Способ дифференциальной диагностики гиперпластических заболеваний и рака эндометрия

 

Использование: медицина, гинекология. Сущность изобретения: у пациента берут пробу цельной крови, выделяют липидную фракцию в которой методом проточной горизонтальной хроматографии определяют уровень фосфатидилинозитов и при значении уровня этого показателя от 6,0 до 6,5 нмоль фосфора фосфатидилинозитов на 1 мг белка диагностируют железистую гиперплазию эндометрия, при значении 4,2-5,0 нмоль фосфора на 1 мг белка - атипическую гиперплазию, а при значении 1,2 - 3,3 нмоль фосфора 1 на мг белка - рак эндометрия. Точность способа составляет 94%.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и предназначено для дифференциальной диагностики гиперпластических заболеваний и рака эндометрия.

Проблема ранней диагностики гиперпластических заболеваний и рака эндометрия остается одной из наиболее актуальных в современной медицине, поскольку наблюдается их неуклонный рост у женщин репродуктивного возраста (Бохман Я. В. Руководство по онкогинекологии. Л. Медицина, 1989, с. 464). Инструментальная диагностика названных заболеваний достаточно сложна и точность выявления патологии эндометрия колеблется от 52 до 89% (Демидкин П.М. Шнирельман А.И. Рентгенодиагностика в акушерстве и гинекологии. М. 1980, с. 414; Демидов В. Н. Зыкин Б.И. Ультразвуковая диагностика в гинекологии. М, 1990, с. 224). Поэтому нередко имеет место неадекватная терапия и наблюдается высокая частота рецидивов заболеваний. В распоряжении клиницистов нет объективных, высокоинформативных, неинвазивных методов, позволяющих своевременно диагностировать переход доброкачественного процесса в злокачественный. В связи с этим значительно возросло число больных с раком эндометрия, которые ошибочно лечились по поводу гиперпластической патологии эндометрия.

Известен ультразвуковой способ диагностики гиперпластических заболеваний и рака эндометрия (Демидов В.Н. Зыкин Б.И. Ультразвуковая диагностика в гинекологии. М. 1990, 224 с.). Вместе с тем, разрешающая способность УЗИ не позволяет проводить достоверную дифференциальную диагностику различных видов патологии эндометрия.

Известен гистероскопический способ диагностики гиперпластических процессов и рака эндометрия, однако, точность диагностики составляет от 54 до 82% (Эндоскопия в гинекологии. Под ред. Г.М.Савельевой. М. 1983, 200 с.). Этот способ имеет следующие недостатки: инвазивность, субъективность визуализируемых картин, травматичность, небезопасность для жизни пациентки (перфорация, наркозные осложнения, инфицирование).

Наиболее достоверным способом диагностики патологии эндометрия является гистологическое исследование ткани слизистой оболочки матки [1] Однако для получения исследуемого материала необходимо производить диагностическое выскабливание ткани эндометрия, что далеко не безразлично для организма больной ввиду инвазивности, риска инфицированности (в том числе: СПИД, гепатит), травматичности. Кроме того, расхождение мнений патологоанатомов при оценке одних и тех же микропрепаратов (особенно атипической гиперплазии) может достигать до 85% (Никонов А.А. О разногласиях при гистологической диагностике гиперпластических состояний и онкологической патологии эндометрия. Вопросы онкологии. 1990, т. 36, N 9 с. 1071-1076). То есть способ также не является достоверным, поскольку нет объективных критериев диагностики.

Таким образом, существующие способы диагностики гиперпластических заболеваний и рака эндометрия не дают возможности достоверно диагностировать различную патологию эндометрия, что осложняет разработку адекватной терапии у этих больных.

