Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк



Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк

 


Владельцы патента RU 2418068:

СИРНА ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. (US)

Настоящее изобретение относится к химически модифицированной молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей смысловую цепь и антисмысловую цепь:

а также к композиции, включающей такую молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Представленная молекула нуклеиновой кислоты позволяет опосредовать активность РНК-мишени путем интерференции РНК и обладает повышенной стабильностью и активностью in vivo. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 43 ил., 8 табл.

 

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США № 11/299254, зарегистрированной 8 декабря 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 11/234730, зарегистрированной 23 сентября 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 11/205646, зарегистрированной 17 августа 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 11/098303, зарегистрированной 4 апреля 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/923536, зарегистрированной 20 августа 2004 года, которая является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US04/16390, зарегистрированной 24 мая 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/826966, зарегистрированной 16 апреля 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/757803, зарегистрированной 14 января 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/720448, зарегистрированной 24 ноября 2003 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/693059, зарегистрированной 23 октября 2003 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/444853, зарегистрированной 23 мая 2003 года, которая является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US03/05346, зарегистрированной 20 февраля 2003 года, и частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US03/05028, зарегистрированной 20 февраля 2003 года, где в двух последних документах заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/358580, зарегистрированной 20 февраля 2002 года, предварительной заявки на патент США 60/363124, зарегистрированной 11 марта 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/386782, зарегистрированной 6 июня 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/406784, зарегистрированной 29 августа 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/408378, зарегистрированной 5 сентября 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/409293, зарегистрированной 9 сентября 2002 года, и предварительной заявки на патент США № 60/440129, зарегистрированной 15 января 2003 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US04/13456, зарегистрированной 30 апреля 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/780447, зарегистрированной 13 февраля 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/427160, зарегистрированной 30 апреля 2003 года, которая является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US02/15876, зарегистрированной 17 мая 2002 года, в которой заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/292217, зарегистрированной 18 мая 2001 года, предварительной заявки на патент США № 60/362016, зарегистрированной 6 марта 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/306883, зарегистрированной 20 июля 2001 года, и предварительной заявки на патент США № 60/311865, зарегистрированной 13 августа 2001 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением заявки на патент США № 10/727780, зарегистрированной 3 декабря 2003 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US05/04270, зарегистрированной 9 февраля 2005 года, в которой заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/543480, зарегистрированной 10 февраля 2004 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением заявки на патент США № 11/353630, зарегистрированной 14 февраля 2006 года, в которой заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/652787, зарегистрированной 14 февраля 2005 года, предварительной заявки на патент США № 60/678531, зарегистрированной 6 мая 2005 года, предварительной заявки на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 года, и предварительной заявки на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 года. В настоящей заявке утверждается полезность всех перечисленных заявок, которые в этой связи включены в качестве ссылок в материалы настоящей заявки полностью, включая имеющиеся в них чертежи и рисунки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям и способам исследования, диагностики и лечения признаков, заболеваний и состояний, которые являются ответом на модуляцию экспрессии генов и/или их активности. Настоящее изобретение также относится к соединениям, композициям и способам, относящимся к признакам, заболеваниям и состояниям, которые являются ответом на модуляцию экспрессии и/или активности генов, вовлекаемых в механизмы генной экспрессии или другие клеточные процессы, которые опосредуют поддержание или развитие таких признаков, заболеваний и состояний. Конкретно, настоящее изобретение относится к двухцепочечным молекулам нуклеиновой кислоты, включающим малые молекулы нуклеиновой кислоты, такие как короткие интерферирующие молекулы нуклеиновой кислоты (киНК), молекулы короткой интерферирующей РНК (киРНК), молекулы РНК двухцепочечной (дцРНК), молекулы микроРНК (миРНК) и молекулы короткой шпилечной РНК (кшРНК), которые способны быть посредниками в процессе интерференции РНК (РНКи), направленной против генной экспрессии, включая коктейли таких малых молекул нуклеиновой кислоты и липидные наночастичные композиции (ЛНЧ) на основе таких малых молекул нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение также относится к малым молекулам нуклеиновой кислоты, таким как киНК, киРНК и другие, которые способны ингибировать функцию молекул эндогенной РНК, таких как эндогенная микроРНК (миРНК) (например, ингибиторы миРНК) или эндогенная короткая интерферирующая РНК (киРНК) (например, ингибиторы киРНК), или которые могут ингибировать функцию RISC (например, ингибиторы RISC), с достижением модуляции генной экспрессии за счет создания препятствий осуществлению регуляторной функции в случае таких эндогенных РНК или белков, ассоциированных с такими эндогенными РНК (например, RISC), включая коктейли таких малых молекул нуклеиновой кислоты и липидных наночастичных композиций (ЛНЧ) на основе таких малых молекул нуклеиновой кислоты. Указанные малые молекулы нуклеиновой кислоты используются, например, при создании композиций, действующих в направлении предупреждения, ингибирования или снижения выраженности различных заболеваний, признаков и состояний, которые ассоциированы с экспрессией или активностью гена у субъекта или в организме.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже приводится обсуждение информации, относящейся к РНКи. Данное обсуждение приводится лишь для пояснения рассматриваемого изобретения. Соответственно, нижеследующее описание не является прямым указанием на то, что приведенная в нем информация отражает достигнутый уровень техники, предшествующий заявленному изобретению.

Интерференция РНК относится к процессу специфичного по последовательности посттранскрипционного молчания гена у животных, который сопряжен с участием в нем коротких интерферирующих молекул РНК (киРНК) (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13:139-141; и Strauss, 1999, Science, 286, 886). Соответствующий процесс в растениях (Heifetz et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/61631) известен как посттранскрипционное молчание гена, или молчание РНК, а также как процесс подавления гена, применительно к грибам. Процесс посттранскрипционного молчания гена, как считается, представляет собой эволюционно законсервативный механизм клеточной защиты, используемый организмом для предотвращения экспрессии чужеродных генов, и представляет собой общий механизм для различных представителей растительного и животного миров (Fire et al., 1999, Trend genet., 15, 358). Такой путь защиты от экспрессии чужеродного гена мог возникнуть в ответ на продукцию двухцепочечных РНК (дцРНК), в результате вирусной инфекции или в результате случайной интеграции транспозоновых элементов в геном организма-хозяина, по механизму клеточного ответа, направленного на специфическое разрушение гомологичной одноцепочечной РНК или вирусной геномной РНК. Наличие дцРНК в клетках запускает ответный процесс РНКи по механизму, который до сих пор полностью не изучен. Указанный механизм, по всей видимости, отличается от других известных механизмов, которые вовлекают рибонуклеазы, специфичные для двухцепочечной РНК, таких как реакция интерферона, которая является результатом дцРНК-опосредованной активации протеинкиназы PKR и 2',5'-олигоаденилатсинтетазы, приводящей к неспецифическому расщеплению мРНК рибонуклеазой L (см., например, патенты США №№ 6107094; 5898031; Clemens et al., 1997, J. Interferon & Сytokine Res., 17, 503-524; Adah et al., 2001, Curr. Med. Chem., 8, 1189).

Наличие длинных дцРНК в клетках стимулирует активность фермента рибонуклеазы III, известного как дайсер (Dicer) (Bass, 2000, Cell, 101, 235; Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293). Дайсер вовлекается в механизм процессинга дцРНК с образованием коротких участков дцРНК, известных как короткие интерферирующие РНК (киРНК) (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2000, Cell, 101, 235; Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363). Короткие интерферирующие РНК, возникающие в результате активности фермента дайсер, содержат в типичном случае от примерно от 21 до примерно 23 нуклеотидов в длину и включают дуплекс из примерно 19 пар оснований (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188). Дайсер также вовлекается в процесс удаления малых временных РНК длиной 21 и 22 нуклеотида (мвРНК) из молекулы РНК-предшественника с консервативной структурой, которая вовлекается в контроль трансляции (Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834). Реакция по типу РНКи также приводит к образованию эндонуклеазного комплекса, известного как РНК-индуцированный молчащий комплекс (RISC), который опосредует расщепление одноцепочечных РНК, содержащих последовательность, комплементарную к антисмысловой цепи дуплекса киРНК. Расщепление целевой РНК происходит в середине участка, комплементарного к антисмысловой цепи дуплекса киРНК (Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188).

Процесс РНКи исследовали на множестве различных систем. Файр с соавт. (Fire et al., 1998, Nature, 391, 806) первыми обнаружили РНКи в C. elegans. Бахрамиан и Зарби, а также Вианни и Гетц (Bahramian and Zarbi, 1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283 и Wianny and Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70) описали функционирующие в системах млекопитающих РНКи, опосредованные дцРНК. Хаммонд с соавт. (Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293) описали РНКи в клетках Drosophila, трансфицированных дцРНК. Элбашир с соавт. и Тушл с соавт. (Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494 и Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164) описали РНКи, индуцированную введением дуплексов синтетических 21-нуклеотидных РНК в культуры клеток млекопитающих, включающих эмбриональные клетки почки человека и клетки HeLa. Последние работы, проведенные на лизатах эмбриональных клеток Drosophila (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877 и Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164), позволили выявить ряд требований к длине киРНК, ее структуре, химическому составу и последовательности, которые являются обязательными для эффективного проявления активности РНКи. Данные исследования показали, что 21-нуклеотидные дуплексы киРНК в основном являются активными в том случае, когда они содержат 3'-концевые динуклеотидные выступающие фрагменты. Кроме того, полное замещение одной или обеих цепей киРНК 2'-дезокси- (2'-H) или 2'-О-метилнуклеотидами удаляет активность РНКи, тогда как, по результатам проведенных исследований, замещение 3'-концевых нуклеотидных выступающих фрагментов киРНК 2'-дезоксинуклеотидами (2'-H) не устраняет активность. Кроме того, было показано, что единичные ошибочные спаривания в последовательностях, расположенных в центре дуплекса киРНК, также удаляют активность РНКи. Дополнительно, проведенные исследования также показали, что положение сайта расщепления в целевой РНК определяется 5'-концом ведущей последовательности киРНК, а не 3'-концом указанной ведущей последовательности (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877). Результаты других исследований показали, что 5'-фосфат в комплементарной цепи-мишени дуплекса киРНК необходим для осуществления активности киРНК, а также продемонстрировали, что АТФ используется для поддержания 5'-фосфатного фрагмента в киРНК (Nykanen et al., 2001, Cell, 107, 309).

Проведенные исследования показали, что замещение 3'-концевых нуклеотидных выступающих сегментов 21-нуклеотидного дуплекса киРНК, содержащего динуклеотидные выступающие 3'-фрагменты с дезоксирибонуклеотидами, не оказывает неблагоприятного эффекта на активность РНКи. Было также показано, что замещение вплоть до четырех нуклеотидов на каждом конце киРНК дезоксирибонуклеотидами хорошо переносится, тогда как полное замещение дезоксирибонуклеотидами приводит к устранению активности РНКи (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877 и Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164). Кроме того, Элбашир с соавт. (Elbashir, et al., выше) также сообщили, что замещение киРНК 2'-O-метилнуклеотидами полностью подавляет активность РНКи. Ли с соавт. и Бич с соавт. (Li et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/44914 и Beach et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/68836) ранее предположили, что киРНК может включать модификации либо фосфатно-сахарного скелета, либо нуклеозида, которые включают по меньшей мере один гетероатом азота или серы, однако ни в одной из заявок не было установлено, в какой мере такие модификации могут быть толерантными для молекул киРНК, а также не было приведено каких-либо указаний или соответствующих примеров относительно таких модифицированных киРНК. Кройтцер с соавт. (Kreutzer et al., публикация на патент Канады № 2359180) также описали некоторые химические возможные для использования в конструкциях дцРНК модификации, которые могут противодействовать активации зависимой от двухцепочечной РНК протеинкиназы PKR, конкретно, за счет наличия 2'-амино- или 2'-О-метилнуклеотидов и нуклеотидов, содержащих 2'-О- или 4'-С-метиленовый мостик. Однако Крейцер с соавт. (Kreutzer et al.) также не привели какие-либо примеры или соответствующие руководства, позволяющие определить, до какой степени такие модификации будут толерантными для молекул дцРНК.

Парриш с соавт. (Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1077-1087) проанализировали некоторые химические модификации, введенные в unc-22 ген из C. elegans с использованием длинных (>25 нуклеотидов) транскриптов киРНК. Авторы описали введение тиофосфатных остатков в такие транскрипты киРНК путем встраивания тиофосфатных аналогов нуклеотидов с использованием Т7 и Т3 РНК-полимеразы и показали, что РНК с двумя модифицированными фосфоротиоатом основаниями характеризуются значительным снижением эффективности РНКи. Кроме того, Парриш с соавт. (Parrish et al.) сообщили, что фосфоротиоатная модификация более чем двух остатков очень сильно дестабилизирует РНК in vitro, так что при этом интерферирующая активность не может быть даже оценена (Id. at 1081). Авторы также проанализировали некоторые модификации в 2'-положении нуклеотидного сахара в длинных транскриптах киРНК и обнаружили, что замещение рибонуклеотидов дезоксинуклеотидами приводит к значительному снижению интерферирующей активности, особенно в случае замены уридина на тимидин и/или цитидина на дезоксицитидин. Кроме того, авторы проанализировали некоторые модификации оснований, включая замещения в смысловых и антисмысловых киРНК, урацила на 4-тиоурацил, 5-бромурацил, 5-йодурацил и 3-(аминоаллил)урацил и гуанозина на инозин. В то время как замещения 4-тиоурацилом и 5-бромурацилом были, по всей видимости, толерантными для исследованных молекул, Парриш (Parrish) сообщил, что введение инозина приводит к значительному снижению интерферирующей активности при его включении в любую цепь. Кроме того, Парриш (Parrish) сообщил также, что включение 5-йодурацила и 3'-(аминоаллил)урацила в антисмысловую цепь также приводит к значительному снижению активности РНКи.

Было описано использование более длинных фрагментов дцРНК. Так, например, Бич с соавт. (Beach et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/68836) описывают специфические методы снижения генной экспрессии с использованием дцРНК эндогенного происхождения. Тушл с соавт. (Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164) описывают систему РНКи в клетках Drosophila in vitro и использование специфических молекул киРНК для некоторых функциональных геномных и некоторых терапевтических направлений использования; хотя Тушл (Tuschl, 2001, Chem. Biochem., 2, 239-245) высказывает сомнение относительно того, что РНКи может использоваться для лечения генетически обусловленных заболеваний или вирусных инфекций в связи с опасностью активации интерферонового ответа. Ли с соавт. (Li et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/44914) описывают использование специфических длинных (141 п.о.-488 п.о.) молекул дцРНК, синтезированных энзиматически или экспрессированных на основе вектора, для снижения экспрессии некоторых целевых генов. Зерницка-Гетц с соавт. (Zernicka-Goetz et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/36646) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии определенных генов в клетках млекопитающих с использованием ряда длинных (550 п.о.-714 п.о.) молекул дцРНК, синтезированных энзиматически или экспрессированных на основе вектора. Файр с соавт. (Fire et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/32619) описывают некоторые способы введения ряда длинных молекул дцРНК в клетки с целью применения их для ингибирования экспрессии генов в нематодах. Плетинк с соавт. (Plaetinck et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/01846) описывают некоторые способы идентификации специфических генов, ответственных за определенный фенотип клетки, с использованием специфических длинных молекул дцРНК. Мелло с соавт. (Mello et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/29058) описывают идентификацию специфических генов, вовлекаемых в дцРНК-опосредованную РНКи. Пачук с соавт. (Pachuck et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/63364) описывают некоторые длинные (по меньшей мере содержащие 200 нуклеотидов) конструкции дцРНК. Дешам Дэпайет с соавт. (Deschamps Depaillette et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/07409) описывают специфические композиции, состоящие из некоторых молекул дцРНК, объединенных с некоторыми антивирусными агентами. Ватерхаус с соавт. (Waterhouse et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/53050 и 1998, PNAS, 95, 13959-13964) описывают некоторые способы снижения фенотипической экспрессии нуклеиновой кислоты в растительных клетках с использованием некоторых дцРНК. Дрисколл с соавт. (Driscoll et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/49844) описывают специфические конструкции экспрессии ДНК, которые при их использовании способствуют молчанию генов в целевых организмах.

В литературе имеются также другие публикации по различным системам РНКи и молчащим генам. Например, Парриш с соавт. (Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1077-1087) описывают специфические химически модифицированные конструкции дцРНК, действие которых направлено на unc-22 ген из C. elegans. Гроссниклаус (Grossniklaus, публикация по Международной заявке PCT № WO 01/38551) описывает некоторые способы регуляции экспрессии генов polycomb с использованием некоторых дцРНК. Чуриков с соавт. (Churikov et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/42443) описывают некоторые способы модификации генетических характеристик организмов с использованием некоторых дцРНК. Когони с соавт. (Cogoni et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/53475) описывают некоторые способы выделения молчащего гена из Neurospora и их использование. Рид с соавт. (Reed et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/68836) описывают некоторые способы достижения молчания генов в растениях. Хонер с соавт. (Honer et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/70944) описывают некоторые способы скрининга лекарственных препаратов с использованием трансгенных нематод на моделях болезни Паркинсона с использованием некоторых дцРНК. Дик с соавт. (Deak et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/72774) описывают некоторые генные продукты из клеток Drosophila, которые могут иметь отношение к РНКи в Drosophila. Арндт с соавт. (Arndt et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/92513) описывают некоторые способы воздействия на супрессию гена с использованием факторов, усиливающих РНКи. Тушл с соавт. (Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 02/44321) описывают некоторые синтетические конструкции киРНК. Пачук с соавт. (Pachuck et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/63364) и Сатишчандран с соавт. (Satishchandran et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/04313) описывают некоторые способы и композиции, используемые для ингибирования функций некоторых полинуклеотидных последовательностей, с использованием некоторых длинных (содержащих свыше 250 п.о.) дцРНК, экспрессированных на основе вектора. Эчевери с соавт. (Echeverri et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 02/38805) описывают некоторые гены из C. elegans, идентифицированные с помощью систем РНКи. Крейцер с соавт. (Kreutzer et al., публикации по Международным заявкам PCT № WO 02/055692, WO 02/055693 и EP 1144623 B1) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии гена с использованием дцРНК. Грахам с соавт. (Graham et al., публикации по Международным заявкам PCT №№ WO 99/49029 и WO 01/70949 и AU 4037501) описывают некоторые молекулы киРНК, экспрессированные на основе векторов. Фиэр с соавт. (Fire et al., US 6506559) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии гена in vitro с использованием некоторых длинных конструкций дцРНК (299 п.о.-1033 п.о.), которые опосредуют функцию РНКи. Мартини с соавт. (Martinez et al., 2002, Cell, 110, 563-574) описывают некоторые одноцепочечные конструкции киРНК, включающие некоторые 5'-фосфорилированные одноцепочечные киРНК, которые опосредуют интерферирующую активность РНК в клетках Hela. Харборт с соавт. (Harborth et al., 2003, Antisense & Nicleic Acid Drug Development, 13, 83-105) описывают некоторые химически и структурно модифицированные молекулы киРНК. (Chiu и Rana, 2003, RNA, 1034-1048) описывают некоторые химические и структурные модифицированные молекулы киРНК. Вулф с соавт. (Woolf et al., публикации по Международным заявкам PCT №№ WO 03/064626 и WO 03/064625) описывают некоторые химически модифицированные конструкции дцРНК. Хорнунг с соавт. (Hornuhg et al., 2005, Nature Medicine, 11, 263-270) описывают мощную, специфичную по последовательности индукцию IFN-альфа короткими интерферирующими РНК в плазмацитоидных дендритных клетках через TLR7. Дяджь с соавт. (Judge et al., 2005, Nature Biotechnology, Published online: 20 March 2005) описывают зависимую от последовательности стимуляцию врожденного и иммунного ответа у млекопитающих синтетическими киРНК. Йюки с соавт. (Yuki et al., публикации по Международным заявкам PCT №№ WO 05/049821 и WO 04/048566) описывают некоторые способы создания коротких последовательностей, интерферирующих РНК, и некоторые короткие последовательности РНК с оптимизированной активностью. Саиго с соавт. (Saigo et al., публикация по Международной заявке US 20040539332) описывают некоторые способы создания олиго- или полинуклеотидных последовательностей, включающих короткие последовательности интерферирующих РНК, для достижения интерференции РНК. Теи с соавт. (Tei et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 03/044188) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии гена-мишени, которые включают трансфекцию клетки, ткани или отдельного организма двухцепочечных полинуклеотидов, включающих ДНК и РНК, содержащих по существу идентичную нуклеотидную последовательность с наличием по меньшей мере частичной нуклеотидной последовательности гена-мишени.

