Применение апопротеинов сыворотки молока в профилактике или лечении микробной или вирусной инфекции

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Молочные апопротеины применяют для ингибирования адгезии потенциальных патогенов к или на поверхности тела человека и животного. Молочные апопротеины применяют для изготовления лекарственного препарата для ингибирования или адгезии потенциальных патогенов к или на поверхности тела человека и животного. Фармацевтически приемлемая система доставки для доставки апопротеина, для профилактики или лечения инфекции включает один молочный протеин или смесь молочных протеинов и фармацевтически приемлемый носитель. Продукт для профилактики или лечения инфекции содержит один молочный апопротеин или смесь молочных апопротеинов и жирную кислоту или смесь жирных кислот, или моноглицерид или смесь моноглицеридов. Применение апопротеинов в составе лекарственного препарата или продукта эффективно при профилактике или лечении инфекции человека или животного. 4 н. и 31 з.п. ф-лы, 13 ил., 1 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение касается применения молочных апопротеинов для профилактики или лечения микробной или вирусной инфекции у человека или животного. Более подробно, эти молочные апопротеины можно применять в чистом виде или в комбинации с одной или более короткоцепочечными органическими кислотами или их солями или эфирами, такими как лимонная кислота, и/или одной или более свободными жирными кислотами и их моноэфирами для ингибирования адгезии и/или роста потенциальных патогенов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Молоко представляет собой белесую жидкость, которую получают из молочных желез зрелых самок млекопитающих после родов. Млекопитающие представляют собой теплокровных позвоночных животных Класса Млекопитающие, включающего человека и других млекопитающих, среди которых наиболее предпочтительными для целей настоящего изобретения являются копытные, парнокопытные млекопитающие Подотряда Жвачных, такие как крупный рогатый скот, овцы, козы, олени и жирафы. Молоко от крупного рогатого скота и коз является предпочтительным источником молочных апопротеинов согласно настоящему изобретению, поскольку этот источник легко доступен в промышленном масштабе.

Термин «молочная сыворотка» («сыворотка молока») обычно используется в молочной промышленности для описания прозрачного жидкого раствора, в котором суспендированы мицеллы казеина и глобулы молочного жира. Молочная сыворотка от жвачных животных содержит молочный сахар лактозу, множество белков, включая антитела молока, лактоферрин и ферменты, а также множество липопротеинов, включая бета-лактоглобулин. Молочная сыворотка является предпочтительным источником молочных апопротеинов.

В молочной промышленности коровье молоко подвергают обработке для получения либо масла, либо сыра. Механическое перемешивание используют для разрушения глобул молочного жира с получением масла, а осаждение казеина используют для получения творога, из которого производят сыр. Жидкое вещество, остающееся после этих процессов, обычно называют сывороткой. Молочная сыворотка представляет собой по существу продукт с повышенным содержанием липопротеинов, происходящих в основном из мембран жировых глобул. Молочная сыворотка является предпочтительным источником молочных апопротеинов. Используемый здесь термин «молочный сывороточный апопротеин» охватывает молочные апопротеины, полученные из сыворотки молока (молочной сыворотки).

В молочной сыворотке имеется множество различных липопротеинов и гликопротеинов, отличительной особенностью которых является наличие белкового остова, к которому присоединены липиды и/или углеводы. Эти липиды и/или углеводы могут быть удалены из белкового остова с помощью ферментативного гидролиза с получением соответствующих апопротеинов. Хотя молочные сывороточные апопротеины были выделены, их медицинское применение неизвестно.

Липиды или жиры включают в себя триэфиры жирных кислот, которые могут быть одинаковыми или разными, и глицерина, и описаны также как триацилглицерины или триглицериды. Дальнейший гидролиз может быть использован для разрушения этих эфирных связей с высвобождением таким образом свободных жирных кислот из триацилглицеринов. Применение телячьей преджелудочной липазы для высвобождения свободных жирных кислот из молочных липидов описано Cynthia Q Sun с соавт. (Chemico-Biological Interactions, 140 (2002), pp.185-198). Этот автор сообщает о рост-ингибирующих свойствах различных свободных жирных кислот, направленных против энтерококков, которые являются грамположительными бактериями, и колиподобных бактерий, которые являются грамотрицательными, но ничего не сообщает о роли молочных сывороточных апопротеинов.

Свободные жирные кислоты, как известно, проявляют потенциальную противомикробную и противовирусную активность. В частности, Schuster с соавт. (Pharmacology and Therapeutics in Dentistry, 5, pp.25-33, 1980) сообщили, что линолевая, линоленовая, каприловая и капроновая кислоты ингибируют микроорганизм, вызывающий кариес зубов. Streptococcus mutans, и вызывают значительное уменьшение зубного налета. Согласно сообщению этого автора наиболее чувствительными к воздействию этих кислот являются грамотрицательные бактерии, тогда как грамположительные бактерии менее подвержены действию этих кислот. Кроме того, Halldor Thormar с соавт. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Jan 1987, pp.27-31) рассматривают противовирусные свойства свободных жирных кислот и их моноэфиров, демонстрируя эффективность полиненасыщенных длинноцепочечных жирных кислот и насыщенных среднецепочечных жирных кислот (и их моноглицеридных эфиров) против оболочечных вирусов и их относительную активность против необолочечных вирусов, при этом вироцидный эффект, возможно, обусловлен разрушением собственно вирусной оболочки. Совсем недавно появилось сообщение о бактерицидной активности свободных жирных кислот. R.Corinne Sprong с соавт. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, April 2001, pp.1298-1301) обнаружили, что С10:0 и С12:0 жирные кислоты являются мощными бактерицидными агентами. Фунгицидные свойства С 10:0 и С12:0 жирных кислот и их моноглицеридов были описаны Gudmundur Bergsson с соавт. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, November 2001, pp.3209-3212).

Многие потенциально патогенные бактерии являются обычными комменсалами кожи, волос и слизистых оболочек - они заселяют эти области путем прикрепления к поверхности эпителиального клеточного слоя, но в норме задерживаются иммунной системой хозяина в секретируемой им слизи и поте. Заболевание, вызванное этими эндогенными видами, обычно возникает в результате некоторого ослабления (истощения) секреторной иммунной способности хозяина, которое делает возможным размножение этих эндогенных патогенов.

Адгезию патогенных бактерий к ткани хозяина обычно рассматривают в качестве первой стадии патогенеза, так что способность блокировать адгезию могла бы быть полезной в профилактике инфекции. Механизмы такой адгезии различны, и многие микроорганизмы используют многочисленные как специфические, так и неспецифические факторы. Например, стафилококки секретируют внеклеточную тейхоевую кислоту, которая специфически связывается с фибронектином, виды Candida используют гликокаликс из маннопротеина, а стрептококки используют водонерастворимые глюканы для заселения зубов. Из-за многочисленности этих факторов долгое время считали невозможным создать единственный ингибитор, который был бы эффективен против широкого ряда потенциально патогенных видов.

Во многих случаях пытались использовать антитела, полученные путем вакцинации донорного животного, но из-за присущей им специфичности терапевтическое применение этих антител ограничивается их применением против видов, к которым они были получены.

Во всех ранее опубликованных данных раскрывается применение свободных жирных кислот для ингибирования роста широкого ряда бактерий, грибов и вирусов, но нет опубликованных данных, раскрывающих или предполагающих их эффективность в ингибировании адгезии и/или роста потенциальных патогенов при их введении с одним или более молочными апопротеинами для поддержания здоровья человека и животных.

Обычная практика в медицинской и ветеринарной помощи при инфекции заключается во введении антибиотического вещества, предназначенного для ингибирования инфекционного агента, который может представлять собой грибковый, бактериальный (оба охватываются термином «микробный») или вирусный агент. В результате длительного применения многие антибиотические вещества потеряли свой лечебный потенциал благодаря развитию устойчивости у инфекционного агента. Проблема антибиотикоустойчивости является наиболее острой в послеоперационных ситуациях, когда инфекционный агент является обычным обитателем кожи и дыхательных путей, и как таковой может часто подвергаться воздействию различных антибиотиков в течение некоторого периода времени, что позволяет ему развить устойчивость к этим веществам. Большое количество этих в норме безвредных агентов может быть диссеминировано во время хирургических операций или процедур, осуществляемых средним медицинским персоналом, и эти агенты могут вызывать инфекции при ослаблении иммунологической толерантности пациента в результате болезни или длительного медицинского вмешательства; такие инфекции часто описываются как нозокомиальные (внутрибольничные) инфекции.

Одну из таких нозокомиальных инфекций обычно обозначают как MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus - метициллин-резистентный штамм Staphylococcus aureus). Staphylococcus aureus является обычным обитателем дыхательных путей многих индивидуумов, где он переносится бессимптомно, в норме не вызывая инфекции. Считают, что вследствие его повсеместного распространения, он был подвергнут воздействию многих широко использующихся антибиотиков, и теперь существуют штаммы, которые устойчивы ко всем обычно использующимся антибиотикам, включая метициллин. Ванкомицин является «последним лекарственным средством» при MRSA, но недавно были выявлены штаммы, которые устойчивы и к ванкомицину. Кроме этого, существует ванкомицин-резистентный штамм Enterococcus faecalis (VREF - vancomycin resistant Enterococcus faecalis), который является обычным обитателем кишечника и может быть диссеминирован оттуда во время хирургических операций, вызывая другую нозокомиальную инфекцию.

