Набор реагентов для определения активности панкреатической -амилазы


 


Владельцы патента RU 2417373:

Закрытое акционерное общество "Вектор-Бест" (RU)

Изобретение относится к области медицины и касается набора реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы, включающего реагент 1, содержащий хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, водорастворимую соль кальция, моноклональные антитела к слюнной α-амилазе (MAT), 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду и реагент 2, содержащий 2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозит (GalG2CNP), MES и воду, отличающегося тем, что реагент 1 дополнительно содержит EDTA и бычий сывороточный альбумин (БСА), а в качестве соли кальция - ацетат кальция, а реагент 2 дополнительно содержит EDTA и азид натрия, при указанном в формуле изобретения соотношении компонентов. Предложенный набор реагентов обладает повышенной стабильностью при сохранении высокой точности и воспроизводимости результатов анализа. 1 табл.

 

Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к созданию реагентов, позволяющих определять активность панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.

Наиболее распространенным для определения активности панкреатической α-амилазы является метод, одобренный Международной федерацией клинической химии (IFCC), с использованием в качестве субстрата 4,6-ethylidene-(G7)-p-nitrophenil-(G1)-α,D-maltoheptaoside (4,6-этилден-(G7)-п-нитрофенил-(G1)-α,D-мальтогептазид; Et-G7PNP). Первой стадией реакции является селективное ингибирование активности слюнного изофермента α-амилазы с помощью моноклональных антител (MAT) к слюнной α-амилазе. Оставшаяся активной панкреатическая α-амилаза расщепляет Et-G7PNP до G2PNP, G3PNP, G4PNP, Et-G3, Et-G4 и Et-G5. После этого α-глюкозидаза гидролизует G2PNP, G3PNP и G4PNP с образованием глюкозы и окрашенного вещества п-нитрофенола. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности панкреатической α-амилазы в образце (Kruse-Jarres J.D., Kaiser С., Hafkenscheid J.С.М. et al. Evaluation of a new α-amylase assay using 4,6-ethylidene-(G7)-1-4-nitrophenil-(G1)-α-D-maltoheptaoside as substrate // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988. Vol.27. P.103-113).

Основным недостатком метода является использование дополнительного фермента для получения окрашенного продукта.

Наиболее близким к заявленному набору реагентов - прототипом, является набор реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы кинетическим колориметрическим методом, состоящий из двух реагентов, имеющих следующий состав компонентов: реагент 1 - хлорид натрия 50-500 ммоль/л, калий роданистый (KSCN) 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, хлорид кальция 0,5-10,0 ммоль/л, MAT 5-100 мг/л, MES (2-морфолиноэтансульфоновая кислота) 50 ммоль/л, рН 5-8, вода - остальное; реагент 2 - 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside (2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозит; GalG2CNP) 2,4-12 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, рН 5-8, вода - остальное (Morishita Y., IinumaY., Nakashima N., et al. Total and pancreatic amylase measured with 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside // Clinical Chemistry. 2000. Vol 46. P.928-933).

В основу набора для определения панкреатической α-амилазы положен кинетический колориметрический метод, заключающийся в том, что на первой стадии слюнной изофермент α-амилазы ингибируется с помощью MAT, на второй стадии - панкреатическая α-амилаза гидролизует GalG2CNP с образованием окрашенного продукта 2-chloro-4-nitrophenol и неокрашенного - 4-O-β-D-galactopyranosylmaltose. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности панкреатической α-амилазы в образце.

Недостатком прототипа является небольшой срок хранения реагентов - 3 месяца при температуре 4°С.

Технической задачей изобретения является повышение стабильности набора реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче и продление срока его хранения при сохранении высокой точности и воспроизводимости результатов анализа.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым набором реагентов, включающим два жидких реагента, готовых к использованию, при этом первый реагент (реагент 1) дополнительно содержит EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и бычий сывороточный альбумин (БСА), а хлорид кальция заменен на ацетат кальция; второй реагент (реагент 2) дополнительно содержит EDTA и азид натрия.

Предлагаемый набор реагентов включает следующие компоненты:

реагент 1, содержащий хлорид натрия 50-500 ммоль/л, KSCN 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA 0,2-5,0 ммоль/л, ацетат кальция 0,7-10,0 ммоль/л, БСА 0,5-2 мас.%, MAT 12,0-25,0 мг/л, MES 50 ммоль/л, рН 5,5-6,5, вода - остальное; реагент 2, содержащий азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA 0,2-5,0 ммоль/л, GalG2CNP 2,5-20 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, рН 5,5-6,5, вода - остальное.

Данный набор реагентов характеризуется правильностью определения активности панкреатической α-амилазы 100±5% с воспроизводимостью результатов (коэффициент вариации) менее 5%. Срок хранения набора реагентов при температуре 2-8°С составляет 1 год.