Все авторы приведенных ниже патентных и научных публикаций (Mattick, 2005, Science, 309, 1527-1528; Claverue, 2005, Science, 309, 1529-1550; Sethupathy et al., 2006, RNA, 12, 192-197; и Czech, 2006, MEJM, 354, 11:1194-1195; Hutvagner et al., US 20050227256 и Tuschl et al., US 20050182005) описывают антисмысловые молекулы, которые могут ингибировать функцию миРНК через пространственное блокирование, и все указанные работы включены в настоящее описание полностью в качестве ссылок.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям и способам, используемым для модуляции экспрессии генов, таких как гены, ассоциированные с развитием или поддержанием состояния болезни, признаков и состояний, имеющих отношение к экспрессии или активности генов, за счет интерференции РНК (РНКи) с использованием коротких молекул интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК). Настоящее изобретение также относится к соединениям, композициям и способам, используемым для модуляции экспрессии и активности одного или нескольких генов, вовлекаемых в пути генной экспрессии и/или активности, по механизму интерференции РНК (РНКи) с использованием малых молекул нуклеиновой кислоты. В частности, настоящее изобретение охватывает малые молекулы нуклеиновой кислоты, такие как короткие молекулы интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), короткие молекулы интерферирующей РНК (киРНК), двухцепочечные молекулы РНК (дцРНК), молекулы микроРНК (миРНК) и короткие шпилечные молекулы РНК (кшРНК), и способы использования для модуляции экспрессии генов и/или других генов, вовлекаемых в пути генной экспрессии и/или активности.

Настоящее изобретение также относится к малым молекулам нуклеиновой кислоты, таким как киНК, киРНК, и к другим молекулам, которые могут ингибировать функции эндогенных молекул РНК, таких как эндогенные молекулы микроРНК (миРНК) (например, ингибиторы миРНК) или эндогенные короткие молекулы интерферирующих РНК (киРНК) (например, ингибиторы киРНК), или которые могут ингибировать функцию RISC (например, ингибиторы RISC) с целью модуляции генной экспрессии путем интерференции регуляторной функции таких эндогенных РНК или белков, ассоциированных с такими эндогенными РНК (например, RISC). Такие молекулы в целом в тексте настоящего описания обозначаются как ингибиторы РНКи.

КиНК или ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может представлять немодифицированную или химически модифицированную молекулу. КиНК или ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может быть синтезирован химически, может быть экспрессирован на основе вектора или может быть синтезирован энзиматически. Настоящее изобретение также охватывает различные химически модифицированные синтетические короткие молекулы интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способные модулировать экспрессию или активность гена-мишени в клетках за счет интерференции РНК (РНКи). Настоящее изобретение также охватывает различные химически модифицированные синтетические короткие молекулы нуклеиновой кислоты (киНК), способные модулировать активность РНКи в клетках путем взаимодействия миРНК, киРНК или RISC и в этой связи регуляцию или ингибирование интерференции РНК (РНКи), ингибирование трансляции или трансляционного молчания в клетке или организме. Использование химически модифицированных киНК и/или РНКи улучшает различные свойства нативных молекул киНК и/или ингибиторов РНКи за счет повышения их резистентности к деградации нуклеазами in vivo и/или в результате повышенного поглощения клетками. В отличие от полученных ранее результатов молекулы киНК согласно настоящему изобретению, содержащие множественные химические модификации, включая полностью модифицированные киНК, сохраняют свою РНКи активность. В этой связи авторы изобретения предлагают химически модифицированные киРНК (в целом обозначаемые в тексте как киНК), которые сохраняют или повышают активность нативных киРНК. Молекулы киНК согласно настоящему изобретению обеспечивают наличие полезных реагентов и способов для множества терапевтических, профилактических, ветеринарных, диагностических применений, для целевой валидации, для геномных исследований, генетической инженерии и для фармакогеномных вариантов использования.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются одна или несколько молекул киНК и/или ингибиторов РНКи и способы, которые независимо или в сочетании модулируют экспрессию генов-мишеней, кодирующих белки, такие как белки, которые ассоциированы с подержанием и/или развитием заболевания, признаков, расстройств и/или состояний, приведенных в настоящем описании или известных в данной области, таких как гены, кодирующие последовательности, включающие последовательности, имеющиеся в Генбанке (GenBank) с номерами доступа, приведенными в предварительных заявках на патенты США №№ 60/363124, USSN 10/923536 и PСТ/US03/05028, которые включены в настоящее описание в качестве «целевых» последовательностей/последовательностей мишеней. Приведенное ниже описание различных аспектов и вариантов настоящего изобретения дано в сочетании со ссылкой на репрезентативные целевые гены, обозначаемые в тексте описания как гены-мишени. Настоящее изобретение также относится к соединениям, композициям и способам, относящимся к признакам, заболеваниям и состояниям, которые являются реакцией на модуляцию экспрессии и/или активности генов, вовлекаемых в пути генной экспрессии или другие клеточные процессы, опосредующие поддержание или развитие таких признаков, заболеваний и состояний. Однако такая ссылка является лишь репрезентативной, и различные аспекты и варианты настоящего изобретения также имеют отношение к другим генам, которые экспрессируют альтернативные целевые гены, такие как мутантные целевые гены, сплайсинг-варианты целевых генов, варианты целевого гена, определяемые видовой спецификой или варьирующие от субъекта к субъекту, и другие целевые генные пути, приведенные в описании или известные в данной области. Дополнительные гены могут быть проанализированы применительно к их целевым сайтам с использованием способов согласно настоящему изобретению, приведенных для репрезентативных целевых генов и описанных последовательностей. Таким образом, модуляция и эффекты такой модуляции других генов могут быть осуществлены по приведенным способам. Иными словами, термины «мишень» и «ген-мишень» в контексте приведенного описания и применительно к цитированным материалам охватывает гены, ассоциированные с развитием и/или поддержанием заболевания, признаков и состояний, таких как гены, кодирующие полипептиды, регуляторные полинуклеотиды (например, миРНК и киРНК), мутантные гены и сплайсинг варианты генов, а также другие гены, вовлекаемые в пути генной экспрессии и/или активности. Таким образом, каждый из вариантов, приведенных в настоящем описании, со ссылкой на термин «мишень» применим во всех молекулах белков, пептидов, полипептидов и/или полинуклеотидов, для которых применим термин «мишень» в контексте, соответствующем настоящему описанию. В целом такие гены-мишени также в тексте настоящего описания могут обозначаться как «целевые» последовательности.

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей две или более разных молекул киНК и/или ингибиторов РНКи согласно настоящему изобретению (например, киНК, дуплекс, формирующий киНК, или многофункциональная киНК или их любое сочетание), воздействующих направленно на разные полинуклеотидные мишени, такие как разные участки целевой РНК или ДНК (например, два разных сайта-мишени, такие как приведенные в настоящем описании или любое сочетание мишеней или целевых путей), или как кодирующие, так и некодирующие мишени. Такое объединение молекул киНК может обеспечить повышенный терапевтический эффект.

В одном варианте настоящее изобретение относится к совокупности композиций, включающей две или более разных молекул киНК согласно настоящему изобретению (например, киНК, дуплекс, формирующий киНК, или многофункциональная киНК, или их любое сочетание), которые обладают специфичностью для разных полинуклеотидных мишеней, таких как разные участки целевой РНК или ДНК (например, два разных сайта-мишени согласно настоящему изобретению или любое сочетание мишеней или целевых путей), или как кодирующие, так и не кодирующие мишени, где указанное объединение включает молекулы киНК, воздействующие направлено на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более разных мишеней.

В связи с тем, что у разных организмов или разных субъектов имеется определенный потенциал вариабельности генома по последовательности, выбор молекул киНК для широкого спектра терапевтических применений будет вовлекать, в высокой степени, консервативные участки гена. В одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваются молекулы киНК и/или ингибиторы РНКи, которые направленно воздействуют на консервативные участки генома или участки, которые законсервированы применительно к разным мишеням. Молекулы киНК или ингибиторы РНКи разработаны таким образом, что воздействуют направленно на консервативные участки разных мишеней, позволяют достичь эффективного ингибирования экспрессии целевого гена в разных группах пациентов.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, такой как молекула киНК, где одна из цепей включает нуклеотидную последовательность, являющуюся комплементарной заданной нуклеотидной последовательности в целевой молекуле нуклеиновой кислоты или ее части. Заданная нуклеотидная последовательность может представлять собой нуклеотидную целевую последовательность, такую как последовательность, описанная в настоящем тексте или известная в данной области. В другом варианте осуществления настоящего изобретения заданная нуклеотидная последовательность представляет собой целевую последовательность или путь к целевой последовательности, известный в данной области.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии гена-мишени или которая направляет процесс расщепления целевой РНК, где указанная молекула киНК включает от примерно 15 до примерно 28 пар оснований.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК, где указанная молекула киНК включает от примерно 15 до примерно 28 пар оснований.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК (РНКи), где указанная двухцепочечная молекула киНК включает первую цепь и вторую цепь, где каждая из цепей молекулы киНК содержит в длину от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов (например, приблизительно 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28), где первая цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью к целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК, и где вторая цепь указанной молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к первой цепи. В одном конкретном варианте, например, каждая цепь молекулы киНК содержит от примерно 18 до примерно 27 нуклеотидов в длину.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК (РНКи), где указанная двухцепочечная молекула киНК включает первую цепь и вторую цепь, где каждая из цепей молекулы киНК содержит в длину от примерно 18 до примерно 23 нуклеотидов (например, приблизительно 18, 19, 20, 21, 22 или 23), где первая цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью к целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК, и где вторая цепь указанной молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к первой цепи.

В одном варианте настоящее изобретение относится к химически синтезированной двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК (РНКи), где каждая цепь молекулы киНК содержит в длину от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов и где одна цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью к целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к химически синтезированной двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК (РНКи), где каждая цепь молекулы киНК содержит в длину от примерно 18 до примерно 23 нуклеотидов и где одна цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью к целевой РНК, с тем чтобы указанная молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, например, где указанный целевой ген РНК включает последовательность, кодирующую белок. В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, например, где целевой ген или РНК включает некодирующую последовательность или регуляторные элементы, вовлекаемые в экспрессию целевого гена (например, некодирующей РНК, миРНК, мвРНК и т.п.).

В одном варианте киНК согласно настоящему изобретению используют для ингибирования экспрессии целевых генов или семейства целевых генов, где указанные гены или последовательности генного семейства обладают гомологией по последовательности. Такие гомологичные последовательности могут быть идентифицированы согласно известным в данной области методам, например с использованием выравнивания последовательностей. Молекулы киНК могут быть разработаны таким образом, чтобы они направленно воздействовали на такие гомологичные последовательности, например, с использованием полностью комплементарных последовательностей или путем включения неканонических пар оснований, например ошибок в паре оснований и/или с использованием пар оснований, соответствующих гипотезе «качелей», которые могут обеспечивать дополнительные целевые последовательности. В тех случаях, когда идентифицировано ошибочное спаривание, неканонические пары оснований (например, ошибочные спаривания и/или пары оснований, соответствующие гипотезе «качелей») могут быть использованы для создания молекул киНК, которые направленно воздействуют на более чем одну генную последовательность. В не ограничивающем примере используют неканонические пары оснований, такие как UU и CC пары оснований, для создания молекул киНК, которые способны направленно воздействовать на последовательности разных полинуклеотидных мишеней, обладающих гомологией по последовательности. В таком случае одним из преимуществ использования киНК согласно настоящему изобретению является тот факт, что может быть разработана одна киНК, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную к нуклеотидной последовательности, которая является консервативной для гомологичных генов. В рамках такого подхода одна киНК может использовать для ингибирования экспрессии более чем один ген и может заменить использование более чем одной молекулы киНК для направленного воздействия на разные гены.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, обладающей активностью РНКи против целевой РНК (например, кодирующей или некодирующей РНК), где указанная молекула киНК включает последовательность, комплементарную к любой последовательности РНК, такой как последовательности, депонированные в Генбанке (GenBank) с номерами доступа, приведенными в PCT/US03/05028, предварительных заявках на патент США № 60/363124 и/или USSN 10/923536, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылок. В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, обладающей активностью РНКи против целевой РНК, где указанная молекула киНК включает последовательность, комплементарную РНК, содержащей вариант кодирующей последовательности, например содержащей другие мутантные гены, известные в данной области как ассоциированные с поддержанием и/или развитием заболеваний, признаков, расстройств и/или состояний согласно настоящему изобретению или иных, известных в данной области. Применительно к любой конструкции киНК согласно настоящему изобретению могут быть использованы химические модификации, показанные в таблице I или иным образом приведенные в настоящем тексте. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, которая может взаимодействовать с нуклеотидной последовательностью целевого гена и тем самым вовлекаться в процесс молчания экспрессии целевого гена, например, где указанная молекула киНК опосредует регуляцию экспрессии целевого гена в рамках клеточных процессов, которые модулируют структуру хроматина или характер метилирования целевого гена, и тем самым препятствует транскрипции целевого гена.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению используют для достижения отрицательной регуляции или ингибирования экспрессии белков, возникающих в результате гаптотипических полиморфизмов, ассоциированных с признаком, заболеванием или состоянием у субъекта или организма. Анализ генов или уровней белка или РНК может использоваться для идентификации субъектов такими полиморфизмами или субъектов, которые имеют риск развития описанных в данном тексте признаков, состояний или заболеваний. В случае таких субъектов может быть использовано лечение, например лечение с применением молекул киНК согласно настоящему изобретению или любой другой композиции, используемой при лечении заболеваний, связанных с экспрессией целевого гена. При этом анализ уровней белка или РНК может использоваться для определения типа лечения и режима терапии при лечении субъекта. Мониторинг уровня белка или РНК может использоваться для предсказания результатов лечения и для определения эффективности соединения или композиции, которое модулирует уровень и/или активность некоторых белков, ассоциированных с признаком, расстройством, состоянием или заболеванием.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения молекула киНК включает антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к нуклеотидной последовательности или ее части, кодирующей целевой белок. При этом киНК также включает смысловую цепь, где указанная смысловая цепь включает нуклеотидную последовательность целевого гена или его часть.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула киНК включает антисмысловой участок, содержащий нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к нуклеотидной последовательности, кодирующей целевой белок или его часть. Указанная молекула киНК также включает смысловой участок, где указанный смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность целевого гена или его часть.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей нуклеотидную последовательность, например нуклеотидную последовательность в антисмысловом участке молекулы киНК, которая комплементарна нуклеотидной последовательности или части такой последовательности целевого гена. В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей участок, например антисмысловой участок конструкции киНК, комплементарный к последовательности, содержащей последовательность целевого гена или его часть.

В одном варианте смысловой участок или смысловая цепь молекулы киНК согласно настоящему изобретению комплементарна части антисмыслового участка или антисмысловой цепи молекулы киНК, которая комплементарна целевой нуклеотидной последовательности.

В еще одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей последовательность, например антисмысловую последовательность конструкции киНК, комплементарную к последовательности или части последовательности, содержащей последовательность, депонированную в Генбанке (GenBank) с номерами доступа, приведенными в PCT/US03/05028, предварительных заявках на патент США № 60/363124 и/или USSN 10/923536, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок. Химические модификации, показанные в таблице I и описанные в данном тексте, могут использоваться применительно к любой конструкции киНК согласно настоящему изобретению. LNP, описанные в таблице IV, могут использоваться применительно к любой молекуле киНК или сочетанию молекул киНК согласно настоящему описанию.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула киНК включает антисмысловую цепь, содержащую от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов, где антисмысловая цепь комплементарна целевой последовательности РНК или ее части и где указанная киНК также включает смысловую цепь, содержащую от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов, и где указанная смысловая цепь и указанная антисмысловая цепь представляют собой различающиеся нуклеотидные последовательности, при этом по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов в каждой цепи комплементарны нуклеотидам другой цепи.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению (например, двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты) включает антисмысловую (ведущую) цепь, содержащую от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов, где антисмысловая цепь комплементарна целевой последовательности РНК или ее части. В одном варианте осуществления по меньшей мере 15 нуклеотидов (например, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) последовательности целевой РНК комплементарны последовательностям в антисмысловой (ведущей) цепи молекулы киНК согласно настоящему изобретению.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению (например, двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты) включает смысловую (цепь-«пассажир») цепь, содержащую от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), которая включает последовательность целевой РНК или ее часть. В одном варианте по меньшей мере 15 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) последовательности целевой РНК включают смысловую (цепь-«пассажир») цепь молекулы киНК согласно настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула киНК по изобретению включает антисмысловой участок, содержащий от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), где указанный антисмысловой участок комплементарен последовательности целевой ДНК, где указанная киНК также включает смысловой участок, содержащий от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), где указанный смысловой участок и указанный антисмысловой участок включаются в длинные молекулы, указанный смысловой участок содержит по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидам в антисмысловом участке.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению обладает активностью РНКи, которая модулирует экспрессию РНК, кодируемой геном. Поскольку гены могут иметь некоторую степень общности, определяемую гомологией последовательности, молекулы киНК могут быть разработаны таким образом, чтобы они оказывали направленное воздействие на класс определенных генов за счет выбора последовательности, которая либо имеет общность среди разных мишеней, либо, альтернативно, они являются уникальными для конкретных мишеней. В этой связи в одном варианте молекула киНК может быть разработана таким образом, чтобы она оказывала направленное воздействие на консервативные участки целевых полинуклеотидных последовательностей, обладающих гомологией среди нескольких генных вариантов, так что будет оказывать направленное воздействие на класс генов посредством одной молекулы киНК. Соответственно, в одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению модулирует экспрессию одного или нескольких целевых генных изоформ или вариантов у субъекта или в организме. В другом варианте молекула киНК может быть разработана таким образом, чтобы она оказывала направленное воздействие на последовательность, которая является уникальной для специфической полинуклеотидной последовательности (например, единственная изоформа целевого гена или единственный полиморфизм нуклеотида (SNP)) в связи с высоким уровнем специфичности, который необходим для молекулы киНК с тем, чтобы вовлекаться в реализацию РНКи активности.

В одном варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, которые функционируют как медиаторы РНК-интерфирирующего ответа, вызывающего молчание гена, представляют собой молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В другом варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению состоят из молекул дуплекса нуклеиновой кислоты, содержащих от примерно 15 до примерно 30 пар оснований между олигонуклеотидами, содержащими примерно от 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В еще одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению включают молекулы дуплекса нуклеиновой кислоты выступающими концами, содержащими от примерно 1 до примерно 3 нуклеотидов (в частности, примерно 1, 2 или 3), например, 21-нуклеотидные дуплексы, включающие примерно 19 пар оснований и 3'-концевые мононуклеотидные, динуклеотидные или тринуклеотидные выступающие фрагменты. В еще одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению включают молекулы дуплекса нуклеиновой кислоты с тупыми концами, где оба конца являются тупыми или, альтернативно, один из концов является тупым.

