Способ прижизненного исследования фотосенсибилизаторов

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может использоваться для исследования фармакокинетики фотосенсибилизаторов на мелких лабораторных животных. Способ позволяет прижизненно и неинвазивно исследовать селективность накопления фотосенсибилизаторов разной химической природы в опухолевой ткани и получать сведения об их диагностических и фармакокинетических характеристиках на основе анализа флюоресценции всей опухоли. Проводят исследование фотосенсибилизаторов путем моделирования у экспериментального животного опухоли, введения фотосенсибилизатора, исследование накопления его в опухоли с помощью флюоресценции. При этом в качестве модели опухоли используют рак шейки матки или карциному легких Льюис при условии отсутствия в карциноме видимых некрозов. Опухоль прививают в организм в любой участок за исключением области брюшной полости и позвоночника. Регистрацию флюоресценции проводят методом диффузионной флюоресцентной томографии с использованием прибора, в котором источник и приемник расположены в конфигурации «на просвет». 7 ил.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для исследования фармакокинетики фотосенсибилизаторов на мелких лабораторных животных.

Выполнение исследований на опухолевых моделях животных in vivo является неотъемлемым этапом в доклиническом изучении новых фармакологических препаратов.

В последние десятилетия все большее развитие получают флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия рака, основанные на применении фотосенсибилизаторов. При этом способность фотосенсибилизаторов флюоресцировать лежит в основе диагностики опухолей и служит для контроля накопления и выведения из тканей, а инициированные ими свободно-радикальные реакции обеспечивают противоопухолевый эффект. Ключевыми свойствами фотосенсибилизатора, определяющими эффективность флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии, являются высокая селективность накопления в опухоли, быстрое выведение из нормальных тканей, интенсивное поглощение и флюоресценция в красной или ближней инфракрасной области спектра.

Необходимость изучения селективности накопления фотосенсибилизаторов в опухолевой ткани обусловлена стремлением минимизировать повреждение окружающих нормальных тканей, а исследование основных элементов их фармакокинетики (время задержки в организме, динамика накопления в опухоли, время выведения из опухолевой ткани) требуется для выявления опасности фототоксической реакции и оптимизации режимов лазерного воздействия при фотодинамической терапии.

Современные методы флюоресцентного анализа предназначены для визуализации флюоресценции или регистрации спектров с поверхности биоткани in vivo или исследования флюоресценции образцов биоткани ех vivo. В настоящее время для исследования селективности накопления фотосенсибилизаторов в опухоли и их фармакокинетики используются спектрофотометрия, микроспектрометрия, флюоресцентная спектроскопия, флюоресцентная микроскопия и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Спектрофотометрия позволяет определять концентрацию фотосенсибилизаторов в гомогенизированных образцах органов и тканей [1, 2]. Применение микроспектрометрии описано для измерения интенсивности флюоресценции, внутриклеточной концентрации флюорофора и его спектральных характеристик в единичных клетках и тканевых срезах [3]. Метод локальной флюоресцентной спектроскопии активно используется для точечного измерения флюоресцентного сигнала с поверхности изолированных органов и тканей [4, 5]. Спектроскопические методы характеризуются высокой чувствительностью, но требуют большого количества животных и не всегда точны в определении количественного содержания фотосенсибилизаторов в тканях. С меньшими затратами времени и на меньшем числе животных выявить особенности и механизм накопления фотосенсибилизаторов позволяют методы флюоресцентной микроскопии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии [6].

Существенным недостатком существующих методов является необходимость умерщвления животного. Очевидно, что любые манипуляции, нарушающие естественные физиологические условия или состояние органа или ткани (извлечение, заморозка, хранение, гомогенизация и т.д.) могут привести к изменению фотохимических свойств и распределения фотосенсибилизатора и ошибкам в интерпретации результатов.

К сожалению, современная экспериментальная онкология ощущает недостаток методов прижизненного и неинвазивного наблюдения флюоресценции фотосенсибилизаторов на уровне целого организма.

