Способ ультраструктурной оценки перфузионной способности капилляров миокарда

 

Способ может быть использован в медицине, в частности, в патофизиологии и патологической анатомии, а именно для ультраструктурной оценки капиллярного русла миокарда и для оценки антистрессовой и антигипоксической гипотермической защиты миокарда при длительных остановках кровообращения. Иссекают кусочки миокарда (биоптаты), из них готовят ультратонкие срезы, которые контрастируют и просматривают в электронном микроскопе, определяют степень перфузируемости капиллярного русла миокарда по числу открытых и закрытых капилляров и дифференцировано определяют механизмы выключения капилляров из кровотока в группе закрытых капилляров. Соотношение капилляров, закрытых за счет патологических механизмов к общему числу нефункционирующих капилляров, позволяет более точно оценивать способность капилляров миокарда при различных патофизиологических состояниях, позволяя прогнозировать течение послеоперационного периода у кардиохирургических больных, а также определять патогенетические звенья для медикаментозной коррекции изменений и тем самым усиливать уровень защиты миокарда от ишемических и реперфузионных повреждений. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к патофизиологии и патологической анатомии, а именно к ультраструктурным оценкам капиллярного русла миокарда, и может быть использовано для оценки антистрессовой и антигипоксической гипотермической защиты миокарда при длительных остановках кровообращения.

Известно, что в нормальном миокарде часть капилляров активно функционирует и перфузируется кровью, тогда как определения доля капилляров находится в резервуаре и не функционирует. Количество открытых и закрытых капилляров регулируется, в основном, резистивными микрососудами и прекапиллярными сфинкерами. Капиллярный резервно значительно варьирует при различных патофизиологических воздействиях. Степень реализации данного резерва при воздействиях можно оценить, учитывая только изменения числа открытых и закрытых капилляров. Такая оценка будет объективной, например, при повышенной физической нагрузке, когда достоверно показано, что адекватный кровоток в интенсивно работающем органе поддерживается главным образом раскрытием дополнительных (ранее закрытых) капилляров. При других воздействиях, например, в случае продолжительной ишемии органа информация, касающаяся реализации капиллярного резерва, весьма противоречива. По данным одних авторов в этих условиях количество открытых капилляров увеличивается, по данным других уменьшается или вообще не меняется [1].

Следовательно, существуют патофизиологические состояния, в которых невозможно определить степень реализации капиллярного резерва, основываясь лишь на подсчете числа открытых и закрытых капилляров. Особенно это касается состояний, включающих многофакторные воздействия. Например, когда возникает необходимость изучить протекторные эффекты или иных препаратов или физических факторов (гипотермии) на ишемизированный миокард, а также определить резервы адаптации сосудистого русла в экспериментальной модели, включающие в себя несколько этапов, сравниваемых между собой и контролем, подсчет числа открытых капилляров не всегда может дать объективную характеристику изменений, происходящих в микроциркуляторном русле. Этот показатель может оказаться одинаковым на разных этапах эксперимента при защите миокарда и без нее, так как он не учитывает возможности регуляции кровотока на уровне самих капилляров. Вместе с тем, попытки учесть влияние некоторых механизмов регуляции регионарного кровтока, действующих в условиях патологии, на уровне собственно капилляров, например, влияние сладжа форменных элементов крови и отека эндотелиальной выстилки сосудов, несистематизированы и наносят описательный характер [2].

Цель изобретения - более точное определение и уточнение функционального резерва капиллярного русла миокарда после длительных остановок кровообращения в условиях бесперфузионной гипотермической защиты.

Поставленная цель достигается тем, что после длительных остановок кровообращения в условиях бесперфузионной гипотермической защиты, в совокупности закрытых капилляров, представляющих собой функциональный резерв обменного звена микроциркуляторного русла миокарда, вычисляют долю закрытия капилляров физиологическими и патологическими механизмами. При получении для последних значения 30% и более на глубине окклюзии защита считается неадекватной, а возможности реперфузии ограниченными.

Для осуществления способа используют контроль (собаки, забитые под наркозом); модели тотальной ишемии миокарда путем пережатия магистральных сосудов сердца наркотизированных собак, находящихся в условиях искусственной вентиляции легких : а) без гипотермической защиты длительностью 30 мин, б) в условиях общей умеренной (28-30^oC) бесперфузионной гипотермии длительностью 30 мин, в) в условиях глубокой (22-24^oC) бесперфузионной гипотермии длительностью 60 мин.

Способ осуществляется следующим образом.

На основных этапах операции иссекают небольшие кусочки миокарда (биоптаты). В нормотермическом эксперименте биоптаты получают в конце окклюзии, на этапе реперфузии при попытках восстановить сердечную деятельность, а в сериях с гипотермическими остановками сердца на этапе охлаждения перед окклюзией сосудов, в конце окклюзионного периода, на этапе реперфузии - согревания на третьи сутки после операции. Также биоптаты получают и в группе сравнения или контроля, то есть у собак, забитых при нормальной температуре тела.