В еще одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) включает нуклеотидный или не нуклеотидный выступающий фрагмент. Термин «выступающий фрагмент» означает концевую часть нуклеотидной последовательности, в которой две цепи двухцепочечной нуклеотидной молекулы не спарены по основаниям (например, фиг.6). В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может включать нуклеотидные или не нуклеотидные выступающие фрагменты на 3'-конце одной или обеих цепей молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может включать нуклеотидные или не нуклеотидные выступающие фрагменты на 3'-конце ведущей цепи или антисмысловой цепи/участке, на 3'-конце цепи-«пассажира» или смысловой цепи/участка или и на ведущей цепи или антисмысловой цепи/участке и на цепи-«пассажире» или смысловой цепи/участке молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В другом варианте нуклеотидный выступающий фрагмент молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает 2'-О-метильный, 2'-дезокси-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси-2'-фторарабино- (FANA), 4'-тио-, 2'-О-трифторметильный, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, универсальное основание, ациклический или 5-С-метильные нуклеотиды. В другом варианте не нуклеотидные выступающие фрагменты молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты (кмНК) согласно настоящему изобретению включают глицерильные, безосновные или инвертированные дезоксисоединения без основания не нуклеотидной природы.

В одном варианте нуклеотиды, включающие выступающие фрагменты молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК по изобретению), соответствуют нуклеотидам, включающим целевую полинуклеотидную последовательность в молекуле киНК. Соответственно, в таких вариантах нуклеотиды, включающие выступающий фрагмент молекулы киНК согласно настоящему изобретению, включают последовательность, основанную на целевой полинуклеотидной последовательности, в которой нуклеотиды, содержащие выступающие фрагменты ведущей цепи или антисмысловой цепи/участка молекулы киНК согласно настоящему изобретению, могут быть комплементарны нуклеотидам в целевой полинуклеотидной последовательности, и нуклеотиды, включающие выступающий фрагмент цепи-«пассажира» или смысловой цепи/участка молекулы киНК согласно настоящему изобретению, могут содержать нуклеотиды в целевой полинуклеотидной последовательности. Такие нуклеотидные выступающие фрагменты включают последовательность, которая может быть результатом процессинга ферментом дайсер на основе нативной дцРНК в киРНК.

В одном варианте нуклеотиды, содержащие выступающий фрагмент молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению, комплементарны целевой полинуклеотидной последовательности и необязательно модифицированы химически, как приведено в настоящем описании. В этой связи в одном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеотиды, содержащие выступающие фрагменты ведущей цепи или антисмысловой цепи/участка молекулы киНК согласно настоящему изобретению, могут быть комплементарны нуклеотидам в целевой полинуклеотидной последовательности, то есть тем нуклеотидным позициям в целевой полинуклеотидной последовательности, которые комплементарны нуклеотидным позициям нуклеотидов выступающего фрагмента в ведущей цепи или антисмысловой цепи/участке молекулы киНК. В другом варианте нуклеотиды, включающие выступающий фрагмент цепи-«пассажира» или смысловой цепи/участка молекулы киНК согласно настоящему изобретению, могут включать нуклеотиды в целевой полинуклеотидной последовательности, то есть те нуклеотидные позиции в целевой полинуклеотидной последовательности, которые соответствуют тем же нуклеотидным позициям в нуклеотидах выступающего фрагмента в цепи-«пассажире» или смысловой цепи/участке молекулы киНК. В другом варианте выступающий фрагмент включает два нуклеотида (например, 3'-GA; 3'-GU; 3'-GG; 3'-GC; 3'-CA; 3'-CU; 3'-CG; 3'-CC; 3'-UA; 3'-UU; 3'-UG; 3'-UC; 3'-AA; 3'-AU; 3'-AG; 3'-AC; 3'-TA; 3'-TU; 3'-TG; 3'-TC; 3'-AT; 3'-UT; 3'-GT; 3'-CT) в выступающем фрагменте, который комплементарен части целевой полинуклеотидной последовательности. В одном варианте выступающий фрагмент включает два нуклеотида (например, 3'-GA; 3'-GU; 3'-GG; 3'-GC; 3'-CA; 3'-CU; 3'-CG; 3'-CC; 3'-UA; 3'-UU; 3'-UG; 3'-UC; 3'-AA; 3'-AU; 3'-AG; 3'-AC; 3'-TA; 3'-TU; 3'-TG; 3'-TC; 3'-AT; 3'-UT; 3'-GT; 3'-CT) в выступающем фрагменте, который не комплементарен части целевой полинуклеотидной последовательности. В другом варианте нуклеотиды выступающего фрагмента в молекуле киНК согласно настоящему изобретению представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабино- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды. В другом варианте нуклеотиды выступающего фрагмента в молекуле киНК согласно настоящему изобретению представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды, в том случае, когда нуклеотиды выступающего фрагмента представляют собой пуриновые нуклеотиды и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды или 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды, в том случае, когда нуклеотиды выступающего фрагмента представляют собой пиримидиновые нуклеотиды. В другом варианте осуществления пуриновый нуклеотид (в случае его наличия) в выступающем фрагменте молекулы киНК согласно настоящему изобретению представляет собой 2'-О-метилнуклеотиды. В другом варианте пиримидиновый нуклеотид (в случае его наличия) в выступающем фрагменте молекулы киНК согласно настоящему изобретению представляет собой 2'-дезокси-2'-фтор- или 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды.

В одном варианте указанные нуклеотиды, содержащие выступающие фрагменты молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению, не комплементарны целевой полинуклеотидной последовательности и необязательно модифицированы химически, как приведено в настоящем описании. В одном варианте выступающий фрагмент включает 3'-UU выступающий фрагмент, который не комплементарен части целевой полинуклеотидной последовательности. В другом варианте указанные нуклеотиды, включающие выступающий фрагмент молекулы киНК согласно настоящему изобретению, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению включает два или три нуклеотида в выступающем фрагменте, где указанные нуклеотиды в выступающем фрагменте могут быть одинаковыми или разыми. В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению включает два или три нуклеотида в выступающем фрагменте, где указанные нуклеотиды в выступающем фрагменте могут быть одинаковыми или разными и где один или несколько нуклеотидов в выступающем фрагменте модифицированы по основанию, сахару и/или фосфатному скелету.

В одном варианте настоящее изобретение относится к одной или нескольким химически модифицированным конструкциям киНК, обладающим специфичностью для целевых молекул нуклеиновой кислоты, таких как ДНК или РНК, кодирующих белок или не кодирующих РНК, ассоциированных с экспрессией целевых генов. В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК на основе РНК (например, киНК, включающая 2'-ОН-нуклеотиды), обладающей специфичностью для молекул нуклеиновой кислоты, которые включают одну или несколько химических модификаций, определенных в настоящем описании. Не ограничивающие примеры таких химических модификаций включают фосфоротиоатные межнуклеотидные связи, 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилрибонуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторрибонуклеотиды, 4'-тиорибонуклеотиды, 2'-О-трифторметилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды (см., например, USSN 10/981966, зарегистрированный 5 ноября 2004 года, включенный в настоящее описание в качестве ссылки), нуклеотиды с «универсальным основанием», «ациклические» нуклеотиды, 5-С-метилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды (FANA, см., например, Dоwler et al., 2006, Nucleic Acids Research, 34, 1669-1675) и концевые глицерильные и/или инвертированные дезокси остатки безосновные, включенные в молекулу. Указанные химические модификации, в случае их использования в конструкциях киНК (например, конструкциях киНК на основе РНК), как было показано, сохраняют активность РНКи в клетках, тогда как в то же самое время резко повышают стабильность этих соединений в сыворотке.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает химические модификации, приведенные в настоящем описании (например, 2'-О-метилрибонуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторрибонуклеотиды, 4'-тиорибонуклеотиды, 2'-О-тритформетилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды, LNA), во внутренних положениях молекулы киНК. Термин «внутреннее положение» используется для обозначения положения спаренных оснований в дуплексе киНК.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды, которые позволяют поддерживать способность опосредовать процесс РНКи. Модифицированные нуклеотиды могут использоваться для улучшения характеристик in vitro или in vivo, таких как стабильность, активность, токсичность, иммунный ответ и/или биодоступность. Например, молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать модифицированные нуклеотиды в виде некоторого процента от общего числа нуклеотидов, имеющихся в молекуле киНК. При этом молекула киНК согласно настоящему изобретению может в основном включать от примерно 5% до примерно 100% модифицированных нуклеотидов (в частности, примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов). Например, в одном варианте осуществления изобретения от примерно 5% до примерно 100% (например, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов) в нуклеотидных позициях в молекуле киНК согласно настоящему изобретению включают модификацию сахарного остатка в нуклеиновой кислоте, такую как модификация 2'-сахара, например 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды, 2'-О-метоксиэтилнуклеотиды, 2'-О-трифторметилнуклеотиды, 2'-О-этилтритформетоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтиксинуклеотиды или 2'-дезоксинуклеотиды. В другом варианте от примерно 5% до примерно 100% (например, примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов) в нуклеотидных позициях в молекуле киНК согласно настоящему изобретению включают модификацию основания в молекуле нуклеиновой кислоты, такую как модификация, включающая инозин, пурин, пиридин-4-он, пиридин-2-он, фенил, псевдоурацил, 2,4,6-триметоксибензол, 3-метилурацил, дигидроуридин, нафтил, аминофенил, 5-алкилцитидины (например, 5-метилцитидин), 5-алкилуридины (например, риботимидин), 5-галогенуридин (например, 5-бромуридин) или 6-азапиримидины, или 6-алкилпиримидины (например, 6-метилуридин) или пропин. В другом варианте от примерно 5% до 100% (например, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов) в нуклеотидных позициях в молекуле киНК согласно настоящему изобретению включают модификацию скелета нуклеиновой кислоты, такую как модификация скелета в приведенной формуле I в настоящем тексте. В другом варианте от примерно 5% до 100% (например, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов) в нуклеотидных позициях в молекуле киНК согласно настоящему изобретению включают модификацию сахара, основания или скелета в молекуле нуклеиновой кислоты или любое их сочетание (например, любое сочетание модификаций сахара, основания, скелета в молекуле нуклеиновой кислоты или не нуклеотидные модификации). В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере примерно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов. Фактически процент модифицированных нуклеотидов, имеющихся в данной молекуле киНК, зависит от общего числа нуклеотидов в молекуле киНК. Если молекула киНК является одноцепочечной, то процент модификации может определяться общим числом нуклеотидов, имеющихся в одноцепочечных молекулах киНК. Аналогично, если молекула киНК является двухцепочечной, то процент модификации может определяться общим числом нуклеотидов, имеющихся в смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих из них: в смысловой и антисмысловой цепях.

Молекула киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды в разных положениях на молекуле киНК. В одном варианте молекула двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды во внутренних положениях спаренных оснований в составе дуплекса киНК. Так, например, внутренние положения могут включать позиции от примерно 3 до примерно 19 нуклеотидов от 5'-конца любой из цепей: смысловой или антисмысловой, или любого участка: смыслового или антисмыслового 21 нуклеотидного дуплекса киНК, содержащего 19 пар оснований и 3'-фрагменты с двумя нуклеотидами. В другом варианте молекула двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды в неспаренном участке или в выступающих участках молекулы киНК. Термин «не спаренный по основанию» означает, что нуклеотиды не спарены между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК. Нуклеотиды выступающего фрагмента могут быть комплементарны или могут быть спарены по основаниям в соответствующие полинуклеотидные целевые последовательности (см., например, фиг. 6С). Так, например, позиции выступающего фрагмента могут включать позиции от примерно 20 до примерно 21 нуклеотида от 5'-конца любой цепи или участка: смыслового или антисмыслового в 21 нуклеотидном дуплексе киНК, содержащем 19 пар оснований и два нуклеотида 3'-выступающих фрагментов. В другом варианте молекула двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды в концевых позициях молекулы киНК. Например, такие концевые участки включают 3'-положения, 5'-положения применительно к 3'-положению и к 5'-положению смысловой и/или антисмысловой цепи или участка молекулы киНК. В другом варианте двухцепочечная молекула киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды в положениях, спаренных по основанию, или во внутренних положениях, в не спаренных по основанию или в выступающих участках и/или в концевых участках, или может включать любые их сочетания.

Один аспект настоящего изобретения относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК. В одном варианте молекула двухцепочечной киНК включает одну или несколько химических модификаций, и каждая цепь двухцепочечной киНК содержит примерно 21 нуклеотид в длину. В одном варианте молекула двухцепочечной киНК не содержит рибонуклеотидов. В другом варианте молекула двухцепочечной киНК включает один или несколько рибонуклеотидов. В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК независимо включает от примерно 15 до примерно 30 (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов, где каждая цепь содержит от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидам на другой цепи. В одном варианте одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности или ее части в целевом гене, и вторая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична нуклеотидной последовательности целевого гена или его части.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, включающей антисмысловой участок, где указанный антисмысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности целевого гена или его части, и смысловой участок, где указанный смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична нуклеотидной последовательности целевого гена или его части. В одном варианте антисмысловой участок и смысловой участок независимо включают от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), где указанный антисмысловой участок включает от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), который комплементарен нуклеотидам в смысловом участке.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, включающей смысловой участок и антисмысловой участок, где указанный антисмысловой участок включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности РНК, кодируемой целевым геном или его частью, и где смысловой участок включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна антисмысловому участку.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает тупые концы, то есть концы, которые не включают каких-либо выступающих нуклеотидов. Например, молекула киНК, включающая приведенные в настоящем описании модификации (например, включающая нуклеотиды формулы I-VII или конструкции киНК, включающие «Stab 00»-«Stab 36» или «Stab 3F»-«Stab 36F» (таблица I) или любое их сочетание) и/или имеющая любую длину согласно настоящему описанию, может включать тупые концы или концы без выступающих нуклеотидов.

В одном варианте любая молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать один или несколько тупых концов, то есть где указанный тупой конец не содержит каких-либо выступающих нуклеотидов. В одном варианте молекула киНК с тупым концом характеризуется числом пар оснований, равных числу нуклеотидов, присутствующих в каждой цепи молекулы киНК. В другом варианте молекула киНК включает один тупой конец, например, в котором 5'-конец антисмысловой цепи и 3'-конец смысловой цепи не содержат выступающих нуклеотидов. В другом варианте молекула киНК включает один тупой конец, например, в котором 3'-конец антисмысловой цепи и 5'-конец смысловой цепи не содержат выступающих нуклеотидов. В другом варианте молекула киНК включает два тупых конца, например, где 3'-конец антисмысловой цепи и 5'-конец смысловой цепи, а также 5'-конец антисмысловой цепи и 3'-конец смысловой цепи не содержат выступающих нуклеотидов. Молекула киНК с тупыми концами может включать, например, от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). Другие нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК с тупыми концами, могут включать, например, ошибочные спаривания, вздутия, петли или пары оснований, соответствующих гипотезе «качелей», которые модулируют активность молекулы киНК, вовлекаемую в процесс интерференции РНК.

Термин «тупые концы» означает симметричные концы или концы двухцепочечной молекулы киНК, не содержащей выступающих нуклеотидов. Две цепи молекулы двухцепочечной киНК выравнивают друг с другом так, чтобы на концах не было выступающих нуклеотидов. Например, конструкция киНК с тупым концом включает концевые нуклеотиды, которые комплементарны для участков и смысловой, и антисмысловой цепей молекулы киНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, где указанная молекула киНК собирается на основе двух отдельных олигонуклеотидных фрагментов, где один фрагмент включает смысловой участок и второй фрагмент включает антисмысловой участок молекулы киНК. Смысловой участок может быть соединен с антисмысловым участком через молекулу-линкер, такую как полинуклеотидный линкер или не нуклеотидный линкер.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению включает рибонуклеотиды в позициях, которые поддерживают или повышают активность РНК. В одном варианте рибонуклеотиды присутствуют в смысловой цепи или в смысловом участке молекулы киНК и могут обеспечивать активность РНКи за счет расщепления смысловой цепи или смыслового участка фермента в составе RISC (например, рибонуклеотиды, присутствующие в определенном положении цепи-«пассажира», смысловой цепи и/или смыслового участка расщепляют, например, положение 9 цепи-«пассажира» дуплекса из 19 пар оснований, который расщепляется RISC ферментом АGO2 (см., например, Matranga et al., 2005, Cell, 123:1-114 и Rand et al., 2005, Cell, 123:621-629). В другом варианте один или несколько (например, 1, 2, 3, 4 или 5) нуклеотидов на 5'-конце ведущей цепи или ведущего участка (также известного как антисмысловая цепь или антисмысловой участок) молекулы нуклеиновой кислоты киНК представляют собой рибонуклеотиды.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению включает один или несколько рибонуклеотидов в тех положениях в составе цепи-«пассажира» или соответствующего ей участка (также известного как смысловая цепь или смысловой участок), которая способствует расщеплению цепи-«пассажира» или соответствующего ей участка ферментом в комплексе RISC (например, рибонуклеотиды, присутствующие в определенном положении цепи-«пассажира», таком как положение 9 цепи-«пассажира» дуплекса из 19 пар оснований, которая расщепляется в RISC, см., например, Matranga et al., 2005, Cell, 123:1-114 и Rand et al., 2005, Cell, 123:621-629).

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более химических модификаций, которые могут быть одинаковыми или разными. В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более разных химических модификаций.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой молекулу двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), где указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает от примерно 15 до примерно 30 пар оснований (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) и где одно или несколько положений нуклеотидов (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) в каждой цепи молекулы киНК включает химическую модификацию. В другом варианте киНК содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более различных химических модификаций.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, где указанная молекула киНК включает от примерно 15 до примерно 30 пар оснований (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) и где каждая цепь молекулы киНК включает одну или несколько химических модификаций. В одном варианте каждая цепь двухцепочечной молекулы киНК включает по меньшей мере две (например, 2, 3, 4, 5 или более) различных химических модификаций, например различные модификации нуклеотидного сахара, основания или скелета. В другом варианте одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности целевого гена или его части, и вторая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая по существа аналогична нуклеотидной последовательности или ее части в целевом гене. В другом варианте одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности целевого гена или его части, и вторая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична нуклеотидной последовательности или ее части в целевом гене. В другом варианте каждая цепь молекулы киНК включает от примерно 15 до примерно 30 (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов и каждая цепь включает по меньшей мере от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), которые комплементарны нуклеотидам в другой цепи. Указанный целевой ген может включать, например, последовательности, приведенные в настоящем описании или приведенные в работах, включенных в описание в качестве ссылок. Указанный ген может включать, например, последовательности, депонированные в ГенБАнк (GenBank) с указанными номерами доступа.

В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению характеризуется разной картиной химических модификаций, таких как «Stab 00»-«Stab 36» или «Stab 3F»-«Stab 36F» (таблица I), модификаций, приведенных в настоящем описании, или их любое сочетание. Не ограничивающие примеры смысловой и антисмысловой цепей таких молекул киНК, характеризующихся различными картинами модификаций, показаны в таблице II и на фиг. 4 и 5.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению не включает рибонуклеотиды. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает один или несколько рибонуклеотидов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более рибонуклеотидов).

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению не включает антисмысловой участок, содержащий нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности целевого гена или его части, и киНК также включает смысловой участок, содержащий нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична нуклеотидной последовательности целевого гена или его части. В другом варианте антисмысловой участок и смысловой участок, каждый, включает от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), и антисмысловой участок включает по меньшей мере от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), которые комплементарны нуклеотидам в смысловом участке. В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает по меньшей мере две (например, 2, 3, 4, 5 или более) различные химические модификации, например различные модификации сахара в нуклеотиде, основания или нуклеотидного скелета. Целевой ген может включать, например, последовательности, приведенные в настоящем тексте или указанные в цитированных в данном описании работах. В другом варианте киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, где каждая из двух цепей молекулы киНК независимо включает от примерно 15 до примерно 40 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) и где одна из цепей молекулы киНК включает по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более), которые комплементарны последовательности нуклеиновой кислоты целевого гена или его части.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению включают смысловой участок и антисмысловой, где антисмысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности РНК, кодируемой целевым геном или его частью, и где смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна антисмысловому участку. В одном варианте молекула киНК собирается из двух отдельных олигонуклеотидных фрагментов, где один фрагмент включает смысловой участок, а второй фрагмент включает антисмысловой участок молекулы киНК. В другом варианте смысловой участок соединен с антисмысловым участком через линкерную молекулу. В другом варианте смысловой участок соединен с антисмысловым участком через линкерную молекулу, такую как нуклеотидный или не нуклеотидный линкер. В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает по меньшей мере две (например, 2, 3, 4, 5 или более) различные химические модификации, например различные модификации сахарного фрагмента в нуклеотиде, основания или нуклеотидного скелета. Целевой ген может включать, например, последовательности, приведенные в настоящем описании или указанные в ссылках.

