Реагент для определения активности общей -амилазы


 


Владельцы патента RU 2417374:

Закрытое акционерное общество "Вектор-Бест" (RU)

Изобретение относится к биохимии и медицине. Реагент для определения активности общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержит в качестве субстрата 2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозид (GalG2CNP), хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, EDTA, ацетат кальция, Triton Х-100, 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду. При этом рН реагента составляет 5,5-6,5. Использование реагента позволяет провести определение α-амилазы с высокой точностью и воспроизводимостью результатов. 1 табл.

 

Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к созданию реагентов, позволяющих определять активность общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.

Для определения активности α-амилазы были разработаны различные методы, основанные на способности фермента гидролизовать внутренние α-1,4-гликозидные связи олиго- и полисахаридов.

Наиболее распространенным для определения активности общей α-амилазы является способ, включающий использование в качестве субстрата 4,6-ethylidene-(G7)-p-nitrophenil-(G1)-α,D-maltoheptaoside (4,6-этилден-(G7)-п-нитрофенил-(G1)-α,D-мальтогептазид; Et-G7PNP), одобренный Международной федерацией клинической химии (IFCC). В процессе реакции α-амилаза расщепляет Et-G7PNP до G2PNP, G3PNP, G4PNP, Et-G3, Et-G4 и Et-G5. После этого α-глюкозидаза гидролизует G2PNP, G3PNP и G4PNP с образованием глюкозы и окрашенного вещества п-нитрофенола. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности общей α-амилазы в образце (Kruse-Jarres J.D., Kaiser С., Hafkenscheid J.С.М. et al. Evaluation of a new α-amylase assay using 4,6-ethylidene-(G7)-l-4-nitrophenil-(G1)-α-D-maltoheptaoside as substrate // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988. Vol.27. P.103-113).

Основным недостатком известного способа является двухстадийность реакции и использование дополнительного фермента для получения окрашенного продукта.

Наиболее близким к заявляемому реагенту - прототипом, является набор реагентов для определения активности общей α-амилазы кинетическим колориметрическим методом, состоящий из двух реагентов, следующих составов: реагент 1 - хлорид натрия 50-500 ммоль/л, калий роданистый (KSCN) 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, хлорид кальция 0,5-10,0 ммоль/л, MES (2-морфолиноэтансульфоновая кислота) 50 ммоль/л, вода - остальное, рН реагента 5-8; реагент 2, содержащий: 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside (2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозид; GalG2CNP) 2,4-12 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, вода-(остальное), рН реагента 5-8. В основу набора для определения активности общей α-амилазы положен кинетический колориметрический метод, заключающийся в том, что α-амилаза гидролизует GalG2CNP с образованием окрашенного продукта 2-chloro-4-nitrophenol и неокрашенного - 4-O-β-D-galactopyranosylmaltose. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности α-амилазы в образце (Morishita Y., IinumaY., Nakashima N., et al. Total and pancreatic amylase measured with 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside // Clinical Chemistry. 2000. Vol 46. P.928-933).

Недостатками прототипа являются:

- небольшой срок хранения реагентов: 3 месяца при температуре 4°С;

- трудоемкость при использовании системы из двух реагентов.

Технической задачей изобретения является повышение стабильности реагента для определения активности общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче с сохранением высокой точности и воспроизводимости результатов анализа.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым реагентом, содержащим следующие компоненты: субстрат GalG2CNP 0,5-20 ммоль/л, хлорид натрия 50-500 ммоль/л, KSCN 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) 0,2-5,0 ммоль/л, Triton Х-100 0,075 об.%, ацетат кальция 0,7-10,0 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, (остальное), рН 5,5-6,5.

Данный реагент характеризуется правильностью определения активности общей α-амилазы 100±5% с воспроизводимостью результатов (коэффициент вариации) менее 5%. Срок хранения реагента при температуре 2-8°С составляет 2 года.

Включение в состав реагента новых компонентов - Triton Х-100, который является неионным поверхностно-активным веществом, EDTA - образующая комплексные соединения с большинством катионов, а также замена кальция хлорида на консервант кальция ацетат позволяет повысить стабильность реагента и продлить срок его годности до 2-х лет.

