Способ селективного определения нонилфенола в растворе с помощью пьезокварцевого иммуносенсора

Авторы патента:

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

C12Q1 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

Владельцы патента RU 2287820:

Липецкий государственный технический университет (ЛГТУ) (RU)

Изобретение относится к аналитической химии и иммунологии. Селективное определение нонилфенола осуществляют с помощью пьезокварцевого иммуносенсора. Пробу, содержащую нонилфенол и фиксированное количество антител к нему в фосфатном буфере (рН 7,1-7,5), пропускают через проточную ячейку, включающую массочувствительный пьезокварцевый иммуносенсор с рецепторным покрытием на основе аминофенол-белкового конъюгата. Нонилфенол определяют по регистрируемому изменению частоты колебания сенсора при взаимодействии аминофенол-белкового конъюгата с антителами к нонилфенолу, где изменение частоты колебания сенсора обратно пропорционально концентрации нонилфенола в анализируемой пробе. Затем регенерируют рецепторное покрытие для проведения последующих определений, пропуская через ячейку 0,02-0,10 мМ раствор тиоционата калия. Использование изобретения позволяет проводить многоразовый селективный анализ с пределом обнаружения нонилфенола 0,8 нг/мл и определять концентрацию нонилфенола в диапазоне 1-20 нг/мл. 1 табл.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть рекомендовано для селективного определения нонилфенола в объектах окружающей среды - почве, промышленных сточных и природных водах.

Известен способ определения нонилфенола с применением поляризационного флуо-ресцентного иммуноанализа (Y.N.Yakovleva, A.Yu.Lobanova, E.A.Shutaleva, M.A.Kourkina, A.A.Mart'ianov, А.V.Zherdev, В.В.Dzantiev, S.A.Express detection of nonylphenol in water samples by fluorescence polarization immunoassay // Anal. Bioanal. Chem., 2004. Vol.378. - p.634-641), характеризующийся относительно невысокой чувствительностью (предел обнаружения равен 7 мкг/мл), высокой стоимостью анализа, поскольку предусматривается однократное использование иммунореагентов. Данным способом невозможно осуществлять определение остаточных концентраций нонилфенола в объектах окружающей среды.

Изобретением решается задача снижения предела обнаружения нонилфенола и увеличения чувствительности определения в сложных по составу пробах с последующей регенерацией иммунореагентов.

Для достижения технического результата в предлагаемом способе через проточную ячейку, включающую массочувствительный пьезокварцевый иммуносенсор с рецепторным покрытием на основе аминофенол-белкового конъюгата, с помощью фосфатного буферного раствора (рН 7,1-7,5) со скоростью 60 мкл/мин пропускают предварительно подготовленную пробу и регистрируют аналитический отклик сенсора. В качестве аналитического сигнала сенсора используют изменение частоты колебания сенсора при взаимодействии аминофенол-белкового конъюгата с антителами к нонилфенолу, присутствующими в пробе. Подготовку пробы осуществляют путем прибавления к раствору, содержащему нонилфенол фиксированного количества антител к нему. Аналитический сигнал сенсора обратно пропорционален содержанию нонилфенола в анализируемой пробе. После каждого цикла измерения осуществляют регенерацию рецепторного покрытия, пропуская через ячейку 0,02-0,10 мМ раствор тиоцианата калия.

Отличительными признаками предложенного способа являются:

- высокая чувствительность способа, позволяющая осуществлять определение нонилфенола в жидких средах в интервале концентраций 1-20 нг/мл, при этом предел обнаружения равен 0,8 нг/мл;

- проведение измерений в режиме реального времени;

- высокая селективность определения нонилфенола в сложных по составу смесях, в том числе в присутствии родственных соединений;

- многократное (более 20 раз) использование иммуносенсора вследствие регенерации биорецепторного покрытия после каждого цикла измерения.