В одном варианте молекула киНК по изобретению включает одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновых модификаций (например, где один, или несколько, или все пиримидины (например, U или C) в соответствующих положениях киНК модифицированы 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидами). В одном варианте модификации 2'-дезокси-2'-фторпиримидином присутствуют в смысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-дезокси-2'-фторпиримидином присутствуют в антисмысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-дезокси-2'-фторпиримидином присутствуют и в смысловой цепи, и в антисмысловой цепи молекулы киНК.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) 2'-О-метилпуриновых модификаций (например, где один, или несколько, или все пурины (то есть A или G) в соответствующих положениях киНК модифицированы 2'-О-метилнуклеотидами). В одном варианте модификации 2'-О-метилпурином присутствуют в смысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-О-метилпурином присутствуют в антисмысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-О-метилпурином присутствуют и в смысловой цепи, и в антисмысловой цепи молекулы киНК.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) 2'-дезоксипуриновых модификаций (то есть, когда один, или несколько, или все пурины (то есть A или G) в соответствующих положениях киНК модифицированы 2'-дезоксинуклеотидами). В одном варианте модификации 2'-дезоксипурином присутствуют в смысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-дезоксипурином присутствуют в антисмысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-дезоксипурином присутствуют и в смысловой цепи, и в антисмысловой цепи молекулы киНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, включающей смысловой участок и антисмысловой участок, где антисмысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности РНК, кодируемой целевым геном или его частью, и где смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна антисмысловому участку, где молекула киНК содержит по меньшей мере один или несколько модифицированных пиримидиновых и/или пуриновых нуклеотидов. В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает по меньшей мере две (например, 2, 3, 4, 5 или более) различные химические модификации, например различные модификации сахарного фрагмента в нуклеотиде, основания или нуклеотидного скелета. В одном варианте пиримидиновые нуклеотиды в смысловом участке представляют 2'-О-метилпиримидиновые нуклеотиды или 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды и пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды в смысловом участке представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды и пуриновые нуклеотиды присутствующие в этом участке, представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды в смысловом участке представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды и пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В одном варианте пиримидиновые нуклеотиды в антисмысловом участке представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды и пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил- или 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В другом варианте в любой из описанных выше молекул киНК любой из нуклеотидов, присутствующих в некомплементарном участке смысловой цепи (например, в выступающем участке), представляет собой 2'-дезоксинуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, где указанная молекула киНК собирается из двух отдельных олигонуклеотидных фрагментов, где один фрагмент включает смысловой участок и второй фрагмент включает антисмысловой участок молекулы киНК, и где фрагмент, включающий смысловой участок, содержит терминальный кэпинг-фрагмент на 5'-конце, 3'-конце или на обоих: и 5'-конце, и 3'-конце фрагмента. В одном варианте терминальный кэпинг-фрагмент представляет собой инвертированный дезоксибезосновный фрагмент или глицерильный фрагмент. В одном варианте каждый из двух фрагментов независимо включает от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В другом варианте каждый из двух фрагментов молекулы киНК независимо включает от примерно 15 до примерно 40 (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) нуклеотидов. В не ограничивающем примере каждый из двух фрагментов молекулы киНК содержит примерно 21 нуклеотид.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, где указанный модифицированный нуклеотид представляет собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотид, 2'-дезокси-2'-фторарабино, 2'-О-тритформетилнуклеотид, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотид или 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотид или любой другой модифицированный нуклеотид/нуклеозид, приведенный в настоящем описании и в USSN 10/981966, зарегистрированной 5 ноября 2004 года, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей по меньшей мере два модифицированных нуклеотида (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более), где указанный модифицированный нуклеотид выбирают из группы, состоящей из 2'-дезокси-2'-фторнуклеотида, 2'-дезокси-2'-фторарабино-, 2'-О-тритформетилнуклеотида, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотида или 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотида или любого другого модифицированного нуклеотида/нуклеозида, приведенного в настоящем описании и в USSN 10/981966, зарегистрированной 5 ноября 2004 года и включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Указанные модифицированные нуклеотид/нуклеозид могут быть одинаковыми или разными. киНК может включать в длину, например, от примерно 15 до примерно 40 нуклеотидов. В одном варианте все пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды, 2'-О-тритформетилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды или 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды, 4'-тиопиримидиновые нуклеотиды. В одном варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНК включают по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторцитидиновый или 2'-дезокси-2'-фтоуридиновый нуклеотид. В другом варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНК включают по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторцитидиновый нуклеотид и по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторуридиновый нуклеотид. В одном варианте все уридиновые нуклеотиды, присутствующие в киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторуридиновые нуклеотиды. В одном варианте все цитидиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторцитидиновые нуклеотиды. В одном варианте все аденозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтораденозиновые нуклеотиды. В одном варианте все гуанозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторгуанозиновые нуклеотиды. Молекула киНК может также включать по меньшей мере модифицированную межнуклеотидную связь, такую как фосфоротиоатную связь. В одном варианте 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды присутствуют в специфически выбранных положениях в молекуле киНК, которые чувствительны к расщеплению рибонуклеазами, такие как положения, содержащие пиримидиновые нуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности молекулы киНК против расщепления рибонуклеазами, включающему встраивание по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида в молекулу киНК, где указанный модифицированный нуклеотид представляет собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотид. В одном варианте все пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды. В одном варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНК включают по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторцитидиновый нуклеотид или 2'-дезокси-2'-фторуридиновый нуклеотид. В другом варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНк включают по меньшей мере один 2'-фторцитидиновый нуклеотид и по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторуридиновый нуклеотид. В одном варианте все уридиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-уридиновые нуклеотиды. В одном варианте все цитидиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторцитидиновые нуклеотиды. В одном варианте все аденозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтораденозиновые нуклеотиды. В одном варианте все гуанозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторгуанозиновые нуклеотиды. При этом киНК могут также включать по меньшей мере одну модифицированную межнуклеотидную связь, такую как фосфоротиоатную связь. В одном варианте указанные 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды присутствуют в специфически выбранных положениях в молекуле киНК, которые чувствительны к расщеплению рибонуклеазами, такие как положения, содержащие пиримидиновые нуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности молекулы киНК против расщепления рибонуклеазами, включающему встраивание по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида в молекулу киНК, где указанный модифицированный нуклеотид представляет собой 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотид. В одном варианте все пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторарабинопиримидиновые нуклеотиды. В одном варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНК включают по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторарабиноцитидиновый нуклеотид или 2'-дезокси-2'-фторарабиноуридиновый нуклеотид. В другом варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНК включают по меньшей мере один 2'-фторцитидиновый нуклеотид и по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторарабиноуридиновый нуклеотид. В одном варианте все уридиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторарабиноуридиновые нуклеотиды. В одном варианте все цитидиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторарабиноцитидиновые нуклеотиды. В одном варианте все аденозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторарабиноаденозиновые нуклеотиды. В одном варианте все гуанозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторарабиногуанозиновые нуклеотиды. При этом молекулы киНК могут также включать по меньшей мере одну модифицированную межнуклеотидную связь, такую как фосфоротиоатная связь. В одном варианте указанные 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды присутствуют в специфически выбранных положениях в молекуле киНК, которые чувствительны к расщеплению рибонуклеазами, таких как положения, содержащие пиримидиновые нуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, включающей смысловой участок и антисмысловой участок, где указанный антисмысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к нуклеотидной последовательности РНК, кодируемой целевым геном, или ее части, и где указанный смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна антисмысловому участку, и где пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловом участке, включают 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В альтернативном варианте пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловом участке, включают 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды. В любом из указанных вариантов антисмысловой участок может включать фосфоротиоатную межнуклеотидную связь на 3'-конце антисмыслового участка. Альтернативно, в любом из указанных вариантов антисмысловой участок может включать глицерильную модификацию на 3'-конце антисмыслового участка. В другом варианте в любой из указанных выше молекул киНК любые нуклеотиды, присутствующие в некомплементарном участке антисмысловой цепи (например, в выступающем фрагменте), представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды.

В одном варианте антисмысловой участок молекулы киНК согласно настоящему изобретению включает последовательность, комплементарную части эндогенного транскрипта, содержащего последовательность, уникальную для аллели, имеющей отношение к конкретному заболеванию или признаку у субъекта или организма, и такая последовательность, включающая отдельный нуклеотидный полиморфизм (SNP), ассоциирована с аллелью, специфичной для определенного заболевания или определенного признака. При этом антисмысловой участок молекулы киНК согласно настоящему изобретению может включать последовательность, комплементарную тем последовательностям, которые уникальны для конкретной аллели, что обеспечивает специфичность в осуществлении селективного процесса РНКи против аллели, связанной с конкретными заболеванием, состоянием или признаком.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, где указанная молекула киНК собирается из двух отдельных олигонуклеотидных фрагментов, где один фрагмент включает смысловой участок, а второй фрагмент включает антисмысловой участок молекулы киНК. В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК содержит в длину примерно 21 нуклеотид и примерно 19 нуклеотидов на каждом фрагменте молекулы киНК связаны по основанию с комплементарными нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК, где по меньшей мере два 3'-концевых нуклеотида в каждом фрагменте молекулы киНК не спарены по основанию с нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК. В другом варианте молекула киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, где каждая цепь содержит в длину примерно 19 нуклеотидов и где нуклеотиды в каждом фрагменте молекулы киНК спарены по основанию с соответствующими нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК с образованием по меньшей мере примерно 15 пар оснований (например, 15, 16, 17, 18 или 19), где один или оба конца молекулы киНК представляют собой тупые концы. В одном варианте каждый из двух 3'-концевых нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК представляет собой 2'-дезоксипиримидиновый нуклеотид, такой как 2'-дезокситимидин. В одном варианте каждый из двух 3'-концевых нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК представляет собой 2'-О-метилпиримидиновый нуклеотид, такой как 2'-О-метил-уридин, -цитидин или -тимидин. В другом варианте все нуклеотиды в каждом фрагменте молекулы киНК спарены по основанию с комплементарными нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК. В одном варианте молекула киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащую от примерно 19 до примерно 25 пар оснований, содержащую смысловой участок и антисмысловой участок, где примерно 19 нуклеотидов в антисмысловом участке спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью или частью молекулы РНК, кодируемой целевым геном. В другом варианте примерно 21 нуклеотид в антисмысловом участке спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью или ее частью молекулы РНК, кодируемой целевым геном. В любом из указанных выше вариантов 5'-конец фрагмента, включающего указанный антисмысловой участок, может необязательно содержать фосфатную группу.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая ингибирует экспрессию целевой последовательности РНК, где указанная молекула киНК не содержит рибонуклеотидов, где каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов. В одном варианте указанная молекула киНК содержит в длину 21 нуклеотид. Примеры конструкций киНК не рибонуклеотидной природы включают сочетания стабилизирующих химических структур, показанных в таблице I, в любом сочетании смысловой/антисмысловой структурной организации, такие как Stab7/8, Stab7/11, Stab8/8, Stab18/8, Stab18/11, Stab12/13, Stab7/13, Stab18/13, Stab7/19, Stab8/19, Stab18/19, Stab7/20, Stab8/20, Stab18/20, Stab7/32, Stab8/32 или Stab18/32 (например, любые киНК, содержащие Stab 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20 или 32 в смысловой или антисмысловой цепях или их сочетания). В контексте настоящего описания различные химические структуры Stab могут включать и 2'-фтор-, и 2'-OCF3 варианты химических структур, приведенных в таблице I. При этом, например, термин «Stab7/8» относится и к Stab7/8, и к Stab7F/8F и т.п. В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически синтезированной двухцепочечной РНК, которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК, где каждая цепь указанной молекулы РНК содержит в длину от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов и где одна цепь молекулы РНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной степенью комплементарности к целевой РНК, с тем чтобы молекула РНК была способна направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК; и где по меньшей мере одна цепь молекулы РНК необязательно включает один или несколько химически модифицированных нуклеотидов согласно настоящему описанию, таких как, без ограничения, дезоксинуклеотиды, 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды, 2'-О-метоксиэтилнуклеотиды, 4'-тионуклеотиды, 2'-О-тритформетилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды и т.п., или их сочетание.

В одном варианте целевая РНК согласно настоящему изобретению включает последовательность, кодирующую белок.

В одном варианте целевая РНК согласно настоящему изобретению включает некодирующую последовательность РНК (например, миРНК, мяРНК, киРНК и т.п.) (см., например, Mattik, 2005, Science, 309, 1527-1528; Claverie, 2005, Science, 309, 1529-1530; Sethupathy et al., 2006, RNA, 12, 192-197; и Czech, 2006 NEJM, 354, 11: 1194-1195).

В одном варианте настоящее изобретение относится к лекарственному средству, включающему молекулу киНК согласно настоящему изобретению.

В одном варианте настоящее изобретение относится к активному ингредиенту, включающему молекулу киНК согласно настоящему изобретению.

В одном варианте настоящее изобретение относится к использованию молекулы двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) для достижения ингибирования, отрицательной регуляции или снижения экспрессии целевого гена, где указанная молекула киНК включает одну или несколько химических модификаций и каждая цепь двухцепочечной киНКнезависимо включает в длину от примерно 15 до примерно 30 или более нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более). В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей одну или несколько химических модификаций, где каждый из двух фрагментов молекулы киНК независимо включает от примерно 15 до примерно 40 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) и где одна из цепей включает по меньшей мере 15 нуклеотидов, которые комплементарны целевой нуклеотидной последовательности, кодирующей РНК, или ее части. В не ограничивающем примере каждый из двух фрагментов молекулы киНК включает примерно 21 нуклеотид. В другом варианте молекула киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей одну или несколько химических модификаций, где каждая цепь включает в длину примерно 21 нуклеотид и где примерно 19 нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК спарены по основанию с комлементарными нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК, где по меньшей мере два 3'-концевых нуклеотида в каждом фрагменте молекулы киНК не спарены по основанию с нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК. В другом варианте указанная молекула киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей одну или несколько химических модификаций, где каждая цепь включает в длину примерно 19 нуклеотидов и где нуклеотиды в каждом фрагменте молекулы киНК спарены по основанию с комлементарными нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК с образованием по меньшей мере примерно 15 пар оснований (например, 15, 16, 17, 18 или 19), где один или оба конца молекулы киНК представляют собой тупые концы. В одном варианте каждый из двух 3'-концевых нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК представляет собой 2'-дезоксипиримидиновый нуклеотид, такой как 2'-дезокситимидин. В одном варианте каждый из двух 3'-концевых нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК представляет собой 2'-О-метилпиримидиновый нуклеотид, такой как 2'-О-метил-уридин, -цитидин или -тимидин. В другом варианте все нуклеотиды в каждом фрагменте молекулы киНК спарены по основанию с комлементарными нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК. В другом варианте указанная молекула киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей от примерно 19 до примерно 25 пар оснований, которая содержит смысловой участок и антисмысловой участок и включает одну или несколько химических модификаций, где примерно 19 нуклеотидов в антисмысловом участке спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью РНК или ее частью, кодируемой целевым геном. В другом варианте примерно 21 нуклеотид в антисмысловом участке спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью РНК или ее частью, кодируемой целевым геном. В любом из указанных выше вариантов 5'-конец фрагмента, включающего антисмысловой участок, может необязательно содержать фосфатную группу.

В одном варианте настоящее изобретение относится к использованию молекулы двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) для достижения ингибирования, отрицательной регуляции или снижения экспрессии целевого гена, где одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК представляет собой антисмысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части, а другая цепь представляет собой смысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи. В одном варианте каждая цепь содержит по меньшей мере две химические модификации (например, 2, 3, 4, 5 или более), которые могут быть одинаковыми или разными, такие как модификации сахарного фрагмента нуклеотида, основания нуклеотида или нуклеотидного скелета. В одном варианте большинство пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента. В одном варианте большинство пуриновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая способна ингибировать, осуществлять отрицательную регуляцию или снижать экспрессию целевого гена, где одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК представляет собой антисмысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части, и где другая цепь представляет собой смысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи. В одном варианте каждая цепь содержит по меньшей мере две химические модификации (например, 2, 3, 4, 5 или более), которые могут быть одинаковыми или разными, такие как модификации сахарного фрагмента нуклеотида, основания нуклеотида или нуклеотидного скелета. В одном варианте большинство пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента. В одном варианте большинство пуриновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента.

В одном варианте настоящее изобретение относится к использованию молекулы двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая способна ингибировать, осуществлять отрицательную регуляцию или снижать экспрессию целевого гена, где одна из цепей указанной молекулы двухцепочечной киНК представляет собой антисмысловую цепь, которая содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой РНК, которая кодирует белок, или ее части, а другая цепь представляет собой смысловую цепь, которая содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи, и где большая часть пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента. В одном варианте каждая цепь молекулы киНК включает от примерно 15 до примерно 30 или более нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более), где каждая цепь включает по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидам в другой цепи. В одном варианте молекула киНК собирается из двух олигонуклеотидных фрагментов, где один включает нуклеотидную последовательность антисмысловой цепи молекулы киНК и второй фрагмент включает нуклеотидную последовательность смыслового участка молекулы киНК. В одном варианте смысловая цепь соединена с антисмысловой цепью через линкерную молекулу, такую как полинуклеотидный линкер или ненуклеотидный линкер. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды, и пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи, представляют собой 2'-дезокси-2'-пуриновые нуклеотиды. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды, и пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды. В еще одном варианте пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды, и любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В другом варианте антисмысловая цепь включает один или несколько 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновых нуклеотидов и один или несколько 2'-О-метилпуриновых нуклеотидов. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды, и любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды. В другом варианте указанная смысловая цепь включает 3'-конец и 5'-конец, где терминальный кэп-фрагмент (например, инвертированный дезоксибезосновный фрагмент или инвертированный дезоксинуклеотидный фрагмент, такой как инвертированный тимидин) присутствует на 5'-конце, 3'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах смысловой цепи. В другом варианте антисмысловая цепь включает фосфоротиоатную межнуклеотидную связь на 3'-конце антисмысловой цепи. В другом варианте антисмысловая цепь включает глицерильную модификацию на 3'-конце. В другом варианте 5'-конец антисмысловой цепи необязательно включает фосфатную группу.

В рамках любого из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения молекула двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая ингибирует экспрессию целевого гена, где большая часть пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента, каждая из двух цепей молекулы киНК может включать от примерно 15 до примерно 30 или более нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более). В одном варианте осуществления настоящего изобретения от примерно 15 до примерно 30 или более нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более) в каждой цепи молекулы киНК спарены по основанию с комплементарными нуклеотидами из другой цепи молекулы киНК. В одном варианте от примерно 15 до примерно 30 или более нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более) в каждой цепи молекулы киНК спарены по основанию с комплементарными нуклеотидами из другой цепи молекулы киНК, где по меньшей мере два 3'-концевых нуклеотида в каждой цепи молекулы киНК не спарены по основанию с нуклеотидами в другой цепи молекулы киНК. В другом варианте каждый из 3'-концевых нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК представляет собой 2'-дезоксипиримидин, такой как 2'-дезокситимидин. В одном варианте каждая цепь молекулы киНК спарена по основанию с комплементарными нуклеотидами из другой цепи молекулы киНК. В другом варианте от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более) в антисмысловой цепи спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью целевой РНК или ее частью. В одном варианте от примерно 18 до примерно 25 нуклеотидов (в частности, примерно 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) в антисмысловой цепи спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью целевой РНК или ее частью.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая ингибирует экспрессию целевого гена, где одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК представляет собой антисмысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части, и другая цепь представляет собой смысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи. В одном варианте каждая цепь содержит по меньшей мере две (например, 2, 3, 4 или 5 или более) различных химических модификаций, таких как модификации сахарного фрагмента нуклеотида, основания нуклеотида или нуклеотидного скелета. В одном варианте большая часть пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента. В другом варианте большая часть пуриновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента. В одном варианте 5'-конец антисмысловой цепи необязательно содержит фосфатную группу.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая ингибирует экспрессию целевого гена, где одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК представляет собой антисмысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части, и другая цепь представляет собой смысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи, и где большая часть пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента, и где указанная нуклеотидная последовательность или ее часть антисмысловой цепи комплементарна нуклеотидной последовательности нетранслируемого участка или его части в молекуле целевой РНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая ингибирует экспрессию целевого гена, где одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК представляет собой антисмысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части, где другая цепь представляет собой смысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи, и где большая часть пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента, и где указанная нуклеотидная последовательность антисмысловой цепи комплементарна нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части, которая присутствует в целевой РНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей молекулу киНК согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В другом варианте настоящее изобретение относится к двум или более различающимся молекулам киНК согласно настоящему изобретению (например, к молекулам киНК, действие которых направлено на различные участки целевой РНК, или молекулам киНК, которые направленно воздействуют на SREBP1 путь РНК) и фармацевтически приемлемому носителю или разбавителю.