Задачей изобретения является создание точного, объективного способа диагностики гиперпластических заболеваний и рака эндометрия, позволяющего проводить раннюю диагностику данной патологии и разрабатывать рациональную лечебную тактику.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе дифференциальной диагностики гиперпластических заболеваний и рака эндометрия путем исследования цельной крови, отличительной особенностью является то, что методом проточной горизонтальной хроматографии определяют уровень содержания фосфатидилинозитов и при их значениях от 7,1 до 7,5 нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка судят о норме, при значении от 6,0 до 6,5 нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка диагностируют железистую гиперплазию эндометрия, от 4,2 до 5,0 нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка атипическую гиперплазию, а от 3,3 до 1,2 нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка рак эндометрия.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат. Способ обладает высокой точностью и объективностью. Он позволяет определять фосфатидилинозиты (ФИ) при малейших изменениях их концентрации. Точность способа составляет 94,2% чувствительность 0,1 мкг. Способ является неинвазивным, благодаря чему значительно уменьшается опасность хирургического и анестезиологического риска, инфицированности, травматичности (перфорация матки, ранение органов брюшной полости, кровотечение). Способ позволяет своевременно диагностировать переход доброкачественного процесса в злокачественный и дает возможность разрабатывать оптимальную тактику ведения данного контингента больных. Применение способа позволяет снизить частоту рецидивов и неоправданных хирургических вмешательств. Высокая информативность способа дает возможность использовать его при профилактических осмотрах в качестве скринингового, а также для более точной диагностики при стационарном обследовании.

ФИ являются одним из основных компонентов биологических мембран, выполняют функцию вторичных мессенджеров в передаче трансмембранного сигнала и служат маркером пролиферативного роста. Однако использование уровня ФИ для дифференциальной диагностики гиперпластических заболеваний и рака эндометрия ранее не проводилось.

Способ осуществляется следующим образом. Из 0,8 мл цельной крови экстрагируют липиды смесью хлороформ-метанол (1:2). Затем фильтруют в мерные пробирки, с притертой пробкой, объемом 20 мл. Осадок на фильтре трижды промывают смесью хлороформ-метанол (2:1), содержащей 0,5% НСl по объему. К фильтрату добавляют 2-3 мл 0,02%-ного раствора хлористого кальция до образования двух фаз: хлороформной и водно-метаноловой, затем 1-2 минуты встряхивают и добавляют 2 мл хлороформа. После четкого расслоения верхнюю фазу отсасывают. Оставшиеся в верхней фазе липиды экстрагируют 2 мл хлороформа. Объединенный хлороформенный экстракт промывают смесью хлороформ-метанол 0,02% СаСl₂ (3: 48: 47). После отмывания отбирают по 1/10 части от имеющегося объема для определения липидного фосфора. Оставшийся липидный экстракт упаривают досуха в токе азота и растворяют в 20-25 мкл хлороформ-метанол 2:1. Нанесенный методом осаждения слой адсорбента высушивают на воздухе, далее 15 мин активизируют в сушильном шкафу при температуре 120^оС и с помощью специального приспособления разделяют на 14 отдельных дорожек шириной 4-5 мм. Исследуемый липидный материал в количестве 10-40 мкг наносят на пластинку, помещенную в плоскую стеклянную камеру для проточной хроматографии. Время хроматографирования фосфолипидов в системе хлороформ-метанол 7 н. аммиак (13:7:1) составляет 60-80 мин, из которых 15 мин проток. При этом исследуемая фракция фосфоинозитидов (Rf 0,44) четко отделялась от расположенных рядом фосфатидилсеринов (Rf 0,59) и фосфатидилхолинов (Rf 0,34). Идентификацию фосфолипидных фракций проводят с помощью цветных тестов, значений Rf и свидетелей фирмы "Sigma" (США). Хроматограммы после высушивания сжигают непосредственно над хромовой смесью в специальном эксикаторе, помещенном в сушильный шкаф при температуре 200^оС на 30 мин. Уровень содержания ФИ определяют денситометрическим методом. Для этих целей используют денситометр "БИАН-170", позволяющий анализировать тонкослойные хроматограммы. Перед нанесением исследуемого экстракта слой силикагеля разделяют на 12-15 узких полос по 4-5 мм каждая. При таких условиях распределение анализируемого вещества происходит только по ходу растворителя, исключая возможность продольной сорбции. Распределение липидного материала в пятне практически соответствует гауссовой кривой и обеспечивает пропорциональность между количеством ФИ и площадью их пиков. При этом имеется возможность в стандартных условиях анализировать на каждой пластинке одновременно до 15 проб. Для построения калибровочной кривой используют стандартный препарат фосфатидилинозидов фирмы "Sigma" (США), который наносят на отдельные полосы силикагеля так, чтобы концентрация липидного фосфора составляла 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 мкг соответственно. После хроматографии пластинку проявляют над раствором хромовой смеси при температуре 200^оС в течение 30 мин, затем денситометрируют. По данным денситометрии строят калибровочную кривую. ФИ определяют в диапазоне концентраций от 0,2 до 8,0 мкг. После сжигания исследуемых проб в парах хромовой смеси обугленное вещество переносят в специальные колбочки с 0,5 мл азотной кислоты. Содержимое колбочек выпаривают в пламени спиртовки, после чего их продолжают прогревать до прекращения выделения бурых паров. В остывшие колбочки помещают 1,0 мл 2%-ной аскорбиновой кислоты на 10% трихлоруксусной кислоты и тщательно встряхивают. Затем приливают 0,5 мл 1%-ного молибдата аммония, через 2 минуты 1,0 мл смеси лимоннокислых мышьяковистых солей, перемешивают и для развития устойчивой окраски оставляют на 1 ч. Колориметрирование проводят с помощью колориметра-нефелометра КФК-2-УХЛ 4,2 при длине волны 670 нм. Одновременно с исследуемыми растворами колориметрируют "холостые" пробы, не содержащие фосфора и стандартные растворы, содержащие 0,1 мг фосфора. Расчет содержания фосфора осуществляют путем сравнения оптических плотностей анализируемых и стандартных растворов. Результаты выражают в нмолях фосфора ФИ на 1 мг белка. Количество белка определяют биуретовым способом.