«Горизонтальный перенос генов» - это биологический термин, который используется для описания возможного переноса генетической устойчивости от одних видов к другим. Перенос антибиотикоустойчивости от такого вида, как VREF, к патогенному виду, такому как Clostridium difficile, вызывающему псевдомембранозный колит, представляет собой потенциально катастрофическое событие, которое вызывает большое беспокойство среди медицинского персонала.

Поэтому существует большая потребность в новых противомикробных веществах, которые могут применяться для лечения таких антибиотикоустойчивых инфекций и других инфекций, которые не поддаются стандартным способам лечения, а также в новых противовирусных веществах для лечения вирусных инфекций, для которых в настоящее время имеется мало эффективных терапевтических лекарственных средств.

Задача настоящего изобретения состоит в замедлении, предпочтительно блокировании адгезии патогенных микроорганизмов и, таким образом, в профилактике или лечении микробной или вирусной инфекции у человека или животного.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в сочетании замедления или блокирования адгезии с ингибированием роста, при котором достигается еще большая польза.

Еще одна дополнительная задача настоящего изобретения состоит в достижении этих целей путем применения мягко действующего продукта, такого как, но не ограничиваясь этим, молочная сыворотка, поскольку этот продукт облегчает значительно более частое применение, чем то, которое считается целесообразным в отношении многих химически агрессивных лекарственных препаратов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к применению, по меньшей мере, одного молочного апопротеина для профилактики или лечения микробной или вирусной инфекции у человека или животного. Не вдаваясь в подробности, полагают, что это воздействие осуществляется путем ингибирования адгезии потенциальных патогенных видов. В частности, остов молочного сывороточного белка, более правильно обозначаемый как молочный сывороточный апопротеин, который остается после удаления из молочных липопротеинов и молочных гликопротеинов связанного липида и/или углевода, демонстрирует потенциальное, широкого спектра ингибирование адгезии потенциальных патогенов к эпителиальным клеткам человека, что будет подтверждено Примерами, приведенными ниже. При использовании в качестве источника молочной сыворотки остаточный апопротеин, лишенный связанных с ним жирных кислот и/или углеводных групп, представляет собой амфотерный белок, который ингибирует адгезию бактерий или других патогенных микроорганизмов к поверхности клетки-хозяина, предотвращая тем самым первую стадию патогенеза. Амфотерный белок имеет как гидрофобный (жирорастворимый), так и гидрофильный (водорастворимый) конец. Клеточная поверхность многих видов микроорганизмов имеет липидный или гликолипидный слой, к которому притягивается гидрофобный конец амфотерного белка. Таким образом, апопротеины молочной сыворотки покрывают поверхность патогенного микроорганизма, создавая грубый молекулярный барьер, который препятствует достижению патогенным микроорганизмом (например, грибком, бактерией или вирионом) близости к поверхности клетки-хозяина, достаточной для возникновения адгезии.

Упомянутые молочные апопротеины предпочтительно используют в сочетании со свободными жирными кислотами или их моноэфирами (включая моноглицериды). Как известно, свободные жирные кислоты или их моноглицериды являются потенциальными противомикробными и противовирусными агентами против широкого ряда видов благодаря ингибированию их роста. Таким образом, одновременное или последовательное (в любом порядке) введение, по меньшей мере, одного молочного апопротеина и, по меньшей мере, одной свободной жирной кислоты или ее моноэфира ингибирует рост, а также адгезию широкого ряда микробных и вирусных видов. Препарат, полученный путем гидролиза сыворотки молока (молочной сыворотки), содержит как молочный апопротеин(ы), так и свободную жирную кислоту (кислоты).

Альтернативно, упомянутые молочные апопротеины используют с короткоцепочечными органическими кислотами или их эфирами или солями. Таким образом, одновременное или последовательное (в любом порядке) введение, по меньшей мере, одного молочного апопротеина и, по меньшей мере, одной короткоцепочечной органической кислоты или ее эфира или соли ингибирует рост, а также адгезию широкого ряда микробных и вирусных видов.

Еще более предпочтительно, чтобы упомянутые молочные апопротеины можно было использовать как со свободными жирными кислотами и их моноэфирами, так и с короткоцепочечными органическими кислотами и их солями и эфирами. Таким образом, одновременное или последовательное (в любом порядке) введение, по меньшей мере, одного молочного апопротеина, по меньшей мере, одной свободной жирной кислоты или ее моноэфира и, по меньшей мере, одной короткоцепочечной органической кислоты или ее эфира или соли ингибирует рост, а также адгезию широкого ряда микробных и вирусных видов. Препарат, содержащий все три компонента, может быть приготовлен путем гидролиза сыворотки молока (молочной сыворотки).

В настоящем изобретении будет продемонстрировано применение, по меньшей мере, одного молочного апопротеина или их смеси, возможно, по меньшей мере, с одной свободной жирной кислотой или ее моноэфиром или их смесью, и/или, возможно, по меньшей мере, с одной короткоцепочечной органической кислотой или ее солью или эфиром, или их смесью, которое полезно для лечения устойчивых к антибиотикам инфекций желудочно-кишечного и орофарингеального тракта, эпителия слизистых оболочек и кожи.

Хотя инфекции, вызываемые такими микроорганизмами, как MRSA и VREF, и многие вирусные инфекции представляют собой острую угрозу для здоровья, по-видимому, существуют внешне менее вредные агенты, которые являются обычными комменсалами организма и которые могут вызывать дискомфортное состояние или болезнь через более длительный период. Примером этого служит возникновение кариеса зубов, вызванное бактериями Streptococcus mutans. Кариес зубов в норме считается косметической проблемой и как таковой лечится дантистами. Однако существуют данные о том, что колонизация ротовой полости бактериями Streptococcus mutans может вызывать образование антител, которые, циркулируя в большом круге кровообращения, могут перекрестно взаимодействовать с сердечной тканью, что приводит к возникновению хронической болезни сердца и аутоимунных повреждений в других органах.

В настоящем изобретении представлено применение молочного сывороточного апопротеина (апопротеинов) для ингибирования адгезии Streptococcus mutans и обеспечения таким образом полезного вспомогательного средства для профилактики кариеса зубов с последующим долговременным благоприятным воздействием на здоровье.

Дрожжи Candida albicans являются обычными обитателями кожи и слизистых оболочек многих индивидуумов, где они переносятся бессимптомно. Candida заселяют слизистые оболочки, прикрепляясь сначала к слизистой поверхности эпителиальных клеток, где они пролиферируют и проникают в клеточные углубления, вызывая молочницу. Компоненты слизи, секретируемой этими тканями, в норме ингибируют прикрепление и пролиферацию; у некоторых индивидуумов, однако, наблюдается ослабление нормальной секреторной функции, и возникает патогенный процесс. Применение молочного сывороточного апопротеина (апопротеинов), ингибирующего адгезию, и свободной жирной кислоты (кислот) или их моноэфиров и/или органической кислоты (кислот) или их солей или эфиров, которые в свою очередь ингибируют рост, обеспечит соответствующую профилактику у тех индивидуумов, которые подвержены рецидивам молочницы.

Вирусные инфекции не отвечают на обычные антибиотики. Хотя существуют специальные противовирусные препараты, такие как «Ацикловир», применяющийся, например, для лечения Herpes simplex, эти препараты в основном дороги, и их действие ограничено очень узким диапазоном вирусных инфекций. Хотя многие вирусные инфекции имеют системный аспект, некоторые из них имеют локальные симптомы, такие как кожная сыпь, волдыри и язвы, которые часто вызывают наибольший дискомфорт у подверженных инфекции индивидуумов. Применение препаратов, содержащих молочные сывороточные апопротеины со свободной жирной кислотой (кислотами) и их моноэфирами, для местного нанесения обеспечит локальную противовирусную активность, которая, будучи применена в качестве вспомогательного средства для системного противовирусного лечения, облегчит внешние симптомы.

«Фамвир» представляет собой патентованный препарат «Ацикловир» (Smith Kline Beecham), созданный в качестве системного противовирусного агента для перорального введения при лечении вторичных инфекций, вызванных Varicella zoster (опоясывающий лишай). Вирус Varicella вызывает ветряную оспу в случае первичных инфекций с интенсивными кожными высыпаниями, представляющими собой гнойные пузырьки, которые вскрываются и образуют струпья. Инфекция вызывает интенсивный зуд, а язвы при расчесывании могут оставлять обширные рубцы. Вирус дремлет в организме в течение многих лет после выздоровления и может повторно активироваться в результате стресса или условий, вызывающих нарушение иммунитета. Вторичная инфекция известна как опоясывающий лишай и характеризуется чрезвычайно болезненной кожной сыпью. Применение местных препаратов, содержащих молочный сывороточный апопротеин(ы) и эфир(ы) и моноэфиры свободных жирных кислот, как здесь описано, будут минимизировать поверхностные симптомы на коже и действовать в качестве полезного вспомогательного средства к обычной противовирусной терапии. В равной степени другие инфекции, где наблюдаются поверхностные (кожные) высыпания, например краснуха (коревая) и герпес (простой герпес), по клиническим показаниям являются подходящими для местных применений.