Включение в состав реагента 1 новых компонентов - EDTA, образующей комплексные соединения с большинством катионов, БСА - способствующего стабильности антител, а также замена хлорида кальция на консервант ацетат кальция, позволяет повысить стабильность реагента 1 и продлить срок его годности до 1 года.

Включение в состав реагента 2 нового компонента - EDTA, образующей комплексные соединения с большинством катионов, а также добавление консерванта - азида натрия позволяет повысить стабильность реагента 2 и продлить срок его годности до 1 года.

Определение активности панкреатической α-амилазы осуществляется при температуре реагентов 37°С следующим образом: к 25 мкл пробы добавляют 1 мл реагента 1, выдерживают 5 минут и добавляют 0,25 мл реагента 2, через 1 мин начинают считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм, при этом количество считываний должно быть не менее трех. Активность панкреатической α-амилазы (А) в Е/л рассчитывают по формуле:

А=ΔЕ/мин×2757,

Где ΔЕ/мин - среднее изменение оптической плотности за минуту;

2757 - фактор пересчета по уравнению Бугера-Ламберта-Бера.

Определяющими существенными отличиями предлагаемого набора реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, по сравнению с прототипом, являются:

- реагент 1 дополнительно содержит EDTA и БСА, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;

- в реагенте 1 хлорид кальция заменен на ацетат кальция, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;

- реагент 2 дополнительно содержит EDTA, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;

все компоненты в наборе использованы в оптимальных, экспериментально подобранных концентрациях, что позволяет повысить функциональность и расширить область применения набора.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Готовят реагент 1 и реагент 2.

Для приготовления реагента 1 делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят их в стеклянный стакан и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке и доводят рН под контролем рН-метра до 6,0. Затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Для приготовления реагента 2 делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят все навески, кроме GalG2CNP, в стеклянный стакан и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке, доводят рН под контролем рН-метра до 6,0. Далее раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр, доводят объем до метки дистиллированной водой, перемешивают, добавляют навеску GalG2CNP и вновь тщательно перемешивают на магнитной мешалке.

В результате получают набор реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:

реагент 1, содержащий:

Хлорид натрия, ммоль/л - 50,0

KSCN, ммоль/л - 400,0

Азид натрия, ммоль/л - 90,0

EDTA, ммоль/л - 0,2

Ацетат кальция, ммоль/л - 0,7

БСА, мас.% - 2,0

MAT, мг/л-12,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное;

реагент 2, содержащий:

Азид натрия, ммоль/л - 90,0

EDTA, ммоль/л - 0,2

GalG2CNP, ммоль/л - 2,5

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,9

Пример 2

Приготовление реагента 1 и реагента 2 осуществляют аналогично примеру 1. Получают набор реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:

реагент 1, содержащий:

Хлорид натрия, ммоль/л - 200,0

KSCN, ммоль/л - 150,0

Азид натрия, ммоль/л - 20,0

EDTA, ммоль/л - 2,5

Ацетат кальция, ммоль/л - 5,0

БСА, мас.% - 1,0

MAT, мг/л - 25,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное;

реагент 2, содержащий:

Азид натрия, ммоль/л - 20,0

EDTA, ммоль/л - 2,5

GalG2CNP, ммоль/л - 20,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,5.

Пример 3

Приготовление реагента 1 и реагента 2 осуществляют аналогично примеру 1. Получают набор реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:

реагент 1, содержащий:

Хлорид натрия, ммоль/л - 500,0

KSCN, ммоль/л - 50,0

Азид натрия, ммоль/л - 1,0

EDTA, ммоль/л - 5,0

Ацетат кальция, ммоль/л - 10,0

БСА, мас.% - 0,5

MAT, мг/л - 20,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное;

реагент 2, содержащий:

Азид натрия, ммоль/л - 1,0

EDTA, ммоль/л - 5,0

GalG2CNP, ммоль/л - 10,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 6,5.

Пример 4 Определение активности панкреатической α-амилазы в контрольных сыворотках.

К 1 мл реагента 1, прогретому до температуры 37°С, добавили 25 мкл контрольной сыворотки «Precinorm U», выдержали 5 минут при температуре 37°С и добавили 0,25 мл реагента 2. Через 1 мин начали считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм. Аналогичную процедуру повторили для контрольных сывороток «Precipath U», «c.f.a.s.», «Contornorm», «Contropath», «BioCal E». Результаты анализа приведены в таблице.

Таблица
Контрольная сыворотка Аттестованное значение активности панкреатической α-амилазы (IFCC), Е/л Полученный результат, Е/л
«Precinorm U» («Roche», Германия) 40,8 (33,6-48,0) 40
«Precipath U» («Roche», Германия) 102(84-120) 102
«c.f.a.s.» («Roche», Германия) 162 164
«Contornorm» («Biocon», Германия) 40,1 (32,9-47,3) 41
«Contropath» («Biocon», Германия) 102 (84-120) 101
«BioCal E» («Biocon», Германия) 171 177

Из таблицы 1 видно, что предлагаемый реагент обеспечивает высокую точность определения активности панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.