Это позволяет проводить экспрессное определение нонилфенола в жидких средах в режиме реального времени в диапазоне концентраций 1-20 нг/мл в сложных по составу смесях. Высокая селективность обеспечивается использованием специфичных иммунореагентов (антител к нонилфенолу) и аминофенол-белкового конъюгата (природа белка не влияет на чувствительность и селективность определения нонилфенола). Многократное (более 20 раз) использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия обеспечивает снижение затрат на осуществление анализа.

Способ осуществляется следующим образом.

Для создания иммуносенсора используется пьезокварцевый массочувствительный резонатор АТ-среза с серебряными электродами диаметром 5 мм и собственной частотой колебания 10 МГц±1 Гц. На одном из электродов сенсора после тщательной очистки и обезжиривания предварительно формировали силиконовую подложку на основе γ-аминопропилтриэтоксисилана, нанося его микрошприцем в виде тонкого слоя. Гаптен-белковый конъюгат ковалентно закрепляли на поверхности силиконового слоя с помощью глутарового альдегида.

Пьезокварцевый иммуносенсор закрепляли в проточной ячейке объемом 15-20 мкл таким образом, чтобы он контактировал только одной стороной с анализируемым раствором.

Перед началом измерений через ячейку пропускали фосфатный буферный раствор (рН 7,1-7,5) до стабилизации сигнала сенсора. Затем в поток буферного раствора вводили предварительно подготовленную пробу (0,2 мл), что вызывало снижение частоты колебания сенсора вследствие образования на поверхности электрода иммунокомплекса аминофенол-белкового конъюгата с антителами к нонилфенолу. Далее ячейку промывали буферным раствором до стабилизации сигнала сенсора и вводили регенерирующий раствор, разрушающий образовавшийся иммунный комплекс. Частота колебаний сенсора при этом возвращалась к исходному значению.

В качестве аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносенсора использовали изменение частоты колебания сенсора (Δf) вследствие увеличения массы рецепторного покрытия в результате взаимодействия антител с аминофенол-белковым конъюгатом. Сигнал рассчитывается по следующему уравнению:

Δf=f_m-f,

где f_m - частота колебаний иммуносенсора до начала измерения с предварительно нанесенным биорецепторным слоем; f - минимальная частота колебаний сенсора, соответствующая образованию гетерогенного иммунокомплекса.

Для предварительной подготовки пробы к образцу, содержащему нонилфенол, прибавляли 50 мкл 0,1%-ного раствора антител к нонилфенолу, соответствующих 50%-ному связыванию их с аминофенол-белковым коньюгатом. Полученную смесь доводили фосфатным буферным раствором до 1 мл и выдерживали до завершения реакции в течение 15 мин при 20°С. Концентрацию нонилфенола в пробе определяли по предварительно построенному градуировочному графику.

Для построения градуировочного графика к 50 мкл анализируемого раствора с концентрацией нонилфенола 1, 5, 10, 15, 20, 25 нг/мл прибавляли 50 мкл 0,1%-ного раствора антител, смесь доводили фосфатным буферным раствором до 1 мл и выдерживали до завершения реакции в течение 15 мин при 20°С.

Значение аналитического сигнала обратно пропорционально содержанию нонилфенола в пробе.

Градуировочный график для определения нонилфенола в жидких средах линеен в диапазоне концентраций 1-20 нг/мл: Δf=-2,5·с+48,6, где Δf - аналитический сигнал; с - концентрация нонилфенола в пробе.

Пример 1. Исследуемый образец объемом 200 мкл с концентрацией нонилфенола 1 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин, включающей серийно выпускаемый отечественный пьезокварцевый резонатор АТ-среза с собственной частотой колебаний 10 МГц ± 1 Гц, на поверхности серебряных электродов (диаметр 5 мм) которого предварительно сформировали биорецепторный слой на основе гаптен-белкового конъюгата. Сенсор контактировал одной стороной с анализируемой жидкой фазой. Предварительно к анализируемой пробе добавляли фиксированное количество антител к нонилфенолу и выдерживали в течение 15 минут до образования комплекса. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию нонилфенола в растворе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли пропусканием через ячейку детектирования раствора KCNS 0,02-0,10 мМ. Определение концентрации нонилфенола осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
1,0 нг/мл	1,0±0,2 нг/мл

Аналитический сигнал Δf=46 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг, предел обнаружения нонилфенола - 0,8 нг/мл.