Наиболее близким аналогом разработанного способа по решаемой задаче и совокупности сходных существенных признаков является способ прижизненного исследования флюоресценции фотосенсибилизаторов в биологических тканях методом локальной флюоресцентной спектроскопии, выбранный в качестве прототипа [7]. При этом производиться регистрация обратно отраженного, обратно рассеянного и флюоресцентного излучений. Уровень флюоресценции, определяющий содержание фотосенсибилизатора в тканях, оценивается по отношению площадей под пиком флюоресценции и под пиком отраженного лазерного излучения. При исследовании флюоресценции in vivo спектры регистрируют локально, контактным способом, подводя световод к коже над опухолью под прямым углом. При этом величина сигнала отраженного лазерного излучения зависит от многих факторов: степени пигментации анализируемого объекта, рельефа поверхности анализируемого объекта, пространственного положения световода в момент регистрации спектра. Глубина залегания опухоли и ее гистологические характеристики также влияют на результат. Показано, что уровень флюоресценции при регистрации спектров через кожу в 1,5-2 раза ниже, чем при регистрации с поверхности опухоли ех vivo. Поэтому многие исследователи находят более целесообразной регистрацию флюоресценции фотосенсибилизаторов в опухоли и нормальных органах и тканях ех vivo.

Таким образом, способ-прототип имеет ограниченные возможности, т.к. фактически позволяет проводить исследования только с поверхности тканей и только локально, точечно. Локальное исследование опухоли недостаточно, поскольку распределение фотосенсибилизатора в опухоли неравномерно ввиду того, что опухоль имеет сложную гистологическую структуру.

В задачу предлагаемого изобретения положено:

1) обеспечение возможности исследования флюоресценции не только в поверхностных слоях тканей, но и в глубине;

2) обеспечение возможности исследования всей опухоли, а не только локальных участков.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве модели опухоли используют рак шейки матки или карциному легких Льюис при условии отсутствия в карциноме видимых некрозов, при этом опухоль прививают в организм в любой участок, за исключением области брюшной полости и позвоночника, регистрацию флюоресценции проводят методом диффузионной флюоресцентной томографии с использованием прибора, в котором источник и приемник расположены в конфигурации «на просвет».

Известен метод диффузионной флюоресцентной томографии (ДФТ), предназначенный для получения in vivo информации о флюоресцирующих объектах в биоткани на глубине до нескольких сантиметров с миллиметровым разрешением на основе обработки сигнала от прошедшего через ткань лазерного излучения. Необходимым условием визуализации опухолей методом ДФТ является флюоресцентное маркирование опухолевой ткани. Потенциальными агентами для флюоресцентной визуализации опухолей являются органические фотосенсибилизаторы. Однако метод ДФТ не находит применения в доклинических испытаниях фотосенсибилизаторов в связи с отсутствием адекватной модели исследования.

Традиционно в качестве экспериментальных новообразований при изучении новых фотосенсибилизаторов используются опухоли мышей: лимфолейкоз Р388, карцинома легких Льюис, меланома В 16, аденокарцинома толстой кишки Соlо26, рак шейки матки РШМ-5, карцинома Эрлиха, аденокарцинома молочной железы Са 755, саркома 37 и др. [8].

Характерно, что фотосенсибилизаторы накапливаются в экспериментальных опухолях различного гистогенеза и удерживаются в них дольше, чем в окружающих тканях. При этом отмечаются общие закономерности в фармакокинетике фотосенсибилизаторов у животных с некоторыми опухолями. Указанные экспериментальные опухоли отличатся друг от друга не только гистологической природой, но и характером роста, формой опухолевых очагов, их структурой, степенью некротизации.

