Способ получения крови с повышенным содержанием нуклеозидов и нуклеотидов

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения крови с повышенным содержанием нуклеозидов и нуклеотидов с последующим использованием ее для лечения и профилактики дистрофических заболеваний любой локализации без экссудативно-геморрагического процесса. Способ заключается в том, что донора с остротой зрения не ниже 0,2 помещают в темное светонепроницаемое помещение, где он находится с открытыми глазами в течение 45 минут. Затем кровь забирают гепаринизированными шприцами. Способ обеспечивает получение крови с повышенным содержанием нуклеозидов и нуклеотидов, в 2-5 раз превышающим исходный уровень в плазме крови.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения крови с повышенным содержанием нуклеозидов и нуклеотидов с последующим ее использованием для лечения и профилактики дистрофических заболеваний любой локализации без экссудативно-геморрагического процесса. Из литературы известно, что для лечения миокардиодистрофии, дистрофии сетчатки, частичной атрофии зрительного нерва и др. широко используется рибоксин, представляющий собой нуклеозид и поэтому легко проникающий в клетку (Машковский М.Д. Лекарственные препараты, 1998, часть 2, с.167). Однако достичь стойкого и длительного положительного терапевтического эффекта не удается. Это можно объяснить тем, что проникая в клетку, он не может одновременно влиять на нарушенные процессы, например, синтетического, энергетического и пластического характера. Поэтому для нормализации трофики необходим комплекс биологически активных веществ, основательно влияющих на указанные процессы.

Наше внимание в проблеме репаративно-дистрофических процессов привлек обмен нуклеозидов и нуклеотидов. Эти вещества являются мощными источниками энергии, служат строительными блоками для РНК (нуклеиновых кислот) и поэтому необходимы для обеспечения нормального течения репаративных процессов и предупреждения развития дистрофических процессов (Страйер Л. Биохимия, М., 1985, Т.2, с.255-278, Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия, М., 2004, с.86-87). Известно, что нуклеотиды пренадлежат к наиболее сложным метаболитам. Их биосинтез требует много времени и высоких затрат энергии. Поэтому понятно, что нуклеотиды не полностью разрушаются, а по большей части снова участвуют в синтезе. Прежде всего, это относится к пуриновым основаниям и гуанину. В организме высших животных 90% пуриновых оснований снова превращаются в нуклеозидмонофосфаты.