Полагают, что Модельный препарат, описанный ниже и представляющий собой гидролизованную молочную сыворотку (сыворотку молока), будет эффективен против патогенных микроорганизмов в концентрации от 0,5 до 25 мг/мл. Конечно, следует принять во внимание, что требуемая концентрация будет зависеть от общего количества патогенных микроорганизмов и от их относительных концентраций. В равной степени диапазоны желательных концентраций для апопротеина (апопротеинов), для свободной жирной кислоты (кислот) и для органической кислоты (кислот) будут зависеть от общего количества патогенных; микроорганизмов и от их относительных концентраций.

Свободные жирные кислоты

Свободная жирная кислота представляет собой органическую кислоту, содержащую углеводородную цепь, по меньшей мере, с одной карбоксильной функциональной группой, которая обычно, хотя и не обязательно, находится в терминальном положении. Жирные кислоты могут быть либо насыщенными, где все углерод-углеродные связи в углеводородной цепи являются простыми, либо ненасыщенными, где в углеводородной цепи существует, по меньшей мере, одна двойная или тройная углерод-углеродная связь. Предпочтительно, чтобы свободные жирные кислоты или их моноэфиры были натуральными или, в качестве альтернативы, высвобождались, например, путем гидролиза из натуральных источников, таких как, но не ограничиваясь этим, молочная сыворотка, яичный желток и растительные масла.

Предпочтительно чтобы полезные противомикробные и противовирусные свободные жирные кислоты были насыщенными или ненасыщенными и имели углеводородную цепь с четным количеством углеродных атомов (С4-24), или представляли собой смесь этих кислот.

Наиболее подходящие ненасыщенные свободные жирные кислоты имеют углеводородную цепь с С14-24 и предпочтительно выбраны из пальмитолеиновой кислоты (С16:1), олеиновой (С18:1), линолевой (С18:2), альфа- и гамма-линоленовой (С18:3), арахидоновой (С20:4), эйкозапентаеновой (С20:5) и тетракозеновой (С24:1) кислот, для которых цифры в круглых скобках означают количество углеродных атомов в углеводородной цепи с количеством двойных (или тройных) связей после двоеточия, обозначающих степень ненасыщенности.

Наиболее подходящие насыщенные свободные жирные кислоты имеют углеводородную цепь с С4-18 и предпочтительно выбраны из масляной и изомасляной (С4:0), янтарной (С4:0), капроновой (С6:0), адипиновой (С6:0), каприловой (С8:0), каприновой (С10:0), лауриновой (С12:0), миристиновой (С14:0), пальмитиновой (С16:0) и стеариновой (С18:0) кислот, которые эффективны против грибов и грамотрицательных бактерий, колиподобных бактерий и стафилококков.

Следует принять во внимание, что свободная жирная кислота (кислоты) или их моноэфиры, независимо от того, являются они натуральными или нет, могут быть модифицированы путем химического замещения, включая, но не ограничиваясь этим, алкилирование короткой цепи, например метилирование или ацетилирование; этерификацию и многие другие превращения для модификации противомикробного потенциала, и такие модифицированные свободные жирные кислоты также являются частью настоящего изобретения. Однако для целей настоящего изобретения предпочтительней использовать натуральные, немодифицированные свободные жирные кислоты или их смеси, или их моноэфиры, предпочтительно их моноглицериды, такие, которые высвобождаются из натуральных жировых резервуаров, выбранных из молочной сыворотки, яичного желтка и растительных масел.

Гидролиз липидного содержимого молочной сыворотки дает подходящую смесь свободных жирных кислот, которые можно успешно использовать для ингибирования роста широкого спектра микробных и вирусных агентов для терапевтических и профилактических целей. Следующая таблица дает типичное распределение состава жирных кислот в молочных сывороточных липидах.

Таблица
Состав жирных кислот в молочных сывороточных липидах
Масляная(С4:0)4%
Капроновая(С6:0)2,1%
Каприловая(С8:0)1,2%
Каприновая(С10:0)2,6%
Лауриновая(С12:0)3,0%
Миристиновая(С14:0)10,6%
Пальмитиновая(С16:0)27%
Пальмитолеиновая(С16:1)2,3%
Стеариновая(С18:0)12,8%
Олеиновая(С18:1)26%
Линолевая(С18:2)2,3%
Линоленовая(С18:3)1,6%
Водадо 100%

Органические кислоты

Подходящие органические кислоты, если они присутствуют, имеют короткую углеводородную цепь (например, С2-6), по меньшей мере, с одной функциональной группой карбоновой кислоты. Термин «кислота» охватывает соли или эфиры этих кислот. Углеводородная цепь может быть насыщенной или ненасыщенной, прямой или разветвленной, замещенной или незамещенной. Подходящие органические кислоты включают гликолевую, щавелевую, молочную, глицериновую, тартроновую, яблочную, малеиновую, фумаровую, винную, малоновую, глутаровую, акриловую, цис- или транс-бутеновую и лимонную кислоты. Из органических кислот предпочтительной является лимонная кислота, которая содержит цепь из трех атомов углерода с тремя карбоксильными группами. Лимонная кислота продуцируется у млекопитающих в процессе метаболизма углеводов и является слабой органической кислотой, которая может быть нейтрализована щелочным раствором, таким как гидроксид натрия, с получением натриевой соли - цитрата натрия. Как таковая, она естественно присутствует в организме в низких концентрациях. Как показано и заявлено в настоящем изобретении, добавляя цитрат натрия к молочным сывороточным апопротеинам, как описано выше, можно усилить эффективность жирных кислот в отношении культур in vitro конкретных бактерий.

Противомикробное и противовирусное применение

Благодаря полиспецифической природе ингибирования адгезии, которая может быть достигнута при применении молочного сывороточного апопротеина (апопротеинов) в чистом виде, или благодаря полиспецифической природе ингибирования адгезии и ингибирования роста при применении молочного сывороточного апопротеина (апопротеинов) в комбинации со свободной жирной кислотой (кислотами) и/или органической кислотой (кислотами), существует широкий диапазон потенциальных патогенов, против которых это может быть использовано.

Среди грамположительных бактерий значение имеют Streptococci, Lactobacilli, Corynebacteria, Actinomycetes, Clostridia, Bacillus и Enterococcus.

Грамотрицательные бактерии включают Staphylococci и Enterobacteria, чувствительными являются также виды Escherichia, Salmonella, Shigella и Chlamydia.

Среди грибов, как уже было показано, чувствительными являются дрожжи Candida albicans, а также дерматофиты, включая виды Trychophyton.

Простейшие, которые проявляют значительную чувствительность, включают Entamoeba hystolytica, Giardia lamblia и Cryptosporidium neoformatans.

Термин «микробный» охватывает бактерии, грибы и простейшие.

Среди оболочечных вирионов значение имеют вирусы герпеса (Herpes simplex, Varicella-zoster и вирус Эпштейна-Барра), Поксвирусы (Ортопоксвирусы и Авипоксвирусы), Тогавирусы (Альфавирусы, Флавивирусы, Рубивирусы и Пестивирусы), Коронавирусы (вирус инфекционного бронхита); Ретровирусы (вирус Т-клеточного лейкоза человека и вирус иммунодефицита человека), вирус гриппа, лиссавирус, Калифорнийский вирус энцефалита, вирус Ласса, Парамиксовирусы, Пневмовирусы и Морбилливирусы.

Фармацевтически и косметически приемлемые системы доставки

Фармацевтически приемлемая система доставки, содержащая фармацевтически или косметически эффективное количество, по меньшей мере, одного молочного сывороточного апопротеина с или без фармацевтически или косметически эффективного количества, по меньшей мере, одной свободной жирной кислоты и ее моноэфиров и/или фармацевтически или косметически эффективного количества, по меньшей мере, одной органической кислоты и ее эфиров или солей, может быть введена для достижения клинически полезного эффекта.

Мази обеспечивают полезный способ доставки для ослабления поверхностных симптомов вирусных и бактериальных инфекций, проявляющихся в кожной сыпи, волдырях и пустулах, которые включают герпес, опоясывающий лишай, угри и инфекционный дерматит.

Бандажи и повязки на рану могут быть пропитаны для достижения длительного высвобождения активного вещества в месте инфекции.

В частности, в случае метициллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus, система доставки может содержать назальный спрей (аэрозоль) для деконтаминации известных носителей. Применение системы доставки в форме лосьона для кожи обеспечит местную деконтаминацию кожи и волос.

Система доставки может включать глазные капли для лечения или профилактики глазной инфекции.

Система доставки может включать интравагинальные кремы или гели, например гидратирующие и смазывающие гели, или пессарии (вагинальные суппозитории), обычно используемые для поддержания женского здоровья для профилактики рецидивирующих дрожжевых инфекций, вызываемых Candida albicans, и в качестве защиты против экзогенной бактериальной и вирусной инфекции.

Система доставки может включать послеоперационные повязки на рану, в которых активный агент(ы) распределен в полимере, обеспечивающем длительное высвобождение. Такая система доставки может использоваться для минимизации нозокомиальных инфекций, возбудителями которых являются MRSA и другие устойчивые к антибиотикам бактерии.

Система доставки может дополнительно включать антиоксидантный наполнитель (наполнители) и вводиться парентерально или путем внутривенного введения (внутривенной инфузии) для достижения системного противовирусного и/или противомикробного эффекта.

