Способ измерения набухания кардиомиоцитов целого сердца при удалении са2+ из внеклеточной среды в эксперименте

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной кардиологии. В эксперименте проводят измерение набухания сердца в бескальциевой среде. При этом непрерывно измеряют диастолическое давление миокарда и рассчитывают набухание по формуле

,

где W - количество воды в миокарде, мл/г сухой массы;

m_wet - масса влажной ткани по окончании бескальциевой перфузии, г;

m_dry - масса сухой ткани, г;

P_diastolic - внутрижелудочковое давление остановленного сердца, мм рт.ст.;

Ро - начальное диастолическое давление, искусственно создаваемое исследователем и обычно равное 20 мм рт.ст. Способ позволяет уменьшить трудозатраты при измерении расчета количества воды в миокарде. 1 табл., 2 ил.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной кардиологии.

Известно, что при проведении бескальциевой кардиоплегии (например, растворами Бретшнейдера) происходит набухание кардиомиоцитов, что является признаком повреждения кардиомиоцитов и угрозой развития послеоперационного инфаркта миокарда. В экспериментах на собаках набухание кардиомиоцитов всегда приводит к развитию острой сердечной недостаточности и даже остановке сердца при хорошо сохраненном уровне макроэргических соединений [1,2,3,4,6,7,8]. Механизм развития набухания кардиомиоцитов в бескальциевой среде до конца не изучен.

При удалении Са²⁺ из внеклеточной среды происходит активирование обмена внутриклеточного Са²⁺ на внеклеточный Na⁺ (Na⁺ - Ca²⁺ обмен). В результате этого внутри клеток увеличивается концентрация Na⁺, повышается осмотическое давление, приводящее к поступлению воды в цитоплазму. Увеличению уровня Na⁺ в клетках способствует уменьшение активности Na⁺,K⁺-АТФазы в результате снижения внеклеточной концентрации Са²⁺[2,3,9].

При набухании кардиомиоцитов происходит увеличение толщины стенок сердца и уменьшение объема желудочков сердца. В эксперименте этот патологический процесс можно зарегистрировать с помощью введенного внутрь желудочков сердца баллончика. При отеке наблюдается увеличение внутрижелудочного давления.

Отек миокарда и набухание кардиомиоцитов можно оценивать, измеряя сухую и влажную массу отдельных участков миокарда, только в определенный момент времени.

Методы, позволяющие зарегистрировать прямую зависимость между интенсивностью отека миокарда и увеличением внутрижелудочкового давления, пока не разработаны.

Отсутствуют также методы, позволяющие оценивать величину набухания кардиомиоцитов целого миокарда непрерывно в течение долгого времени.

Техническим результатом изобретения является разработка способа оценки набухания кардиомиоцитов целого сердца в эксперименте при перфузии сердца бескальциевой средой.

Технический результат изобретения достигается непрерывным измерением величины диастолического давления P_diastolic в миокарде остановленного удалением Са²⁺ сердца с последующим использованием эмпирически выведенной формулы (1)

где W - количество воды в миокарде, мл/г сухой массы;

m_wet - масса влажной ткани по окончании бескальциевой перфузии, г;

m_dry - масса сухой ткани, г;

P_diastolic - внутрижелудочное давление остановленного сердца, мм рт.ст.

Ро - начальное диастолическое давление, искусственно создаваемое исследователем и обычно равное 20 мм рт.ст.

Пример 1

Эксперименты проводились на изолированных сердцах белых крыс линии Wistar. Для этого под эфирным наркозом крыс декапитировали, вскрывали грудную клетку и сердце помещали в охлажденный раствор. Затем сердце перфузировали по методу Лангендорфа оксигенированным раствором (100% О₂) следующего состава (в мМ): NaCl-140; NaH₂PO₄ - 0,5; КСl - 5; трис-ОН-5(рH 7,4); глюкоза - 11; СаСl₂ - 2. В аорту вводили канюлю и со скоростью 10 мл/мин подавали исходный раствор при температуре 37°С в течение 15 минут для стабилизации сократительной функции и показателей энергетического состояния.

Затем сердце перфузировали бескальциевой средой, содержащей 0,5 мМ ЭДТА в течение 10 минут. По окончании перфузии бескальциевой средой через сердце пропускали исходный раствор, содержащий 2,0 мМ Са²⁺.

Для измерения сократительной активности миокарда и диастолического давления левого желудочка в полость левого желудочка вводили латексный баллончик, заполненный жидкостью. Измерение давления в левом желудочке проводили в изоволюмическом режиме. Сигнал, полученный электроманометром фирмы «Bentley lab. Europe» от латексного баллончика, передавался на электронный потенциометр Н-3030/6.

Содержание миоглобина в оттекающем перфузионном растворе оценивали спектрофотометрически [5].

Концентрацию Ca²⁺ в растворах контролировали с помощью ионоселективного электрода ЭИ-Са-01 и электронного потенциометра ВЛ-750.

Для оценки глубины повреждения кардиомиоцитов при "кальциевом парадоксе" измеряли концентрацию в оттекающем растворе миоглобина.