Использование предлагаемого набора реагентов позволит, по сравнению с прототипом:

- увеличить срок годности набора до 1 года путем обеспечения стабильности реагентов;

- расширить область применения и повысить функциональность набора за счет обеспечения возможности работы с ним в условиях клинико-диагностических, поликлинических и биохимических лабораторий.

Предлагаемый набор реагентов доступен для любой клинико-диагностической, поликлинической и биохимической лаборатории и позволяет получать точные, достоверные результаты анализа, соответствующие зарубежным стандартам.

Набор реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы, включающий реагент 1, содержащий хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, водорастворимую соль кальция, моноклональные антитела к слюнной α-амилазе (MAT), 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду и реагент 2, содержащий 2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозит (GalG2CNP), MES и воду, отличающийся тем, что реагент 1 дополнительно содержит EDTA и бычий сывороточный альбумин (БСА), а в качестве соли кальция - ацетат кальция, а реагент 2 дополнительно содержит EDTA и азид натрия, при следующем соотношении компонентов:

реагент 1
Хлорид натрия, ммоль/л 50,0-500,0
KSCN, ммоль/л 50,0-400,0
Азид натрия, ммоль/л 1,0-90,0
EDTA, ммоль/л 0,2-5,0
Ацетат кальция, ммоль/л 0,7-10,0
БСА, мас.% 0,5-2,0
МАТ, мг/л 12,0-25,0
MES, ммоль/л 50,0
Вода, л Остальное до 1 л;
реагент 2
Азид натрия, ммоль/л 1,0-90,0
EDTA, ммоль/л 0,2-5,0
GalG2CNP, ммоль/л 2,5-20,0
MES, ммоль/л 50,0
Вода, л Остальное до 1 л,

при этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,5-6,5.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, а именно к способам прогнозирования послеоперационных осложнений, точнее к способам прогнозирования развития рубцов после перенесенной угревой болезни.
Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам диагностики. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам. .

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологическим и биохимическим методам исследования. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и направлено на оценку влияния повреждений мышц при скелетной травме на общее состояние организма пациентов в острый период.
Изобретение относится к области медицины, в частности токсикологии и реаниматологии, и может быть использовано для раннего прогнозирования развития пневмонии у больных.
Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням, диагностике. .

Изобретение относится к медицине, более точно к физиологии, биохимии, и может быть использовано для экспресс-диагностики адаптации организма к гипокинезии как в обычных условиях, так и при выполнении космических полетов.
Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии. .
Изобретение относится к биохимии и медицине

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности местной химиотерапии головного мозга у больных со злокачественными опухолями центральной нервной системы
Изобретение относится к области медицины и касается способа прогноза течения иерсиниозной инфекции у детей Сущность способа заключается в том, что наряду с оценкой клинических симптомов болезни (лихорадки и экзантемы) в начальный период заболевания (с 3 по 12 день), дополнительно определяют в сыворотке крови С-реактивный белок (СРБ), скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и специфические антитела (AT) и при:- лихорадочной реакции менее 2 суток, длительности экзантемы менее 1,5 суток, СРБ менее 7,5 мг/л, показателе СОЭ менее 15 мм/час уровне ИФН- менее 75 пг/мл, ЦИК не выше 0,115 ед.опт.пл

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике
Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии и аллергологии и касается способа прогнозирования риска развития аллергических заболеваний у детей раннего возраста
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения концентрации фторхинолоновых антибиотиков, конкретно флюмеквина, в мышечных тканях, сыворотке крови и пищевых продуктах флуориметрическим методом, позволяющее понизить предел обнаружения с целью регулирования введения оптимальных доз антибиотиков при лечении различных инфекционных заболеваний, исследовании фармакокинетики и фармакодинамики
Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и описывает способ оценки эффективности неоадъювантной химиотерапии рака мочевого пузыря путем исследования пациента, при котором производят регистрацию максимальной интенсивности аутофлюоресценции опухолевых тканей в зеленой области спектра на этапе первичной диагностики и через 1 месяц после проведения предоперационной химиотерапии и при увеличении у пациента значений максимальной интенсивности аутофлюоресценции опухолевой ткани на 15% от исходных и более эффективность лечения оценивают как частичную регрессию опухолевого процесса, при отсутствии изменений показателей интенсивности аутофлюоресценции опухолевой ткани от исходных определяют стабилизацию процесса, при уменьшении показателей интенсивности аутофлюоресценции опухолевой ткани на 15% и более от исходных отмечают прогрессирование опухолевого процесса
Наверх