 2 мл метиленхлорида, охлажденного при 0 С, затем смесь перемешивали при комнатной температуре s течение 3 ч. Реакционную смесь влили в воду Со льдом и экстрагировали этилацетатом. Экстракт сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали выпариванием, Остаток растворили в 4 мл ацетонитрила, который затем охлаждали при 0 С, 0,5 мл

68%-ного фтористого водорода в пиридине добавили к раствору и смеСь перемешивали

3,08 (1Н, дублет триплетов, J = 2,4, 9,3 Гц, С25Н)

20. 4 84 (1Н, дублет, 3 = 13,3 Гц, СиН) 30

55 при комнатной температуре в течение 1 5 ч.

В конце этого времени реакционную смесь влили в воду со льдом и экстрагировали этилацетатом. Экстракт промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали выпариванием.

Остаток очищали препаративной тонкослойной хроматографией с получением 66,5 мг целевого соединения (48% выход).

Масс-спектр (метод электронной бомбардироки, m/z):

626 (M ), 540, 522, 414, 264, 245, 191, 167, 151

Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц, СОС!3, ч/млн.):

1.99 (ЗН, дублет дублетов, J = 6,9, 1,6 Гц, СН СНз=СН СОО ) 5,87 (1 Н, квартет дублетов, J = 1 6, 15,3 Гц, СН-CH3=CQ-СОО-)

7,03 (1Н. квартет дублетов, J - 6.9. 15,3 Гц, СН-CH3=CH-СОО-) Пример 5, 26-(3-Метил-2-бутеноилокси)милбемицин (соединение Q 16)

0,15 мл 3-метил-2-бутеноил хлорида добавили к раствору 177,3 мг 26-гидрокси-5-0трет-бутилдиметилсилилмилбемицина и 0,1 мл пиридина в 15 мл метиленхлорида, охлажденного до 0 С. Затем смесь перемешивали в течение 2 ч. Реакционную смесь влили в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и экстрагировали метиленхлоридом. Экстракт сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали выпариванием. Остаток растворили в 10 мл ацетонитрила и затем охладили до 0 С. 1 мл

68%-ного фтористого водорода в пиридине добавили к раствору и смесь перемешивали в течение 2 часов. В конце этого времени реакционную смесь влили в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и экстрагировали этилацетатом. Экстракт сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали выпариванием. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем с получением 144,7 мг целевого соединения (выход 86%).

Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, m/z):

654 (М ), 618, 554, 428, 410, 356

Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц, СОС13, ч/млн):

3,07 (1Н, широкий дублет, J - 7,7 Гц, СжН)

4,48 (1Н, широкий дублет, J = 4,0 Гц, С Н)

4,68 (1 Н, дублет, J - 14,7 Гц, С26Н)

4,79 (1Н, дублет, 3 - 14.7 Гц, С26Н}

1836426

Следуя одной из соответствующих методик примеров 2-5 были получены следующие соединения, Пример 6. 26-(2-Метил-2-бутеноилокси)милбемицин А1(соединение М 6)

Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, m/z):

640 (M }, 604, 540,522,414 .

Спектр ядерного магнитного резонанса(270

Гц, СООз, ч/млн):

1,80 (ЗН, дублет, Л = 7,2 Гц, СНз-СН=С(СНз)СОО-)

1,85 (ЗН, синглет, СНз-СН=С(СНз)-СОО-)

3,08 (1Н, дублет триплетов," J = 2,4, 9,3 Гц, С25Н}

4,73 (I Н, дублет J = 13,7 Гц . C26H)

Пример 7.. 26 (2-.Гексеноилокси}милбемицин Aq (соединение N- 7)

Масс-спектр {метод электронной бомбардировки, m/z);

654 (М ) 618 522 504 4 f4, 396 ,Спектр ядерного магнитного резонанса{270 мГц, CDC4, ч/млн):

0,93 (3Н, триплет, J = 7 3 Гц. СН—

СНзСН2СН=СН-СОΠ— )

4,02 {I Н, дублет, J = 13,3 Гц, С26Н)

4,86 (1Н, дублет, J =- 13,3 Гц, С2вН)

7,01 (IH, триплет дублетов; J = 6,9, 15,7 Гц, Сзнт-СН=СН вЂ” СОО-)

Пример 8. 26-(4-Метил-2-пентеноилокси)милбемицин А< (соединение N. 8)

Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, mlz}:

654 (М ), 618, 522, 414, 396

Спектр ядерного магнитного резонанса(270 мГц, CDCtz, ч/млн):

1,07 (GH, дублет, J = 6,9 Гц, (СНз}2СН—

СН=СН-СОО-}

3,08 (I Н, дублет триплетов, J = 2,4 Гц, 9,3 Гц, Cz> H)

4,72 (I Н, дублет, S = 13,3 Гц, CzgH)

4,86 (1Н, дублет, J =- 1.3,3 Гц, СиН)

6,99 {1Н, дублет дублетов, J = 6,5, 15,7 Гц, (СНз(2СН вЂ” С l=CH-СОО-)

Пример 9. 26 (3-Гексеноилокси)милбемицин Aq (соединение N 9}

Масс-спектр (метод электронной бомбардиpoBKLi, m/z):

654 (M }, 414, 279, 195, 167

Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц, CDCla, ч/млн):

3,07 (2H, дублет, J = 6,4 Гц СН2 - CHg=-CHСН.-СОО-)

4,68 (1Н, дублет, J = 12,9 Гц, СиН)

4,79 (I Н, дублет, J = 12,9 Г2, C26H)

Пример 10. 26-(4-Пентеноипокси)мипбемицин А (соединение N 10)

Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, m/z).

640 (М ), 604, 522. 264, 195, 167

Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мгц, СОС!з, ч/млн):

3,07 (1Н, дублет триплетов, S = 2,4, 9,3 Гц, С25Н)

4,69 {IН, дублет, J = 13,7 Гц, СжН)

4,79(IH, дублет, J -13,7 Гц, СиН)

4,99-5, 10 (2 Н, мул ьти и лет, С Н2=СН10 СН2СН2 СОО-) Пример 11. 26-Циннамоилоксимилбемицин Аа(соединение М 11)

Масс-спектр (метод электронной бомбарди15 ровки, m/z):

688 (М ), 652, 522, 276, 195, 167

Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц, CDClg, ч/млн):

3,07 (IН, дублет триплетов, J = 2,4, 9,7 Гц, 20 С2Ф)

4,81(1Н, дублет, J -13,3 Гц, С2вН)

4,89(IH, дублет, J =13.3 Гц, СиН)

6,47 (IH, дублет, J = 16,1 Гц, Ph — СН=СН—

СОО-)

7,72 (IН, дублет, J = 16.1 Гц. Ph-СН=СНСОО-)

Пример 12. 26-Пара-хлорциннамоилоксимилбемицин А4 (соединение М 12)

Масс-спектр (метод электронной бомбарди30 ровки, m/z): 722 (Мз), 704, 540, 522, 504 ..

Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц, C DC b, ч/млн):

3,07 (1Н, дублет триплетов, J = 2,4, 8,9 Гц, 35 С25Н)

4,81 (I Н, дублет, J = l3,3 Гц, C26H)

4,93 (1 Н, дублет, S = 13,3 Гц, С26Н) 6,44 (IН, дублет, J = 16.IГц,,пара-Cl-PhCH=CH-СОО-)

40 7,67 {IH, дублет, S =. 16,1 Гц, пара-О-PhCH=-CH-СОΠ†)

Пример 13..5-0-Пропионил-2 (3-метил-2-бутеноилокси)милбемицин А4 (соединение N 14)

45 Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, m/z):

696 (M ), 604, 504, 414, 396, 356, 264, 195, 167, 151

Спектр ядерного магнитного резонанса(270

50 мГц, CDClg, ч/млн):

1,15 (ЗН, триплет, J = 7,6 Гц, СНзСН2СО-)

2,40 (2Н, квартет, J = 7,6 Гц, CHgCHgCO-)

3,07 (I Н, широкий триплет, J = 8,0 Гц, С25Н)

4,11 (I H. дублет, J = 6,0 Гц, СвН)

55: 4,50-4,76 (4Н, мультиплет, С2вН, С2уН)

5,65-5,95 (5Н, мультиплет, СзН, CsH, CgH, С1оН). (CHIC=CH COO-)

Пример 14, 5-0-Этоксикарбонил-2-(3метил-2-бутеноилокси)милбемицин И ;.-(соединение М 15) 22

21

1836426

Масс-спектр (метод электронной бомбардировки, m/z):

712 (M ), 414, 396, 264, 195, 167, 151

Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц. СОС!э, ч/млн):