Очевидно, что процесс дистрофии как таковой связан с нарушением, прежде всего, энергетического баланса клеток, вовлеченных в этот процесс. Касаясь энергетического баланса клетки. Известно, что регуляция метаболизма направлена, в частности, на поддержание энергетического заряда в сравнительно узких пределах. Энергетический заряд клетки, так же как и рН клетки забуферен. Его значение в большинстве клеток находится в диапазоне 0,80-0,95 (Страйер Л., там же, т.2, с.19). Поэтому, очевидно, что при любого вида альтерации клетки для предупреждения развития в ней дистрофического процесса необходим комплекс веществ, направленных на обеспечение достаточного уровня энергетических, синтетических и пластических процессов, позволяющих восстановить нормальное состояние клетки. Какие вещества составляют этот комплекс, вероятно, можно было бы ответить, зная, какие изменения происходят в крови бодрствующего организма, внезапно лишившегося информации зрительного анализатора в условиях темноты. Известно, что зрение участвует в регуляции положения тела в пространстве, оказывает влияние на тонус нервной системы (Гершуни Г.В. Физиология сенсорных систем. Часть первая. Физиология зрения. Ленинград, 1971, с.150-179). Поэтому можно предположить, что центральная нервная система, лишившись информационного влияния зрительного анализатора на пространственное положение тела в темноте, впадает в стресс и ожидание изменения скорости биохимических реакций в ответ на работу организма в новых чрезвычайных условиях. В настоящее время науке не известно, что происходит в крови бодрствующего организма, попавшего в описанную ситуацию. Однако известно, что зрительное восприятие в темноте, согласно современным представлениям, осуществляется в результате особенности работы сигнального каскада - в темноте в палочках накапливается циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) с высокой концентрацией, которая способствует тому, что цГМФ зависимые каналы плазматической мембраны остаются открытыми и катионы Na и Са беспрепятственно поступают в клетку. При этом зрительная клетка постоянно выбрасывает нейромедиатор глутамат в синаптическую щель. Для катионного насоса требуется большая концентрация АТФ. За счет указанного механизма обеспечивается минимальное зрение при неблагоприятной освещенности. На свету уровень цГМФ резко падает за счет активации фосфодиэстеразы, что приводит к закрытию ионных каналов и зрительная система пациента возвращается в состояние, которое он имел до наступления темноты. Причем, этот переход осуществляется в течение нескольких миллисекунд (Кольман Я., Рем К.Г., там же, с.346-347). Известно, что зрение через пути, идущие от сетчатки в гипоталамус и ретикулярную формацию среднего мозга, оказывает влияние на нервно-эндокринную регуляцию и тонус всей нервной системы (Гершуни В.Г., там же, с.150-179). Поэтому можно предположить, что организм, находясь в условиях темновой адаптации (фактор темноты), запускает через зрительный анализатор работу сигнального каскада, обеспечивающего появление в кровеносном русле дополнительного количества легкоподвижных (низкомолекулярных) веществ, имеющихся в организме всегда в достаточном запасе и ненуждающихся в синтезе de novo (с начала) и, в зависимости от ситуации, легко трансформирующихся друг в друга и обеспечивающих высокий энергетический, пластический и синтетический потенциал, необходимый для выполнения физиологических нагрузок в экстремальных условиях темноты. Известно, что перечисленными свойствами обладают нуклеозиды и нуклеотиды (Jan Koolman, Klaus-Heinrich Rohm. Taschenatlas der Biocheme. Stuttgart - New York, 1998; Кольман Я., Рем К.Г., там же, 2004, с.44-45, с.86-87, с.188-191; Страйер Л., там же, 1985, т.2, с.255-279). По нашему представлению, по окончании экстремальных условий - при переходе организма в обычные условия освещенности и восстановлении зрения в регуляции положения тела в пространстве и влиянии на тонус всей нервной системы уровень биологических веществ, обеспечивающих энергетический, пластический и синтетический потенциал, должен вернуться в исходное состояние, которое он имел до наступления состояния темновой адаптации. Очевидно, что для ликвидации дистрофических очагов и предупреждения прогрессирования дистрофического процесса необходимо восстановление энергетического заряда каждой клетки, входящей в дистрофический очаг. Для этого, как нам представляется, необходим более высокий уровень в плазме крови больных определенного комплекса веществ, представляющего собой сложный нуклеозидно-нуклеотидный комплекс, обеспечивающий повышение энергетических, пластических и синтетических процессов в дистрофической клетке.

До настоящего времени в экспериментальной и клинической медицине не ставился вопрос о получении крови с повышенным содержанием нуклеозидов и нуклеотидов.

Таким образом, задача предлагаемого изобретения состояла в разработке способа получения такой крови, которая бы содержала нуклеозиды и нуклеотиды для последующего ее использования с лечебными целями.

В клиническом эксперименте на здоровых волонтерах было показано, что при нахождении их в темноте в течение 45 минут с открытыми глазами в плазме крови в 2-5 раз повышался исходный уровень нуклеозидов и нуклеотидов. У больных с дистрофическими зоболеваниями глазного дна, помещенных в аналогичные условия, в плазме крови также повышался уровень вышеуказанных веществ в 2-5 раза, сравнительно с исходным уровнем, если острота зрения была не ниже 0,2. Вероятно, количество фоторецепторов, соответствующее остроте зрения ниже 0,2, не обеспечивало поступления достаточной информации в гипоталамус и ретикулярную формацию среднего мозга для запуска в крови реакции, подобной сигнальному каскаду. Характерно, что повышение биологически активных веществ было напрямую связано с условиями взятия крови. Так, после нахождения испытуемых в условиях темновой адаптации (темноты) и при взятии крови в условиях обычной освещенности процедурного кабинета со светонепроницаемой повязкой на обоих глазах обеспечивается повышение вышеуказанных уровней нуклеозидов и нуклеотидов. Кровь, взятая при произвольно открытых глазах донора и обычной освещенности, по указанным параметрам не отличалась от исходного уровня. Это указывает на то, что в первом случае, когда отсутствуют условия попадания света на фоторецепторы и поэтому нет условий для активации фосфодиэстеразы, за счет того, вероятно, и сохраняется повышенный уровень нуклеозидов и нуклеотидов. Во втором случае, когда кровь бралась с открытыми глазами при обычной освещенности, активировалась, как известно, фосфодиэстераза, в результате чего происходило быстрое падение уровня нуклеозидов и нуклеотидов до исходного их уровня.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение крови с повышенным содержанием нуклеозидов и нуклеотидов.