Система доставки может альтернативно или дополнительно включать напиток или пищевой продукт, подобный молоку, в котором активный агент(ы) может быть покрыт энтеросолюбильной оболочкой для облегчения его транспортировки через желудок в кишечник, где активный агент(ы) может быть использован в качестве профилактического агента против кишечных инфекций, включая псевдомембранозный колит.

Система доставки может включать продукты гигиены, такие как жевательные резинки, полоскание для рта, зубную пасту и связующие и закрепляющие вещества для зубных протезов для уменьшения кариеса и зубного налета и для обеспечения длительной защиты против гингивита, периодонтита и рецидивирующей молочницы.

Система доставки может включать обработанный пищевой продукт, в которой активный агент(ы) препятствует микробному и/или вирусному заражению и возможности передачи с пищей таких возбудителей, как Salmonella и Campylobacter.

Система доставки может быть выполнена в форме перевязочного материала для применения в профилактике или лечении инфекции.

Если молочный апопротеин или смесь молочных апопротеинов получены путем гидролиза молочной сыворотки или молока ферментом, то гидролизованная молочная сыворотка может присутствовать в системе доставки в диапазоне концентраций от 0,5 до 25 мг/мл.

Молочный апопротеин или смесь молочных апопротеинов может присутствовать в системе доставки в диапазоне концентраций от 0,5 до 10 мг/мл, предпочтительно от 3 до 7 мг/мл.

Свободная жирная кислота, или ее моноглицерид, или их смесь может присутствовать в системе доставки в диапазоне концентраций от 0,5 до 5 мг/мл.

Органическая кислота, или ее соль, или эфир или их смесь может присутствовать в системе доставки в диапазоне концентраций от 0,5 до 5 мг/мл.

Молочный апопротеин или смесь молочных апопротеинов и свободная жирная кислота, или ее моноглицерид, или их смесь могут вводиться посредством системы доставки согласно изобретению либо одновременно, либо последовательно в течение 6 часов в любом порядке.

Система доставки согласно изобретению может использоваться для косметического ухода за кожей.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1. Диаграмма 1 иллюстрирует четыре отдельные эксклюзионные хроматограммы, которые обозначены А, В, С и D.

A) Время 0 часов, предварительная обработка: Фронтальный подвижный пик при Rt 7,174 минут, выявленный при 280 нм, имеет нижележащий пик, видимый при 330 нм. Поглощение при 330 нм обусловлено липидной группировкой, связанной с большими белками, которые составляют эту первичную фракцию.

B) Время 2 часа после начала лечения: первоначальный пик при 7,174 минутах уменьшился с одновременным увеличением двух поздних подвижных фракций при Rt 9,7 и 10,6 минут. Липидная фракция при 330 нм уменьшилась, и нет видимого увеличения в поглощении при 330 нм поздними подвижными пиками.

С) Время 8 часов: демонстрирует дальнейшую деградацию липидной фракции с незначительным изменением в поздних подвижных белках при 280 нм.

D) Время 16 часов: увеличение срока инкубации не меняет общий профиль при той же длине волны:

Фиг.2. На Диаграмме 2 проиллюстрировано использование адгезии Candida albicans к буккальным эпителиальным клеткам для измерения эффективности исследуемого продукта (молочной сыворотки) до и после ферментативного гидролиза. «Контроль» представляет собой среднее значение общей адгезии (36%), достигающейся в отсутствие ингибирующих веществ. Молочная сыворотка до гидролиза в концентрации 1 мг/мл и 2 мг/мл дает некоторое ингибирование (39%) контрольной адгезии (22% адгезии по сравнению с 36% адгезии). При концентрации негидролизованной молочной сыворотки 5 мг/мл достигается 45%-ное ингибирование адгезии. Тот же продукт представлен в тех же концентрациях после ферментативного гидролиза. Очевидно, что концентрация 1 мг/мл является менее эффективной, чем та же концентрация негидролизованного продукта, однако при концентрации 2 мг/мл наблюдается 62%-ное ингибирование, (по сравнению с 39%), а при концентрации 5 мг/мл наблюдается 100%-ное ингибирование адгезии, по сравнению с 45%-ным ингибированием при использовании негидролизованной молочной сыворотки.

Фиг.3. Диаграмма 3 демонстрирует относительное ингибирование адгезии Candida, которое было достигнуто при использовании липидной и белковой фракций Модельного препарата. «Контроль» представляет собой 45% адгезии. Белковая фракция при концентрации 1 мг/мл демонстрирует 19% адгезии (58%-ное ингибирование), при концентрации 2 мг/мл адгезия уменьшается до 3%, при этом наблюдается 94%-ное ингибирование, и адгезия полностью блокируется при 5 мг/мл. В сравнении с этим липидная фракция при любой концентрации не оказывает видимого ингибирующего эффекта на адгезию.

Фиг.4. Диаграмма 4 демонстрирует при использовании тех же липидных и белковых фракций, которые представлены на Диаграмме 3, относительные рост-ингибирующие свойства липидной фракции на Candida albicans при концентрациях 10, 8 и 6 мг/мл. Наблюдается постепенное увеличение рост-ингибирующих свойств в зависимости от увеличения концентрации с видимой деструкцией дрожжевой культуры при концентрации 10 мг/мл, о чем можно судить по снижению оптической плотности.

Фиг.5. Диаграмма 5 демонстрирует воздействие белковой фракции, представленной на Диаграмме 3, на рост Candida albicans. При любой из исследованных концентраций белковая фракция не оказывает очевидного ингибирующего воздействия на рост.

Фиг.6. Диаграмма 6 демонстрирует рост-ингибирующие свойства Модельного препарата на Candida при концентрациях 0, 1 и 5 мг/мл, 90%-ное ингибирование достигается при самой высокой концентрации.

Фиг.7. Диаграмма 7 демонстрирует анализ воздействия на рост, при котором ингибирующие вещества добавляют через 5 часов после нормального роста Candida albicans. Незамедлительность ингибирования при концентрациях 8 и 6 мг/мл очевидна. При более низких концентрациях эффект уменьшается, но общее ингибирование эффективно при концентрации 4 мг/мл, и некоторое ингибирование наблюдается также при 2 мг/мл.

Фиг.8. Диаграмма 8 демонстрирует ингибирующие свойства Модельного препарата на адгезию Candida при концентрациях 1, 2 и 5 мг/мл, где дрожжи были предварительно обработаны тест-веществом в течение 10 минут до экспозиции с буккальными эпителиальными клетками. При концентрации 1 мг/мл наблюдается 53%-ное ингибирование адгезии, тогда как при концентрациях 2 и 5 мг/мл адгезия не наблюдается. Белковым контролем является бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мг/мл, демонстрирующий только 13%-ное ингибирование (при сравнении с 53% для Модельного препарата).

Фиг.9. Диаграмма 9 демонстрирует тот же Модельный препарат, использованный выше в Диаграмме 8, для предварительной обработки буккальных эпителиальных клеток в течение 10 минут до их экспозиции с культурой Candida. При концентрации 1 мг/мл наблюдается 55%-ное ингибирование адгезии, тогда как при концентрациях 2 и 5 мг/мл адгезия полностью ингибируется. Белковым контролем в этом примере является яичный белок, лишенный овальбумина, в концентрации 1 мг/мл, дающий некоторое (12%-ное) ингибирование адгезии.

Фиг.10. Диаграмма 10 демонстрирует ингибирующее воздействие Модельного препарата на рост мециллин-резистетного штамма Staphylococcus aureus (MRSA) примерно на 50% относительно контроля, в качестве которого используют фосфатно-солевой буфер (PBS). Когда Модельный препарат дополняют 2, 4 и 5 мг/мл цитрата натрия, рост постепенно ингибируется до 0 при самых высоких концентрациях.

Фиг.11. Диаграмма 11 демонстрирует ингибирующие свойства Модельного препарата на адгезию MRSA к буккальным эпителиальным клеткам по сравнению с цитратом натрия и БСА (BSA - bovine serum albumin, альбумин бычьей сыворотки). При концентрации Модельного препарата 5 мг/мл достигается 98%-ное ингибирование адгезии, хотя при той же концентрации цитрата натрия ингибирование составляет примерно 10%, а белковый контроль не оказывает эффекта.

Фиг.12. Диаграмма 12 демонстрирует, что рост микроорганизмов Streptococcus mutans, вызывающих кариес зубов, ингибируется 5 мг/мл Модельного препарата при условиях анализа, описанных в тексте.