1,31 (ЗН, триплет, J =7,1 Гц, СНзСН2ОСОО-)

3,07 (1Н, дублет триплетов, J = 2,4, 8,9 Гц, С25Н)

4,14 (1Н, дублет, J = 6,1 Гц, CsH)

4,19 (2Н, квартет, J =7,1 Гц, СНзСН2ОСОО-}

4,57 — 4,76 (4Н, мультиплет, С25Н, C27H)

5,54 (1H, дублет дублетов, J = 1,6, 6,1 Гц, С5Н)

Пример 15. 26-(3-Метил-2-бутеноилокси)ивермектин Bfa (соединение N. 17)

Масс-спектр (метод FAR, добавлен триэтаноламин, m/z):

1014, 992,.978, 962, 934, 878, 830, 299, 194

Спектр ядерного магнитного резонанса (270 м Гц, CD Cig, ч /млн);

3,07 — 3,29 (ЗН, мультиплет, С4, Н, С4Н, C25H)

3,35 (1Н, синглет, С2Н)

3,48 (6Н, синглет, два-ОСНз)

3,97 (1Н, дублет, J = 6,1 Гц, С5Н)

4,49 (1Н, широкий синглет, С5Н)

4,69 (2Н, широкий синглет, С27Н)

4,97 (1Н, широкий дублет, J = 7,3 Гц, С15Н)

Пример 16. 26 — (3-Метил-2-бутеноилокси)Я вЂ” 541А (соединение N. 20)

Масс-спектр (метод электронной бомбардировки. m/z):

710 (M }, 592, 523, 468, 448, 423, 376

Спектр ядерного магнитного резонанса (270 мГц, СОС!з, ч/млн):

3,75 (1H, дублет, J = 10.9 Гц, Cz5H)

4,67 (1Н, дублЕт, J = 13,3 Гц, С25Н)

4,82 (1 Н, дублет, J = 13,3 Гц, С25Н)

5,20 (1H, дублет, J = 8,9 Гц, Сэ2Н)

Пример 17. Испытания активности:

Взрослые клещи

Были приготовлены образцы растворов, каждый из которых содержал 0,3 ч/млн, 1 ч/млн или 3 ч/млн индивидуальных соединений настоящего изобретения, или одно иэ трех контрольных соединений (милбемицин

С, смесь милбемицина С1 и милбемицина

Cz, описанная в патенте Японии 29742-84;

26-ацетоксимилбемицин А4; или 26-ацетоксиавермектин В1а) и 0,01 Д спредера.

Дву-пятнистые паукообразные клещи (Tetranychus ог0сае), чувствительные к органо-фосфорным инсектицидам, инокулировали на первичный лист растений вигны китайской (Vihna slnensis Savi). Через день после инокуляции с помощью вращательно5

35 го разбрыэгивателя распределяли 7 мл образца раствора, указанного выше (разбрызгиватель фирмы Mlzuho Selsakusho Со.) с получением распределенного количества

3,5 мг/см листа. После разбрызгивания лист оставляли при комнатной температуре при 25 С, Через три дня с помощью бинокулярного микроскопа оценивали состояние взрОслых насекомых и смертность (P) рассчитывали. Результаты приведены s табл. 2.

Пример 18, Испытания активности: яйца клещей

Были приготовлены образцы растворов, каждый из которых содержал 1 ч/млн или 3 ч/млн индивидуальных соединений настоящего изобретения, или одного из трех контрольных соединений (милбемицин С, смесь милбемицина С1 и милбемицина С2, описанная в патенте Японии 29742 — 84; 26-ацетоксимилбемицин А4; или 26-ацетоксиавермектин

В1а) и 0,01 спредера.

Самкам дву-пятнистых паукообразных клещей позволяли откладывать яйца на первичном листе растений вигны китайской.

Взрослых клещей удаляли с получением листьев для испытания с отложенными на них

50 яйцами, К испытуемым листьям применили образцы растворов по способу, описанному выше в примере 17. После 2-недельного нахождения в комнате при температуре 25 С сосчитывали число не созревших яиц (число не вылупившихся особей) и оценивали их в процентах, Результаты представлены в табл. 3.

Таким образом было показано, что новые милбемицины настоящего изобретения показали высокую акарицидную активность против взрослых клещей при такой низкой концентрации, как 0.3 ч/млн, а также проявили полезную овицидальную активность. !

