Способ диагностики внутричерепных кровоизлияний у новорожденных детей

Изобретение относится к медицине, а точнее, к неонатологии. Для осуществления диагностики внутричерепных кровоизлияний у новорожденных определяют концентрацию неоптерина в спинно-мозговой жидкости и в сыворотке крови. При значениях концентрации неоптерина 51,6±7,29 нмоль/л в сыворотке крови и 16,3±3,80 нмоль/л в спинно-мозговой жидкости диагностируют внутричерепное кровоизлияние. В способе используется метод иммуноферментного анализа, требующий минимального количества биологических жидкостей. Способ прост в исполнении, для его осуществления требуются малые количества исследуемых биологических жидкостей, что позволяет широко использовать его в роддомах, реанимационных отделениях, отделениях патологии новорожденных. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине и может быть эффективно использовано в неонатологии, перинатальной неврологии и реаниматологии.

Внутричерепные кровоизлияния согласно классификации перинатальных поражений центральной нервной системы (ЦНС) у новорожденных детей (Володин Н.Н. Классификация перинатальных поражений ЦНС у новорожденных, 2000 г.), являются проявлением тяжелых гипоксических поражений ЦНС. Они часто приводят к летальным исходам или широкому спектру неврологических расстройств в детском возрасте, поэтому их диагностика является одной из актуальных проблем.

Известны способы диагностики перинатальных поражений ЦНС и, в частности, внутричерепных кровоизлияний, основанные на инструментальных методах исследований: эхоэнцефалографии, электроэнцефалографии, доплерографии, компьютерной, магнитно-резонансной, позитронно-эмиссионной томографии. Многочисленные исследования подтверждают трудность диагностики внутричерепных кровоизлияний у новорожденных детей (Барашнев Ю.И. Гипоксически-ишемическая энцефалопатия новорожденных: вклад перинатальных факторов, патогенетическая характеристика и прогноз // Рос. вест, перинатологии и педиатрии. - 1996. - №2. - С.29-35).

Так, известен способ прогнозирования течения и исходов гипоксических поражений ЦНС у новорожденных на основе компьютерного анализа ЭЭГ, при котором определяют показатели спектральной мощности 5-ритма и его пространственные распределения. При этом если с первых суток реанимации максимальные показатели спектральной мощности отмечаются в затылочных и теменных зонах, достигая соответственно 119-160 мкВ² и 106-138 мкВ², а на 2-3 сутки мощностные характеристики 5-ритма достоверно преобладают в левом полушарии по сравнению с правым, прогнозируют благоприятный исход заболевания (Масалитинова И.В., Эстрин И.В., Скоморохов А.А. и др., патент РФ №2192779).

К недостаткам способа относится то, что картина ЭЭГ у новорожденных при внутричерепных кровоизлияниях не отличается строгой специфичностью.

Любые процессы, сопровождающиеся гипоксией, могут характеризоваться, так же как и интракраниальные геморрагии, появлением медленных 8-волн, что затрудняет дифференциальную диагностику внутричерепных кровоизлияний на основании ЭЭГ-исследования (Семашко Г.Д. Диагностика и лечение перинатальной энцефалопатии в условиях детского центра // Детский центр. Возможности современных методов диагностики: Тез. докл. юбилейной конф. сотрудников детского центра. - Омск, 1993. - С.127-129).

Известен способ прогнозирования внутрижелудочковых кровоизлияний у доношенных новорожденных путем оценки показателей церебральной гемодинамики в передней мозговой артерии методом ультразвуковой доплерографии, отличающийся тем, что определяют индекс резистентности и при его значениях от 0,9 и выше в первые 12 ч жизни и падении до 0,55 и ниже в последующие 12 ч прогнозируют развитие внутрижелудочковых кровоизлияний (Лобанова Л.В., Философова М.С., Реброва Н.П., патент №2187964). Недостатком данного способа является то, что ультразвуковая доплерография малоинформативна при диагностике изолированных субарахноидальных кровоизлияний или кровоизлияний в глубине структуры вещества мозга (Особенности гемодинамики у детей с отсроченными проявлениями перинатального поражения ЦНС // М.А.Голозубова, А.А.Афонин, Т.Н.Погорелова и др. // II съезд РАСПМ по перинатальной неврологии: Тез. докл. - М.,1997. - С.165).

Известны способы диагностики перинатальных поражений ЦНС и прогнозирования их исходов, основанные на лабораторных данных.

Так, способ диагностики внутрижелудочковых кровоизлияний основан на определении биохимических показателей крови, отражающих гипоксию (лактат), интенсивность перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид и его фракции, степень механического и перекисного гемолиза), антиоксидантную активность (АОА). (Endotoxin, cytokines and lipid peroxides in children with intussusception. Willetts I., Kite P., Barclay G. et all. // Br. J. Surg. - 2001. - Jun; 88(6): 878-883).