Фиг.13. Диаграмма 13 демонстрирует, что Streptococcus mutans прикрепляется к гранулам из гидроксиапатита, использующимся здесь в качестве заменителя зубной эмали. Модельный препарат в концентрации 0,8 мг/мл достигает почти 100%-ного ингибирования адгезии при условиях анализа. Цитрат натрия воздействует на адгезию этого микроорганизма примерно на 10% при концентрации 0,8 мг/мл, тогда как бычий сывороточный альбумин, использующийся в качестве белкового контроля, достигает 30%-ного ингибирования при этих условиях анализа.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способы и вещества:

Молочные сывороточные белки могут быть экстрагированы из цельного свежего молока, предпочтительно из цельного свежего молока жвачных животных, путем первичного отделения молочного жира с использованием центрифугирования. Супернатант затем подкисляют до рН 4,5, при котором осаждаются казеины. Дополнительное центрифугирование даст прозрачный супернатант, содержащий молочный сахар лактозу, молочные сывороточные белки и растворенные минералы. Лактозу, которая представляет значительную часть твердого содержимого молочной сыворотки (вплоть до 50%), затем удаляют диализом или ультрафильтрацией. Полученная «обогащенная связанными белками» фракция будет иметь состав, приближенный к следующему, % (объем/объем):

Бета-Лактоглобулин56
Альфа-Лактальбумин11
Гамма-Глобулин12
Сывороточный альбумин6
Лактоферрин4
Муцины2
Ферменты1
Минорные белки1
Связанные с белками липиды (жиры)7

Многие из этих белков представляют собой сложные липопротеины или гликопротеины со значительными небелковыми макромолекулами, связанными с ними, но мажорным белковым компонентом сыворотки от жвачных животных является бета-лактоглобулин, который может составлять до 70% сыворотки и 90% молозива (первичного молока после родов). Бета-лактоглобулин представляет собой липопротеин со значительными количествами связанных с ним изопреноида, ретинола, а липиды и жирные кислоты составляют значительную часть небелкового компонента.

Альтернативно, обычным источником молочных сывороточных белков является получаемый в молочной промышленности порошок сыворотки, который может быть получен из различных коммерческих источников. Во многих случаях коммерческие поставщики имеют сыворотку с уже удаленным лактозным компонентом, поставляя «обогащенный связанными белками» продукт с содержанием жира от 6 до 10%, при этом такой продукт является предпочтительным в качестве источника для применения в настоящем изобретении. Хотя некоторые коммерческие поставщики используют ультравысокую температуру для увеличения времени хранения жидкой сыворотки, такая обработка разрушает белковый остов и делает продукт бесполезным для целей, описанных здесь. Если содержание жира составляет ниже 6%, то оно может быть дополнено добавлением молочного жира к порошку сыворотки при его восстановлении в очищенной воде (воде, очищенной обратным осмосом) для ферментативного гидролиза, как описано здесь.

Подходящим источником стандартизированного порошка сыворотки с низким содержанием лактозы является «Carbelac 80» - концентрат сывороточных белков, производимый фирмой Carbery Milk Products (Ballineen, County Cork, Ирландия).

Анализ ингибирования роста

Ингибирование роста различных бактерий или дрожжей может быть продемонстрировано выращиванием микроорганизмов в подходящей среде в присутствии и в отсутствие тестируемых веществ, таких как молочные сывороточные апопротеины, свободные жирные кислоты/моноэфиры и/или органические кислоты/соли/эфиры; при этом объем анализа соответственно устанавливается с помощью бланков и контролей. Анализ на микротитровальных планшетах может быть использован для увеличения количества исследуемых точек, и рост измеряют путем определения оптической плотности.

Для гарантии отсутствия эффекта разведения, возникающего при добавлении разных концентраций исследуемого продукта, тест-растворы приготавливают путем растворения или суспендирования соответствующего количества исследуемого вещества в соответствующей свежей ростовой среде для бактерий или дрожжей. Обычно тест-растворы приготавливают из маточного раствора с концентрацией 20 мг/мл, полученного путем растворения, например, 200 мг исследуемого вещества в конечном объеме 10 мл свежей ростовой среды. Маточный раствор центрифугируют при 6000 об/мин для удаления суспендированных твердых частиц. Маточный раствор затем стерильно разбавляют, используя соответствующие объемы маточного раствора и свежей ростовой среды для получения тест-концентраций, например, 10, 8, 6, 4, 2 мг/мл.

Чтобы получить разведение 10 мг/мл из описанного здесь маточного раствора с концентрацией 20 мг/мл, нужно один объем маточного раствора разбавить одним объемом разбавителя с получением конечного объема, равного 2 объемам. Это правило будет использоваться здесь со ссылкой на все этапы разведения, использующиеся здесь.

Приготовленные растворы предварительно нагревают до 37°С. В каждую лунку добавляют по 100 мкл непосредственно перед добавлением 100 мкл приготовленного инокулята. Таким образом, тест-концентрацию 10 мг/мл подвергают дополнительному разведению 1:2 в тест-лунке, так что «10 мг/мл» фактически означает 5 мг/мл в самой тест-лунке. Прибор для считывания микротитровальных планшетов Multiskan Ascent имеет автоматический цикл встряхивания, который используется для обеспечения равномерного распределения культуры перед каждым считыванием OD.

Что касается ингибирования роста Candida albicans, то используют 96-луночные микротитровальные планшеты "Nunc" (Nalge Nunc International, Копенгаген, Дания), каждая лунка которых вмещает в себя упомянутые 200 мкл. Тест-точки организованы в квадруплеты. Инокулят состоит из 100 мкл свежевыращенных бактерий или дрожжей, полученных, как описано ниже. Конечный объем в каждой лунке составляет в целом 200 мкл, включающих 100 мкл соответствующего разведения тест-вещества и 100 мкл инокулята в свежей среде.

Планшеты с инокулятом загружают в Multiskan Ascent (LabSystems, Хельсинки, Финляндия) и инкубируют при 37°С в течение 18-часового периода времени, во время которого в лунках измеряют изменения оптической плотности при 600 нм каждый час. В конце ростового цикла получают результаты путем усреднения каждой из квадруплетных лунок, и эти изменения представляют графически.

Дрожжи:

12-часовую (ночную) культуру Candida albicans, выращенную в минимальной среде фирмы Oxoid для дрожжей с добавлением 5% (масса/объем) глюкозы (Oxoid - товарный знак), разбавленную 1:10 (один к конечному объему 10) (объем/объем) свежей средой при 37°С, добавляют по 100 мкл в каждую лунку.

Дрожжи Candida albicans имеют оптимальный рН для роста от 4,0 до 4,5, и многие патогенные процессы также оптимальны в этом диапазоне рН. Анализ роста, описанный выше, может быть модифицирован с использованием 50 мМ буфера лактата натрия с рН 4,0 для получения дрожжевой минимальной среды и тест-раствора, для того чтобы более адекватно отразить окружение in vitro, где будет эффективен Модельный препарат.

Сходная методология может быть использована соответственно для измерения роста и ингибирования роста бактерий (и грибов) путем модификации ростовой среды. В случае штаммов Streptococcus mutans и Staphylococcus aureus, которые оба представлены здесь в качестве примеров, ростовой средой является питательный бульон Oxoid Brain Heart Infusion Broth (Oxoid - товарный знак).

Анализ адгезии:

Измерение адгезии и ингибирование адгезии требуют выбора подходящего субстрата и способа подсчета количества микроорганизмов, прикрепившихся (или нет) к этому субстрату. Наиболее патогенные микроорганизмы прикрепляются к эпителиальным клеткам слизистых оболочек, и обычным источником репрезентативных эпителиальных клеток слизистых оболочек является внутренняя сторона щеки. Буккальные эпителиальные клетки (БЭК) получают, соскабливая слизистые оболочки в полости рта с помощью деревянного депрессора языка следующим образом.

Получение буккальных эпителиальных клеток:

Стандартные деревянные депрессоры языка, которые используются в клиническом исследовании ротовой полости, заворачивают в оловянную фольгу и автоклавируют. Аликвоты по 5,0 мл 0,1 М фосфата калия, содержащие 0,9% (масса/объем) хлорида натрия с рН, доведенным до 6,8 (т.е. PBS), помещают в стерильные бутылки для образцов объемом 25 мл. Депрессоры языка затем используют для соскабливания внутренней поверхности щеки волонтера, и собранные соскобы переносят в контейнеры с PBS. Собранные образцы центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 минут для осаждения БЭК, оставляя бактерии и другой оральный детрит в суспензии. Супернатант из этих пробирок осаждают и дополняют 5 мл свежего стерильного PBS, БЭК повторно суспендируют и дважды центрифугируют с получением «отмытых клеток».

Существуют различные способы подсчета бактерий и дрожжей, которые хорошо известны специалистам в данной области и которые включают подсчет видимых колоний, прямой микроскопический подсчет, радиосцинтилляционное мечение и флуоресцентное мечение. Любой способ подсчета является подходящим при условии, что он не препятствует способности микроорганизмов прикрепляться к выбранному субстрату.

В приведенных ниже примерах прямой микроскопический подсчет был выбран для дрожжей Candida, а флуоресцентная метка для бактерий. Однако более важно, чтобы было определено количество дрожжей и бактерий, не прикрепившихся из обычной популяции, в отличие от попытки подсчитать прикрепившиеся клетки, поскольку субстрат обычно мешает подсчету.

Принцип методики включает в себя стандартизированное (известное) количество дрожжей или бактерий в стандартизированном субстрате (количество БЭК), обеспечение 60-минутного инкубационного периода для того, чтобы клетки могли прикрепиться, и затем фильтрация объединенной популяции через 10 мкм нейлоновое сито. Сито задержит БЭК и дрожжи или бактерии, прикрепившиеся к ним; неприкрепившиеся дрожжи или бактерии будут отмыты, после чего они могут быть подсчитаны в фильтрате и выражены как процент неприкрепившихся клеток в первоначальной популяции; процент адгезии будет обратным этому значению.

Прямой микроскопический подсчет дрожжей и БЭК проводят с помощью градуированного предметного стекла гемоцитометра, и этот способ хорошо известен специалистам в этой области.