Определение активности общей α-амилазы осуществляют при температуре реагента 37°С следующим образом: к 25 мкл пробы добавляют 1 мл реагента и через 1 мин начинают считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм, при этом количество считываний должно быть не менее трех. Активность общей α-амилазы (А) в Е/л рассчитывают по формуле:

А=ΔЕ/мин×3060, где ΔЕ/мин - среднее изменение оптической плотности за минуту; 3060 - фактор пересчета по уравнению Бугера-Ламберта-Бера.

Определяющими существенными отличиями предлагаемого реагента, по сравнению с прототипом, являются:

- реагент дополнительно содержит Triton Х-100 и EDTA в экспериментально подобранных, оптимальных количествах, что позволяет повысить стабильность последнего при хранении;

- в реагенте кальция хлорид заменен на более подходящий компонент - ацетат кальция, что позволяет повысить стабильность реагента при хранении;

- жидкий реагент готов к использованию, что позволяет существенно упростить процедуру анализа;

- все компоненты в реагенте использованы в оптимальных, экспериментально подобранных концентрациях, что позволяет повысить функциональность и расширить область применения реагента.

Предлагаемый реагент прошел клинические испытания и разрешен к производству, продаже и применению на территории Российской, Федерации. Предлагаемый реагент доступен для любой клинико-диагностической, поликлинической и биохимической лаборатории и позволяет получать точные, достоверные результаты анализа, соответствующие зарубежным стандартам.

Пример 1

Для приготовления реагента делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят их в стеклянные стаканы и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Растворы тщательно перемешивают на магнитной мешалке. Растворы компонентов, кроме GalG2CNP, переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр и доводят рН под контролем рН-метра до 5,73. Затем добавляют навеску GalG2CNP. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. В результате получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:

Хлорид натрия, ммоль/л - 50,0

KSCN, ммоль/л - 400,0

Азид натрия, ммоль/л - 90,0

EDTA, ммоль/л - 0,2

Ацетат кальция, ммоль/л - 0,7

Triton Х-100, об.% - 0,075

GalG2CNP, ммоль/л - 0,5

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента составляет 6,0.

Пример 2

Приготовление реагента осуществляют аналогично примеру 1. Получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:

Хлорид натрия, ммоль/л - 300,0

KSCN, ммоль/л - 100,0

Азид натрия, ммоль/л - 20,0

EDTA, ммоль/л - 2,5

Ацетат кальция, ммоль/л - 5,0

Triton Х-100, об.% - 0,075

GalG2CNP, ммоль/л - 10,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента составляет 5,5.

Пример 3

Приготовление реагента осуществляют аналогично примеру 1.

Получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:

Хлорид натрия, ммоль/л - 500,0

KSCN, ммоль/л - 50,0

Азид натрия, ммоль/л - 1,0

EDTA, ммоль/л - 5,0

Ацетат кальция, ммоль/л - 10,0

Triton X-100, об.% - 0,075

GalG2CNP, ммоль/л - 20,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента составляет 6,5.

Пример 4

Определение активности панкреатической α-амилазы в контрольных сыворотках.

К 1 мл реагента, прогретому до температуры 37°С, добавили 25 мкл контрольной сыворотки «Precinorm U». Через 1 мин начали считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм. Аналогичную процедуру повторили для контрольных сывороток «Precipath U», «c.f.a.s.», «Contornorm», «Contropath», «BioCal E». Результаты анализа приведены в табл.1.

Таблица 1
Контрольная сыворотка Аттестованное значение активности панкреатической α-амилазы (IFCC), Е/л Полученный результат, Е/л
«Precinorm U» («Roche», Германия) 40,8 (33,6-48,0) 40
«Precipath U» («Roche», Германия) 102 (84-120) 102
«c.f.a.s.» («Roche», Германия) 162 164
«Contornorm» («Biocon», Германия) 40,1 (32,9-47,3) 41
«Contropath» («Biocon», Германия) 102 (84-120) 101
«BioCal E» («Biocon», Германия) 171 177

Из таблицы 1 видно, что предлагаемый реагент обеспечивает высокую точность определения активности общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.

Использование предлагаемого реагента позволит по сравнению с прототипом:

- увеличить срок годности реагента до 2-х лет за счет обеспечения его стабильности;

- расширить область применения и повысить функциональность реагента за счет обеспечения возможности работы с ним в условиях клинико-диагностических, поликлинических и биохимических лабораторий.