В не ограничивающем примере осуществления настоящего изобретения встраивание химически модифицированных нуклеотидов в молекулы нуклеиновой кислоты представляет собой мощный инструмент, позволяющий преодолеть возможные ограничения по стабильности и биодоступности in vivo, характерные нативным молекулам РНК, которые подлежат экзогенной доставке. Так, например, использование молекул химически модифицированной нуклеиновой кислоты может позволить снизить дозу конкретной вводимой молекулы нуклеиновой кислоты для достижения заданного терапевтического эффекта, поскольку молекулы химически модифицированной нуклеиновой кислоты имеют более длительный период полувыведения из сыворотки. Кроме того, некоторые химические модификации могут повышать биодоступность молекул нуклеиновой кислоты за счет их прямого воздействия на конкретные клетки или ткани и/или за счет повышения уровня захвата молекул нуклеиновой кислоты клетками. В этой связи даже если активность молекул химически модифицированной нуклеиновой кислоты снижена в сравнении с молекулой нативной нуклеиновой кислоты, например в сравнении с молекулами нуклеиновой кислоты, применительно к суммарной РНК, то общая активность молекул модифицированной нуклеиновой кислоты может быть выше, чем нативной молекулы, в связи с повышенной стабильностью и/или благодаря повышенному уровню доставки молекулы. В отличие от нативных немодифицированных киНК химически модифицированные киНК также позволяют минимизировать возможность активации активности интерферона или возможность иммуностимуляции у людей. В этой связи указанные свойства являются преимуществом относительно нативных киРНК или минимально модифицированных киРНК, в свете их способности опосредовать РНКи, в контексте различных применений in vivo или in vitro, включая использование в исследовательских целях и в терапевтических стратегиях. Автор настоящего изобретения описывает молекулы химически модифицированных киНК с повышенной РНКи активностью в сравнении с соответствующими немодифицированными или минимально модифицированными молекулами киРНК. Химически модифицированные мотивы киНК, приведенные в настоящем описании, обеспечивают возможность поддерживать активность РНКи, которая по существу аналогична таковой для немодифицированных или минимально модифицированных активных киРНК (см., например, Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20:6877-6888), но обеспечивая в то же время устойчивость к действию нуклеаз и фармакокинетические свойства, приемлемые для использования в терапевтических вариантах применения.

В молекулах киНК, согласно любому варианту осуществления изобретения, антисмысловой участок рассматриваемой молекулы киНК может включать фосфоротиоатную межнуклеотидную связь на 3'-конце указанного антисмыслового участка. В любых вариантах молекулы киНК согласно настоящему изобретению, приведенные в настоящем описании, характеризуются наличием антисмыслового участка, который может включать от примерно одной до примерно пяти фосфоротиоатных межнуклеотидных связей на 5'-конце указанного антисмыслового участка. В любых вариантах осуществления настоящего изобретения в рассматриваемых молекулах киНК 3'-концевые нуклеотидные выступающие фрагменты молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут включать рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды, которые химически модифицированы по сахарному фрагменту, основанию или скелету нуклеиновой кислоты. В любом из вариантов осуществления настоящего изобретения в рассматриваемых молекулах киНК 3'-концевые нуклеотидные выступающие фрагменты могут включать, в качестве универсального основания один или несколько рибонуклеотидов. В любом из вариантов осуществления настоящего изобретения в молекулах киНК 3'-концевые нуклеотидные выступающие фрагменты могут включать один или несколько ациклических нуклеотидов.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к вектору экспрессии, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует по меньшей мере одну молекулу киНК согласно настоящему изобретению, таким образом, что допускается экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к клетке млекопитающего, включающей такой вектор экспрессии. Указанная клетка млекопитающего может представлять собой человеческую клетку. Молекула киНК в векторе экспрессии может включать смысловой участок и антисмысловой участок. Антисмысловой участок может включать последовательность, комплементарную последовательности РНК или ДНК, кодирующей мишень, а смысловой участок может включать последовательность, комплементарную антисмысловому участку. Молекула киНК может включать две различающихся цепи, содержащие комплементарные смысловой и антисмысловой участки. Молекула киНК может включать одну цепь, содержащую комплементарные смысловой и антисмысловой участки.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) внутри клетки или в составе восстановленной in vitro системы, где указанная модификация включает один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) нуклеотидов, включающих модифицированные межнуклеотидные связи в скелете молекулы формулы I:

где каждый R1 и R2 независимо обозначает нуклеотид, фрагмент, отличный от нуклеотида, или полинуклеотид, который может быть природным или может быть химически модифицирован и который может быть включен в структуру молекулы киНК или может выполнять функцию точки присоединения к молекуле киНК, каждый X и Y независимо обозначает O, S, N, алкил или замещенный алкил, каждый Z и W независимо обозначают O, S, N, алкил, замещенный алкил, О-алкил, S-алкил, алкарил, аралкил или ацетил, и где W, X, Y и Z необязательно, но не все, обозначают O. В другом варианте модификация скелета согласно настоящему изобретению включает фосфоротиоатные и/или тиофосфоноацетатные межнуклеотидные связи (см., например, Sheehan et al., 2003, Nucleic Acids Research, 31, 4109-4118).

Химически модифицированные межнуклеотидные связи, имеющиеся в структуре формулы I, например, где любой из Z, W, X и/или Y необязательно включает атом серы, могут присутствовать в одной или обеих олигонуклеотидных цепях дуплекса киНК, например в смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях. Молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут включать одну или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) химически модифицированных межнуклеотидных связей, согласно формуле I, на 3'-конце и 5'-конце или на обоих: 3'-конце и 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. Например, репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) химически модифицированных межнуклеотидных связей, согласно формуле I, на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. В другом не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) пиримидиновых нуклеотидов с химически модифицированными межнуклеотидными связями, согласно формуле I, в смысловой цепи, антисмысловой цепи или в обеих цепях. В еще одном не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) пуриновых нуклеотидов с химически модифицированными межнуклеотидными связями, согласно формуле I, в смысловой цепи, антисмысловой цепи или в обеих цепях. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению, содержащая одну или несколько межнуклеотидных связей, согласно формуле I, также включает химически модифицированный нуклеотид или фрагмент ненуклеотидной природы и описывается формулами I-VII.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) внутри клетки или в составе восстановленной in vitro системы, где указанная химическая модификация включает один или несколько нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) формулы II:

где каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11 или R12 обозначает независимо H, OH, алкил, замещенный алкил, алкарил или аралкил, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-алкил, S-алкил, N-алкил, O-алкенил, S-алкенил, N-алкенил, SO-алкил, алкил-OSH, алкил-OH, O-алкил-OH, O-алкил-SH, S-алкил-OH, S-алкил-SH, алкил-S-алкил, алкил-O-алкил, ONO2, NO2, N3, NH2, аминоалкил, аминокислоту, аминоацил, ONH2, O-аминоалкил, О-аминокислоту, О-аминоацил, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил или группу формулы I, II, III, IV, V, VI и/или VII, где любая из указанных групп может быть включена в структуру молекулы киНК или служить точкой присоединения к молекуле киНК; R9 обозначает O, S, CH2, S=O, CHF или CF2, и B обозначает нуклеозидное основание, такое как аденин, гуанин, урацил, цитозин, тимин, 2-аминоаденозин, 5-метилцитозин, 2,6-диаминопурин или любое другое неприродное основание, которое может быть комплементарным или может быть некомплементарным к целевой РНК, или ненуклеозидное основание, такое как фенил, нафтил, 3-нитропиррол, 5-нитроиндол, небуларин, пиридон, пиридинон или любое другое неприродное универсальное основание, которое может быть комплементарным или может быть некомплементарным к целевой РНК. В одном варианте R3 и/или R7 включает конъюгированные фрагмент и линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, согласно настоящему описанию, или иной, известный в данной области). Не ограничивающие примеры конъюгированных фрагментов включают лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие белковую локализацию, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин. В одном варианте нуклеотид согласно настоящему изобретению, описываемый формулой II, представляет 2'-дезокси-2'-фторнуклеотид. В одном варианте нуклеотид согласно настоящему изобретению, описываемый формулой II, представляет собой 2'-О-метилнуклеотид. В одном варианте нуклеотид согласно настоящему изобретению, описываемый формулой II, представляет 2'-дезоксинуклеотид.

Химически модифицированные нуклеотид или фрагмент ненуклеотидной природы формулы II может присутствовать в одной или обеих олигонуклеотидных цепях дуплекса киНК, например в его смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях. Молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут включать один или несколько химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы II на 3'-конце и 5'-конце или на обоих: 3'-конце и 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или в обеих цепях. Например, репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы II на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. В другом не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы II на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) внутри клетки или в составе восстановленной in vitro системы, где указанная химическая модификация включает один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы III:

где каждый из R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11 или R12 обозначает независимо H, OH, алкил, замещенный алкил, алкарил или аралкил, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-алкил, S-алкил, N-алкил, O-алкенил, S-алкенил, N-алкенил, SO-алкил, алкил-OSH, алкил-OH, O-алкил-OH, O-алкил-SH, S-алкил-OH, S-алкил-SH, алкил-S-алкил, алкил-O-алкил, ONO2, NO2, N3, NH2, аминоалкил, аминокислоту, аминоацил, ONH2, O-аминоалкил, О-аминокислоту, О-аминоацил, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил или группу формулы I, II, III, IV, V, VI и/или VII, где любая из указанных групп может быть включена в структуру молекулы киНК или служить точкой присоединения к молекуле киНК; R9 обозначает O, S, CH2, S=O, CHF или CF2, и B обозначает нуклеозидное основание, такое как аденин, гуанин, урацил, цитозин, тимин, 2-аминоаденозин, 5-метилцитозин, 2,6-диаминопурин или любое другое неприродное основание, которое может быть комплементарным или может быть некомплементарным к целевой РНК, или ненуклеозидное основание, такое как фенил, нафтил, 3-нитропиррол, 5-нитроиндол, небуларин, пиридон, пиридинон или любое другое неприродное универсальное основание, которое может быть комплементарным или может быть некомплементарным к целевой РНК. В одном варианте R3 и/или R7 включает/ют конъюгированные фрагмент и линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, приведенный в настоящем описании, или иной, известный в данной области). Не ограничивающие примеры конъюгированных фрагментов включают лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие белковую локализацию, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин.

Химически модифицированные нуклеотид или фрагмент ненуклеотидной природы формулы III может присутствовать в одной или в обеих олигонуклеотидных цепях дуплекса киНК, например в его смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях. Молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут включать один или несколько химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы III на 3'-конце и 5'-конце или на обоих: 3'-конце и 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. Например, репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы III на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. В другом не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы III на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает нуклеотид формулы II или III, где указанный нуклеотид формулы II или III имеет инвертированную конфигурацию. Так, например, нуклеотид формулы II или III соединен с конструкцией киНК в конфигурации 3'-3', 3'-2', 2'-3' или 5'-5', например, на 3'-конце, на 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах одной или обеих цепей киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) внутри клетки или в составе восстановленной in vitro системы, где указанная химическая модификация включает 5'-концевую фосфатную группу формулы IV:

где каждый X и Y независимо обозначает O, S, N, алкил, замещенный алкил или алкилгалоген; каждый Z и W независимо обозначает O, S, N, алкил, замещенный алкил, О-алкил, S-алкил, алкарил, аралкил, алкилгалоген или ацетил; и где W, X, Y и Z необязательно, но не все, обозначают O и Y, служит в качестве точки присоединения к молекуле киНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, содержащей 5'-концевую фосфатную группу формулы IV в составе цепи, комплементарной к мишени, например в цепи, комплементарной к целевой РНК, где молекула киНК включает молекулу киНК суммарной РНК. В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, содержащей 5'-концевую фосфатную группу формулы IV в составе цепи, комплементарной к мишени, где указанная молекула киНК также включает от примерно 1 до примерно 3 (например, примерно 1, 2 или 3) нуклеотида в 3'-концевом выступающем нуклеотидном фрагменте, содержащем от примерно 1 до примерно 4 (в частности, примерно 1, 2, 3 или 4) дезоксирибонуклеотидов на 3'-конце одной или обеих цепей. В другом варианте 5'-концевая фосфатная группа формулы IV присутствует в составе цепи, комплементарной к мишени, в молекуле киНК согласно настоящему изобретению, например, молекуле киНК, содержащей химические модификации согласно формулам I-VII.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) внутри клетки или в составе восстановленной in vitro системы, где указанная химическая модификация включает одну или несколько фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. Например, в не ограничивающем примере настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), содержащей примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более фосфоротиоатных межнуклеотидных связей в одной цепи киНК. В еще одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), содержащей примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более фосфоротиоатных межнуклеотидных связей в обеих цепях киНК. Указанные фосфоротиоатные межнуклеотидные связи могут присутствовать в одной или в обеих олигонуклеотидных цепях дуплекса киНК, например в смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях. Указанные молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут включать одну или несколько фосфоротиоатных межнуклеотидных связей на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: на 3'-конце и на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. Например, репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) последовательных фосфоротиоатных межнуклеотидных связей на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепях. В другом не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать одну или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) пиримидиновых фосфоротиоатных межнуклеотидных связей в смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях. В еще одном не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать одну или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) пуриновых фосфоротиоатных межнуклеотидных связей в смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях.

Каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению может содержать одну или несколько химических модификаций, так что каждая цепь характеризуется определенной картиной химических модификаций. Несколько не ограничивающих примеров разных схем модификаций, которые могут привести к созданию разных картин модификации, описаны ниже.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, где смысловая цепь включает одну или несколько, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильных, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильных, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, и/или примерно один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи; и где указанная антисмысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 10 или более, конкретно примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильных, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильных, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или более (в частности, примерно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно концевой кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой цепи. В другом варианте один или несколько, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, пиримидиновых нуклеотидов в смысловой и/или антисмысловой цепи киНК химически модифицированы до 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тио- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидов, при наличии или в отсутствие одной или нескольких, в частности примерно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей и/или терминального кэп-фрагмента на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах, которые могут присутствовать на одной или на разных цепях.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, где указанная смысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 5, конкретно примерно 1, 2, 3, 4 или 5, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно, 1, 2, 3, 4, 5 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тио-, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи; и где указанная антисмысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 5 или более, конкретно примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой цепи. В другом варианте один или несколько, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, пиримидиновых нуклеотидов в смысловой и/или в антисмысловой цепи киНК химически модифицированы до 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тио- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидов, при наличии или в отсутствие от примерно 1 до примерно 5 или более, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей и/или концевого кэп-фрагмента на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах, которые могут присутствовать на одной и той же цепи или на разных цепях.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, где указанная антисмысловая цепь включает одну или несколько, конкретно примерно, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или примерно один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи; и где указанная антисмысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 10 или более, конкретно примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой цепи. В другом варианте один или несколько, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, пиримидиновых нуклеотидов в смысловой и/или в антисмысловой цепи киНК химически модифицированы до 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тио- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидов, при наличии или в отсутствие одной или нескольких, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или концевого кэп-фрагмента на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах, которые могут присутствовать на одной и той же или на разных цепях.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, где антисмысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 5 или более, конкретно примерно 1,2, 3, 4, 5 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи; и где указанная антисмысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 5 или более, конкретно примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или несколько (в частности, примерно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой цепи. В другом варианте один или несколько, в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, пиримидиновых нуклеотидов в смысловой и/или антисмысловой цепи киНК химически модифицированы до 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тио- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидов, при наличии или в отсутствие от примерно 1 до примерно 5, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или концевого кэп-фрагмента на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах, которые могут присутствовать на одной и той же цепи или на разных цепях.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), содержащей от 1 до примерно 5 или более (конкретно, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) фосфоротиоатных межнуклеотидных связей в каждой цепи молекулы киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей 2'-5'-межнуклеотидные связи. Одна или несколько 2'-5'-межнуклеотидных связей могут находиться на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах одной или нескольких цепей последовательности киНК. Кроме того, одна или несколько 2'-5'-межнуклеотидных связей может присутствовать в различных других положениях на одной или обеих цепях последовательности киНК, в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, включая каждую межнуклеотидную связь пиримидинового нуклеотида в одной или обеих цепях молекулы киНК, которая может включать 2'-5'-межнуклеотидную связь, или примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, включая каждую межнуклеотидную связь пуринового нуклеотида в одной или обеих цепях молекулы киНК, которая может включать 2'-5'-межнуклеотидную связь.

