Способ получения липосом, обладающих иммунокорригирующим и гепатопротекторным действием
Владельцы патента RU 2308940:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Восточно-Сибирский государственный технологический университет (RU)
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано при производстве лекарственных средств, корригирующих иммунную и гепатобиллиарную системы организма. Изобретение раскрывает способ получения липосом, обладающих иммунокорригирующим и гепатопротекторным действием, заключающийся в том, что проводят экстракцию фосфолипидов из печени байкальской нерпы, растворяют смесь полученных фосфолипидов и жир байкальской нерпы в органическом растворителе в соотношении 4:6 с антиоксидантом α-токоферолом, высушивают тонкий слой липидов на роторном испарителе, добавляют буферный раствор, встряхивают смесь до получения однородной суспензии, проводят обработку липидной смеси ультразвуком при водяном охлаждении, далее центрифугируют смесь и отделяют верхние три четверти надосадочной жидкости. Заявляемый способ позволяет получить липосомальное средство, обладающее самостоятельным лечебным - иммунокорригирующим и гепатопротекторным - действием, и расширить сырьевую базу для получения липосом, используя дешевое природное сырье. 6 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано при производстве лекарственных средств, корригирующих иммунную и гепатобилиарную системы организма.
Известен способ получения лецитин-холестериновых липосом, обладающих антиэкссудативной активностью, мембрана которых содержит дополнительное количество ненасыщенных жирных кислот [см. Е.М.Бородулина, В.М.Крейнес. Усиление антиэкссудативной активности липосом с помощью ненасыщенных жирных кислот // Патологич. физиология и эксперим. терапия. 1996 N3. М., Медицина, с. 18-20].
Однако в известном способе не выявлено влияние полученных липосом на иммунную и гепатобилиарную системы организма.
Известен способ получения липосом, изготавливаемых из лецитинов растительного и животного происхождений и смеси кислых (соевых) фосфолипидов, пригодных для инкапсулирования лекарств (цитостатиков, иммуномодуляторов, полиненасыщенных жирных кислот из морских животных, обладающих кардиопротекторными, антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами) [Способ получения липосом. Патент РФ 02071765, опубл. 20.01.1997 г.].
Однако недостатком известного способа является то, что полученные средства используются только в качестве носителей лекарственных препаратов и биологически активных веществ, не обладают каким-либо самостоятельным биологически активным действием и применяются только для парентерального введения в организм, в то время как не была изучена их активность при пероральном введении.
Известен способ получения липосом, содержащих биологически активные вещества (негормональные противовоспалительные средства и др.), а также противовирусные и противогрибковые агенты [см. Liposomes containing biologically active compounds. EP 1515698 A2 N03761255. 23.03.2005].
Однако недостатком известного способа является то, что полученные липосомальные средства обладают только анальгетическими, противовоспалительными, противобактериальными и противовирусными свойствами, тогда как не было выявлено их иммунобиологическая и гепатопротекторная активность.
Известен способ получения липосом из яичных фосфолипидов, включающий экстракцию суммарных фосфолипидов из яичных желтков, растворение яичных фосфолипидов в органическом растворителе, высушивание тонкого слоя яичных фосфолипидов в круглодонной колбе на роторном испарителе, добавление буферного раствора, встряхивание смеси, обработку смеси ультразвуком, центрифугирование смеси и отделение верхних трех четвертей надосадочной жидкости [см. Биологические мембраны. Методы: Пер. с англ. /Под ред. Дж.Б.Финдлея, У.Г.Эванза. - М.: Мир, 1990, с.188-195].
Недостатком данного способа является то, что полученные липосомы используются только в качестве носителей лекарственных препаратов и не обладают каким-либо самостоятельным фармакологическим воздействием.