В предлагаемом изобретении впервые в результате проведенных эмпирических исследований были сформулированы следующие требования к экспериментальной опухоли, которые делают ее оптимальной для визуализации методом ДФТ: способность селективно накапливать фотосенсибилизаторы разной химической природы, солидный характер роста, возможность трансплантации на любой участок тела, отсутствие крупных некрозов, медленная скорость роста, формирование объемных шарообразных опухолевых узлов. Таким требованиям отвечает, например, рак шейки матки РШМ-5. Данная опухоль перевивается по стандартной общепринятой для солидных перевиваемых опухолей методике мышам-самкам линии СВА путем подкожной трансплантации ex tempore взвеси опухолевых клеток или ткани опухоли в питательной среде 199 или изотоническом (0,9%) растворе хлористого натрия, полученных от донора (мыши-опухоленосителя линии СВА).

В ходе специально проведенных авторами данной заявки экспериментов было установлено, что подходящими моделями опухолей для исследования методом ДФТ являются рак шейки матки и карцинома легких Льюис при условии отсутствия в карциноме видимых некрозов. Подробно эти эксперименты описаны далее в примере эксперимента №1, подтверждающем существенность отличительных признаков.

Нами установлено, что локализация экспериментальной опухоли должна быть такой, чтобы ее проекция на получаемых двумерных изображениях не пересекалась с проекцией органов брюшной полости и позвоночника. Это обусловлено тем, что фотосенсибилизаторы накапливаются не только в опухоли, но и в нормальных органах и тканях, что приводит к появлению на изображениях дополнительных флюоресцирующих очагов в области брюшной полости. Расположение опухоли в проекции брюшной полости может вызвать затруднения в идентификации ее формы и размеров, а также оценке интенсивности флюоресцентного сигнала на изображениях. Позвоночник является непрозрачным для возбуждающего излучения ДФТ-устройства, поэтому визуализация опухоли (или ее части), расположенной на позвоночнике, невозможна. Более подробно эти результаты изложены в примере эксперимента №2, подтверждающем существенность отличительных признаков.

Для получения прижизненных флюоресцентных изображений используют флюоресцентный диффузионный томограф, удовлетворяющий следующим условиям. Облучение объекта производится на длине волны возбуждения фотосенсибилизатора. Источники зондирующего излучения находятся в диапазоне 630-680 нм. Излучение от лазерного источника и вызываемая им флюоресценция регистрируются приемником, расположенным с противоположной стороны объекта (конфигурация «на просвет»). Таким условиям удовлетворяет, например, диффузионный флюоресцентный томограф ДФТ-2М, описанный в (МПК⁷ А61В 5/00. Устройство получения флуоресцентных томографических изображений. Заявка 2006124041/14 (22) от 2006.07.06).

Описанная модель позволяет наблюдать прижизненно динамику накопления фотосенсибилизаторов в опухоли и их выведения из окружающих тканей. Наиболее эффективны для визуализации методом ДФТ фотосенсибилизаторы, имеющие максимальное поглощение и флюоресценцию в красной области спектра, где биологические ткани обладают наибольшей прозрачностью. С одной стороны это открывает возможность визуализации более глубоко локализованных опухолей, а с другой - позволяет избежать эффекта автофлюоресценции биологических тканей. Известно, что эндогенная флюоресценция биологических тканей в красной области спектра крайне мала [9]. Поэтому регистрируемая флюоресценция в данной области может быть обусловлена только экзогенными маркерами, а получаемые ДФТ-изображения дают прямую информацию о накоплении фотосенсибилизаторов и их фармакокинетике.

Разработанная модель показала свою эффективность на фотосенсибилизаторах второго поколения разной химической природы (фталоцианины, хлорины, 5-алк-индуцированный протопорфирин IX), которые в настоящее время применяются в клинической практике для флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии рака. Данные о фармакокинетике фотосенсибилизаторов, в частности о динамике накопления в опухоли, подтверждаются методами флюоресцентной спектроскопии и конфокальной флюоресцентной микроскопии и совпадают с данными литературы.