Флуоресцентное мечение бактерий осуществляют после адгезии (на клетках в фильтрате) с использованием флуоресцентных красителей, таких как BCECF/AM (Calbiochem Biosciences Inc., La Jolla, CA) и Syto 13 (Molecular Probes, Oregon, США). Способы мечения описываются производителями меток. Количество флуоресценции измеряется с помощью флуориметра (Fluroscan от фирмы Lab-Systems, Хельсинки, Финляндия) и находится в прямой зависимости от количества присутствующих бактерий.

Следующий общий способ может быть использован для измерения адгезии дрожжей Candida albicans к БЭК и ингибирования этой адгезии с помощью препарата молочного сывороточного апопротеина (апопротеинов), как описано выше. Тот же общий способ подходит для измерения ингибирования адгезии Staphylococcus aureus к БЭК, а также ингибирования адгезии Streptococcus mutans, за исключением того, что субстратом для Streptococcus mutans является измельченный гидроксиапатит, производимый фирмой Merck, который используется в качестве заменителя зубной эмали.

Предпочтительным является свежий клинический изолят Candida albicans, поскольку многие типовые культуры теряют вирулентность в культуральных условиях. Если клинический изолят не доступен, можно использовать типовой штамм C.albicans ATCC 10231 для получения репрезентативных результатов (АТСС представляет собой Американскую коллекцию типовых культур, расположенную в Мэриленде, США).

Дрожжи обычно культивируют на агаре фирмы Oxoid с экстрактом солода (Oxoid Malt Extract Agar). Пептонно-декстрозный бульон фирмы Oxoid (Oxoid Yeast Extract Peptone Dextrose) используют для жидких культур, инокуляцию осуществляют из свежих агаровых планшетов и инкубируют при перемешивании при 37°С в течение 10 часов. Через 10 часов дрожжи получают центрифугированием и промывают стерильным PBS с рН 6,8.

Как промытые БЭК, так и свежевыращенные отмытые дрожжевые клетки подсчитывают под микроскопом, и их концентрации подгоняют таким образом, чтобы концентрация дрожжей составляла примерно 1×105, а концентрация БЭК - 1×103. Одинаковые объемы двух растворов при смешивании дадут соотношение: 100 дрожжевых клеток на БЭК.

При тестировании различных концентраций тест-веществ, таких как молочный сывороточный апопротеин(ы), эти вещества добавляют в нужной концентрации в PBS (рН 6,8), использующемуся в конечной суспензии либо дрожжевых, либо буккальных клеток. Обычно используют концентрации 5, 2 и 1 мг/мл и тесты проводят для определения эффективности препарата при ингибировании адгезии путем предварительного покрытия БЭК или дрожжей. «Предварительное покрытие» клеток одной из двух суспензий осуществляют как раз в течение 10 минут перед смешиванием с другой суспензией и началом адгезии. Показано, что препарат эффективен либо при предварительном покрытии буккальных эпителиальных клеток, либо при предварительном покрытии клеток Candida albicans. Таким образом, можно достичь большей пользы, создавая защитный молекулярный барьер на поверхности клеток одной или обеих этих суспензий. Более подробно, предварительное покрытие буккальных эпителиальных клеток предотвратит уже имеющуюся адгезию, тогда как предварительное покрытие патогенных микроорганизмов, в этом случае - дрожжей, будет препятствовать распространению уже образованной колонии в другие области.

Равные объемы двух растворов/суспензий смешивают и инкубируют при осторожном перемешивании в течение 60 минут, после чего смесь фильтруют через нейлоновое сито с пористостью 10 микрон. Количество дрожжевых клеток в фильтрате подсчитывают микроскопически и выражают как процент от количества клеток в первоначальной популяции. При использовании высоковирулентных клинических изолятов адгезия может достигать 40%.

Пример 1.

Получение свободных жирных кислот и апопротеинов из молочной сыворотки

Порошок сыворотки, освобожденной от лактозы (Carbelac 80 от фирмы Carbery Milk Products), является исходным продуктом. Carbelac 80 обычно представляет собой 100%-ную сыворотку, в которой сливки составляют обычно 0%, белок - 80%, влажность - 5%, жир - 8% и зола - 3%. 30 грамм исходного продукта растворяют в конечном объеме 1 литр фосфатно-солевого буфера (PBS) с рН 6,8. К этому добавляют 1 грамм подходящей смеси различных эстераз (в основном липаз, а также амилаз и протеаз), например «неочищенной липазы 2 типа из поджелудочной железы свиньи», полученной от фирмы Sigma. Полученную смесь инкубируют при 37°С в течение 18 часов, затем нагревают при 60°С в течение 10 минут для инактивации фермента и высушивают распылением.

Другие подходящие эстеразы включают, но не ограничиваются, «Палатазу» ("Patalase") и «Новозим» ("Novozyme"), производимые фирмой Novo Nordisk (Копенгаген, Дания), которые используют в смеси 50:50 (масса/масса) в концентрации 1 грамм на 30 грамм безлактозной сыворотки.

Процесс образования апопротеина и свободной жирной кислоты/моноглицерида может быть проконтролирован хроматографически, как показано на Диаграмме 1. Гель-фильтрационная (эксклюзионная) ВЭЖХ с использованием Sephacryl S-200 и PBS (рН 6,8) в качестве элюирующего буфера дает адекватное разрешение для иллюстрации основных событий во время ферментативного гидролиза. Предпочтительно применение двух длин волн для контроля элюента: при 280 нм выявляются белки, тогда как при 330 нм выявляется липид/углеводный компонент, связанный с этими белками. Фронтальный бегущий пик при Rt (время удерживания) 7,174 минут (Диаграмма 1А) представляет раннюю элюцию больших белков, и липидный компонент виден как нижележащий пик. В процессе гидролиза (Диаграммы 1В (2 часа) и 1С (8 часов)) фронтальный пик и сопряженный с ним липид/углеводный пик исчезают с соответствующим увеличением концентрации в двух поздних движущихся фракциях (280 нм) на 9,7 и 10,6 минут, это более маленькие белки и апопротеины из фронтального пика. Диаграмма 1D показывает, что длительный гидролиз (16 часов) не дает дополнительного изменения в Rt при этой длине волны.

После применения описанных выше процедур обработанная обычной смесью ферментов безлактозная сыворотка (или фракция, обогащенная апопротеином и свободными жирными кислотами) будет иметь следующий типичный состав:

Компонент% (объем/объем)
Апопротеин Бета-лактоглобулина25-35
Апопротеин жировых глобул5-15
Свободные жирные кислоты15-25 (см. Таблицу)
Остаточные липиды (включая холестерин)5-15
Апопротеин Альфа-лактоглобулина5-15
Апопротеин Гамма-глобулина6-10
Сывороточный альбумин1-3
Альфа-токоферол2-6
Цитрат натрия2-6
Фосфат натрия1-3

Способ получения апопротеина можно дополнить путем добавления сурфактантов (поверхностно-активных веществ), таких как очищенные компоненты желчных кислот, например холевой кислоты, и/или путем добавления подходящих ферментных кофакторов, таких как соли кальция, и/или путем добавления подходящих буферов, таких как цитрат натрия. При некоторых применениях, например при ингибировании роста MRSA, остаточный цитрат натрия также вносит вклад в рост-ингибирующие свойства, но не в ингибирование адгезии. Стабильность свободных жирных кислот и их моноглицеридов может быть увеличена путем добавления антиоксидантов, таких как, например, альфа-токоферол (витамин Е).

На содержание гамма-глобулина (иммуноглобулина) в сыворотке можно влиять путем иммунизации донорного животного. Процедуры по иммунизации хорошо известны, и специфичность иммуноглобулинов может быть достигнута и умножена в отношении любого конкретного микроорганизма при использовании в вакцине ослабленных штаммов этого микроорганизма. Хотя применение таких иммунных сывороток находится в рамках настоящего изобретения, предпочтительно применение неиммунной сыворотки, где «нативный» гамма-глобулин не имеет определенной специфичности в отношении какого-либо микроорганизма.

Этот полученный гидролизованный продукт демонстрирует ингибирование роста и ингибирование адгезии, как показано в следующих Примерах с использованием Streptococcus mutans, микроорганизма, вызывающего кариес зубов, дрожжей Candida albicans и метициллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus.

«Модельный препарат», описанный и приведенный здесь в качестве примера, содержит, % (объем/объем):

Апопротеин Бета-лактоглобулина32
Апопротеин мембран жировых глобул8
Свободные жирные кислоты22 (см. Таблицу)
Остаточные липиды (включая холестерин)8
Апопротеин Альфа-лактоглобулина10
Апопротеин Гамма-глобулина8
Сывороточный альбумин2
Альфа-токоферол5
Цитрат натрия3
Фосфат натрия2

Процесс гидролиза активирует ингибирующие адгезию свойства сыворотки, которые отсутствуют в неактивированной сыворотке. Диаграмма 2 иллюстрирует этот эффект путем сравнения ингибирования адгезии Candida albicans к буккальным эпителиальным клеткам молочной сывороткой до гидролиза и после гидролиза (последняя представляет собой Модельный препарат). Можно видеть, что, несмотря на то, что негидролизованная молочная сыворотка демонстрирует некоторое ингибирование адгезии, существует значительное, зависимое от концентрации, ингибирование адгезии в присутствии гидролизованной молочной сыворотки, такое, что при концентрации 5 мг/мл адгезия Candida albicans не наблюдается.