В другом варианте молекула химически модифицированной киНК согласно настоящему изобретению включает дуплекс, содержащий две цепи, где одна или обе указанные цепи могут быть химически модифицированы, где каждая цепь независимо включает от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов в длину, где указанный дуплекс содержит от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) пар оснований и где указанная химическая модификация включает структуру, соответствующую любой из формул I-VII. Например, репрезентативная химически модифицированная молекула киНК согласно настоящему изобретению включает дуплекс, содержащий две цепи, где одна или обе указанные цепи могут быть химически модифицированы посредством химической модификации, включающей структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию, где каждая цепь состоит примерно из 21 нуклеотида и каждая из них содержит двухнуклеотидный 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент и где указанный дуплекс содержит примерно 19 пар оснований. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает одноцепочечную шпилечную структуру, где указанная киНК содержит от примерно 36 до примерно 70 (в частности, примерно 36, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70) нуклеотидов в длину и содержит от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) пар оснований и где указанная молекула киНК может включать химическую модификацию, соответствующую структуре любой из формул I-VII или любому их сочетанию. Например, репрезентативная химически модифицированная молекула киНК согласно настоящему изобретению включает линейный олигонуклеотид, содержащий от примерно 42 до примерно 50 (в частности, примерно 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50) нуклеотидов, которые химически модифицированы посредством химической модификации, включающей структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию, где указанный линейный олигонуклеотид формирует шпилечную структуру, содержащую от примерно 19 до примерно 21 (в частности, примерно 19, 20 или 21) пар оснований и двухнуклеотидный 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент. В другом варианте молекула линейной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению включает мотив стволовой части петли, где часть петли в молекуле киНК является биодеградируемой. Например, молекула линейной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению конструируется таким образом, чтобы при разложении петлевой части молекулы киНК in vivo могла образовываться молекула двухцепочечной киНК с 3'-концевым выступающим фрагментом, таким как 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, содержащий примерно 2 нуклеотида.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает шпилечную структуру, где указанная молекула киНК содержит от примерно 25 до примерно 50 (в частности, примерно 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50) нуклеотидов в длину и содержит от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) пар оснований и где указанная молекула киНК может включать одну или несколько химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию. Например, репрезентативная молекула химически модифицированной киНК согласно настоящему изобретению включает линейный олигонуклеотид, содержащий от примерно 25 до примерно 35 (в частности, примерно 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35) нуклеотидов, которые химически модифицированы посредством одной или нескольких химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию, где указанный линейный олигонуклеотид формирует шпилечную структуру, содержащую от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) пар оснований и 5'-концевую фосфатную группу, которая может быть химически модифицирована согласно настоящему описанию (например, по 5'-концевой фосфатной группе формулы IV). В другом варианте молекула линейной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению содержит мотив стволовой части петли, где указанная петлевая часть молекулы киНК является биодеградируемой. В одном варианте молекула линейной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению включает петлевую часть, содержащую ненуклеотидный линкер.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает асимметричную шпилечную структуру, где указанная молекула киНК содержит от примерно 25 до примерно 50 (в частности, примерно 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50) нуклеотидов в длину и содержит от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) пар оснований и где указанная молекула киНК может включать одну или несколько химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию. Например, репрезентативная химически модифицированная молекула киНК согласно настоящему изобретению включает линейный олигонуклеотид, содержащий от примерно 25 до примерно 35 (в частности, примерно 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35) нуклеотидов, которые химически модифицированы посредством одной или нескольких химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию, где указанный линейный олигонуклеотид формирует асимметричную шпилечную структуру, содержащую от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) пар оснований и 5'-концевую фосфатную группу, которая может быть химически модифицирована согласно настоящему описанию (например, по 5'-концевой фосфатной группе формулы IV). В одном варианте молекула асимметричной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению содержит мотив стволовой части петли, где указанная петлевая часть молекулы киНК является биодеградируемой. В другом варианте молекула асимметричной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению включает петлевую часть, содержащую ненуклеотидный линкер.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает асимметричную двухцепочечную структуру, содержащую отдельные полинуклеотидные цепи, которые включают смысловой и антисмысловой участки, где антисмысловой участок имеет от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов в длину, и где указанный смысловой участок содержит от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) нуклеотидов в длину, и где указанный смысловой участок и указанный антисмысловой участок содержат по меньшей мере 3 комплементарных нуклеотида, и где указанная молекула киНК может включать одну или несколько химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию. Например, репрезентативная химически модифицированная молекула киНК согласно настоящему изобретению включает асимметричную двухцепочечную структуру, содержащую отдельные полинуклеотидные цепи, которые включают смысловой участок и антисмысловой участок, где указанный антисмысловой участок содержит от примерно 18 до примерно 23 (в частности, примерно 18, 19, 20, 21, 22 или 23) нуклеотидов в длину, и где указанный смысловой участок содержит от примерно 3 до примерно 15 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15) нуклеотидов в длину, и где указанный смысловой участок и указанный антисмысловой участок содержат по меньшей мере 3 комплементарных нуклеотида, и где указанная молекула киНК может включать одну или несколько химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию. В другом варианте молекула асимметричной двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению может также содержать 5'-концевую фосфатную группу, которая может быть химически модифицирована согласно настоящему описанию (например, по 5'-концевой фосфатной группе формулы IV).

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает кольцевую молекулу нуклеиновой кислоты, где указанная молекула киНК включает в длину от примерно 38 до примерно 70 нуклеотидов (в частности, примерно 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70) и содержит от примерно 15 до примерно 30 пар оснований (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) и где указанная молекула киНК может содержать химическую модификацию, которая включает структуру, соответствующую формулам I-VII или любому их сочетанию. Например, репрезентативная молекула химически модифицированной киНК согласно настоящему изобретению включает кольцевой олигонуклеотид, содержащий от примерно 42 до примерно 50 нуклеотидов (в частности, примерно 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50), которые химически модифицированы посредством химической модификации, которая включает структуру, соответствующую формулам I-VII или любому их сочетанию, где указанный кольцевой олигонуклеотид формирует структуру в форме гантели, содержащую примерно 19 пар оснований и 2 петли.

В другом варианте кольцевая молекула киНК согласно настоящему изобретению содержит два петлевых мотива, где одна или обе петлевых части в молекуле киНК являются биодеградируемыми. Например, кольцевая молекула киНК согласно настоящему изобретению сконструирована таким образом, что разложение петлевых частей молекулы киНК in vivo может приводить к образованию молекулы двухцепочечной киНК с 3'-концевыми выступающими фрагментами, такими как 3'-концевые нуклеотидные выступающие фрагменты, содержащие примерно 2 нуклеотида.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере один (например, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) безосновный фрагмент, например соединение формулы V:

где каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11, R12 и R13 независимо обозначает Н, ОН, алкил, замещенный алкил, алкарил или аралкил, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-алкил, S-алкил, N-алкил, О-алкенил, S-алкенил, N-алкенил, SO-алкил, алкил-OSH, алкил-ОН, О-алкил-ОН, О-алкил-SH, S-алкил-ОН, S-алкил-SH, алкил-S-алкил, алкил-О-алкил, ONO2, NO2, N3, NH2, аминоалкил, аминокислоту, аминоацил, ONH2, О-аминоалкил, О-аминокислоту, О-аминоацил, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил или группу, описываемую любой из формул I, II, III, IV, V, VI и/или VII, где каждый из указанных фрагментов может быть включен в структуру молекулы киНК или выполнять функцию точки присоединения к молекуле киНК; R9 обозначает О, S, CH2, S=O, CHF или СF2. В одном варианте R3 и/или R7 включает конъюгированный фрагмент и линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, приведенный в настоящем описании, или иной линкер, известный в данной области). Не ограничивающие примеры конъюгированных фрагментов включают лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие локализацию белка, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере один инвертированный безосновный фрагмент (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более фрагментов), например соединение формулы VI:

где каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11, R12 и R13 обозначает независимо Н, ОН, алкил, замещенный алкил, алкарил или аралкил, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-алкил, S-алкил, N-алкил, О-алкенил, S-алкенил, N-алкенил, SO-алкил, алкил-OSH, алкил-ОН, О-алкил-ОН, О-алкил-SH, S-алкил-ОН, S-алкил-SH, алкил-S-алкил, алкил-О-алкил, ONO2, NO2, N3, NH2, аминоалкил, аминокислоту, аминоацил, ONH2, О-аминоалкил, О-аминокислоту, О-аминоацил, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил или группу, описываемую любой из формул I, II, III, IV, V, VI и/или VII, где каждая из указанных групп может быть включена в структуру молекулы киНК или выполнять функцию точки присоединения к молекуле киНК; R9 обозначает О, S, CH2, S=О, CHF или СF2 и любой из R2, R3, R8 или R13 служит в качестве точек присоединения к молекуле киНК согласно настоящему изобретению. В одном варианте R3 и/или R7 включает конъюгированный фрагмент и линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, приведенный в настоящем описании, или иной линкер, известный в данной области). Не ограничивающие примеры конъюгированных фрагментов включают лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие локализацию белка, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела, аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере один замещенный полиалкильный фрагмент (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более), например соединение формулы VII:

где n независимо равен целому числу от 1 до 12, каждый R1, R2 и R3 обозначает независимо Н, ОН, алкил, замещенный алкил, алкарил или аралкил, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-алкил, S-алкил, N-алкил, О-алкенил, S-алкенил, N-алкенил, SO-алкил, алкил-OSH, алкил-ОН, О-алкил-ОН, О-алкил-SH, S-алкил-ОН, S-алкил-SH, алкил-S-алкил, алкил-О-алкил, ONO2, NO2, N3, NH2, аминоалкил, аминокислоту, аминоацил, ONH2, О-аминоалкил, О-аминокислоту, О-аминоацил, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил или группу, описываемую любой из формул I, II, III, IV, V, VI и/или VII, где каждая из указанных групп может быть включена в структуру молекулы киНК или выполнять функцию точки присоединения к молекуле киНК. В одном варианте R3 и/или R1 включает конъюгированный фрагмент и линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, приведенный в настоящем описании, или иной линкер, известный в данной области). Не ограничивающие примеры конъюгированных фрагментов включают лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие локализацию белка, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин.

Термин «ZIP-кодовые» последовательности обозначает любую пептидную или белковую последовательность, которая вовлекается в клеточный топогенный транспорт, опосредованный сигнальным событием (см., например, Ray et al., 2004, Science, 306(1501): 1505).

Каждый нуклеотид в составе молекулы двухцепочечной киНК может независимо содержать химическую модификацию, включающую структуру, соответствующую любой из формул I-VIII. Таким образом, в одном варианте одно или несколько нуклеотидных положений в молекуле киНК согласно настоящему изобретению включает химическую модификацию, соответствующую структуре любой из формул I-VII, или любую другую модификацию согласно настоящему описанию. В одном варианте каждое нуклеотидное положение в составе молекулы киНК согласно настоящему изобретению содержит химическую модификацию, соответствующую любой из формул I-VII, или любую другую модификацию согласно настоящему описанию.

В одном варианте одно или несколько нуклеотидных положений в одной или обеих цепях молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает химическую модификацию, соответствующую структуре любой из формул I-VII, или любую другую модификацию согласно настоящему описанию. В одном варианте каждое нуклеотидное положение в одной или обеих цепях молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению содержит химическую модификацию, соответствующую любой из формул I-VII, или любую другую модификацию согласно настоящему описанию.

В другом варианте настоящее изобретение относится к соединению формулы VII, где R1 и R2 обозначают гидроксильные (ОН) группы, n=1, и R3 обозначает О и является точкой присоединения к 3'-концу, 5'-концу или к обоим: 3'- и 5'-концам на одной или обеих цепях молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению или к одноцепочечной молекуле киНК согласно настоящему изобретению. Данная модификация обозначается в настоящем описании как «глицерильная» модификация (например, модификация 6, показанная на фиг. 10).

В другом варианте химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент, соответствующий любой из формул V, VI или VII) согласно настоящему изобретению находятся на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах молекулы киНК согласно настоящему изобретению. Например, химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент, соответствующий формуле V, VI или VII) может присутствовать на 3'-конце, на 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой цепи, смысловой цепи или в обеих: антисмысловой и смысловой цепях молекулы киНК. В одном варианте химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент формулы V, VI или VII) присутствует на 5'-конце и 3'-конце смысловой цепи и на 3'-конце антисмысловой цепи молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению. В одном варианте химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент формулы V, VI или VII) присутствует в терминальном положении на 5'-конце и 3'-конце смысловой цепи и на 3'-конце антисмысловой цепи молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению. В одном варианте химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент, соответствующий формулам V, VI или VII) присутствует в двух терминальных положениях на 5'-конце и 3'-конце смысловой цепи и на 3'-конце антисмысловой цепи молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению. В одном варианте химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент формулы V, VI или VII) присутствует в предпоследнем положении на 5'-конце и 3'-конце смысловой цепи и на 3'-конце антисмысловой цепи молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению. Дополнительно, фрагмент формулы VII может присутствовать на 3'-конце или 5'-конце молекулы шпилечной киНК согласно настоящему описанию.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает безосновный остаток формулы V или VI, где указанный безосновный остаток, соответствующий формуле V или VI, соединен с конструкцией киНК в 3'-3', 3'-2', 2'-3' или 5'-5' конфигурации, например, может находиться на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах одной или обеих цепей киНК.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) нуклеотидов в закрытой нуклеиновой кислоте (LNA), например, на 5'-конце, 3'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах или согласно любому их сочетанию, в молекуле киНК.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 4'-тионуклеотидов, например, на 5'-конце, 3'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах или согласно любому их сочетанию, в молекуле киНК.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) ациклических нуклеотидов, например, на 5'-конце, 3'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах или согласно любому их сочетанию, в молекуле киНК.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает смысловую цепь или смысловой участок, содержащий одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) модификаций: 2'-О-алкильную (например, 2'-О-метильную), 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси-, FANA или безосновную химическую модификацию, или любое их сочетание.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает антисмысловую цепь или антисмысловой участок, содержащий одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) модификаций: 2'-О-алкильную (например, 2'-О-метильную), 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси-, FANA или безосновную химическую модификацию, или любое их сочетание.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает смысловую цепь или смысловой участок и антисмысловую цепь или антисмысловой участок, содержащий одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) модификаций: 2'-О-алкильную (например, 2'-О-метильную), 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси-, FANA или безосновную химическую модификацию, или любое их сочетание.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей смысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-пиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-пиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-пиримидиновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей смысловой участок, где любые (например, один, или несколько, или все) пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке, представляет собой FANA-пиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой FANA-пиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой FANA-пиримидиновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей антисмысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-пиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-пиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-пиримидиновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей смысловой участок и антисмысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке и в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-пиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-пиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-пиримидиновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей смысловой участок, где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей антисмысловой участок, где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей смысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды) и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей смысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды), и где любые нуклеотиды, включающие 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, присутствующий в указанном смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей смысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтокси пиримидиновые нуклеотиды) и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей смысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды), и где любые нуклеотиды, включающие 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, присутствующий в указанном смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей антисмысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляет собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей антисмысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтокси пуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды), и где любые нуклеотиды, включающие 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, присутствующий в указанном антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей антисмысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды) и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей антисмысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды) и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к химически модифицированной молекуле короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) в клетке или в составе восстановленной in vitro системы, включающей смысловой участок, где один или несколько пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) из пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и один или несколько пуриновых нуклеотидов, присутствующих в смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) из пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды), и антисмысловой участок, где один или несколько пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и один или несколько пуриновых нуклеотидов, присутствующих в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды). Смысловой участок и/или антисмысловой участок могут содержать модификацию в виде концевого кэппинга, такую как модификация, приведенная в настоящем описании или проиллюстрированная на фиг.10, которая необязательно может присутствовать на 3'-конце, 5'-конце или на обоих из них: и 3'-, и 5'-концах смысловой и/или антисмысловой последовательности. Смысловой участок и/или антисмысловой участок необязательно могут также содержать 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, включающий от примерно 1 до примерно 4 (например, 1, 2, 3 или 4) 2'-дезоксиинуклеотидов. Нуклеотиды на выступающем фрагменте могут также включать одну или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) фосфоротиоатных, фосфоноацетатных и/или тиофосфоноацетатных межнуклеотидных связей. Не ограничивающие примеры указанных химически модифицированных киНК проиллюстрированы на фиг. 4 и 5 и приведены в Таблице II в настоящем описании. В рамках любого из описанных здесь вариантов пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке, альтернативно представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов представляет собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды) и один или несколько пуриновых нуклеотидов, присутствующих в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды). Кроме того, в соответствии с любым описанным здесь вариантом один или несколько пуриновых нуклеотидов, присутствующих в смысловом участке, альтернативно представляют собой пуриновые рибонуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой пуриновые рибонуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой пуриновые рибонуклеотиды) и любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды). Дополнительно, согласно любому из указанных вариантов один или несколько пуриновых нуклеотидов, присутствующих в смысловом и/или антисмысловом участке, альтернативно выбирают из группы, состоящей из 2'-дезоксинуклеотидов, нуклеотидов закрытых нуклеиновых кислот (LNA), 2'-метоксиэтилнуклеотидов, 4'-тионуклеотидов, 2'-О-трифторметилнуклеотидов, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотидов, 2'-дифторметоксиэтоксинуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов (например, где все пуриновые нуклеотиды выбирают из группы, состоящей из 2'-дезоксинуклеотидов, нуклеотидов закрытых нуклеиновых кислот (LNA), 2'-метоксиэтилнуклеотидов, 4'-тионуклеотидов, 2'-О-трифторметилнуклеотидов, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотидов, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов выбирают из группы, состоящей из 2'-дезоксинуклеотидов, нуклеотидов закрытых нуклеиновых кислот (LNA), 2'-метоксиэтилнуклеотидов, 4'-тионуклеотидов, 2'-О-трифторметилнуклеотидов, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотидов, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов).

В другом варианте любые модифицированные нуклеотиды, присутствующие в молекулах киНК согласно настоящему изобретению, предпочтительно в антисмысловой цепи молекул киНК согласно настоящему изобретению, но также, необязательно, и в смысловой и/или в обеих: антисмысловой и смысловой, цепях, включают модифицированные нуклеотиды, обладающие свойствами или характеристиками, которые аналогичны природным рибонуклеотидам. Так, например, настоящее изобретение относится к молекулам киНК, включающим модифицированные нуклеотиды, имеющие нозерн-конформацию (например, конформацию согласно циклу псевдоротации, см., например, Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984), иначе известную как «рибо-подобная» конфигурация или «А-спираль». Соответственно, химически модифицированные нуклеотиды, присутствующие в молекулах киНК согласно настоящему изобретению, предпочтительно в антисмысловой цепи молекул киНК согласно настоящему изобретению, но также, необязательно, и в смысловой и/или в обеих: антисмысловой и смысловой, цепях, устойчивы к нуклеазной деградации, но сохраняют при этом способность опосредовать РНКи. Не ограничивающие примеры нуклеотидов, имеющих нозерн-конформацию, включают нуклеотиды закрытых нуклеиновых кислот (LNA) (например, 2'-О, 4'-С-метилен-(D-рибофуранозил)нуклеотиды); 2'-метоксиэтокси нуклеотиды (МОЕ); 2'-метилтиоэтил-, 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-хлорнуклеотиды, 2'-азидонуклеотиды, 2'-О-трифторметилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды, 4'-тионуклеотиды и 2'-О-метилнуклеотиды.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемая в нем смысловая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает концевой кэппинг-фрагмент (см., например, фиг.10), такой как инвертированный дезоксибезосновный фрагмент, на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи.

В одном варианте настоящее изобретение относится к химически модифицированной молекуле короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) в клетке или в составе восстановленной in vitro системы, где указанная химическая модификация включает конъюгат, ковалентно присоединенный к химически модифицированной молекуле киНК. Не ограничивающие примеры конъюгатов согласно настоящему изобретению включают конъюгаты, описанные в документе: Vargeese et al., USSN 10/427160, зарегистрированном 30 апреля 2003 г., который включен в настоящее описание полностью, включая имеющиеся в нем чертежи. В другом варианте указанный конъюгат ковалентно присоединен к химически модифицированной молекуле киНК через биодеградируемый линкер. В одном варианте указанную молекулу конъюгата присоединяют к 3'-концу любой из цепей: смысловой или антисмысловой, или к обеим цепям химически модифицированной молекулы киНК. В другом варианте указанную молекулу конъюгата присоединяют к 5'-концу любой из цепей: смысловой или антисмысловой, или к обеим цепям химически модифицированной молекулы киНК. В еще одном варианте указанную молекулу конъюгата присоединяют и к 3'-, и к 5'-концу любой из цепей: смысловой или антисмысловой, или к обеим цепям химически модифицированной молекулы киНК, или к их сочетанию. В одном варианте молекула конъюгата согласно настоящему изобретению включает молекулу, которая облегчает доставку химически модифицированной молекулы киНК в биологическую систему, такую как клетка. В другом варианте молекула конъюгата, присоединенная к химически модифицированной молекуле киНК согласно настоящему изобретению, представляет собой лиганд для клеточного рецептора, такой как пептиды, получаемые из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие локализацию белка, включающие клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин. Примеры конкретных молекул конъюгатов согласно настоящему изобретению, которые могут быть присоединены к химически модифицированным молекулам киНК, описаны в документе: Vargeese et al., U.S. Serial № 10/201394, зарегистрированном 22 июля 2002, который включен в настоящее изобретение в качестве ссылки. Тип используемых конъюгатов и уровень конъюгированности молекул киНК согласно настоящему изобретению могут быть оценены с точки зрения улучшения фармакокинетических профилей, биодоступности и/или стабильности конструкций киНК, при сохранении в то же время способности киНК опосредовать активность РНКи. Соответственно, любой специалист со средним уровнем знаний в данной области в состоянии провести скрининг конструкций киНК, которые были модифицированы различными конъюгатами, с тем чтобы определить, обладает ли данный конъюгат киНК улучшенными свойствами, при сохранении способности вовлекаться в процесс РНКи, например, на моделях животных, известных в данной области.