В ходе разработки предлагаемой модели было обнаружено, что метод ДФТ является высокочувствительным и детектирует флюоресценцию фотосенсибилизаторов в организме животного при использовании их в терапевтических концентрациях и даже меньше таковых. Так эффективная для визуализации опухоли доза препарата Фотосенс составляла 1 мг/кг, что ниже терапевтической дозы (>2 мг/кг), указанной в работах [1, 8]. Минимизация концентрации фотосенсибилизатора, который в данном случае используется для контрастирования опухоли, является особо важной, т.к. снижает фототоксическое влияние и фармакологическую нагрузку на организм.

Представляется перспективным использование модели для прижизненного исследования селективности накопления в опухоли и фармакокинетики новых фотосенсибилизаторов.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

При подготовке к исследованию в случае необходимости проводят депиляцию тела животного или части тела. Моделируют опухоль путем трансплантации животному суспензии опухолевой ткани. Затем животному вводят раствор фотосенсибилизатора (внутривенно, перорально или внутрибрюшинно). Размер опухоли на момент первого сканирования должен составлять не менее 5 мм, т.к. концентрация фотосенсибилизатора в опухоли меньшего размера недостаточна для обеспечения высокого контраста с окружающими тканями. Используют диффузионный флюоресцентный томограф ДФТ-2М. Первое изображение получают до введения фотосенсибилизатора. Данное изображение служит контролем. Далее получают флюоресцентные изображения путем сканирования интересующей области через разные интервалы времени. На изображениях светлые оттенки соответствуют высокой интенсивности флюоресцентного сигнала, темные оттенки - низкой. Время максимального накопления фотосенсибилизатора в опухоли оценивается визуально по интенсивности сигнала в области опухолевого очага.

Приводим описание фигур, иллюстрирующих предлагаемый способ.

На фиг.1 приведены двумерные флюоресцентные изображения мыши без опухоли:

фиг.1А - мышь in vivo без фотосенсибилизатора (контроль);

фиг.1Б - мышь in vivo через 3 ч после внутривенного введения фотосенсибилизатора Фотосенс в дозе 1 мг/кг.

На фиг.2 (А, Б, В) приведены прижизненные двумерные флюоресцентные изображения различных экспериментальных опухолей:

фиг.2А - рак шейки матки РШМ-5;

фиг.2Б - карцинома легких Льюис LLC;

фиг.2В - карцинома Эрлиха.

На фиг.2 (А, Б, В) цифрами обозначено: 1 - типичная растущая опухолевая ткань, 2 - зона некроза.

На фиг.3 приведены типичные фотографии мышей с опухолями, трансплантированными в область лопатки:

фиг.3А - рак шейки матки РШМ-5;

фиг.3Б - карцинома легких Льюис LLC;

фиг.3В - карцинома Эрлиха.

На фиг.4 продемонстрирован прижизненный мониторинг накопления фотосенсибилизатора (5-алкиндуцированного протопорфирина IX) в опухоли РШМ-5:

фиг.4А - контроль до введения препарата Аласенс;

фиг.4Б - через 1 ч после введения;

фиг.4В - через 3 ч после введения;

фиг.4Г - через 5 ч после введения;

фиг.4Д - через 24 ч после введения.

На фиг.5 (А, Б, В, Г, Д, Е) приведены результаты исследования селективности накопления фотосенсибилизатора в опухоли разными методами:

фиг.5А, Б - методом диффузионной флюоресцентной томографии, in vivo (область опухоли выделена пунктиром);

фиг.5А - контроль без фотосенсибилизатора;

фиг.5Б - в максимуме накопления фотосенсибилизатора. 2 ч после внутривенного введения фотосенса в дозе 1 мг/кг;

фиг.5В, Г - методом флюоресцентной спектроскопии, ех vivo;

фиг.5Д, Е - методом конфокальной флюоресцентной микроскопии, ех vivo.

На фиг.6 приведены двумерные прижизненные изображения мыши с опухолью РШМ-5:

фиг.6А - контроль без фотосенсибилизатора;

фиг.6Б - в максимуме накопления фотосенсибилизатора. 4 ч после внутривенного введения фотодитазина в дозе 25 мг/кг.