К недостаткам способа относится то, что он позволяет лишь в определенной степени диагностировать внутричерепные кровоизлияния и прогнозировать их исход в связи с тем, что описываемые изменения содержания показателей не являются специфичными для родовых внутричерепных кровоизлияний. При целом ряде патологических состояний, сопровождающихся глубокими гипоксическими и метаболическими сдвигами, в тканях организма новорожденного могут встречаться аналогичные изменения (Свободнорадикальное окисление у доношенных новорожденных детей с различной патологией / И.И.Евсюкова, Т.В.Савельева, А.В.Арутюнян и др. // Педиатрия. - 1996. - №1. - С.13-16).

Известен способ диагностики внутричерепных кровоизлияний у новорожденных (Эстрин В.В., Каушанская Е.Я., Крайнева Н.Н. Способ диагностики родовых внутричерепных кровоизлияний у новорожденных 1994 г., патент РФ №2012879), основанный на определении уровня протеолитической активности катепсина D, который выбран нами в качестве прототипа.

Сущность изобретения состоит в том, что проводятся биохимические исследования спинно-мозговой жидкости новорожденных, при этом определяют активность катепсина D и при ее значении выше 6,9 нмоль тирозина (мл/мин) диагностируют внутричерепное родовое кровоизлияние.

Недостатки данного способа следующие.

Способ основан на определении уровня протеолитической активности катепсина D исключительно в спинно-мозговой жидкости, что ограничивает его использование в неонатологии в связи с наличием строгих показаний к проведению спинно-мозговой пункции.

Другим недостатком является необходимость использования больших объемов спинно-мозговой жидкости (0,6 мл), что в 30 раз больше, чем это требуется при использовании современного иммуноферментного метода (0,02 мл).

Задачей изобретения является разработка способа диагностики внутричерепных кровоизлияний у новорожденных детей. Поставленная задача достигается тем, что у новорожденных детей проводится биохимическое исследование концентраций неоптерина в спинно-мозговой жидкости и дополнительно в сыворотке крови, и при значениях 51,6±7,29 нмоль/л в сыворотке крови и 16,3±3,80 нмоль/л в спинно-мозговой жидкости диагностируют внутричерепное кровоизлияние.

Сущность изобретения заключается в создании теста для диагностики внутричерепных кровоизлияний у новорожденных детей путем анализа изменений концентраций неоптерина, определяемого методом иммуноферментного анализа у детей с внутричерепными кровоизлияниями.

Существенным отличием заявляемого способа от прототипа является то, что у новорожденных определяют концентрации неоптерина не только в спинно-мозговой жидкости, но и дополнительно в сыворотке крови. При этом способе используется метод иммуноферментного анализа, требующий минимального количества биологических жидкостей (по 0,02 мл сыворотки крови и ликвора) в отличие от прототипа.

Способ осуществляется следующим образом. Из периферической вены новорожденного ребенка в пластиковую силиконизированную пробирку забирается кровь, которая затем центрифугируется при 1500 об/мин в течение 20 минут в центрифуге с охлаждением. В асептических условиях проводится спинно-мозговая пункция. Образцы сыворотки крови и СМЖ хранятся при 2-8°С до 2 часов, для более длительного хранения (до 1 месяца) используется лабораторный низкотемпературный морозильник (-20°С).

Антиген, конъюгированный с пероксидазой и неконъюгированный антиген конкурируют между собой за ограниченное число мест связывания при взаимодействии с антигенами кролика. Комплекс пероксидаза-конъюгированный антиген-антитело связывается с поверхностью лунок на стрипе для микротитрования, покрытых антителами козы к антителам кролика. Несвязавшийся антиген удаляется из лунок на стадии промывания. После проведения ферментативной реакции со специфическим субстратом в лунках измеряют поглощение при 450 нм. Количество комплексов, связавшихся с поверхностью микролунок, и оптическая плотность обратно пропорциональны концентрации неоптерина в исследуемом образце. Количественное определение проводят путем сравнения ферментативной активности в исследуемом образце с кривой, полученной при анализе стандартов с известными концентрациями.

Заявляемый способ осуществляли следующим образом.

29 новорожденных детей в возрасте от 3-х до 15 суток жизни были распределены на 2 группы: 1 группа (n=13) - дети с перинатальными поражениями ЦНС в виде документированных внутричерепных кровоизлияний, 2 группа (контрольная) (n=16) - дети с перинатальными поражениями ЦНС без документированных внутричерепных кровоизлияний. Дети этих групп были сопоставимы по наличию сопутствующей патологии, срокам гестации и др. Изменения содержания неоптерина (М±m) в сыворотке крови и спинно-мозговой жидкости новорожденных детей представлены в таблице 1.