Известен способ получения липосом из яичных фосфолипидов, включающий экстракцию суммарных фосфолипидов из яичных желтков, растворение смеси яичных фосфолипидов и жира байкальской нерпы в соотношении 4:6 в органическом растворителе, высушивание тонкого слоя яичных фосфолипидов в круглодонной колбе на роторном испарителе, добавление раствора, содержащего 0.25 М сахарозу, 0.01 М трис-буфер, 0.001 М ЭДТА, рН 7.4, встряхивание смеси до получения однородной суспензии на механической качалке в течение 30 минут, обработку смеси в течение 7 минут ультразвуком на диспергаторе УЗДН-2Т при водяном охлаждении при частоте 22 кГц, центрифугирование смеси в течение 90 минут при 105000 g и отделение верхних трех четвертей надосадочной жидкости [см. Способ получения липосом. Патент РФ №2153328, опубл. 27.07.2000 г., Бюл. №21].
Полученные по известному способу липосомы обладают иммунокорригирующими свойствами, тогда как не выявлено их влияние на гепатобилиарную систему организма.
Задача, решаемая в предлагаемом изобретении, заключается в изменении фармакологических свойств липосом.
Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, - это создание липосомального средства, обладающего гепатопротекторными свойствами с высокими иммунокорригирующими свойствами.
Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что известный способ характеризуется тем, что проводят экстракцию фосфолипидов из печени байкальской нерпы, растворяют смесь полученных фосфолипидов и жир байкальской нерпы в органическом растворителе в соотношении 4:6 с антиоксидантом α-токоферолом, высушивают тонкий слой липидов на роторном испарителе, добавляют буферный раствор, встряхивают смесь до получения однородной суспензии, проводят обработку липидной смеси ультразвуком при водяном охлаждении, далее центрифугируют смесь и отделяют верхние три четверти надосадочной жидкости.
Байкальская нерпа - эндемик уникального озера Байкал, относится к отряду ластоногих семейства настоящих тюленей. В данное время нерпа - важнейший объект зверобойного промысла, добывается с единственной целью получения меха животного, а жир и другие виды тканей (в том числе и печень), в лучшем случае направляются на зверофермы для откорма животных либо на техническую переработку [В.Д.Пастухов Нерпа Байкала. - Новосиб.: ВО Наука. 1993, 271 с.].
Как известно, основную массу покровных жиров морских млекопитающих составляют простые липиды - триацилглицериды. Исследования химического состава жира выявили 60 жирных кислот, содержащих от 8 до 22 углеродных атомов. Из них на долю насыщенных кислот приходится 17-19%, мононенасыщенных 59-60%, полиненасыщенных 22-23% (в том числе диеновых 6.1-7.0%, триеновых 0.2-0.3%, тетраеновых 3.9-4.1%, пентаеновых 4.6-5.0%, гексаеновых 6.2-7.0%). Высокая биологическая ценность жира нерпы обусловлена в основном содержанием таких высоконенасыщенных кислот, как экозапентаеновой (2.65%) и докозагексаеновой (6.28%). Эти кислоты являются предшественниками особых гормоноподобных веществ - простагландинов и тромбоксанов. В результате исследований фракционного состава жира нерпы было показано, что доминирующей фракцией являются триацилглицериды (до 99%). Свободные жирные кислоты, эфиры стеаринов находятся в следовых количествах (до 0.2%). Количество неомыляемых соединений не превышает 0.3%, остальные 0.5% приходятся на сумму ди- и моноглицеринов. Витамины А, Д, К в жире нерпы не обнаружены. Токоферолы содержатся в следовых количествах.
Жирнокислотный состав липидов печени байкальской нерпы включает в себя более 25-и полиненасыщенных жирных кислот с длиной цепи более 14-и углеродных атомов, наиболее распространенными из которых являются олеиновая - 18:1n-9 (11.62%), линолевая - 18:2n-6 (4.31%), эйкозадиеновая - 20:2n-6 (1.55%), дихомо-гамма-линоленовая - 20:3n-6 (1.12%), арахидоновая - 20:4n-6 (20.15%), эйкозапентаеновая - 20:5n-3 (0.44%), докозагексаеновая - 22:6n-3 (6.73%). Анализ жирнокислотного состава липидов печени нерпы показал, что содержание насыщенных, мононенасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот практически одинаково и составляет 31.85%, 33.15% и 35.70% соответственно. При этом соотношение жирных кислот семейств омега-6/омега-3 составляет 3.19:1, что позволяет отнести печень байкальской нерпы к числу перспективных источников сырья для использования в пищу и использования в качестве БАВ.