В одном варианте настоящее изобретение относится к рассматриваемой в нем молекуле короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), где указанная молекула киНК включает также нуклеотидный, ненуклеотидный или смешанный нуклеотидный/ненуклеотидный линкер, который соединяет смысловой участок молекулы киНК с антисмысловым участком молекулы киНК. В одном варианте нуклеотидный, ненуклеотидный или смешанный нуклеотидный/ненуклеотидный линкер используется, например, для присоединения конъюгатного фрагмента к киНК. В одном варианте нуклеотидный линкер согласно настоящему изобретению может представлять собой линкер, включающий в длину ≥2 нуклеотидов, в частности примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. В другом варианте указанный нуклеотидный линкер может представлять собой аптамер нуклеиновой кислоты. Термин «аптамер» или «аптамер нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая специфически связывается с молекулой-мишенью, где указанная молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность, которая включает последовательность, распознаваемую молекулой-мишенью в естественной среде. Альтернативно, аптамер может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая связывается с молекулой-мишенью, где указанная молекула-мишень не связывается в естественных условиях с нуклеиновой кислотой. Молекула-мишень может представлять собой любую интересующую молекулу. Так, например, аптамер может использоваться для связывания с лиганд-связывающим доменом белка, препятствуя тем самым имеющему место в естественных условиях взаимодействию лиганда с белком. Приведенный пример не ограничивает настоящее изобретение и для специалистов в данной области очевидно, что с использованием известных методик могут быть реализованы также другие варианты (См., например, Gold et al., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brody and Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74, 27; Hermann and Patel, 2000, Science, 287, 820; и Jayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628).

В еще одном варианте ненуклеотидный линкер согласно настоящему изобретению включает безосновный нуклеотид, полиэфир, полиамин, полиамид, пептид, углевод, липид, полиуглеводород или другие полимерные соединения (например, полиэтиленгликоли, такие как полиэтиленгликоли, включающие от 2 до 100 этиленгликольных единиц). Конкретные примеры включают соответствующие примеры, описанные в литературе (Seela and Kaiser, Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353 и Nucleic Acids Res. 1987, 15:3113; Cload and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:6324; Richardson and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:5109; Ma et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21:2585 и Biochemistry 1993, 32:1751; Durand et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides 1991, 10:287; Jschke et al., Tetrahedron Lett. 1993, 34:301; Ono et al., Biochemistry 1991, 30:9914; Arnold et al., публикация по международному патенту № WO 89/02439; Usman et al., публикация по международному патенту № WO 95/06731; Dudycz et al., публикация по международному патенту № WO 95/11910, и Ferentz and Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:4000, все указанные работы включены в настоящее описание в качестве ссылок). Термин «ненуклеотидный» также охватывает любую группу или любое соединение, которые могут быть введены в состав цепи нуклеиновой кислоты вместо одной или нескольких нуклеотидных единиц, включая замещения сахарами и/или фосфатными группами, и которые позволяют оставшимся основаниям проявлять свойственную им энзиматическую активность. Указанные группа или соединение могут быть безосновными, в том смысле, что они не содержат обычно распознаваемое нуклеотидное основание, такое как аденозин, гуанин, цитозин, урацил или тимин, например, в С1 положении сахара.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) в клетке или в составе восстановленной in vitro системы, где одна или обе цепи молекулы киНК, которые были собраны из двух отдельных олигонуклеотидов, не включают рибонуклеотидов. Например, молекула киНК может быть собрана на основе одного олигонуклеотида, где смысловой и антисмысловой участки киНК включают отдельные олигонуклеотиды, которые не содержат никаких рибонуклеотидов (например, нуклеотидов, содержащих 2'-ОН группу) в составе олигонуклеотидов. В другом примере молекула киНК может быть собрана на основе одного олигонуклеотида, где смысловой и антисмысловой участки киНК соединены или циклизованы нуклеотидным или ненуклеотидным линкером согласно настоящему описанию, где указанный олигонуклеотид не содержит никаких рибонуклеотидов (например, нуклеотидов, содержащих 2'-ОН группу) в составе олигонуклеотида. Автор настоящей заявки неожиданно обнаружил, что присутствие рибонуклеотидов (например, нуклеотидов, содержащих 2'-гидроксильную группу) в составе молекулы киНК не требуется или не является обязательным для проявления активности РНКи. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения все положения в составе киНК могут включать химически модифицированные нуклеотиды или отличные от нуклеотидов фрагменты, такие как нуклеотиды или отличные от нуклеотидов фрагменты, описываемые формулами I, II, II, IV, V, VI или VII, или любое их сочетание, на том уровне, который позволяет сохранить способность молекулы киНК поддерживать активность РНКи.

В еще одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой молекулу одноцепочечной киНК, которая опосредует активность РНКи в клетке или в составе восстановленной in vitro системы, включающей одноцепочечный полинуклеотид, обладающий комплементарностью к последовательности целевой нуклеиновой кислоты. В другом варианте молекула одноцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает 5'-концевую фосфатную группу. В другом варианте молекула одноцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает 5'-концевую фосфатную группу и 3'-концевую фосфатную группу (например, 2',3'-циклический фосфат). В другом варианте молекула одноцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В еще одном варианте молекула одноцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает один или несколько химически модифицированных нуклеотидов или отличных от нуклеотидов фрагментов согласно настоящему описанию. Например, все положения в молекуле киНК могут включать химически модифицированные нуклеотиды, такие как нуклеотиды, описываемые любой из формул I-VII, или любое их сочетание, на том уровне, который позволяет сохранить способность молекулы киНК поддерживать активность РНКи.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой молекулу одноцепочечной киНК, которая опосредует активность РНКи или которая, в альтернативном варианте, моделирует активность РНКи в клетке или в восстановленной in vitro системе, включающей одноцепочечный полинуклеотид, характеризующийся комплементарностью к целевой последовательности нуклеиновой кислоты, где один или несколько пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество пиримидиновых нуклеотидов представляет собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды) и где любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды), и включает концевую кэп-модификацию, такую как любая модификация, приведенная в настоящем описании или проиллюстрированная на фиг. 10, которая необязательно может присутствовать на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой последовательности. Указанная молекула киНК необязательно включает также от примерно 1 до примерно 4 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4 или более) концевых 2'-дезоксинуклеотидов на 3'-конце молекулы киНК, где указанные концевые нуклеотиды могут также включать одну или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4 или более) фосфоротиоатных, фосфоноацетатных и/или тиофосфоноацетатных межнуклеотидных связей и где указанная молекула киНК необязательно также включает концевую фосфатную группу, такую как 5'-концевая фосфатная группа. В любом из указанных вариантов любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой, альтернативно, 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды). Кроме того, в любом из указанных вариантов осуществления настоящего изобретения любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК (например, пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке и/или антисмысловом участке), могут, альтернативно, представлять собой нуклеотиды закрытой нуклеиновой кислоты (LNA) (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой нуклеотиды LNA или, альтернативно, множество пуриновых нуклеотидов представляют собой нуклеотиды LNA). Кроме того, в любом из указанных вариантов осуществления настоящего изобретения любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой, альтернативно, 2'-метоксиэтилпуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'- метоксиэтилпуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-метоксиэтилпуриновые нуклеотиды). В другом варианте осуществления настоящего изобретения любые модифицированные нуклеотиды, присутствующие в молекулах одноцепочечных киНК согласно настоящему изобретению, включают модифицированные нуклеотиды, обладающие свойствами или характеристиками, аналогичными таковым природных рибонуклеотидов. Например, настоящее изобретение относится к молекулам киНК, включающим модифицированные нуклеотиды, характеризующиеся нозерн-конформацией (например, конформация согласно циклу нозерн-псевдоротации, см. например, Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984). Соответственно, химически модифицированные нуклеотиды, присутствующие в молекулах одноцепочечных киНК согласно настоящему изобретению, предпочтительно устойчивы к нуклеазной деградации, но в то же время они сохраняют способность опосредовать процесс РНКи.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает смысловую цепь или смысловой участок, который содержит две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) 2'-О-алкильных (например, 2'-О-метильных) модификаций или любое их сочетание. В другом варианте 2'-О-алкильная модификация находится в чередующихся положениях в смысловой цепи или в смысловом участке киНК, таких как положения 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и т.п. или положения 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и т.п.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает антисмысловую цепь или антисмысловой участок, который содержит две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) 2'-О-алкильных (например, 2'-О-метильных) модификаций или любое их сочетание. В другом варианте 2'-О-алкильная модификация находится в чередующихся положениях в антисмысловой цепи или в антисмысловом участке киНК, таких как положения 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и т.п. или положения 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и т.п.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает смысловую цепь или смысловой участок и антисмысловую цепь или антисмысловой участок, каждый из которых содержит две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) 2'-О-алкильных (например, 2'-О-метильных), 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси- или безосновных химических модификаций или любое их сочетание. В другом варианте 2'-О-алкильная модификация находится в чередующихся положениях в смысловой цепи или в смысловом участке киНК, таких как положения 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и т.п. или положения 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и т.п. В другом варианте 2'-О-алкильная модификация находится в чередующихся положениях в антисмысловой цепи или в антисмысловом участке киНК, таких как положения 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и т.п. или положения 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и т.п.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает химически модифицированные нуклеотиды или фрагменты ненуклеотидной природы (например, описываемые любой из формул I-VII, такие как 2'-дезокси-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси- или 2'-О-метилнуклеотиды) в чередующихся положениях в пределах одной или нескольких цепей или участков молекулы киНК. Так, например, такие химические модификации могут быть встроены в положение через один на молекуле киНК, созданной на основе РНК, начиная от первого или второго нуклеотида с 3'-конца или 5'-конца молекулы киНК. В не ограничивающем примере молекула двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению, в которой каждая цепь в киНК составляет 21 нуклеотид в длину, характеризуется тем, что положения 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21 в каждой цепи химически модифицированы (например, представляет соединение, описываемое любой из формул I-VII, такое как 2'-дезокси-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси- или 2'-О-метилнуклеотиды). В другом не ограничивающем примере молекула двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению, в которой каждая цепь в киНК составляет 21 нуклеотид в длину, характеризуется тем, что положения 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 в каждой цепи химически модифицированы (например, представляет соединение, описываемое любой из формул I-VII, такое как 2'-дезокси-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси- или 2'-О-метилнуклеотиды). В одном варианте одна цепь молекулы двухцепочечной киНК включает химические модификации в положениях 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 и химические модификации в положениях 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21. Такие молекулы киНК также могут включать концевые кэп-фрагменты и/или скелетные модификации согласно настоящему описанию.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению характеризуется следующими особенностями: если пуриновые нуклеозиды присутствуют на 5'-конце (например, по любому из положений концевых нуклеотидов 1, 2, 3, 4, 5 или 6 от 5'-конца) антисмысловой цепи или участка антисмысловой цепи (иначе называемой как ведущая последовательность или ведущая цепь) молекулы киНК, то такие пуриновые нуклеотиды являются рибонуклеотидами. В другом варианте пуриновые рибонуклеотиды, при их наличии, спарены по основаниям с нуклеотидами смысловой цепи или смыслового участка (иначе называемой как цепь-«пассажир») молекулы киНК. Такие пуриновые рибонуклеотиды могут присутствовать в стабилизационном мотиве киНК, который в ином случае включает модифицированные нуклеотиды.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению характеризуется следующими особенностями: если пиримидиновые нуклеотиды присутствуют на 5'-конце (например, по любому из положений концевых нуклеотидов 1, 2, 3, 4, 5 или 6 от 5'-конца) антисмысловой цепи или антисмыслового участка (иначе называемой как ведущая последовательность или ведущая цепь) молекулы киНК, то такие пиримидиновые нуклеозиды являются рибонуклеотидами. В другом варианте пиримидиновые рибонуклеотиды, в случае их наличия, спарены по основаниям с нуклеотидами смысловой цепи или смыслового участка (иначе называемой как цепь-»пассажир») молекулы киНК. Такие пиримидиновые рибонуклеотиды могут присутствовать в стабилизационном мотиве киНК, который в ином случае включает модифицированные нуклеотиды.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению характеризуется следующими особенностями: если пиримидиновые нуклеотиды присутствуют на 5'-конце (например, по любому из концевых положений нуклеотидов 1, 2, 3, 4, 5 или 6 от 5'-конца) антисмысловой цепи или антисмыслового участка (иначе называемой как ведущая последовательность или ведущая цепь) молекулы киНК, то такие пиримидиновые нуклеозиды являются модифицированными нуклеотидами. В другом варианте модифицированные пиримидиновые нуклеотиды, в случае их наличия, спарены по основаниям с нуклеотидами смысловой цепи или смыслового участка (иначе называемой как цепь-«пассажир») молекулы киНК. Не ограничивающие примеры модифицированных пиримидиновых нуклеотидов включают такие нуклеотиды, которые описываются любой из формул I-VII, такие как 2'-дезокси-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси или 2'-О-метилнуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SI:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, в которых любые пуриновые нуклеотиды, в случае их наличия, представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой независимо 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезоксирибонуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой независимо 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилнуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SII:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, в которых любые пуриновые нуклеотиды, в случае их присутствия, представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой рибонуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой рибонуклеотиды; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SIII:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, в которых любые пуриновые нуклеотиды, в случае их присутствия, представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют рибонуклеотиды; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SIV:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, в которых любые пуриновые нуклеотиды, в случае их присутствия, представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют дезоксирибонуклеотиды; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SV:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, в которых любые пуриновые нуклеотиды, в случае их присутствия, представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой нуклеотиды, имеющие рибоподобную конфигурацию (например, нозерн-конфигурацию или А-спираль); любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой нуклеотиды, имеющие рибоподобную конфигурацию (например, нозерн-конфигурацию или А-спираль); любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SVI:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает спаренные по основанию или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, включающие последовательность, которая придает 5'-концу антисмысловой цепи (нижняя цепь) меньшую термостабильность, чем 5'-конец в смысловой цепи (верхняя цепь); Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой независимо 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезоксирибонуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой независимо 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилнуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SVII:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30; NX3 комплементарен NX4; и любые (N) нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SVIII:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, включающие последовательность, которая придает 5'-концу антисмысловой цепи (нижняя цепь) меньшую термостабильность, чем 5'-конец в смысловой цепи (верхняя цепь); [ N ] обозначает положения, в которых нуклеотиды представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 15; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; Х6 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 4; Х7 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 15; NX7, NX6 и NX3 комплементарны NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой независимо 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезоксирибонуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, отличные от [N] нуклеотидов; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой независимо 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилнуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов, отличных от [ N ] нуклеотидов; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SIX:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает положения, в которых нуклеотиды являются рибонуклеотидами; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой независимо 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезоксирибонуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой независимо 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилнуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SX:

,

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает положения, в которых нуклеотиды являются рибонуклеотидами; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой рибонуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой рибонуклеотиды; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SXI:

,

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает положения, в которых нуклеотиды являются рибонуклеотидами; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой рибонуклеотиды; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SXII:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает положения, в которых нуклеотиды являются рибонуклеотидами; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой дезоксирибонуклеотиды; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SXIII:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает положения, в которых нуклеотиды являются рибонуклеотидами; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой нуклеотиды, имеющие рибоподобную конфигурацию (например, нозерн-конфигурацию или А-спираль); любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой нуклеотиды, имеющие рибоподобную конфигурацию (например, нозерн-конфигурацию или А-спираль); любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-метилнуклеотиды; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SXIV:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть не модифицированы или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает положения, в которых нуклеотиды являются рибонуклеотидами; [ N ] обозначает положения, в которых нуклеотиды являются рибонуклеотидами; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 15; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; Х6 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 4; Х7 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 15; NX7, NX6 и NX3 комплементарны NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой независимо 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезоксирибонуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, отличающиеся от [ N ] нуклеотидов; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой независимо 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилнуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов, отличающиеся от [ N ] нуклеотидов; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает концевую фосфатную группу на 5'-конце антисмысловой цепи или антисмыслового участка молекулы нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает Х5=1, 2 или 3; каждый Х1 и Х2=1 или 2; Х3=12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, и Х4=5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает Х5=1; каждый Х1 и Х2=2; Х3=19 и Х4=18.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает Х5=2; каждый Х1 и Х2=2; Х3=19 и Х4=17.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает Х5=3; каждый Х1 и Х2=2; Х3=19 и Х4=16.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает В на 3'- и 5'-концах смысловой цепи или смыслового участка.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает В на 3'-конце антисмысловой цепи или антисмыслового участка.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает В на 3'- и 5'-концах смысловой цепи или смыслового участка и В на 3'-конце антисмысловой цепи или антисмыслового участка.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, также включает одну или несколько фосфоротиоатных межнуклеотидных связей по первому концевому (N) на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или на обеих: смысловой цепи и антисмысловой цепи молекулы нуклеиновой кислоты. Например, молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты может включать Х1 и/или Х2=2, содержащие нуклеотиды в выступающих положениях с фосфоротиоатной межнуклеотидной связью, например, (NsN), где «s» обозначает фосфоротиоат.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает (N) нуклеотиды, которые представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает (N) нуклеотиды, которые представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает (N) нуклеотиды в антисмысловой цепи (нижняя цепь), которые комплементарны нуклеотидам в целевой полинуклеотидной последовательности, обладающей комплементарностью к N и [N] нуклеотидам антисмысловой (нижней) цепи.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает (N) нуклеотиды в смысловой цепи (верхняя цепь), которая содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, включающую от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов из целевой полинуклеотидной последовательности.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает (N) нуклеотиды в смысловой цепи (верхняя цепь), которые содержат нуклеотидную последовательность, соответствующую целевой полинуклеотидной последовательности, комплементарной к антисмысловой (нижней) цепи, так что непрерывная (N) и N нуклеотидная последовательность смысловой цепи включает нуклеотидную последовательность из последовательности целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SVIII или SXIV, включает В только на 5'-конце смысловой (верхней) цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает также неспаренный концевой нуклеотид на 5'-конце антисмысловой (нижней) цепи. Неспаренный нуклеотид не комплементарен смысловой (верхней) цепи. В одном варианте неспаренный концевой нуклеотид комплементарен целевой полинуклеотидной последовательности, которая комплементарна N и [N] нуклеотидам в антисмысловой (нижней) цепи. В другом варианте неспаренный концевой нуклеотид не комплементарен последовательности целевого полинуклеотида, характеризующейся комплементарностью к N и [N] нуклеотидам в антисмысловой (нижней) цепи.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SVIII или SXIV, включает Х6=1 и Х3=10.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SVIII или SXIV, включает Х6=2 и Х3=9.

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, или ингибитор РНКи, изготовленный в виде любой из композиций LNP-051; LNP-053; LNP-054; LNP-069; LNP-073; LNP-077; LNP-080; LNP-082; LNP-083; LNP-060; LNP-061; LNP-086; LNP-097; LNP-098; LNP-099; LNP-100; LNP-101; LNP-102; LNP-103 или LNP-104 (см. таблица IV).

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей первую молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты и вторую молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, где каждая из молекул имеет первую цепь и вторую цепь, которые комплементарны друг другу, где указанная вторая цепь первой молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает последовательность, комплементарную первой целевой последовательности, и вторая цепь второй молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает последовательность, комплементарную второй мишени или целевой последовательности определенного пути. В одном варианте указанная композиция также включает катионный липид, нейтральный липид и полиэтиленгликолевый конъюгат. В одном варианте композиция также включает катионный липид, нейтральный липид, полиэтиленгликолевый конъюгат и холестерин. В одном варианте композиция также включает полиэтиленгликолевый конъюгат, холестерин и поверхностно-активное вещество. В одном варианте указанный катионный липид выбирают из группы, состоящей из CLinDMA, pCLinDMA, eCLinDMA, DMOBA и DMLBA. В одном варианте указанный нейтральный липид выбирают из группы, состоящей из DSPC, DOBA и холестерина. В одном варианте указанный полиэтиленгликолевый конъюгат выбирают из группы, состоящей из ПЭГ-димиристоилглицерола и ПЭГ-холестерина. В одном варианте указанный ПЭГ представляет собой 2К-ПЭГ. В одном варианте указанное поверхностно-активное вещество выбирают из группы, состоящей из пальмитилового спирта, стеарилового спирта, олеилового спирта и линолеилового спирта. В одном варианте указанный катионный липид представляет собой CLinDMA, нейтральный липид представляет собой DSPC, полиэтиленгликолевый конъюгат представляет собой 2К-ПЭГ-DMG, холестерин представляет собой холестерин и поверхностно-активное вещество представляет собой линолеиловый спирт. В одном варианте указанные CLinDMA, DSPC, 2К-ПЭГ-DMG, холестерин и линолеиловый спирт присутствуют в молярном соотношении 43:38:10:2:7 соответственно.