Как показано в таблице, содержание неоптерина в сыворотке крови повышено более чем в 4,5 раза (Р<0,05) и в спинно-мозговой жидкости увеличено более чем в 2,6 раза (Р<0,05) у детей с документированными перинатальными поражениями ЦНС в виде внутричерепных кровоизлияний, что значимо отличается от уровней неоптерина у детей контрольной группы. Причем при значениях уровней неоптерина 51,6±7,29 нмоль/л в сыворотке крови и 16,3±3,80 нмоль/л в спинно-мозговой жидкости новорожденных детей достоверно диагностируется внутричерепное кровоизлияние (табл.1).

В предложенном способе впервые для диагностики внутричерепных кровоизлияний используется анализ концентраций неоптерина, известного как маркер активации клеточного иммунитета (Свиридов Е.А., Телегина Т.А. Неоптерин и его восстановленные формы: биологическая роль и участие в клеточном иммунитете // Успехи биол. химии. - 2005. - Т.45. - С.355-390).

Таблица 1
Изменения содержания неоптерина (М±m) в сыворотке крови и спинно-мозговой жидкости новорожденных детей
Группы обследованных больных	Содержание неоптерина в сыворотке крови (нмоль/л)	Содержание неоптерина в спинно-мозговой жидкости (нмоль/л)
Новорожденные дети с перинатальными поражениями центральной нервной системы в виде внутричерепных кровоизлияний (n=13)	51,6±7,29*	16,3±3,80*
Новорожденные дети с перинатальными гипоксическими поражениями центральной нервной системы без внутричерепных кровоизлияний - контроль (n=16)	11,4±0,90	6,23±0,58
Примечание: звездочкой * обозначены уровни значимости различий по сравнению с контрольной группой (*- р<0,05)

Неоптерин [2-амино-4-гидрокси-6-(D-эритро-1',2',3'-тригидроксипропил)-птеридин] - низкомолекулярное производное гуанозинтрифосфата, которое продуцируется макрофагами при активации последних интерфероном-γ или фактором некроза опухолей-α и может быть обнаружено в моче и плазме (сыворотке) крови человека при различных формах патологии, связанных с активацией клеточного иммунитета.

Причастность иммунной системы к внутричерепным кровоизлияниям лишь на первый взгляд может показаться странной: известно, что иммунная защита организма срабатывает не только при инфекционных агрессиях, но реагирует также на любое стрессовое воздействие, гемодинамическую перегрузку, интоксикацию и т.д. Полученные нами данные указывают на то, что иммунная система новорожденных детей может реагировать на тяжелую гипоксию, проявляющуюся внутричерепными кровоизлияниями. Выявленные изменения существующей модели патогенеза перинатальных поражений ЦНС не противоречат ей, а дополняют представления о механизмах их развития. Усиление застоя и нарастающая гипоксия мозга плода и новорожденного могут стать причиной клеточных повреждений с повышением продукции гуанозинтрифосфата и активации клеточных элементов иммунной системы, что в совокупности приводит к усилению синтеза неоптерина. Такая последовательность событий косвенно подтверждается прямой пропорциональной зависимостью изменений уровней неоптерина от тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС: значимым увеличением концентраций неоптерина в сыворотке крови и спинно-мозговой жидкости при внутричерепных кровоизлияниях у новорожденных детей по сравнению с гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС без внутричерепных кровоизлияний. И наоборот: уменьшение степени гипоксии понижает активность иммунного ответа и концентрацию неоптерина.

Клинические примеры.

Пример 1. Ребенок С., возраст 7 дней, дата рождения: 05.04.03 (№ истории болезни 1058/03). Диагноз: Перинатальное гипоксическое поражение ЦНС тяжелой степени. Судорожный синдром. Внутрижелудочковое кровоизлияние IV ст. Постгеморрагическая вентрикуломегалия. Ребенок от второй беременности, протекавшей с гестозом в I половине и острой респираторной вирусной инфекцией (ОРВИ), перенесенной в 5 недель. Роды вторые, срочные. Тугое обвитие пуповиной шеи плода. Масса при рождении 3800 г. Оценка по Апгар- 3/6 б. Состояние ребенка с рождения - тяжелое за счет выраженной неврологической симптоматики. В легких дыхание пуэрильное, проводится во все отделы. Тоны сердца приглушены, тахикардия, ЧСС - 160 в мин. Живот мягкий, печень у края реберной дуги. Селезенка не пальпируется. Неврологический статус: болезненный крик, гиперестезия; спонтанный рефлекс Моро; крупноразмашистый тремор конечностей; головка округлая, незначительно конфигурирована, родовой отек; черепно-мозговая иннервация: глазные щели D=S, зрачки округлой формы, D=S, диаметр 0,3 см, реакция на свет, корнеальный рефлекс сохранены, симптом Грефе положительный, периодически сходящееся косоглазие, н/складки симметричны, язык по средней линии; мышечная дистония, сухожильные рефлексы оживлены, S˜D, спинальные автоматизмы: рефлекс опоры, шаговый, Бауэра несколько снижены. На вторые сутки отмечалось ухудшение состояния, тонико-клонические судороги, акроцианоз. На 6 сутки - переведен в отделение интенсивной терапии и реанимации ГУ НЦЗД РАМН. При ультразвуковом исследовании головного мозга (нейросонография) ребенка от 14.04.03 г.установлено расширение желудочковой системы на уровне III и боковых желудочков со значительной постгеморрагической дилатацией, увеличение субарахноидального пространства.