Реагент для определения активности общей α-амилазы кинетическим колориметрическим методом, содержащий субстрат 2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозид (GalG2CNP), хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, водорастворимую соль кальция, 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду, отличающийся тем, что он дополнительно содержит EDTA и Triton Х-100, а в качестве соли кальция - ацетат кальция, при следующем соотношении компонентов:

Хлорид натрия, ммоль/л 50,0-500,0
Калий роданистый, ммоль/л 50,0-400,0
Азид натрия, ммоль/л 1,0-90,0
EDTA, ммоль/л 0,2-5,0
Ацетат кальция, ммоль/л 0,7-10,0
Triton Х-100, об.% 0,075
GalG2CNP, ммоль/л 0,5-20,0
MES, ммоль/л 50,0
Вода Остальное,

при этом рН реагента составляет 5,5-6,5.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины и касается набора реагентов для определения активности панкреатической -амилазы, включающего реагент 1, содержащий хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, водорастворимую соль кальция, моноклональные антитела к слюнной -амилазе (MAT), 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду и реагент 2, содержащий 2-хлор-4-нитрофенил-4-O- -D-галактопиранозилмальтозит (GalG2CNP), MES и воду, отличающегося тем, что реагент 1 дополнительно содержит EDTA и бычий сывороточный альбумин (БСА), а в качестве соли кальция - ацетат кальция, а реагент 2 дополнительно содержит EDTA и азид натрия, при указанном в формуле изобретения соотношении компонентов.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способам прогнозирования послеоперационных осложнений, точнее к способам прогнозирования развития рубцов после перенесенной угревой болезни.
Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам диагностики. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам. .

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологическим и биохимическим методам исследования. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и направлено на оценку влияния повреждений мышц при скелетной травме на общее состояние организма пациентов в острый период.
Изобретение относится к области медицины, в частности токсикологии и реаниматологии, и может быть использовано для раннего прогнозирования развития пневмонии у больных.
Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням, диагностике. .

Изобретение относится к медицине, более точно к физиологии, биохимии, и может быть использовано для экспресс-диагностики адаптации организма к гипокинезии как в обычных условиях, так и при выполнении космических полетов.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности местной химиотерапии головного мозга у больных со злокачественными опухолями центральной нервной системы
Изобретение относится к области медицины и касается способа прогноза течения иерсиниозной инфекции у детей Сущность способа заключается в том, что наряду с оценкой клинических симптомов болезни (лихорадки и экзантемы) в начальный период заболевания (с 3 по 12 день), дополнительно определяют в сыворотке крови С-реактивный белок (СРБ), скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и специфические антитела (AT) и при:- лихорадочной реакции менее 2 суток, длительности экзантемы менее 1,5 суток, СРБ менее 7,5 мг/л, показателе СОЭ менее 15 мм/час уровне ИФН- менее 75 пг/мл, ЦИК не выше 0,115 ед.опт.пл

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике
Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии и аллергологии и касается способа прогнозирования риска развития аллергических заболеваний у детей раннего возраста
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения концентрации фторхинолоновых антибиотиков, конкретно флюмеквина, в мышечных тканях, сыворотке крови и пищевых продуктах флуориметрическим методом, позволяющее понизить предел обнаружения с целью регулирования введения оптимальных доз антибиотиков при лечении различных инфекционных заболеваний, исследовании фармакокинетики и фармакодинамики
Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и описывает способ оценки эффективности неоадъювантной химиотерапии рака мочевого пузыря путем исследования пациента, при котором производят регистрацию максимальной интенсивности аутофлюоресценции опухолевых тканей в зеленой области спектра на этапе первичной диагностики и через 1 месяц после проведения предоперационной химиотерапии и при увеличении у пациента значений максимальной интенсивности аутофлюоресценции опухолевой ткани на 15% от исходных и более эффективность лечения оценивают как частичную регрессию опухолевого процесса, при отсутствии изменений показателей интенсивности аутофлюоресценции опухолевой ткани от исходных определяют стабилизацию процесса, при уменьшении показателей интенсивности аутофлюоресценции опухолевой ткани на 15% и более от исходных отмечают прогрессирование опухолевого процесса
Изобретение относится к медицине, к биологическим исследованиям в онкологии, и может быть использовано для определения развития злокачественного процесса при опухолях головного мозга после оперативного лечения
Наверх