Преимуществом жира, содержащегося во внутренних органах, перед покровным, является наличие в нем фосфолипидов. Как показали исследования, содержание фосфолипидов в печени нерпы составило 4.7% от сухого остатка. Среди фосфолипидов в печени байкальской нерпы преобладают по количеству фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин (41.07% и 37.22% по отношению к общему количеству фосфолипидов соответственно) [Кабирова И.Р. Характеристика и промышленное использование печени байкальской нерпы на пищевые цели. Дисс...к.т.н. - Улан-Удэ, 2005. - 107 с.].
Соотношение фосфолипидов печени нерпы и жира нерпы подбирали таким образом, чтобы обеспечить максимальное иммунокорригирующее действие.
Иммунокорригирующую активность изучали в реакциях, ответственных за клеточный (в реакциях «трансплантат против хозяина» - РТПХ и гиперчувствительность замедленного типа - ГЗТ) и гуморальный иммунитет (в реакции антителообразования).
Эксперименты проводились на мышах обоего пола линии F1 (СВАхС57В1/6), а также линии СВА массой 20-22 г. В работе были исследованы: 1) липосомы, приготовленные на основе яичных фосфолипидов с добавлением жира нерпы в соотношении 4:6; 2) липосомы, приготовленные на основе фосфолипидов печени нерпы с добавлением жира нерпы в соотношениях 4:6 и 6:4; 3) липосомы, приготовленные на основе фосфолипидов печени нерпы. Препараты вводились экспериментальным животным ежедневно перорально в течение 14 дней в объеме 0.2 мл. Действие экстракта было изучено на животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, которое вызывали введением азатиоприна в концентрации 50 мг/кг, что вызывало угнетение показателей клеточного и гуморального иммунитета.
Использование липосом, содержащих разные соотношения фосфолипидов печени нерпы и жира нерпы, на фоне иммунной супрессии восстанавливало показатель РТПХ лабораторных животных до уровня интактных. Несколько больший (на 5-10%) по сравнению с остальными группами индекс реакции был отмечен в группе животных, получавших липосомы, содержащие фосфолипиды печени и жир нерпы в соотношении 4:6 (см. табл. 1).
| Таблица 1 Изменение показателя реакции «Трансплантат против хозяина» у мышей, получавших липосомальные средства | |
| Группа животных | Индекс увеличения лимфоузлов |
| Интактные | 2.51±0.11 |
| Азатиоприн, 50 мг/кг | 1.24±0.06* |
| Азатиоприн + липосомы Я/Ж (4:6) | 2.4±0.08** |
| Азатиоприн + липосомы П/Ж (4:6) | 2.42±0.14** |
| Азатиоприн + липосомы П/Ж (6:4) | 2.30±0.07** |
| Азатиоприн + липосомы П | 2.46±0.12** |
| Примечания (к табл. 1-4): 1. липосомы Я/Ж (4:6) - липосомы, приготовленные на основе яичных фосфолипидов с добавлением жира нерпы в соотношении 4:6; |
| 2. липосомы П/Ж (4:6) и (6:4) - липосомы, приготовленные на основе фосфолипидов печени нерпы с добавлением жира нерпы в соотношениях 4:6 и 6:4; 3. липосомы П - липосомы, приготовленные на основе фосфолипидов печени нерпы; 4. * - достоверное отклонение результатов по сравнению с группой интактных животных (р<0.05); 5. ** - достоверное отклонение результатов по сравнению с группой животных «Азатиоприн» (р<0.05); 6. *** - достоверное отклонение результатов по сравнению с группой животных «Азатиоприн + липосомы Я/Ж» (р<0.05). |
Использование всех исследуемых липосомальных средств восстанавливало показатель клеточноопосредованной реакции ГЗТ лабораторных животных, находившихся в состоянии иммунной супрессии, до уровня показателя ГЗТ у интактных животных, причем максимальное значение индекса достигало в группе, получавшей липосомы, полученные на основе фосфолипидов печени нерпы с добавлением жира в соотношении 4:6 (см. табл.2).