При этом уровень содержания ФИ у здоровых женщин составляет от 7,1 до 7,5 нмоль фосфора ФИ на мг белка, у больных с железистой гиперплазией эндометрия от 6,0 до 6,5 нмоль фосфора ФИ на мг белка, у больных с атипической гиперплазией эндометрия от 4,2 до 5,0 нмоль фосфора ФИ на мг белка, а у больных с раком эндометрия от 3,3 до 1,2 нмоль фосфора ФИ на мг белка.

П р и м е р 1. Больная П. 34 лет, N истории 19124, поступила в гинекологическое отделение больницы им. С.П.Боткина. При клиническом обследовании проведено УЗИ, однако патологии не было обнаружено. Одновременно у больной методом проточной горизонтальной хроматографии было проведено определение в цельной крови уровня содержания ФИ. Оно составило 6,0 нмоль фосфора ФИ на мг белка. Было высказано предположение о наличии железистой гиперплазии эндометрия. Кроме того, анамнестические и клинические данные также не позволяли исключить патологию эндометрия. Больной с лечебно-диагностической целью было произведено выскабливание стенок полости матки. При гистологическом исследовании (N 34491-94) установлен окончательный диагноз: железистая гиперплазия эндометрия".

П р и м е р 2. Больная Х. 42 лет, N история 22647, находилась на обследовании в гинекологическом отделении больницы им. С.П. Боткина. При ультразвуковом исследовании диагностировано: подозрение на "гиперплазию эндометрия". Проведено определение количественного содержания ФИ в цельной крови, которое составило 4,4 нмоль фосфора ФИ на мг белка. Было высказано предположение о наличии атипической гиперплазии эндометрия. Вместе с тем при гистероскопии была диагностирована "железисто-кистовая гиперплазия эндометрия". Однако при гистологическом исследовании выскобленной ткани эндометрия (N гистологии 40385-92) установлена "атипическая гиперплазия эндометрия". Окончательный диагноз: Атипическая гиперплазия эндометрия.

П р и м е р 3. Больная О. 49 лет, N истории болезни 6448, находилась на обследовании в гинекологическом отделении больницы им. С.П.Боткина. При гистероскопии установлен диагноз: "аденокарцинома тела матки". При исследовании содержания ФИ в цельной крови вышеприведенным способом оно составило 2,9 нмоль фосфора ФИ на мг белка было высказано предположение о раке эндометрия. При гистологическом исследовании соскоба эндометрия (N гистологии 14120-23) установлен заключительный диагноз: "рак эндометрия (высокодифференцированная аденокарцинома)".

Формула изобретения

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАКА ЭНДОМЕТРИЯ, включающий исследование биологического материала, отличающийся тем, что у пациента берут цельную кровь, выделяют липидную фракцию, в которой методом проточной горизонтальной хроматографии определяют уровень фосфатидилинозитов и при значении уровня этого показателя 6,0 - 6,5 нмоль фосфора на 1 мг белка диагностируют железистую гиперплазию эндометрия, при значении 4,2 - 5,0 нмоль фосфора на 1 мг белка - атипическую гиперплазию, а при значении 1,2 - 3,3 нмоль фосфора на 1 мг белка - рак эндометрия.