Величину набухания кардиомиоцитов дискретно через 1 мин, 2 мин, 3 мин, 5 мин, 7 мин, 9 мин, 10 мин бескальциевой перфузии (n=10 в каждый период времени) оценивали по накоплению воды в ткани сердца, определяя содержание воды в миокарде, соотнесенное на 1 грамм сухой массы. Для этого образцы сердечной мышцы высушивали при 100° в течение 24 часов. При этом использовали формулу (2)

где W - количество воды в миокарде, мл/г сухой массы; m_wet - масса влажной ткани, г; m_dry - масса сухой ткани, г.

Полученные данные по двум различным формулам (1 или 2) были сравнены с использованием критерия t Стьюдента и анализа вариации ANOVA.

Измерение количества воды в миокарде по формуле (1) показало, что интактное сердце содержит 1,96±0,05 мл/г сухой массы (n=10). Последующая перфузия сердца бескальциевой средой, содержащей 0,5 мМ ЭДТА, приводила к прогрессивному увеличению количества воды в миокарде. Учитывая, что в каждой момент времени проведено измерение количества воды не менее чем в 10 сердцах, всего измерений проведено на 70 изолированных сердцах. Количество миоглобина, потерянного сердцем при реперфузии Ca²⁺ содержащей средой составило 497,9±25,3 мкг/г сухой массы.

Во второй серии экспериментов измеряли диастолическое давление в левом желудочке до и во время перфузии сердца бескальциевой средой (фиг.1). Спустя уже 1 минуту от начала перфузии сердца бескальциевым раствором отмечается повышение диастолического давления (фиг.1), которое измеряли на 1-й, 2-й, 3-й, 5-й, 7-й, 9-й, 10-й минуте перфузии.

К 10-й минуте перфузии диастолическое давление достигало 76 мм рт.ст. (фиг.1). Расчеты набухания кардиомиоцитов по диастолическому давлению во второй серии экспериментов приведены в таблице 1. На фиг.2 представлена корреляционная зависимость между диастолическим давлением левого желудочка, перфузированного бескальциевой средой, и содержанием воды в миокарде, измеренного традиционным методом. Количество миоглобина, потерянного сердцем при реперфузии Са²⁺ содержащей средой, составило 449,6±52,5 мкг/г сухой массы (р<0,5 по сравнению с серией экспериментов 1).

Сравнение найденного экспериментально и рассчитанного по формуле (1) количества воды достоверно не отличается от количества воды в миокарде, рассчитанного по формуле (2) (см. табл.1).

Таблица 1

Динамика увеличения количества воды в миокарде, измеренного

традиционным методом и путем расчета по диастолическому давлению.

Время перфузии бескальциевой средой, мин	Серия 1	Серия 2	Достоверность ошибки отличий между сериями 1 и 2
Количество воды, рассчитанное по величине диастолического давления (n=10-19) по формуле 1	Количество воды, измеренное дискретно (n=10)по формуле 2
0 (до перфузии)	1,96±0,05	1,96±0,049	p<0,5
1	3,24±0,06	2,83±0,020	p<0,5
3	4,14±0,05	3,56±0,045	p<0,5
5	4,80±0,05	4,37±0,050	p<0,5
7	5,37±0,08	5,39±0,045	p<0,5
9	6,54±0,08	6,50±0,030	p<0,5
10	7,51±0,07	7,51±0,046	p<0,5

Цитированные первоисточники

[1]. Alto L.E., Dhalla N.S. Myocardial cation contents during induction of calcium paradox. Am. J. Physiol. 237.:H713-H719. 1979.

[2]. Bhojani I.H., Chapman R.A. The effect of bathing sodium ions upon the intracellular sodium activity in calcium - free media and the calcium paradox of isolated ferret ventricular muscle. 22.:507-522. 1990.

[3]. Blaustein M.P. Sodium-calcium exchange in the smooth muscles. Oxford Univ. Press.: 208-232. 1989.

[4]. Bretschneider H.-J., Hebhard M.M., C.J. Preusse. Cardioplegia. Principles and problems. In: Physiology and pathophysiology of the heart. Ed. N. Sperelakis. 605-616. 1984.

[5]. Busselen P. The effect of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pfluger's Arch. European J. Physiol. 408.:458-464. 1987.

[6]. Chapman R.A., Tunstall J. The calcium paradox of the heart. Prog.Biophys. Mol. Biol. 50.:67-96. 1987.

[7]. Dhalla N.S., Singh J.N., McNamara D.B., Bematsky A., Sing A., Harrow J.A.C. Energy production and utilization in contractile failure due to intracellular calcium overload. Myocardial injury. Proc.4 Meeting Annual. American Section International Society Heart Research. 1983. P.303.

[8]. Hearse D.J., Braimbridge M.V., Jynge P. Protection of the ischemic myocardium. Cardioplegia. Raven Press. London. 1981.

[9]. Lamers J.M.J., Stinis J.T., Ruigrok T.J.C. Biochemical properties of membranes isolated from calcium - depleted hearts. Circ. Res. 54. - P.217-226. 1984.

Способ измерения набухания сердца в бескальциевой среде в эксперименте, отличающийся тем, что непрерывно измеряют диастолическое давление миокарда и рассчитывают набухание по формуле

где W - количество воды в миокарде, мл/г сухой массы;
m_wet -масса влажной ткани по окончании бескальциевой перфузии, г;
m_dry - масса сухой ткани, г;
P_diastolic - внутрижелудочное давление остановленного сердца, мм рт.ст.;
Ро - начальное диастолическое давление, искусственно создаваемое исследователем и обычно равное 20 мм рт.ст.