| Таблица 2 Изменение индекса реакции ГЗТ под воздействием липосомальных средств | |
| Группа животных | Индекс реакции, % |
| Интактные | 27.29±0.78 |
| Азатиоприн, 50 мг/кг | 14.54±1.88* |
| Азатиоприн + липосомы Я/Ж (4:6) | 30.39±1.90** |
| Азатиоприн + липосомы П/Ж (4:6) | 31.85±2.52** |
| Азатиоприн + липосомы П/Ж (6:4) | 24.4±1.85** |
| Азатиоприн + липосомы П | 27.23±1.52** |
| Примечания: (см. табл.1). |
Как показали результаты исследования, липосомы на основе фосфолипидов печени с добавлением жира нерпы, взятых во всех изучаемых соотношениях, проявляли большую активность по сравнению с липосомами на основе яичных фосфолипидов и липосомами на основе только фосфолипидов печени нерпы на фоне иммунодепрессии и вызывали достоверное увеличение количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 106 спленоцитов; при этом показатели антителообразующей активности клеток селезенки подопытных животных восстанавливались до уровня интактных животных (см. табл.3).
| Таблица 3 Количество антителообразующих клеток у животных под воздействием липосомальных средств | ||
| Группа животных | Число АОК на селезенку | Число АОК на 106 спленоцитов |
| Интактные | 40042±2367 | 673.2±42.5 |
| Азатиоприн, 50 мг/кг | 16375±1451* | 271.5±28.1* |
| Азатиоприн + липосомы Я/Ж (4:6) | 33761±1493** | 516.0±73.2** |
| Азатиоприн + липосомы П/Ж (4:6) | 46705±1284**, *** | 721.0±62.3 **, *** |
| Азатиоприн + липосомы П/Ж (6:4) | 44167±2055**, *** | 677.5±54.6**, *** |
| Азатиоприн + липосомы П | 34500±3500** | 521.7±33.5** |
| Примечания: (см. табл.1). |
Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальным соотношением: фосфолипиды печени нерпы: жир нерпы, при котором наблюдалось максимальное иммуностимулирующее действие, является 4:6.
Изучение иммунобиологической активности липосом, полученных предложенным способом, проводили на мышах обоего пола линии F1 (СВАхС57В1/6) со средней массой тела 20-22 грамма в реакции фагоцитоза Staphylococcus aureus перитонеальными макрофагами in vitro по методике И.С.Фрейдлин [И.С.Фрейдлин. Использование культуры мышиных перитонеальных макрофагов в качестве моделей для изучения клеток мононуклеарной фагоцитарной системы организма и их применение под влиянием биологически активных веществ // Метод, рекоменд. - Л., 1976]. В реакции фагоцитоза подсчитывали два показателя: активность (процент фагоцитирующих клеток от общего числа сосчитанных макрофагов) и интенсивность (среднее количество микроорганизмов, поглощенное одной клеткой). Подавление функций макрофагов моделировали введением классического иммунодепрессанта азатиоприна в концентрации 500 мкг/мл в культуральную среду. Действие азатиоприна вызывало снижение активности фагоцитоза на 50%, интенсивности фагоцитоза интактных макрофагов - на 48.25%. Липосомы вводили в среду с иммуносупрессированными клетками в концентрации 200 мкг/мл (в пересчете на жир нерпы). Анализ полученных данных показал, что введение в данном опыте липосом, полученных предложенным способом, на фоне предварительного воздействия азатиоприном достоверно превышало оба показателя и восстанавливало их до уровня интактных (см. табл.4).
| Таблица 4 Показатели фагоцитоза Staphylococcus aureus перитонеальными макрофагами мышей in vitro при воздействии липосомальных средств, полученных на основе фосфолипидов печени нерпы | ||
| Группы животных | Активность фагоцитоза | Интенсивность фагоцитоза |
| Контроль (интактные клетки) | 64.16±5.36 | 12.58±1.08 |
| Азатиоприн, 500 мкг/мл | 35.29±1.12* | 6.51±0.32* |
| Азатиоприн + липосомы П/Ж (4:6) | 63.23±4.18** | 12.35±1.09** |
| Примечания: (см. табл.1). |
Согласно этим данным можно сделать вывод о стимулирующем действии полученных липосом на фагоцитарную активность макрофагов in vitro.