Формула изобретения

Способ получения смеси милбемицинов

a >>, а а, а з, а 14 и а >5, заключающийся в том, что штамм Streptomyces

hygroscoplcus subsp. aureoiacrimosus SANK

60286, FERM BP — 1190 культивируют в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, в течение 5-15 дней при температуре 22-30 С и выделяют целевой продукт из фильтрата культуральной жидкости.

1836426

23 таблица 1

Свойство

Ха акте истики

Сеа рост аэриальный мицелий обратная поверхность аство .имый пигмент нет очень хороший, желтовато - серый (2-9-11 ) рост агар аэриальный мицелий обратная поверхность аство имый пигмент хороший, серовато-белый (М-9) светло - желтая (3-9-10) нет

Глицерино-аспарагиновый агар (!ЯР 5). рост аэриальный мицелий обратная поверхность аствооимый пигмент нет

Иеорганическая соль-крахмальный агар (1ЗР 4) рост аэриальный мицелий обратная поверхность аство имый пигмент нет рост аэриальный мицелий обратная поверхность аство имый пигмент нет рост аэриальный мицелий обратная поверхность аство имый пигмент рост нет аэриальный мицелий обратная поверхность аство имый пигмент нет

Сахарно - нитратный агар

Глюкоза - аспарагиновый

Тирозиновый агар (ISP 7) Агар пептон-дрожжевой экстракт - железо(13Р 6) Питательный агар (Дифко) хороший, серовато-белый (М-9) хороший, белый желтозато - серая

Хороший, желтовато-коричневый (2-9-11) хороший, белыйжелтовато-серый (2-9-11) светло-желтая (8-9-11) очень хороший, светлооливковый (6-8-11 ) обильный, от белого до светло оливково-серого (4-8-11 ) желтовато- коричневая (2-9-11 ) хороший, светлый оливковосерый (2-8-11 ) хороший, от белого до светло-желтого (3-9-10 ) светло-желтая(6-8-10) хороший, желтовато-серый (2-9-12 ) хороший, белый желтовато-серая (4-9-11) хороший, желтовато-серый (1-9-10) незначительное образова ние. серый (M 9) светло-желтая (3-9-?О) 26

1836426

Продолжение табл, Ха акте истики

Свойство

Среда

Агар дрожжевой экстрактрост солодовый экстракт (ISP2 ) аэриальный мицелий обратная поверхность светло-желтый (8-9-12 ) растворимый пигмент

Агар овсяной муки (ISP 3) рост аэриальный мицелий обратная поверхность растворимый пигмент

ый

Водный агар рост аэриальный мицелий обратная поверхность аство имый пигмент

Агар картофельный экстракт - морковный экстракт рост аэриальный мицелий обратная поверхность аство имый пигмен нет

3. Физиологические свойства

Физиологические свойства штамма SANK 60286 показаны ниже, Гидролиз крахмала

Ожижение желатина положительный положительное (слабое } положительное положительная (слабоя ) положительноя (сла боя )

37о(;

Восстановление нитрата

Коагуляция молока (при 28О и 37 С )

Пептонизация молока (при 28 и 37 С)

Интервал температур роста (среда 1) . Образование меланоидного пигмента очень хороший, желтоватокоричневый (2-9-11 ) обильный, серовато-белый (М-9) красновато - желтая (12-8-9 ) очень хороший, светложелтый (8-9-12 ) обильный, серовато-белый (М - 8) желтовато-коричневая (2-9-11 ) светлый оливково-себедный, серовато-белый (М-9) незначительное образование, светлый коричнево-серый (2-8-9 ) серовато-белая (М-9 ) бедный, серовато-белый

{ N. - 9) хороший. светлый коричнево-серый (2-8-8) светл ожелто-оранжевая (2-9-9 ) «27, 1836426

Продолжение табл. 1

Среда 1: агар дрожжевой экстракт-солодовый экстракт (ISP 2) среда 2: триптон-дрожжевой экстракт-бульон (ISP 1) среда 3: агар пептон дрожжевой экстракт-железо (ISP 6) среда 4; тирозиновый агар (ISP 7)

Таблица 2

ppm - ч/млн

Таблица 3 30

1836426

Продолжение табл. 3 рра -ч/млн.

Составитель Т.Лукачевых

Техред M.Моргентал Корректор О.Кравцова

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3008 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5