Исследование содержания неоптерина (12.04.03) в сыворотке крови: - 58,89 нмоль/л, в спинно-мозговой жидкости -19,94 нмоль/л.

Таким образом, у обследованного ребенка с внутрижелудочковым кровоизлиянием выявлено существенное повышение концентраций неоптерина в сыворотке крови и спинно-мозговой жидкости по сравнению с установленными нами контрольными значениями, что позволяет диагностировать внутричерепное кровоизлияние.

Пример 2. Ребенок К. возраст 4 дня, дата рождения: 12.04.03 (№ истории болезни 1069/03). Диагноз: Перинатальное гипоксическое поражение ЦНС тяжелой степени. Субарахноидальное кровоизлияние. Внутриутробная гипотрофия 1 степени. Ребенок от второй беременности, протекавшей с гестозом в I и II половине, явлениями фето-плацентарной недостаточности. Роды - 2, срочные. Девочка родилась с внутриутробной гипотрофией I степени. Масса тела 2100 г, длина 50 см. Оценка по шкале Апгар 0-1 балл. Реанимационные мероприятия в родзале в полном объеме. Состояние при рождении тяжелое. Отмечалась резкая конфигурация головки, захождение теменных и затылочных костей. Большой родничок 0,5×0,5 см. Крик болезненный. При плаче появлялся периоральный цианоз и акроцианоз. На коже лица мелкоточечные кровоизлияния, кровоизлияния в склеры. В легких дыхание пуэрильное, проводится во все отделы Тоны сердца приглушены, тахикардия, ЧСС - 160 в мин. Живот мягкий, печень у края реберной дуги. Селезенка не пальпируется. Неврологический статус: черепно-мозговая иннервация - глазные щели D=S, горизонтальный, мелкоразмашистый нистагм. Зрачки округлой формы, диаметр 0,3 см, D=S. Реакция зрачков на свет - прямая и содружественная - живая. Корнеальный рефлекс вызывается, вялый. Мышечная диффузная гипотония, арефлексия, D=S. Рефлексы орального и спинального автоматизма угнетены.

На 2-сутки состояние ребенка ухудшилось: стал постанывать, в течение 2 часов дважды зарегистрирована спонтанная остановка дыхания (апноэ). При нейросонографии установлено субарахноидальное кровоизлияние с его расширением. Исследование содержания неоптерина (16.04.03) в сыворотке крови: - 58,20 нмоль/л, в спинно-мозговой жидкости -17,24 нмоль/л.

Таким образом, у обследованного ребенка с субарахноидальным кровоизлиянием выявлено существенное повышение концентраций неоптерина в сыворотке крови и спинно-мозговой жидкости по сравнению с установленными нами контрольными значениями, что позволяет диагностировать внутричерепное кровоизлияние.

Приведенные клинические примеры подтверждают работоспособность предлагаемого теста для ранней биохимической диагностики внутричерепных кровоизлияний у новорожденных детей, что имеет существенное значение для оптимизации тактики и объема лечебных мероприятий.

Способ позволяет своевременно выбрать правильную тактику ведения новорожденных с внутричерепными кровоизлияниями, а доказанное участие неоптерина в патогенезе заболевания расширяет базу терапевтического вмешательства и открывает новые перспективы для повышения эффективности лечения детей с внутричерепными кровоизлияниями и тем самым - снижения процента осложнений и летальности.

Предлагаемый способ позволяет правильно выбрать тактику ведения и лечения больных, тем самым снизить процент летальности и осложнений, приводящих к инвалидности детей; способ прост, оперативен, не требует дорогостоящей аппаратуры, что позволяет широко использовать его в роддомах, реанимационных отделениях, отделениях патологии новорожденных и II этапа выхаживания недоношенных детей.

Способ диагностики внутричерепных кровоизлияний у новорожденных детей, включающий биохимическое исследование спинномозговой жидкости новорожденных, отличающийся тем, что в спинномозговой жидкости и дополнительно в сыворотке крови определяют концентрации неоптерина и при значениях 51,6±7,29 нмоль/л в сыворотке крови и 16,3±3,80 нмоль/л в спинномозговой жидкости диагностируют внутричерепное кровоизлияние.