На фиг.7 приведены двумерные прижизненные изображения мыши с опухолью РШМ-5:

фиг.7А - контроль без фотосенсибилизатора;

фиг.7Б - в максимуме накопления 5-алк-индуцированного протопорфирина IX. 6 ч после перорального введения в дозе 400 мг/кг.

На фиг.6 (А, Б), 7 (А, Б) область опухоли выделена пунктиром.

Примеры экспериментов, подтверждающие существенность отличительных признаков

Пример эксперимента №1.

Определение оптимального места трансплантации экспериментальной опухоли. Выполнено на здоровых мышах линии СВА. Животному вводили фотосенсибилизатор Фотосенс внутривенно в дозе 1 мг/кг. На диффузионном флюоресцентном томографе in vivo получали изображения до введения фотосенсибилизатора (контроль) и через 3 ч после введения. В качестве источника облучения использовался полупроводниковый лазер с длиной волны 635 нм и мощностью на объекте 10 мВт. Для разделения спектров возбуждения и флюоресценции использовался фильтр HQ 710/50. Область сканирования составляла 30×40 мм. Контрольное изображение выглядит темным, имеет низкую интенсивность сигнала (фиг.1А). После введения фотосенса на полученных изображениях отмечается обширное свечение в виде области с высокой или средней интенсивностью сигнала в проекции брюшной полости (фиг.1Б). Это связано с накоплением фотосенсибилизатора во внутренних органах. Установлено, что позвоночник непрозрачен для возбуждающего излучения, поскольку интенсивность сигнала в его проекции крайне низкая и не превышает фоновой интенсивности (10-15 отн. ед.). На основании полученных результатов сделано заключение, что идентификация опухоли, трансплантированной в область брюшной полости, будет затруднена в связи с высоким уровнем флюоресценции других органов. Визуализация опухоли, трансплантированной в область позвоночника, методом ДФТ невозможна.

Пример эксперимента №2.

Подбор оптимальной экспериментальной опухоли для исследования селективности накопления фотосенсибилизаторов методом ДФТ. Использовано 3 типа перевиваемых опухолей мышей с солидным характером роста: рак шейки матки РШМ-5, карцинома легких Льюис LLC и карцинома Эрлиха. Данные типы опухолей в настоящее время широко используются в России для испытания новых фотосенсибилизаторов и противоопухолевых препаратов. Двумерные флюоресцентные изображения получали на диффузионном флюоресцентном томографе с техническими параметрами, указанными в примере 1. Опухоли прививали в подлопаточную область спины животного путем подкожной инъекции взвеси опухолевой ткани. Исследование начинали, когда наибольший линейный размер опухолей составлял не менее 5 мм. Фотосенсибилизаторы использовали в концентрациях: фотосенс 1 мг/кг, фотодитазин 25 мг/кг, аласенс 400 мг/кг.

Избирательное накопление фотосенсибилизаторов опухолевой тканью приводит к визуализации опухолей на изображениях. Установлено, что карцинома легких Льюис и карцинома Эрлиха рано некротизируются с образованием на поверхности геморрагических корочек, не пропускающих возбуждающее излучение (фиг.3). Зоны некроза на изображениях выглядят как темные области с низкой интенсивностью сигнала и затрудняют оценку селективности накопления фотосенсибилизатора (фиг.2Б). Карцинома легких Льюис отличается высокой скоростью роста, что, с одной стороны, нежелательно при исследовании фотосенсибилизаторов с длительным периодом накопления (более 24 ч). Существенным недостатком карциномы Эрлиха является то, что она представляет собой довольно плоское новообразование, не образует объемных узлов (фиг.2 В). Тогда как рак шейки матки растет медленно, как правило, не имеет крупных видимых некрозов и формирует шарообразные узлы. Изображение рака шейки матки всегда более-менее светлое, однородное (фиг.2А). Считаем, что рак шейки матки является оптимальной экспериментальной опухолью для проведения исследований фотосенсибилизаторов методом ДФТ. Использование карциномы легких Льюис требует тщательного отбора опухолей без некроза.