Гепатопротекторную активность липосом, полученных предложенным способом, изучали на крысах-самцах линии Wistar с исходной массой 180-200 г. Липосомальные средства на основе фосфолипидов печени нерпы вводили перорально в объеме 0.5 мл/200 г массы крысы 1 раз в сутки в течение 7-и, 14-и и 21-го дня. Соответствующие контрольные группы животных в аналогичных условиях получали дистиллированную воду в эквивалентном объеме. Действие липосомальных средств на основе фосфолипидов печени нерпы было изучено на животных с токсическим гепатитом. Токсический гепатит вызывали подкожным введением крысам 50%-ного масляного (V/V) раствора тетрахлорметана (CCl4) в объеме 0,4 мл на 100 г веса, 1 раз в сутки, в течение четырех дней. В качестве препарата сравнения был использован «Холосас», рекомендуемый при заболеваниях гепатобилиарной системы в качестве желчегонного средства [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Изд-во Новая волна», 2005. - 1200 с.]. «Холосас» вводили крысам с CCl4 -гепатитом в объеме 0,1 мл на 100 г массы. Желчь для исследования получали в условиях острых опытов под наркозом (0,1 мл внутрибрюшинно 25% водного раствора тиопентала-натрия).
Оценку желчевыделительной функции печени проводили по скорости секреции желчи [Скакун Н.П., Олейник А.Н. Сравнительное действие атропина и метацина на внешнесекреторную функцию печени // Фармакология и токсикология. - 1967. - Т.30. - №3. - С.334-337] (см. табл.5).
| Таблица 5 Влияние липосом на основе фосфолипидов печени байкальской нерпы на скорость секреции желчи у белых крыс при токсическом гепатите, вызванном тетрахлорметаном (ТХМ) | ||||
| Условия опыта | Скорость секреции желчи в течение 4-х часов, мг/мин на 100 г | |||
| 1 ч | 2 ч | 3 ч | 4 ч | |
| Интактные животные | 6.6±0.1 | 6.4±0.2 | 5.7±0.08 | 5.3±0.5 |
| 7 сутки | ||||
| Контроль (ТХМ) | 5.4±0.1 | 5.1±0.2 | 5.1±0.05 | 3.3±0.0 |
| ТХМ + Холосас | 5.6±0.4 | 6.3±0.6* | 5.9+0.4* | 4.1±0.4* |
| ТХМ + Липосомы | 6.5±0.2*, ** | 6.9±0.2* | 6.6±0.4* | 6.0±0.4*, ** |
| 14 сутки | ||||
| Контроль (ТХМ) | 4.4±0.03 | 4.0±0.03 | 3.3±0.0 | 3.3±0.3 |
| ТХМ + Холосас | 7.1±0.1* | 6.5±0.1* | 5.1+0.3* | 4.8±0.3* |
| ТХМ + Липосомы | 7.4±0.1* | 6.6±0.08* | 6.0±0.1*, ** | 5.3±0.1*, ** |
| 21 сутки | ||||
| Контроль (ТХМ) | 5.7±0.2 | 5.4±0.4 | 5.0±0.3 | 4.6±0.3 |
| ТХМ + Холосас | 6.0±0.3 | 5.6±0.2 | 5.4±0.4 | 4.7±0.2 |
| ТХМ + Липосомы | 7.6±0.6*, ** | 6.9±0.4*, ** | 5.4±0.2 | 5.0±0.3 |
| Примечание (к табл. 5 и 6): * - достоверное отклонение значения относительно контрольного значения в соответствующие сроки эксперимента; ** - достоверное отклонение значения относительно значения в группе животных, получавших «Холосас», в соответствующие сроки эксперимента. |
В процессе экспериментальной фармакотерапии токсического гепатита липосомами, приготовленными заявляемым способом, наблюдали ускорение желчевыделительной функции печени крыс (табл.5). На ранних сроках эксперимента (7-й день) у крыс, получавших липосомы, скорость секреции желчи возрастала по сравнению с животными контрольной группы на 20.4%, 35%, 29% и в 2 раза в 1-й, 2-й, 3-й и 4-й часы наблюдения соответственно. На 14-й день опыта под влиянием липосом скорость секреции желчи возрастала в 1.6 раза (после 1-го, 2-го и 4-го часа опыта) и в 1.8 раза (после 3-го часа опыта) по сравнению с контролем. На 21-й день опыта у крыс, получавших испытуемые липосомы, скорость секреции желчи возрастала умеренно. Так, через 1 час после их введения скорость секреции желчи увеличилась на 33%, а через 2 часа - на 27% по сравнению с контролем; тогда как через 3 и 4 часа после введения липосом существенной разницы в скорости выделения желчи у животных не наблюдалось. Необходимо отметить, что в некоторые сроки эксперимента скорость выделения желчи у животных, принимавших липосомы, была достоверно выше таковой у животных, получавших фармакопейное средство «Холосас».