Пример 2. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 2 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
2,0 нг/мл	2,0±0,2 нг/мл

Δf=44 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Предел обнаружения нонилфенола - 0,80 нг/мл.

Пример 3. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 5 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
5,0 нг/мл	5,0±0,2 нг/мл

Δf=36 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Предел обнаружения нонилфенола - 0,80 нг/мл.

Пример 4. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 8 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
8,0 нг/мл	8,0±0,2 нг/мл

Δf=29 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Предел обнаружения нонилфенола - 0,80 нг/мл.

Пример 5. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 5 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,0) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
5,0 нг/мл	10,6±0,2 нг/мл

Δf=22 Гц; чувствительность определения нонилфенола 0,9 Гц/нг. Предел обнаружения - 1,5 нг/мл.

Пример 6. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 5 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,6) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
5,0 нг/мл	9,4±0,2 нг/мл

Δf=25 Гц; чувствительность определения нонилфенола 0,8 Гц/нг. Предел обнаружения нонилфенола - 1,3 нг/мл.

Пример 7. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 5 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли пропусканием через ячейку детектирования раствора KCNS 0,11 мМ. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
5,0 нг/мл	13,4±0,2 нг/мл

Δf=15 Гц; происходит разрушение биорецепторного покрытия иммуносенсора, снижается воспроизводимость результатов, невозможно многократное применение сенсора.

Пример 8. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 5 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли пропусканием через ячейку детектирования раствора KCNS 0,01 мМ. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
5,0 нг/мл	5,0±0,2 нг/мл

Δf=36 Гц; существенно увеличивается время анализа.

Пример 9. Исследуемый образец 200 мкл, содержащий 5 нг/мл нонилфенола и 5 нг/мл 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
5,0 нг/мл	5,0±0,2 нг/мл

Δf=36 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Присутствие 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) не влияет на результаты определения нонилфенола.

Пример 10. Исследуемый образец 200 мкл, содержащий 5 нг/мл нонилфенола и 10 нг/мл 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
5,0 нг/мл	5,0±0,2 нг/мл

Пример 11. Исследуемый образец 200 мкл, содержащий 5 нг/мл нонилфенола и 20 нг/мл 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
5,0 нг/мл	5,0±0,2 нг/мл

Пример 12. Исследуемый образец 200 мкл, содержащий 5 нг/мл нонилфенола и 40 нг/мл 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
5,0 нг/мл	5,0±0,2 нг/мл

Пример 13. Исследуемый образец 200 мкл, содержащий 5 нг/мл нонилфенола и 50 нг/мл 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:	Найдено нонилфенола:
5,0 нг/мл	5,0±0,2 нг/мл

Данный способ позволяет существенно увеличить чувствительность определения нонилфенола в сложных по составу смесях, а также обеспечивает многократное использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия, что снижает затраты на осуществление анализа. Предел обнаружения нонилфенола равен 0,8 нг/мл.

Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способа определения нонилфенола в жидких средах приведена в таблице.

Таблица
Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способа детектированиия нонилфенола в жидких средах
Показатели	Известный способ	Предлагаемый способ
Диапазон определяемых содержаний	18-300 мкг/мл	1-20 нг/мл
Предел обнаружения	7 мкг/мл	0,8 нг/мл
Применение дополнительных меток	Флуоресцентная	Не требуется
Объем анализируемой пробы	500 мкл	200 мкл
Вид анализа	Дискретный/косвенный	Непрерывный/прямой
Регенерация иммунореагентов	Не осуществляется	После каждого цикла измерения
Продолжительность измерения аналитического сигнала, мин	1	3

Способ селективного определения нонилфенола, отличающийся тем, что селективное определение нонилфенола осуществляют с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, где пробу, содержащую нонилфенол и фиксированное количество антител к нему в фосфатном буфере (рН 7,1-7,5), пропускают через проточную ячейку, включающую массочувствительный пьезокварцевый иммуносенсор с рецепторным покрытием на основе аминофенол-белкового конъюгата и регистрируют изменение частоты колебания сенсора при взаимодействии аминофенол-белкового конъюгата с антителами к нонилфенолу, обратно пропорциональное концентрации нонилфенола в анализируемой пробе, а затем регенерируют рецепторное покрытие для проведения последующих определений, пропуская через ячейку 0,02-0,10 мМ раствор тиоционата калия.