Примеры конкретного осуществления способа

Пример 3.

Наблюдение динамики накопления фотосенсибилизатора в опухоли. Моделью для исследования служила экспериментальная опухоль рак шейки матки, трансплантированная в область лопатки мышам линии СВА. Сканирование в ДФТ-установке проводили in vivo до введения препарата (контроль) и далее каждые 30 мин по достижении максимума накопления фотосенсибилизатора в опухоли. Максимум оценивался по возрастанию интенсивности сигнала в зоне опухолевого очага. Препарат Аласенс (5-аминолевулиновая кислота, 5-алк) вводили перорально в дозе 400 мг/кг.

На контрольном изображении область опухоли выглядит темной, т.к. флюоресценция отсутствует (фиг.4А). После введения аласенса область опухоли становится более светлой уже через 30 мин в связи с селективным накоплением эндогенного фотоактивного соединения 5-алк-индуцированного протопорфирина IX (фиг.4Б). Постепенно контраст опухоли увеличивается и достигает максимума к 4-5 ч после введения (фиг.4В, 4Г). При дальнейшем наблюдении интенсивность сигнала в опухоли не изменяется до 7 ч после введения аласенса. К 24 ч наблюдения отмечается значительное снижение интенсивности сигнала в опухоли в связи с выведением фотосенсибилизатора.

Пример 4.

Исследование селективности накопления фотосенсибилизаторов с помощью предлагаемого изобретения и подтверждение результата стандартными методами. Использовали модель исследования, ДФТ-устройство и схему сканирования, описанные в примере 3. Опухоль РШМ-5 была трансплантирована под лопатку мышам линии СВА. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Перед началом исследования с тела животного в области сканирования удалялся волосяной покров путем машинной стрижки и последующей обработки кремом для депиляции. В качестве источника облучения использовался полупроводниковый лазер с длиной волны 635 нм и мощностью на объекте 10 мВт. Для разделения спектров возбуждения и флюоресценции использовался фильтр HQ 710/50. Приемником служил высокочувствительный охлаждаемый ФЭУ. Сканирование осуществлялось путем пошагового синхронного перемещения источника и приемника, расположенных в конфигурации «на просвет», шаг сканирования 1 мм. Для процедуры сканирования животное фиксировалось на специальной подставке между двумя стеклянными пластинами с легким прижатием (расстояние между пластинами 1.2 мм). Область сканирования составляла 30×30 мм. Первое изображение (контроль) получали до введения фотосенсибилизатора, последующие - каждые 30 мин in vivo до достижения максимума накопления фотосенсибилизатора в опухоли. По достижении максимума проводили эвтаназию животного под наркозом и анализировали флюоресценцию образцов опухолевой ткани ех vivo методами флюоресцентной спектроскопии и лазерной конфокальной флюоресцентной микроскопии.