Сразу после забора биоптаты помещают в охлажденную смесь, содержащую 2% р-р параформа и 2,5% р/р глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,3. Материал дофиксируют в 1%-ном р-ре четырехокиси осмия на том же фосфатном буфере, обезвоживают в охлажденных растворах спиртов и ацетонов возрастающей концентрации и заливают в смесь Эпона и Аралдита. Затем на ультрамикротоме получают ультратонкие срезы толщиной 700-800 A, которые контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца и просматривают в электронном микроскопе.

Непосредственно в электронном микроскопе определяют степень перфузируемости капилляров и дополнительно механизм выключения капилляров из кровотока. Для этого подсчитывают общее количество капилляров на срезе и вычисляют процентное соотношение капилляров с открытым и закрытым просветом. Среди закрытых капилляров определяют количество тех, которые закрыты физиологическими механизмами, - за счет разворота ядра эндотелиальной клетки в просвет сосуда и за счет пассивного спадения просвета до щелевидного, а также закрытых патологическими механизмами - за счет отека эндотелиальных клеток и за счет сладжа форменных элементов крови.

После этого адекватность защиты перфузионной способности капиллярного русла миокарда оценивают по процентному соотношению капилляров, закрытых за счет патологических механизмов к общему числу нефункционирующих капилляров на этапах нормотермических и гипотермических остановок сердца. При нормотермии уже на этапе окклюзии число капилляров, закрытых патологическими механизмами, превышает 30% (см. табл.) от числа всех закрытых капилляров. При этом на этапе реперфузии это число продолжает увеличиваться как за счет роста числа капилляров, закрытых сладжем, так и за счет вовлечения все большего количества отечных эндотелиальных клеток в выключение капилляров из кровотока. В отличие от этого на глубине гипотермических окклюзий число закрытых капилляров патологическими механизмами не превышает 26%, а на этапе реперфузии уменьшается. На третьи сутки после гипотермических окклюзий число закрытых капилляров приближается к контролю.

Пример 1 (контроль). У двух беспородных собак, самок массой 4 кг 550 г и 8 кг 550 г при эвтаназии (забое) под нембуталовым наркозом (25 мг/кг) с предварительной премедикацией промедолом (1 мл/кг 2% р-ра) были получены биоптаты миокарда левого желудочка. Согласно предлагаемому способу в процессе электронно-микроскопического анализа биоптатов у каждой собаки определялись следующие показатели Собака 1: а) число открытых капилляров - 101 б) число закрытых капилляров - 12 в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 10 г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 2 Собака 2: а) число открытых капилляров - 126 б) число закрытых капилляров - 9 в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 8
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 1
Общее число закрытых капилляров принималось за 100% и рассчитывались следующие пропорции:
12 капилляров - 100%
2 капилляра - X
9 капилляров - 100%
1 капилляр - X
Таким образом X или процент капилляров, закрытых патологическими механизмами, у собаки 1 был равен 17%, а у собаки 2 - 11%.

Пример 2 (ишемия миокарда без защиты). Беспородной собаке, самцу массой 5 кг 200 г за 1 ч до операции делали премедикацию подкожным ведением промедола из расчета 1 мг/кг 2% р-ра и атропина сульфата 0,1% р-р 0,05 мг/кг. После этого проводили вводный наркоз внутривенным введением 10 мг/кг нембутала, интубировали трахею и переводили собаку в режим ИВЛ. Далее следовали торакотомия и пережатие магистральных сосудов длительностью 30 мин в условиях нормотермии. После окончания окклюзии собаке делались попытки восстановить сердечную деятельность путем многократных дефибрилляций м введения больших доз кардиотоников. Восстановить стабильную гемодинамику не удалось и через 4 ч после операции собака погибла. Биоптаты для электронной микроскопии получали из стенки левого желудочка на 30-й минуте окклюзии и через 20-25 мин реанимационных мероприятий. Согласно предлагаемому способу в биоптатах определялись следующие показатели.

В конце окклюзии
а) число открытых капилляров - 87
б) число закрытых капилляров - 13
в) число капилляров; закрытых физиологическими механизмами - 7
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 6
На реперфузии в зоне восстановленного кровотока
а) число открытых капилляров - 39
б) число закрытых капилляров - 37
в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 15
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 22
Составлялась пропорция:
13 капилляров - 100%
6 капилляров - X X = 46%
37 капилляров - 100%
22 капилляра - X X = 59%
В зоне невосстановленого кровотока все 100% капилляров, выключенных из кровотока, были закрыты патологическими механизмами.