Изобретение относится к иммунологии. .

Деградированное антитело, являющееся агонистом tpo // 2287534

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской практике. .

Способ прогнозирования течения неврологических расстройств у детей раннего возраста с перинатальным поражением цнс // 2286575

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии. .

Способ прогнозирования ринотубарной миграции микроорганизмов в барабанную полость при заболеваниях верхних дыхательных путей // 2286574

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам прогнозирования ринотубарной миграции микроорганизмов в барабанную полость. .

Способ определения степени выраженности воспаления в слизистой оболочке тонкой кишки // 2285927

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано в клинико-лабораторной практике в детской гастроэнтерологии для определения степени воспаления в слизистой оболочке тонкой кишки.

Способ прогнозирования угрозы прерывания беременности с ранних сроков гестации // 2285926

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. .

Способ прогнозирования гнойно-воспалительных осложнений при лечении открытых переломов длинных трубчатых костей // 2285925

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для раннего прогнозирования гнойно-воспалительных осложнений у больных с открытыми переломами длинных трубчатых костей в послеоперационном периоде.

Способ прогнозирования течения раневого процесса // 2285924

Изобретение относится к области клинической биохимии и может быть использовано для прогнозирования течения раневого процесса в послеоперационном периоде. .

Способ дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы у детей и подростков // 2285923

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, в частности к иммуногенетическим методам исследования в онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы.

Способ прогнозирования осложнений при лечении зубочелюстных аномалий и деформаций брекет-системой // 2285922

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано в практическом здравоохранении. .

Способ определения генотипа крупного рогатого скота // 2287587

Изобретение относится к области генотипирования КРС, а именно к типированию генотипа крупного рогатого скота по аллелям гена BoLA DRB 3 главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II с целью выявления животных, предрасположенных к персистентному лимфоцитозу.

Способ экспрессного определения устойчивости к рифампицину у микобактерий туберкулеза // 2287586

Изобретение относится к фтизиобактериологии и может быть использовано для лабораторной диагностики множественно-лекарственного туберкулеза. .

Состав покрытия пьезокварцевого резонатора для определения антител yersinia enterocolitica в водных средах // 2287585

Изобретение относится к иммунологии. .

Количественный диагностический анализ гипертензии // 2287160

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики in vitro, обусловленной генетическими факторами предрасположенности к гипертонии посредством выявления в образце (а) SNP, который выявляют в экзоне 8(С Т) гена hsgk1 и представленном в SEQ ID NO:1, а также (б) SNP, который выявляют в интроне 6(Т С) гена hsgk1 и локализованном во фрагменте размером 551 п.о.

Способ прогнозирования развития гипертонической болезни по генетическим факторам риска // 2287158

Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования развития гипертонической болезни по генетическим факторам риска. .

Способ идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) // 2286798

Изобретение относится к области медицины и касается способа идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов) с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа).

Культуральная среда и способ идентификации грамотрицательных микроорганизмов // 2286392

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культуральной среде, используемой в способе идентификации грамотрицательных микроорганизмов. .

Способ биологической изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования // 2286391

Способ заражения птиц возбудителем пастереллеза для постановки биологической пробы // 2286390

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. .

Композиция реагентов, реагентная тест-полоска, система, способ и набор для обнаружения или определения присутствия аналита в физиологическом образце // 2288273

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к определению аналита в физиологическом образце, и может быть использовано в медицинских и диагностических целях