Выделение молочных сывороточных апопротеинов

Модельный препарат можно фракционировать с помощью смеси хлороформ: метанол для разделения липидной и апопротеиновой фракций.

Процедуру осуществляли с использованием Модельного препарата в концентрации 10 мг/мл фосфатно-солевого буфера с рН 6,8. Один миллилитр этого раствора добавляли в стеклянную пробирку, содержащую 5 мл хлороформа и 2,5 мл метанола. Смесь встряхивали в течение 30 секунд и затем перемешивали в течение 30 минут, после чего ей позволяли отстояться до полного разделения слоев растворителя. Верхний слой метанола затем удаляли с помощью пипетки Пастера. Аликвоты каждой фракции растворителя высушивали под вакуумом. Во фракции полярного растворителя (метанола) присутствуют любые полярные соединения, а неполярные соединения (жирные кислоты) будут задерживаться в слое хлороформа. Высушенные фракции метанола брали в 1/10 от их первоначального объема в фосфатно-солевом буфере с рН 6,8 и высушенную фракцию хлороформа брали в 1/10 от первоначального объема этанола и разбавляли в PBS для аналитических целей.

Диаграмма 3 иллюстрирует ингибирующие адгезию свойства как апопротеин-обогащенной, так и липид-обогащенной фракций, зависимое от концентрации ингибирование адгезии, ассоциированное с апопротеин-обогащенной фракцией, но не с липидной фракцией. Кроме того, при концентрации 5 мг/мл фактически невозможно было определить адгезию Candida albicans.

Диаграмма 4 иллюстрирует зависимые от концентрации рост-ингибирующие свойства обогащенной липидами фракции на Candida albicans, тогда как Диаграмма 5 показывает, что апопротеин-обогащенная фракция не оказывает влияния на рост (фактически наблюдается некоторое увеличение роста при увеличении концентрации белковой фракции, особенно при концентрации 10 мг/мл).

Пример 2.

Используя анализ роста, описанный выше в подразделе «Способы и вещества», оценивали рост-ингибирующие свойства Модельного препарата против свежего клинического изолята Candida albicans. Анализ проводили в микротитровальных планшетах и каждую тест-концентрацию определяли в квадруплетах. Рост измеряли при 600 нм в течение 20-часового периода, и результаты проиллюстрированы на Диаграмме 6. Модельный препарат (в концентрации 5 мг/мл) дал почти 90%-ное ингибирование роста относительно контроля с добавлением Модельного препарата в концентрации 0 мг/мл. При концентрации 1 мг/мл Модельный препарат дал промежуточный результат.

Применение похожей процедуры анализа, за исключением того, что тест-вещества добавляются через 5 часов нормального роста культуры, описывается здесь как анализ воздействия. Модельный препарат добавляют в концентрациях, варьирующихся от 0 до 8 мг/мл. Тест-концентрации устанавливают таким образом, чтобы существовал похожий эффект разведения во всех лунках при добавлении предварительно нагретых до 37°С тест-растворов. Результаты анализа воздействия на свежий клинический изолят Candida albicans представлены на Диаграмме 7, данные были обработаны, для того чтобы удалить изменение оптической плотности в 5-часовой точке, полученное при добавлении тест-вещества. Быстрый и резкий, зависимый от концентрации, ингибирующий эффект Модельного препарата на рост С.albicans очевиден при концентрациях 8, 6, 4 и 2 мг/мл.

Пример 3.

Модельный препарат ингибирует адгезию, а также рост. Способ анализа адгезии был описан выше в подразделе «Способы и вещества». Применение того же препарата, что и в Примере 2, ингибирующие эффекты на адгезию того же свежего клинического изолята к БЭК проиллюстрированы на Диаграммах 8 и 9.

На Диаграмме 8 дрожжевые клетки были экспонированы с Модельным препаратом в течение 10 минут перед добавлением к БЭК. На Диаграмме 9 БЭК были экспонированы с Модельным препаратом в течение 10 минут перед добавлением к суспензии дрожжевых клеток.

«Контроль» в обоих этих анализах представляет собой адгезию, полученную в тест-условиях в отсутствие ингибирующих веществ: 41% и 35% соответственно. Предварительная обработка клеток Candida путем добавления в культуру Модельного препарата в концентрации 1 мг/мл уменьшает адгезию до 20% (53%-ное ингибирование), тогда как та же концентрация при предварительной обработке БЭК уменьшает адгезию до 16% (55%-ное ингибирование). В случае предобработки и дрожжей, и БЭК Модельным препаратом в концентрациях 2 и 5 мг/мл наблюдается 100%-ное ингибирование адгезии в тест-условиях.

«Белковым контролем» на Диаграмме 8 является бычий сывороточный альбумин, а на Диаграмме 9 использовали яичный белок, лишенный овальбумина, оба в концентрации 1 мг/мл, и оба белка предназначены для того, чтобы показать, что эффект Модельного препарата не определяется только концентрацией белка.

Пример 4.

Эффективность Модельного препарата против роста и адгезии метициллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus (MRSA) продемонстрирована на Диаграммах 10 и 11.

MRSA обычно культивируют на кровяном агаре и одну колонию используют для инокуляции пробирки с сердечно-мозговым агаром фирмы Oxoid (Oxoid Brain Heart Infusion Broth), как описано выше в подразделе «Способы и вещества». Через 8 часов инокулят используют в анализах роста и адгезии согласно способам, описанным выше.

MRSA не так чувствителен к свободным жирным кислотам/моноглицеридам, как другие микроорганизмы, и добавление цитратных солей, которые содержатся в Модельном препарате, существенно для значительного ингибирования роста этого конкретного микроорганизма.

Диаграмма 10 иллюстрирует эффект Модельного препарата при концентрации 5 мг/мл с увеличивающимися концентрациями тринатрия цитрата (0, 2, 4 и 5 мг/мл), полное ингибирование роста достигается при добавлении тринатрия цитрата в концентрациях 4 или 5 мг/мл к Модельному препарату с концентрацией 5 мг/мл. Тринатрия цитрат добавляют к тест-растворам при их приготовлении в ростовой среде, в соответствии с методиками, описанными в подразделе «Анализ ингибирования роста». Более подробно, как уже было описано, маточный раствор Модельного препарата с концентрацией 20 мг/мл смешивают с равным объемом раствора тринатрия цитрата с концентрацией 20 мг/мл. Таким образом, получают разведение 1:2 в растворе, содержащем 10 мг/мл Модельного препарата и 10 мг/мл тринатрия цитрата. Как поясняется выше, этот комбинированный препарат содержит в тест-лунке 5 мг/мл Модельного препарата и 5 мг/мл тринатрия цитрата. В равной степени, конечно, маточный раствор Модельного препарата (20 мг/мл) может быть смешан с равным объемом раствора тринатрия цитрата, содержащего 16 мг/мл или 8 мг/мл, так чтобы получить Модельный препарат, дополненный соответственно 4 и 2 мг/мл тринатрия цитрата, как показано на Диаграмме 10.

MRSA прикрепляется к БЭК, и эти клетки используют здесь таким же образом, как описано для Candida albicans. Цитрат натрия в чистом виде не оказывает влияния на адгезию MRSA к БЭК, хотя, как показано на Диаграмме 11, в этих тест-условиях достигается почти полное ингибирование адгезии при концентрации Модельного препарата 5 мг/мл (без добавления цитрата натрия). Бычий сывороточный альбумин используют в качестве белкового контроля, и это вещество не оказывает влияния на адгезию MRSA к БЭК.

Пример 5.

Микроорганизм Streptococcus mutans считают агентом, вызывающим кариес зубов, поскольку он избирательно прикрепляется к поверхности зубной эмали. Ферментация углеводов приводит к секреции молочной кислоты, которая вызывает локальное понижение рН, последующее растворение зубной эмали и возникновение кариеса зубов.

Диаграмма 12 иллюстрирует эффект Модельного препарата в концентрации 5 мг/мл на рост Streptococcus mutans. Анализ осуществляют по способу, описанному для всех упомянутых выше анализов роста. При концентрации Модельного препарата 5 мг/мл наблюдается полное ингибирование роста микроорганизма в течение 15 часов анализа. В течение того же периода времени контрольный рост в присутствии фосфатно-солевого буфера с рН 6,8, добавленного вместо Модельного препарата, демонстрирует ожидаемое логарифмическое увеличение.

При измерении ингибирования адгезии Streptococcus mutans используют гидроксиапатитный порошок от фирмы Merck в качестве заменителя зубной эмали. Способ тестирования описан выше в подразделе «Способы и вещества» со следующими модификациями: 1 мл свежей культуры, доведенной до оптической плотности 0,1 при 600 нм, добавляют к 5 мг покрытых слюной гидроксиапатитных шариков; оставляют прикрепляться в течение 1 часа и центрифугируют при низкой скорости для осаждения гидроксиапатита с прикрепившимися бактериями. Количество бактерий, оставшихся в супернатанте, представляет собой процент неприкрепившихся клеток от общего количества клеток в первоначальной популяции; обратная величина представляет процент ингибирования адгезии.