Пример 3 (адекватная защита ишемизированного миокарда). Беспородной собаке, самке массой 11 кг 500 г проводили премедикацию и вводный наркоз по схеме, изложенной в примере 2. После интубации трахеи и перевода собаки на ИВЛ осуществляли наружное охлаждение животного в ванне в водой (4^oC), дополнительно обложив поверхность тела собаки мелкоколотым льдом. По достижении температуры в прямой кишке 24^oC производили пережатие магистральных сосудов и сердца длительностью 60 мин. Для быстрой остановки сердца применяли кардиоплегический раствор Бунатяна, который вводили в корень аорты и полость левого желудочка. По окончании окклюзии удалялись зажимы с магистральных сосудов и производились реанимационные мероприятия, включающие прямой массаж сердца, согревание его теплым (35-40^oC) физ. раствором и стимуляцию кардиотониками. После восстановления работы сердца собаку согревали снаружи теплой водой (45^oC). По ходу согревания наркоз углубляли нембуталом из расчета 4-5 мг/кг. Грудную клетку ушивали по достижении температуры в прямой кишке 35-36^oC. Послеоперационный период протекал без осложнений. Биоптаты для электронной микроскопии получали из стенки левого желудочка на 59-50 мин окклюзии и на этапе согревания перед ушиванием грудной клетки. По предлагаемому способу на срезах, полученных от указанных биоптатов определяли следующие показатели.

В конце 60 мин гипотермической окклюзии :
а) число открытых капилляров - 78
б) число закрытых капилляров - 43
в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 34
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 9
На этапе реперфузии-согревания
а) число открытых капилляров - 50
б) число закрытых капилляров - 40
в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 37
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 3
43 капилляра - 100%
9 капилляров - X X = 21%
40 капилляров - 100%
3 капилляра - X X = 8%
Пример 4 (неадекватная защита ишемизированного миокарда). Беспородной собаке, самцу массой 9 кг 900 г проводили премедикацию, вводный наркоз, интубацию трахеи и наружное охлаждение по схеме, изложенной в примерах 2 и 3. Собаку охлаждали до температуры в прямой кишке 24^oC. По ходу охлаждения при достижении температуры 29^oC возникла желудочковая фибрилляция, которую устранили одним разрядом дефибриллятора, затем при 26^oC возникла повторная фибрилляция, которую удалось устранить уже с пятью разрядами дефибриллятора. После устранения гемодинамических нарушений охлаждение продолжали и при 24^oC была выполнена окклюзия магистральных сосудов сердца длительностью 60 мин. По окончании окклюзии были проведены реанимационные мероприятия по схеме, изложенной в примере 3. У собаки в раннем послеоперационном периоде отмечались признаки неврологических расстройств, а на третьи сутки при забое были обнаружены очаговые повреждения миокарда на фоне дилятации полостей сердца. Биоптаты для электронной микроскопии были взяты в конце 60 мин. гипотермической окклюзии и в конце согревания при 35-36^oC. Предлагаемым способом на срезах, полученных от указанных биоптатов, определялись следующие показатели.

В конце окклюзии
а) число открытых капилляров - 45
б) число закрытых капилляров - 35
в) число капилляров, закрытых физиологическими механическими - 21
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 14
На этапе реперфузии-согревания
а) число открытых капилляров - 100
б) число закрытых капилляров - 17
в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 8
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 9
35 капилляров - 100%
14 капилляров - X X = 40%
17 капилляров - 100%
9 капилляров - X X = 53%
Вывод. Предлагаемый способ обеспечивает объективную оценку перфузионной способности капилляров миокарда при различных патофизиологических состояниях: ишемии, охлаждении, реперфузии. Показатели, полученные этим способом, более точно характеризуют уровень и степень того или иного способа защиты миокарда при длительных остановках кровообращения, чем оценка изменений перфузионной способности микроциркуляторного русла миокарда только по числу открытых и закрытых капилляров, поскольку последний показатель малоинформативен и может быть приблизительно одинаковым как на этапах нормотермических, так и гипотермических остановок сердца, не позволяя тем самым прогнозировать течение послеоперационного периода. Предлагаемый способ позволяет определить патогенетические звенья для медикоментозной коррекции изменений, возникающих в капиллярном русле и тем самым усилить уровень защиты миокарда от ишемических и реперфузионных повреждения путем дальнейшего совершенствования метода бесперфузионной гипотермии. Применение данного способа в патологоанатомической практике и судебной медицине позволит ввести объективные критерии развития острой коронарной недостаточности на уровне микроциркуляторного русла в случаях отсутствия макроскопических признаков выключения крупных сосудов из кровообращения (обтурация их просвета тромбами, атеросклеротическими бляшками или эмболами).

Формула изобретения

Способ ультраструктурной оценки перфузионной способности капилляров миокарда, включающий определение степени перфузируемости капиллярного русла по числу открытых и закрытых капилляров, отличающийся тем, что дополнительно в группе закрытых капилляров дифференцированно определяют число капилляров, закрытых по физиологическому механизму выключения капилляров - развороту ядра эндотелиальной клетки в просвет сосуда и пассивного спадения просвета капилляра и по патологическому механизму - отеку эндотелиальной клетки и сладжа форменных элементов крови, затем определяют соотношение числа капилляров, закрытых по патологическому механизму, к общему числу закрытых капилляров и при значении 30% и менее определяют достаточность резерва капиллярного русла миокарда, а при значении более 30% возможности реперфузии ограничены, а резерв капиллярного русла недостаточен.

РИСУНКИ

Рисунок 1