Оценку желчеобразовательной функции печени производили по общему количеству выделенной желчи, концентрации желчных кислот [Карбач Я.И. Количественное определение желчных кислот в желчи и крови с применением хроматографического метода // Биохимия. - 1961. - Т.26. - №2. - С.305-309]. Концентрацию холестерина в желчи определяли по методу [Дроговоз С.М. Нарушение интенсивности желчеотделения и химического состава желчи при дистрофии печени, вызванной четыреххлористым углеродом // Вопросы медицинской химии. - 1971. - Вып.4. - С.397-400], билирубина - по методу [Скакун Н.П. Нейрогуморальный механизм желчегонного действия инсулина. // Проблемы эндокринологии. - 1956. - №6. - С.75-78].
Биохимические показатели секретируемой желчи подопытных животных представлены в табл. 6, из которой следует, что при введении животным липосом общее количество желчи, выделенное за 4 часа (весь период наблюдения), повышалось на 8.3% (после 7-и суток), на 68.7% (после 14-и суток) и на 20.3% (после 21-х суток) по сравнению с контролем в соответствующие сроки эксперимента. Необходимо отметить, что по данному показателю активность липосом была достоверно выше, чем у «Холосаса». Наряду с ускорением холереза под влиянием липосом отмечены позитивные изменения и в химическом составе желчи. Так, концентрация общих желчных кислот в секретируемой желчи повышалась с 7-х суток наблюдения и превышала таковую в контроле на 58% (так же как и на 14-е сутки), а на 21-е сутки - на 72%; содержание билирубина повышалось на 20% (на 7-е и 14-е сутки) и на 85% (на 21-е сутки эксперимента). При этом количество холестерина оставалось на одном и том же уровне на 7-е сутки, на 14-е сутки уменьшалось на 18%, а на 21-е сутки увеличивалось в 4 раза (см. табл.6).
| Таблица 6 Влияние липосом на основе фосфолипидов печени байкальской нерпы на биохимический состав желчи у белых крыс при токсическом гепатите, вызванном тетрахлорметаном (n=5) | ||||
| Условия опыта | Общее количество желчи, выделенное за 4 часа | Содержание желчных кислот | Содержание билирубина | Содержание холестерина |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| мг/100 г | Мг % | |||
| Интактные животные | 1440±54 | 62.7 | 20 | 5.15 |
| 7 сутки | ||||
| Контроль (ТХМ) | 1134±24 | 54.15 | 5 | 11.55 |
| ТХМ + Холосас | 1314±118* | 48.45 | 6 | 10.4 |
| ТХМ + Липосомы | 1560±148* | 85.5 | 6 | 12.25 |
| 14 сутки | ||||
| Контроль (ТХМ) | 900±19 | 57 | 5 | 9.9 |
| ТХМ + Холосас | 1410±51* | 85.5 | 6 | 9.85 |
| ТХМ + Липосомы | 1518±26*, ** | 85.5 | 6 | 8.1 |
| 21 сутки | ||||
| Контроль (ТХМ) | 1242±81 | 62.7 | 7 | 0.8 |
| ТХМ + Холосас | 1302±76 | 96.9 | 18 | 1.85 |
| ТХМ + Липосомы | 1494±94*, ** | 108.3 | 13 | 3.9 |
| Примечания: (см. табл.5). |
По результатам исследований активности липосомального средства, полученного предложенным способом, видно, что оно является корректором иммунной и гепатобилиарной систем организма. Это в свою очередь позволяет предполагать эффективность применения полученного средства при состояниях, сопровождающихся угнетением иммунной системы организма и нарушениями желчеотделительной функции печени.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, позволил установить, что заявитель не обнаружил аналогичных технических решений.
Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условиям «новизна» и «изобретательский уровень».
Заявляемый способ получения липосом осуществляется следующим образом.
Фосфолипиды по известному способу экстрагируют из печени байкальской нерпы [см. М. Кейтс. Техника липидологии. М.: «Мир», 1975. - 236 с.]. К 6-7 г свежей печени прибавляют 3 мл воды и 30 мл смеси хлороформ-метанол (1:2) и ткань гомогенизируют в гомогенизаторе с ножами [Foss Tecato-2094] в течение 2 мин при комнатной температуре. Гомогенат центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин, супернатант декантируют и остаток реэкстрагируют 38 мл смеси хлороформ-метанол-вода (1:2:0.8) в гомогенизаторе [Foss Tecato-2094] в течение 2 мин. Ткань отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин, объединенные супернатанты разбавляют 20 мл хлороформа и 20 мл воды, водно-метанольную и хлороформную фазу разделяют отстаиванием в делительной воронке. Нижний хлороформный слой концентрируют на роторном испарителе [испаритель ротационный ИР-1М2 ТУ 25-1173.102-84] при 30-35°С. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа. Далее к раствору суммарных липидов в хлороформе приливают пятикратный объем ацетона и смесь выдерживают 2-3 ч при 0°С, выпавший осадок отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин. С помощью пипетки вносят раствор фосфолипидов печени нерпы, жира байкальской нерпы [ТУ 9281-017-02069473-2001] и антиоксиданта альфа-токоферола [см. М.Д.Машковский. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.2. - 11-е изд. Стер. - М.: Медицина, 1988. - С.37-39] в соотношении 4:6:0.05 (0.1 г смеси) в органическом растворителе (1 мл хлороформа + 1 мл метанола) в толстостенную круглодонную колбу. Испаряют растворитель на роторном испарителе [испаритель ротационный ИР-1М2 ТУ 25-1173.102-84] так, чтобы дать возможность полученной смеси распределиться в виде тонкой пленки по стенке колбы. В колбу добавляют раствор, содержащий 0.25 М сахарозу, 0.01 М трис-буфер; 0.001 М ЭДТА, рН 7.4, встряхивают до получения однородной суспензии на механической качалке [Установка выращивания микроорганизмов, термостатированная УВМТ-12-250] в течение 30 минут. Обрабатывают липидную смесь в течение 7 минут ультразвуком на диспергаторе УЗДН-2Т при водяном охлаждении при частоте 22 кГц. Обработанную смесь центрифугируют в течение 90 минут при 105000 g и отбирают верхние три четверти надосадочной жидкости.
Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о том, что заявляемый способ позволяет получить липосомальное средство, обладающее самостоятельным лечебным - иммунокорригирующим и гепатопротекторным - действием, и расширить сырьевую базу для получения липосом, используя дешевое природное сырье.
Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «промышленная применимость».
Способ получения липосом, обладающих иммунокорригирующим и гепатопротекторным действием, характеризующийся тем, что проводят экстракцию фосфолипидов из печени байкальской нерпы, растворяют смесь полученных фосфолипидов и жир байкальской нерпы в органическом растворителе в соотношении 4:6 с антиоксидантом α-токоферолом, высушивают тонкий слой липидов на роторном испарителе, добавляют буферный раствор, встряхивают смесь до получения однородной суспензии, проводят обработку липидной смеси ультразвуком при водяном охлаждении, далее центрифугируют смесь и отделяют верхние три четверти надосадочной жидкости.