Пример 4.1. Фотосенсибилизатор Фотосенс. Фотосенс представляет собой раствор смеси натриевых солей сульфированного фталоцианина алюминия. Исследование начали на 16-й день после перевивки опухоли. Максимальный линейный размер опухоли на момент первого сканирования составлял 2 см. Фотосенс вводили внутривенно в дозе 1 мг/кг. Максимум накопления фотосенса в опухоли составлял 2-3 ч. В отдельных случаях накопление происходило только к 24 ч. В максимуме накопления фотосенса опухоль всегда выглядит очень светлой, контрастной по отношению к окружающей ткани, имеет высокую интенсивность сигнала (фиг.5Б). Если в контроле интенсивность сигнала в опухоли составляла порядка 35-40 отн.ед., то в максимуме накопления фотосенса - 1600-1800 отн.ед. Очень высокая интенсивность сигнала в опухоли, связанная с накоплением фотосенса, обусловлена особенностями флюоресцентных свойств препарата, в частности высоким квантовым выходом флюоресценции. Показано, что фотосенс успешно детектируется в организме животного предлагаемым способом в концентрациях минимум в 2 раза меньше терапевтических, которые составляют >2 мг/кг. Спектр флюоресценции опухолевой ткани с фотосенсом имеет характерную форму с пиком на 685 нм и максимальным значением интенсивности порядка 10000 отн.ед. Интенсивность флюоресценции опухолевой ткани без фотосенса составляла не более 50 отн.ед. (фиг.5 В, Г). На микрофотографиях отмечается интенсивная флюоресценция фотосенсибилизатора в опухолевых клетках (фиг.5 Д, Е). Таким образом, удалось установить in vivo, что фотосенсибилизатор Фотосенс селективно накапливается в экспериментальной опухоли. Максимум накопления в опухоли достигается к 2-24 ч. Характерно, что фотосенс длительно удерживается в опухолевой ткани. Максимальный сигнал сохраняется до 72 ч наблюдения, затем отмечается снижение.

Пример 4.2. Фотосенсибилизатор Фотодитазин. Фотодитазин - глюкаминовая соль хлорина Е6. Исследование начали на 13-й день после перевивки опухоли. Максимальный линейный размер опухоли на момент первого сканирования составлял 1.3 см. Фотодитазин вводили внутривенно в дозе 25 мг/кг. Данная концентрация фотодитазина в пересчете на животное массой 21-22 г является терапевтической. Отмечено стабильное селективное накопление фотодитазина в опухоли с достижением максимума к 2-3 ч после введения (фиг.6). Значения сигнала в опухоли ниже, чем при применении фотосенса и составляют в максимуме 2000-2300 отн.ед. (та же опухоль в контроле до введения препарата 120-150 отн.ед.). Фотодитазин удерживается в опухоли в течение 6-7 ч, затем начинается выведение. Результаты исследования подтверждены флюоресцентной спектроскопией и конфокальной флюоресцентной микроскопией. Спектры флюоресценции опухолевой ткани ex vivo с фотодитазином имеют характерную форму с максимумом порядка 1500 отн.ед. на 675 нм. Методом конфокальной флюоресцентной микроскопии обнаружена флюоресценция фотодитазина в опухолевой ткани.

Пример 4.3. Фотосенсибилизатор - 5-алк-индуцированный протопорфирин IX. Исследование начали на 13-й день после перевивки опухоли. Максимальный линейный размер опухоли на момент первого сканирования составлял 1 см. Аласенс вводили мышам перорально в терапевтической дозе 400 мг/кг.Прижизненно с помощью предлагаемой модели было детектировано селективное накопление фотосенсибилизатора в опухоли. Установлено, что время максимальной флюоресценции опухоли, т.е. максимум накопления фотосенсибилизатора, приходится на период 4-7 ч после введения аласенса (фиг.7). Интенсивность сигнала в опухоли при этом составляла 750-900 отн.ед. (та же опухоль в контроле до введения препарата 65-90 отн.ед.). В дальнейшем интенсивность сигнала в опухоли снижается. Стандартными методами флюоресцентной спектроскопии и конфокальной флюоресцентной микроскопии подтверждено накопление в опухоли 5-алк-индуцированного протопорфирина IX. Спектры опухолевой ткани ех vivo имели характерную для протопорфирина IX форму с максимумом порядка 2000 отн. ед. на 705 нм.

Таким образом, нами показано, что разработанная модель оптимально подходит для прижизненного исследования селективности накопления в опухоли органических фотосенсибилизаторов разной химической природы при использовании их в терапевтических концентрациях и даже меньше таковых. Избирательное накопление фотосенсибилизаторов опухолевой тканью и их флюоресценция приводят к возрастанию сигнала в проекции опухоли на изображениях. Получаемые изображения позволяют оценивать флюоресценцию фотосенсибилизаторов в опухоли и на основании полученных данных делать заключения о диагностических свойствах фотосенсибилизатора. Также с помощью предлагаемой модели возможен подбор и оценка концентраций фотосенсибилизаторов с точки зрения их эффективности для визуализации опухолей.

