Способ приготовления препаратов десквамированных эндотелиальных клеток периферической крови
Владельцы патента RU 2309752:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ивановская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике в кардиологии, ревматологии, профилактической медицине. Способ приготовления препаратов десквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) периферической крови включает отбор венозной крови, ее центрифугирование, отделение бестромбоцитарной плазмы с последующим выделением: ДЭК, при этом наносят бестромбоцитарную плазму на покровное стекло, инкубируют при 37°С 60 минут, фиксируют в метаноле в течение 5 минут или в 1%-ном глутаровом альдегиде на среде 199 в течение 1 суток, окрашивают краской азур-II-эозин в соотношении 1:1 с дистиллированной водой и монтируют на предметные стекла. Изобретение позволяет усовершенствовать качество морфологической диагностики и идентификации циркулирующих десквамированных эндотелиоцитов, изучать внутриклеточные структуры ДЭК; препараты могут храниться длительное время, транспортироваться, структура клеток не искажается. 2 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике в кардиологии, ревматологии, профилактической медицине.
Количественная оценка содержания десквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) в периферической крови используется в России (Петрищев Н.Н., Беркович О.А., Власов Т.Д. и др. Диагностическая ценность определения десквамированных эндотелиальных клеток в крови // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2001, №1. - С.50-58) и за рубежом (М.Mutin, I.Canavy, A.Blann, et al. Direct Evidence of Endothelial Injury in Acute Myocardial Infarction and Unstable Angina by Demonstration of Circulating Endothelial Cells // Blood. - 1999. - Vol.93 (9). - P.2951-2958) с диагностической целью. Изменение концентрации ДЭК в периферической крови позволяет оценивать тяжесть и динамику состояния пациента, судить об остроте патологии, системности заболевания с вовлечением в патологический процесс и повреждением сосудов кровеносного русла (Hladovec J., Prerovsky I., Stanek V., Fabian J. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina pectoris // Klin. Wochenschr. - 1978. - Vol.56 (20). - P.1033-1036; Dierk H. Endemann, Ernesto L. Schiffrin. Endothelial Dysfunction // J Am Soc Nephrol - 2004. - Vol.15. - P.1983-1992; Douglas B. Cines, Eleanor S. Pollak, Clayton A. Buck, et al., Endothelial Cells in Physiology and in the Pathophysiology of Vascular Disorders // Blood - 1998. - Vol.91 (10). - P.3527-3561).
Для исследования концентрации ДЭК в периферической крови принято пользоваться методикой, предложенной в 1978 г. Hladovec J. (HIadovec J. Circulating endothelial cells as a sign of vessel wall lesions // Physiol. Bohemoslov. - 1978. - Vol.27. - P.140-144). Существующая методика позволяет проводить количественный скрининг содержания ДЭК в периферической крови. Для более точной морфологической идентификации, улучшения качества изображения объекта (ДЭК) и изучения клеточной структуры ДЭК в динамике заболевания, у лиц с различной патологией требуется стабильный способ их фиксации, не искажающий структуру клетки и позволяющий транспортировать препараты с целью консультации, создавать архив препаратов для сравнения изменений в динамике и дальнейшей диагностики, проводить качественное морфологическое исследование окрашенных препаратов.
Технический результат предлагаемого способа заключается в повышении точности морфологической диагностики за счет приготовления препарата ДЭК путем эвапорации жидкой части бестромбоцитарной плазмы с последующей его фиксацией, окраской при соотношении краски азур-II-эозин: дистиллированная вода=1:1 и монтированием на предметные стекла.
Предлагается способ приготовления препаратов ДЭК, дополняющая имеющуюся методику:
1. Венозная кровь в объеме 2 мл забирается в гепаринизированную пробирку.
2. Тромбоцитарная плазма отделяется центрифугированием (1000 оборотов в минуту в течение 10 минут).
3. Тромбоциты отделяются путем добавления раствора АДФ к супернатанту в соотношении 1:4, перемешивания смеси в течение 10 минут и центрифугирования (1000 оборотов в минуту в течение 15 минут).
4. Бестромбоцитарную плазму в объеме 0,01 мл наносят тонким слоем на покровные стекла, помещенные в планшет для культур клеток, и инкубируют в термостате при t=37°C в течение 60 минут до испарения жидкой части плазмы.
5. Полученные препараты фиксируют в чистом метаноле в течение 5 минут или в 1% глутаровом альдегиде на среде 199 в течение 1 суток.
6. Препараты высушивают и окрашивают готовым раствором азур-II-эозина в течение 5 минут (в отличие от традиционного, рекомендуется разведение готовой краски дистиллированной водой в соотношении 1:1).
7. Окрашенные препараты ДЭК монтируют на предметные стекла.
8. Препараты доступны для просмотра под микроскопом.
Пример осуществления изобретения
Для успешного достижения конечной цели - приготовления препаратов ДЭК периферической крови необходимо поэтапно выполнить все вышеуказанные операции, в ходе которых после получения бестромбоцитарной плазмы проводится эвапорации ее жидкой части, препарат фиксируют в чистом метаноле, окрашивают при соотношении краски азур-II-эозин: дистиллированная вода=1:1 и монтируют на предметные стекла. Это позволяет качественно визуализировать препараты ДЭК (фиг.1) по сравнению с имеющейся методикой их идентификации (фиг.2).
Таким образом, предлагаемая методика повышает точность диагностики и расширяет возможности распознавания сосудистого поражения на различных стадиях развития патологического процесса у кардиологических, ревматологических больных и пациентов общетерапевтического профиля с повышенным риском кардиоваскулярной патологии.
Способ приготовления препаратов десквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) периферической крови, включающий отбор венозной крови, ее ценитрифугирование, отделение бестромбоцитарной плазмы с последующим выделением ДЭК, отличающийся тем, что дополнительно наносят бестромбоцитарную плазму на покровное стекло, инкубируют при 37°С 60 мин, фиксируют в метаноле в течение 5 мин или в 1%-ном глутаровом альдегиде на среде 199 в течение 1 сут, окрашивают краской азур-II-эозин в соотношении 1:1 с дистиллированной водой и монтируют на предметные стекла.