Технический результат достигается за счет воздействия темноты на фоторецепторы и определенные структуры мозга в течение определенного времени (45 минут) при условии остроты зрения у донора не ниже 0,2.

Исследования крови, полученной с помощью разработанной технологии, подтвердили, что данная кровь действительно обладает повышенным содержанием нуклеозидов и нуклеотидов.

Способ осуществляют следующим образом. Донора помещают на 45 минут в темное помещение со светонепроницаемыми жалюзи и дверями. В течение указанного времени испытуемый находится с открытыми глазами. Затем кровь забирают гепаринизированными шприцами. Полученную кровь используют в течение 20 минут - 5 часов для лечебных целей или отделяют плазму и помещают ее в холодильник при температуре минус 17°С. Как показали исследования, требуемые свойства плазмы крови сохраняются в течение 6 месяцев. Это было показано масс-спектральным анализом.

Масс-спектры образцов плазмы крови снимали на приборе Vision 2000 Thermo Bioanalysis Corp (Англия) с времяпролетным детектором по методике матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ). Прибор имеет азотистый лазер с длиной волны луча 337 нм с частотой импульса 3 нс и максимальной энергией импульса 250 кДж. Пробу плазмы крови объемом 50 мкл помещали в пластиковую пробирку, приливали 50 мкл смеси растворителей вода/метанол (1:1) и тщательно перемешивали, осадок отделяли центрифугированием и 0,2 мкл надосадочной жидкости наносили на предварительно нанесенные на мишень 0,2 мкл матрицы - 2,5-дигидроксибензойной кислоты. Пятна высушивали при комнатной температуре и мишень после высушивания пятен помещали в источник ионизациии. Высокочувствительный метод масс-спектра МАЛДИ позволяет определить молекулярные веса компонентов плазмы крови и оценить их относительное содержание по интенсивности ионов в масс-спектре. Результаты исследований показали, что масс-спектры образцов плазмы до помещения в темноту и сразу после пребывания в темноте (кровь бралась с открытыми глазами у исследуемого и при нормальной освещенности) были идентичны. В образцах плазмы крови, взятой при нормальной освещенности и светонепроницаемой повязкой на обоих глазах после 45 минутного пребывания пациента в условиях темноты с открытыми глазами, были выявлены в больших концентрациях (в 2-5 раза, превышающих исходные уровни в образцах плазмы, взятых при других условиях) рибозиды оснований нуклеиновых кислот: тимина, цитозина, гуанина. Остальные пики во всех образцах плазмы имели низкую интенсивность. Различие в компонентном составе образцов плазмы установлены в диапазоне масс ионов от m/z (массы) 300 до 1000 а.е.м. (единиц атомных масс) при усилении этого участка в 8-10 раз. В этом интервале масс-спектров выявлено 4 взаимосвязанных участка, характеризующих области мононуклеотид - монофосфатов (m/z 300-390 а.е.м.), дифосфатов (m/z 400-550 а.е.м.), трифосфатов (m/z 340-600 а.е.м.) и их солей и область динуклеотидов или ассоциатов мононуклеотидов (m/z 600 а.е.м. и выше). Учитывая физиологическую роль вышеуказанных веществ, кровь, взятая в вышеуказанных специфических условиях, в дальнейшем может быть использована как лечебный препарат, представляющий собой сложный нуклеозидно-нуклеотидный комплекс, обеспечивающий повышение энергетических, пластических и синтетических процессов при дистрофиях различной локализации и различного генеза без экссудативно-геморрагического процесса.

Способ получения крови с повышенным содержанием нуклеозидов и нуклеотидов в 2-5 раз, превышающим исходный уровень в плазме крови, включающий взятие крови у донора с остротой зрения не ниже 0,2 после его нахождения в условиях темновой адаптации с открытыми глазами в течение 45 мин.