Прижизненный мониторинг фотосенсибилизаторов в опухоли дает информацию о фармакокинетике препаратов: времени начала поступления в опухоль, периоде максимального накопления, времени выведения. Это открывает возможность определения оптимального времени для наиболее эффективного лазерного воздействия при проведении фотодинамической терапии. Важно, что исследование фотосенсибилизаторов предлагаемым способом выполняется прижизненно на одном и том же животном и позволяет выявить индивидуальные особенности. Считаем, что предлагаемое изобретение может стать незаменимым инструментом при доклиническом изучении новых фотосенсибилизаторов и позволит в более короткое время и на ограниченном числе животных получить высокоинформативные сведения об основных биологических характеристиках новых фотосенсибилизаторов.

Литература

1. Смирнова З.С., Оборотова Н.А., Макарова О.А. и др. Эффективность и фармакокинетика липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора "Фотосенс" на основе сульфофталоцианина алюминия // Химико-фармацевтический журнал. - 2005 - Т.39. - №7. - С.3-6.

2. Schneckenburger H., Lang M., Kollner Т. et. al. Fluorescence spectra and microscopic imaging of porphyrins in single cells and tissues // Lasers in Medical Science. - 1989. - V.4. - №159. - P.159-166.

3. Назарова А.И., Феофанов А.В., Кармакова Т.А. и др. Влияние заместителей на фотохимические и биологические свойства 13,15-N-циклоимидных производных хлорина р6. // Биоорганическая химия. - 2005. - Т.31. - №5. - С.1-14.

4. Bulgakova N.N., Kazachkina N.L, Sokolov V.V., Smirnov V.V. Local fluorescence spectroscopy and detection of malignancies using laser excitation at various wavelengths // Laser Physics. - 2006. - V.16. - №5. - P.889-895.

5. Loschenov V.В., Konov V.I., Prokhorov A.M. Photodynamic therapy and fluorescence diagnostics // Laser Physics. - 2000. - V.10. - №6. - P.1188-1207.

6. Peary G.M., Krasieva Т.В., Tromberg B.J., et. al. Variation in the distribution of a phthalocyanine photosensitizer in naturally occurring tumors of animals // J. Photochem. Photobiol. - 1995. - V.27. - P. 271-277.

7. Фомина Г.И. Изучение новых фотосенсибилизаторов, предназначенных для флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии опухолей // Автореф. дис.... канд. биол. наук. M., 2001, 33 с.

8. Морозова H.Б., Якубовская Р.И., Деркачева В.M., Лукъянец Е.А. Биораспределение препарата фталосенса у интактных животных и животных с опухолями различного гистогенеза // Российский онкологический журнал. - 2007. - №1. - С.37-43.

9. Чиссов В.И., Соколов В.В., Булгакова H.H., Филоненко Е.В. Флуоресцентная эндоскопия, дермаскопия и спектрофотометрия в диагностике злокачественных опухолей основных локализаций // Российский биотерапевтический журнал. - 2003. - Т.2. - №4. - С.45-56.

Способ прижизненного исследования фотосенсибилизаторов, включающий моделирование у экспериментального животного опухоли, введения фотосенсибилизатора, исследование накопления фотосенсибилизатора в опухоли путем регистрации флюоресценции, отличающийся тем, что в качестве модели опухоли используют рак шейки матки или карциному легких Льюиса при условии отсутствия в карциноме видимых некрозов, при этом опухоль прививают в организм в любой участок за исключением области брюшной полости и позвоночника, регистрацию флюоресценции проводят методом диффузионной флюоресцентной томографии с использованием прибора, в котором источник и приемник расположены в конфигурации «на просвет».