Диаграмма 13 иллюстрирует дозо-зависимый, ингибирующий адгезию эффект Модельного препарата, почти полное ингибирование достигается при концентрации 0,8 мг/мл. В этом Примере в качестве «белкового контроля» использовали бычий сывороточный альбумин, и в этой тест-системе БСА имеет ингибирующий эффект около 30% при концентрации 0,8 мг/мл, тогда как цитрат натрия демонстрирует около 10% ингибирования адгезии.

1. Применение молочного апопротеина или смеси молочных апопротеинов для ингибирования адгезии потенциальных патогенов к или на поверхности тела человека или животного.

2. Применение молочного апопротеина или смеси молочных апопротеинов для изготовления лекарственного препарата для ингибирования адгезии потенциальных патогенов к или на поверхности тела человека или животного.

3. Фармацевтически приемлемая система доставки для доставки апопротеина для профилактики или лечения инфекции, включающая, по меньшей мере, один молочный апопротеин или их смесь и фармацевтически приемлемый носитель.

4. Система доставки по п.3, отличающаяся тем, что молочный апопротеин или каждый из них представляет собой молочный аполипопротеин.

5. Система доставки по п.4, отличающаяся тем, что молочный аполипопротеин или каждый из них получен из молочного липопротеина, выбранного из бета-лактоглобулина, мембран жировых глобул и альфа-лактальбумина или их смеси.

6. Система доставки по п.3, отличающаяся тем, что молочный апопротеин или смесь молочных апопротеинов получают путем гидролиза молочной сыворотки ферментом (ферментами), предпочтительно липазой (липазами), денатурации фермента (ферментов) и отделения фракции, обогащенной апопротеином (апопротеинами).

7. Система доставки по п.3, отличающаяся тем, что молочный апопротеин или смесь молочных апопротеинов получают путем гидролиза молочной сыворотки ферментом (ферментами), предпочтительно липазой (липазами).

8. Система доставки по п.3, отличающаяся тем, что молоко представляет собой коровье или козье молоко.

9. Система доставки по п.3, отличающаяся тем, что дополнительно включает, по меньшей мере, одну свободную жирную кислоту или их смесь, или ее моноглицерид, или их смесь.

10. Система доставки по п.9, отличающаяся тем, что жирная кислота является насыщенной или ненасыщенной и имеет углеводородную цепь с четным количеством углеродных атомов от С4 до С24 или их смесью.

11. Система доставки по п.10, отличающаяся тем, что ненасыщенная жирная кислота имеет углеводородную цепь с С14-С24 и предпочтительно выбрана из пальмитолеиновой, олеиновой, линолевой, альфа- или гамма-линоленовой, арахидоновой, эйкозапентаеновой и тетракозеновой кислот и их моноглицеридов или их смесей.

12. Система доставки по п.10, отличающаяся тем, что насыщенная жирная кислота имеет углеводородную цепь с С4-С18 и предпочтительно выбрана из масляной, изомасляной, янтарной, капроновой, адипиновой, каприловой, каприновой, лауриновой, миристиновой, пальмитиновой и стеариновой кислот и их моноглицеридов или их смесей.

13. Система доставки по п.3, отличающаяся тем, что дополнительно включает, по меньшей мере, одну органическую кислоту или ее соль, или эфир, или их смесь.

14. Система доставки по п.13, отличающаяся тем, что органическая кислота выбрана из гликолевой, щавелевой, молочной, глицериновой, тартроновой, яблочной, малеиновой, фумаровой, винной, малоновой, глутаровой, акриловой, цис- или транс-бутеновой и лимонной кислот или их солей, или эфиров, или их смесей.

15. Система доставки по п.3, отличающаяся тем, что дополнительно включает антиоксидант, предпочтительно альфа-токоферол.

16. Система доставки по п.3 в форме раствора для парентерального вливания для системного лечения или профилактики инфекции.

17. Система доставки по п.3 в форме мази для местного применения для профилактики или лечения кожной инфекции.

18. Система доставки по п.3 в форме интравагинального крема или геля, или пессария для профилактики или лечения рецидивирующей инфекции, вызванной Candida albicans.

19. Система доставки по п.3 в форме перевязочного материала для применения в профилактике или лечении инфекции.

20. Система доставки по п.3 в форме лекарственного препарата для нанесения на слизистые оболочки глаз, носа, ротовой полости, кишечника или гениталий.

21. Система доставки по п.20 в форме глазных капель для профилактики или лечения глазных инфекций.

22. Система доставки по п.20 в форме назального аэрозоля для ингибирования переноса устойчивых к антибиотикам микроорганизмов от носителя.

23. Система доставки по п.20 в форме пищевого продукта или напитка для применения в качестве профилактического агента против кишечной инфекции.

24. Система доставки по п.20 в форме перорального препарата для поддержания здоровья, выбранного из зубной пасты, жевательной резинки, полоскания для рта или других средств для чистки зубов, для улучшения гигиены зубов, или в качестве профилактического агента против орального заболевания.

25. Система доставки по п.7, отличающаяся тем, что гидролизованная молочная сыворотка находится в диапазоне концентраций от 0,5 до 25 мг/мл.

26. Система доставки по п.3, отличающаяся тем, что молочный апопротеин или смесь молочных апопротеинов содержится в диапазоне концентраций от 0,5 до 10 мг/мл, предпочтительно от 3 до 7 мг/мл.

27. Система доставки по п.9, отличающаяся тем, что свободная жирная кислота или ее моноглицерид, или их смесь, содержится в диапазоне концентраций от 0,5 до 5 мг/мл.

28. Система доставки по п.13, отличающаяся тем, что органическая кислота или ее соль или эфир, или их смесь, содержится в диапазоне концентраций от 0,5 до 5 мг/мл.

29. Система доставки по п.9, отличающаяся тем, что молочный апопротеин или смесь молочных апопротеинов, и свободную жирную кислоту или ее моноглицерид, или их смесь, вводят либо одновременно, либо последовательно в течение 6 ч в любом порядке.

30. Система доставки по п.13, отличающаяся тем, что молочный апопротеин или смесь молочных апопротеинов и органическую кислоту или ее соль, или эфир, или их смесь, вводят либо одновременно, либо последовательно в течение 6 ч в любом порядке.

31. Система доставки по п.13, отличающаяся тем, что молочный апопротеин или его смесь, свободную жирную кислоту или моноглицерид, или их смесь, и органическую кислоту или ее соль, или эфир, или их смесь, вводят либо одновременно, либо последовательно в течение 6 ч в любом порядке.

32. Система доставки по п.3, отличающаяся тем, что используется для косметического ухода за кожей.

33. Продукт для профилактики или лечения инфекции, содержащий (а) по меньшей мере, один молочный апопротеин или их смесь, и (б) по меньшей мере, одну жирную кислоту или их смесь, или моноглицерид, или их смесь.

34. Продукт по п.33, отличающийся тем, что указанный молочный апопротеин или каждый из молочных апопротеинов представляет собой молочный апопротеин, выбранный из бета-лактоглобулина, мембран жировых глобул и альфа-лактальбумина или их смеси.

35. Продукт по п.33, отличающийся тем, что указанная жирная кислота или каждая из жирных кислот выбрана из пальмитолеиновой кислоты, олеиновой, линолевой, альфа- и гамма-линоленовой, арахидоновой, эйкозапентаеновой, тетракозеновой, масляной, изомасляной, янтарной, капроновой, адипиновой, каприловой, каприновой, лауриновой, миристиновой, пальмитиновой и стеариновой кислот и их моноглицеридов или их смесей.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к фармакологии и может быть использовано в качестве противоракового лекарственного средства направленного действия. .

Изобретение относится к действию полипептида Саратина, который значительно уменьшает адгезию и аккумулирование тромбоцитов после повреждений сосудов, таких как эндартеректомия.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в производстве лактоглобулина для иммунотерапии. .

Изобретение относится к области медицины и касается химерного белка для лечения злокачественных лимфом. .

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии и может быть использовано в медицине, а также в производстве медицинской техники. .

Изобретение относится к способу приготовления состава, включающего маннан-связывающий лектин, и к лечению состояний, связанных с дефицитом маннан-связывающего пектина, что связано с повышенной предрасположенностью к инфекциям.

Изобретение относится к лекарственным средствам, а именно к применению амидов фумаровой кислоты формулы (I) для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения аутоиммунных заболеваний, для лечения реакций "трансплантат против хозяина", для лечения заболеваний, опосредованных NFkappaB, а также к амидам фумаровой кислоты формулы (I) и к лекарственному средству, содержащему амид фумаровой кислоты формулы (I) в количестве, соответствующем 1-500 мг фумаровой кислоты в расчете на разовую дозу, предназначенному для лечения указанных выше заболеваний.

Изобретение относится к медицине, а именно - к офтальмологии, и может быть использовано при лечении врожденной миопии у детей. .

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в медицине. .
Изобретение относится к косметической промышленности. .

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в производстве лактоглобулина для иммунотерапии. .

Изобретение относится к области лечебного питания. .
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к средствам для профилактики и лечения желудочных заболеваний телят. .
Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологиии, и касается лечения климактерического синдрома. .

Изобретение относится к медицине, а именно к способам немедикаментозного оздоровления. .
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способу получения секреторного иммуноглобулина A (S-IgA) из молозива животных. .
Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и терапии, и касается лечения йоддефицитных состояний у беременных женщин. .
Изобретение относится к области биофармакологии и медицине. .
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и используется для местного лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии

Наверх