В любом из приведенных в описании вариантов молекула киНК согласно настоящему изобретению модулирует экспрессию одной или нескольких мишеней через процесс интерференции РНК или посредством ингибирования интерференции РНК. В одном варианте интерференция РНК представляет собой RISC-опосредованные расщепления мишени (например, киРНК-опосредованную интерференцию РНК). В одном варианте интерференция РНК представляет собой ингибирование мишени на уровне трансляции (например, миРНК-опосредованную интерференцию РНК). В одном варианте интерференция РНК представляет собой ингибирование мишени на уровне транскрипции (например, киРНК-опосредованное молчание на уровне транскрипции). В одном варианте интерференция РНК происходит в цитоплазме. В одном варианте интерференция РНК происходит в ядре.

В любом из приведенных в описании вариантов молекула киНК согласно настоящему изобретению модулирует экспрессию одной или нескольких мишеней посредством ингибирования эндогенной целевой РНК, такой как эндогенная мРНК, киРНК, миРНК, или, альтернативно, через ингибирование RISC.

В одном варианте настоящее изобретение относится к одному или нескольким ингибиторам РНКи, которые модулируют экспрессию одного или нескольких генов-мишеней посредством ингибирования миРНК, ингибирования киРНК или ингибирования RISC.

В одном варианте ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению представляет собой молекулу киНК, приведенную в настоящем описании, которая содержит одну или несколько цепей, комплементарных одной или нескольким целевым молекулам миРНК или киРНК.

В одном варианте ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению представляет собой антисмысловую молекулу, которая комплементарна целевой молекуле миРНК или киРНК или их части. Антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать в длину от примерно 10 до примерно 40 нуклеотидов (например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов в длину). Антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один или несколько модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы, приведенных в настоящем описании (см., например, молекулы, описываемые любой из формул I-VII согласно настоящему описанию или их любым сочетанием). В одном варианте антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один, или несколько, или все 2'-О-метилнуклеотиды. В одном варианте антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один, или несколько, или все 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды. В одном варианте антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один, или несколько, или все 2'-О-метоксиэтилнуклеотиды (также известные, как 2'-метоксиэтокси- или МОЕ). В одном варианте антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать одну, или несколько, или все фосфоротиоатные межнуклеотидные связи. В одном варианте антисмысловой ингибитор РНК согласно настоящему изобретению может включать терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах, антисмыслового ингибитора РНК.

В одном варианте ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению представляет собой аптамер нуклеиновой кислоты, имеющий связывающую аффинность к RISC, такой как регулируемый аптамер (см., например, An et al., 2006, RNA, 12:710-716). Аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать в длину от примерно 10 до примерно 50 нуклеотидов (например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов в длину). Аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один или несколько модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы, приведенных в настоящем описании (см., например, молекулы, описываемые любой из формул I-VII согласно настоящему описанию или их любым сочетанием). В одном варианте аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один, или несколько, или все 2'-О-метилнуклеотиды. В одном варианте аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один или несколько, или все 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды. В одном варианте аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один или несколько или все 2'-О-метоксиэтилнуклеотиды (также известные как 2'-метоксиэтокси- или МОЕ). В одном варианте аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать одну, или несколько, или все фосфоротиоатные межнуклеотидные связи. В одном варианте аптамер-ингибитор РНК согласно настоящему изобретению может включать терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах, аптамера-ингибитора РНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии целевого гена в клетке, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной или может быть немодифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК целевого гена; и (b) введение молекулы киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в клетке.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной или может быть немодифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени, и где указанная последовательность смысловой цепи киНК включает последовательность, идентичную или по существу аналогичную последовательности целевой РНК; и (b) введение молекулы киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в клетке.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными или могут быть немодифицированными, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК генов-мишеней; и (b) введение молекул киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в клетке.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии двух или более генов-мишеней в клетке, включающему: (а) синтез одной или нескольких молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными или могут быть немодифицированными, где цепи киНК включают последовательности, комплементарные РНК генов-мишеней, и где указанные последовательности смысловой цепи киНК включают последовательности, идентичные или по существу аналогичные последовательностям целевых РНК; и (b) введение молекул киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в клетке.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной или может быть немодифицированной, где одна или несколько цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишеней, и где указанная последовательность смысловой цепи киНК включает последовательность, идентичную или по существу аналогичную последовательностям целевых РНК; и (b) введение молекулы киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в клетке.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной или может быть немодифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени, и где указанная последовательность смысловой цепи киНК включает последовательность, идентичную или по существу аналогичную последовательностям целевой РНК; и (b) введение молекулы киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в клетке.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению используются в качестве реагента в вариантах применения ex vivo. Например, киНК реагенты вводят в ткань или в клетки, которые затем трансплантируют в организм субъекта для достижения терапевтического эффекта. Указанные клетки и/или ткань могут быть получены из организма или от субъекта, которому позже будет введен эксплантат, или могут быть получены из другого организма или от другого субъекта перед трансплантацией. Молекулы киНК могут использоваться для модуляции экспрессии одного или нескольких генов в клетках или ткани, так что указанные клетки или ткань получают желательный фенотип или становятся способными осуществлять соответствующую функцию при трансплантации in vivo. В одном варианте выделяют определенные клетки-мишени от пациента. Указанные выделенные клетки подвергают контакту с киНК, направленными на специфическую нуклеотидную последовательность внутри клетки, в условиях, подходящих для захвата киНК указанными клетками (например, с использованием реагентов для доставки, таких как катионные липиды, липосомы и т.п., или с использованием других методик, таких как электропорация, для облегчения доставки киНК в клетки). Далее клетки снова вводят в организм того же пациента или другим пациентам.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где одна или несколько цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; и (b) введение молекулы киНК в клетку тканевого эксплантата, полученного из определенного организма, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате. В другом варианте данный способ также включает введение тканевого эксплантата снова в организм, из которого была получена ткань, или в другой организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в указанном организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени, и где последовательность смысловой цепи киНК включает последовательность, идентичную или по существу аналогичную последовательности целевой РНК; и (b) введение молекулы киНК в клетку тканевого эксплантата, полученного из определенного организма, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате. В другом варианте данный способ также включает введение тканевого эксплантата снова в организм, из которого была получена ткань, или в другой организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в указанном организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени в тканевом эксплантате, включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК генов-мишеней; и (b) введение молекул киНК в клетку тканевого эксплантата, полученного из определенного организма, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в тканевом эксплантате. В другом варианте данный способ также включает введение тканевого эксплантата снова в организм, из которого была получена ткань, или в другой организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в указанном организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-миши; и (b) введение молекулы киНК субъекту или в организм в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме. Уровень целевого белка или РНК может быть определен с использованием различных методик, известных в данной области.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного целевого гена у субъекта или в организме, включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК генов-мишеней; и (b) введение молекул киНК субъекту или в организм в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней у субъекта или в организме. Уровень целевого белка или РНК может быть определен с использованием различных методик, известных в данной области.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, обладающую комплементарностью к РНК гена-мишени; и (b) введение молекулы киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в клетке.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, обладающую комплементарностью к РНК гена-мишени; и (b) контактирование клетки in vitro или in vivo с молекулой киНК в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в клетке.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате (например, в любом органе, ткани или клетке, которые могут быть трансплантированы из одного организма в другой или возвращены в тот же организм, из которого данный орган, данная ткань или клетка были взяты), включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, обладающую комплементарностью к РНК гена-мишени; и (b) контактирование клетки из тканевого эксплантата, полученного от конкретного субъекта или из конкретного организма, с молекулой киНК в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате. В другом варианте указанный способ также включает введение тканевого эксплантата снова тому субъекту или в тот организм, от/из которого данная ткань была получена, или другому субъекту или другой организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у указанного субъекта или в указанном организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени в тканевом эксплантате (например, в любом органе, любой ткани или клетке, которые могут быть трансплантированы из одного организма в другой или возвращены в тот же организм, из которого данный орган, данная ткань или клетка были взяты), включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; и (b) введение молекул киНК в клетку тканевого эксплантата, полученного от конкретного субъекта или из конкретного организма, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в тканевом эксплантате. В другом варианте указанный способ также включает введение тканевого эксплантата снова тому субъекту или в тот организм, из которого данная ткань была получена, или другому субъекту или в другой организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней у указанного субъекта или в указанном организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; и (b) введение молекулы киНК субъекту или в организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени у субъекта или в организме, включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; и (b) введение молекул киНК субъекту или в организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания, расстройства, признака или состояния, связанных с экспрессией или активностью гена у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме. Снижение экспрессии гена и в этой связи снижение уровня соответствующего белка/РНК облегчает до некоторой степени симптомы заболевания, расстройства, болезненного признака или болезненного состояния.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение рака. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как раковые клетки и ткани. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как подкожное или внутривенное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие рака у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения рака у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения пролиферативного заболевания или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или преждупреждение пролиферативного заболевания или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как клетки ткани, вовлекаемые в пролиферативное заболевание. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие пролиферативного заболевания или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения пролиферативных заболеваний, признаков, расстройств или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения отторжения трансплантата и/или ткани (отторжения аллотрансплантата) у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение реакции отторжения трансплантата и/или ткани (отторжения аллотрансплантата). В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в реакцию отторжения трансплантата и/или ткани (отторжения аллотрансплантата). В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие реакции отторжения трансплантата и/или ткани (отторжения аллотрансплантата) у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения реакции отторжения трансплантата и/или ткани (отторжения аллотрансплантата) у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения аутоиммунного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение аутоиммунного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в аутоиммунное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие аутоиммунного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения аутоиммунных заболеваний, расстройств, признаков или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекционного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение инфекционного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в инфекционное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие инфекционного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения инфекционных заболеваний, признаков или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила в сочетании с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, где адефовир-дипивоксил и молекулу киНК согласно настоящему изобретению вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и молекулой киНК. В одном варианте молекулу киНК согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.), которые все включены полностью в настоящее описание в качестве ссылки. Такие композиции киНК в основном называются как «липидные частицы с нуклеиновой кислотой» (LNP).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, где ламивудин (3ТС) и молекулу киНК согласно настоящему изобретению вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению ламивудином (3ТС) и молекулой киНК. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила и ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, где адефовир-дипивоксил и ламивудин (3ТС) и молекулу киНК согласно настоящему изобретению вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и ламивудином (3ТС) и молекулой киНК. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., и в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам в антисмысловой цепи; и (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); и где адефовир-дипивоксил и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/70 946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам в антисмысловой цепи; и (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); и где ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила и ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам в антисмысловой цепи; и (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); и где адефовир-дипивоксил и ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам в антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие химическую модификацию; и (f) по меньшей мере две химические модификации отличаются друг от друга; и где адефовир-дипивоксил и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие химическую модификацию; и (f) по меньшей мере две химические модификации отличаются друг от друга; и где ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила и ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие химическую модификацию; и (f) по меньшей мере две химических модификации отличаются друг от друга; и где адефовир-дипивоксил и ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие сахарную модификацию; и (f) по меньшей мере две модификации сахарного фрагмента отличаются друг от друга; и где адефовир-дипивоксил и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие сахарную модификацию; и (f) по меньшей мере две модификации сахарного фрагмента отличаются друг от друга; и где ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила и ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие сахарную модификацию; и (f) по меньшей мере две модификации сахарного фрагмента отличаются друг от друга; и где адефовир-дипивоксил и ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей адефовир-дипивоксил или молекулы одной или нескольких двухцепочечных нуклеиновых кислот или молекул киНК согласно настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. В другом варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей адефовир-дипивоксил, ламивудин (3ТС) и молекулы одной или нескольких двухцепочечных нуклеиновых кислот или молекулы киНК согласно настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения возрастного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение возрастного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в возрастное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие возрастного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения возрастных заболеваний, расстройств, признаков или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения неврологического или нейродегенеративного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение неврологического или нейродегенеративного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в неврологическое или нейродегенеративное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие неврологического или нейродегенеративного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения неврологических или нейродегенеративных заболеваний, признаков, расстройств или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения респираторного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение респираторного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как клетки и ткани, вовлекаемые в респираторное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие респираторного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения респираторных заболеваний, расстройств, признаков или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения офтальмологического заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение офтальмологического заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие, как ткани и клетки, вовлекаемые в офтальмологическое заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие офтальмологического заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения офтальмологических заболеваний, расстройств, признаков или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения кожного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или профилактика кожного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в кожное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие, как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие кожного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения кожных заболеваний, признаков, расстройств или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания печени, расстройства функции печени, соответствующего признака или состояния (например, гепатита, HCV, HBV, диабета, цирроза, гепатоцеллюлярной карциномы и т.п.) у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение заболевания печени, расстройства функции печени, соответствующего признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки печени, вовлекаемые в заболевание печени, расстройство функции печени, соответствующий признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие заболевания печени, расстройства функции печени, соответствующего признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения заболевания печени, расстройства функции печени, соответствующего признака или состояния у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания почки, расстройства функции почки, соответствующего признака или состояния (например, поликистоза почки и т.п.) у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение заболевания почки, расстройства функции почки, соответствующего признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки почки, вовлекаемые в заболевание почки, расстройство функции почки, соответствующий признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие заболевания почки, расстройства функции почки, соответствующего признака или состояния. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения заболеваний почки, расстройств функции почки, соответствующих признаков или состояний.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания, расстройства, признака или состояния системы органов слуха (например, снижения слуха, глухоты и т.п.) у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение заболевания, расстройства, признака или состояния системы органов слуха. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки уха, внутреннего уха или среднего уха, вовлекаемые в заболевание, расстройство, признак или состояние системы органов слуха. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие заболевания, расстройства, признака или состояния системы органов слуха у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения заболеваний, расстройств, признаков или состояний системы органов слуха у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения одного или нескольких метаболических заболеваний, признаков или состояний у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение одного или нескольких метаболических заболеваний, признаков или состояний. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное, внутримышечное, подкожное введение киНК или введение киНК через ЖКТ) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие метаболического заболевания, признака или состояния у субъекта или в организме (например, в ткань или клетки печени, поджелудочной железы, тонкого кишечника, жировую ткань или жировые клетки). Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижении направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме (например, на ткани или клетки печени, поджелудочной железы, тонкого кишечника, жировую ткань или жировые клетки). Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения метаболических заболеваний, признаков или состояний у субъекта или в организме. В одном варианте метаболическое заболевание выбирают из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, дислипидемии, диабета (например, диабета типа I и/или типа II), инсулинрезистентности, ожирения или родственных состояний, включающих, без ограничения, апноэ во сне, хиатальную грыжу, эзофагеальный рефлюкс, остеоартрит, подагру, рак, ассоциированный с повышенным весом, камни желчного пузыря, камни в почках, легочную гипертензию, бесплодие, заболевание сердечно-сосудистой системы, повышенный вес и повышенные относительно нормы уровни липидов, мочевой кислоты или оксалатов.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения одного или нескольких метаболических заболеваний, признаков или состояний у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии ингибитора генной экспрессии у субъекта или в организме. В одном варианте указанный ингибитор генной экспрессии представляет собой миРНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения одного или нескольких заболеваний сердечно-сосудистой системы, соответствующих признаков или состояний у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение одного или нескольких заболеваний сердечно-сосудистой системы, соответствующих признаков или состояний. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, например в ткань или клетки печени, поджелудочной железы, тонкого кишечника, в жировую ткань или в жировые клетки. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное, внутримышечное, подкожное введение киНК или введение киНК через ЖКТ) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие заболеваний сердечно-сосудистой системы, соответствующих признаков или состояний у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения заболеваний сердечно-сосудистой системы, соответствующих признаков или состояний у субъекта или в организме. В одном варианте указанное заболевание сердечно-сосудистой системы выбирают из группы, состоящей из гипертензии, тромбоза венечной артерии, сердечного приступа, липидных синдромов, гипергликемии, гипертриглицеридемии, гиперлипидемии, ишемии, застойной сердечной недостаточности и инфаркта миокарда.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения одного или нескольких заболеваний сердечно-сосудистой системы, соответствующих признаков или состояний у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии ингибитора генной экспрессии у субъекта или в организме. В одном варианте указанный ингибитор генной экспрессии представляет собой миРНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу снижения веса у субъекта или организма, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего может быть достигнуто снижение веса. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, например, в ткань или клетки печени, поджелудочной железы, тонкого кишечника, в жировую ткань или в жировые клетки. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное, внутримышечное, подкожное введение киНК или введение киНК через ЖКТ) в соответствующие ткани или клетки. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для снижения веса у субъекта или организма.

В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г., и в USSN 11/353630, зарегистрированной 14 февраля 2006 г. (Vargeese et al.).

В любом из приведенных в настоящем описании способов модуляции экспрессии одного или нескольких генов-мишеней для лечения или предупреждения заболеваний, признаков, состояний или фенотипов в клетке, у субъекта или в организме, молекула киНК согласно настоящему изобретению модулирует экспрессию одной или нескольких мишеней посредством интерференции РНК. В одном варианте интерференция РНК представляет собой RISC-опосредованное расщепление мишени (например, киРНК-опосредованную интерференцию РНК). В одном варианте интерференция РНК представляет собой ингибирование мишени на уровне трансляции (например, миРНК-опосредованную интерференцию РНК). В одном варианте интерференция РНК представляет собой ингибирование мишени на уровне транскрипции (например, киРНК-опосредованное молчание на уровне транскрипции). В одном варианте интерференция РНК происходит в цитоплазме. В одном варианте интерференция РНК происходит в ядре.

В рамках любого из способов лечения согласно настоящему изобретению киНК может быть введена субъекту в ходе лечения, например, при введении с различными интервалами времени, такими как введение один раз в день в течение всего курса лечения, введение каждые два дня в течение всего курса лечения, введение каждые три дня в течение всего курса лечения, введение один раз в четыре дня в течение всего курса лечения, введение один раз в пять дней в течение всего курса лечения, введение один раз в шесть дней в течение всего курса лечения, введение один раз в неделю в течение всего курса лечения, введение через неделю в течение всего курса лечения, введение один раз в месяц в течение всего курса лечения и т.п. В одном варианте курс лечения охватывает введение один раз каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель. В одном варианте курс лечения составляет от примерно одной до примерно 52 недель или дольше (например, может составлять неопределенное по длительности время лечения). В одном варианте курс лечения составляет от примерно одного до примерно 48 месяцев или дольше (например, может составлять неопределенное по длительности время лечения).

В одном варианте курс лечения включает первоначальный курс лечения, такой как введение один раз каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более недель в течение фиксированного интервала времени (например, 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или более) с проведением впоследствии поддерживающего курса лечения, такого как введение один раз каждые 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или более недель в течение дополнительного фиксированного интервала времени (например, 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или более).

В рамках любого из способов лечения согласно настоящему изобретению киНК может быть введена субъекту в рамках системного режима согласно настоящему описанию или с использованием любого другого, известного в данной области, способа, либо одного в рамках монотерапии, либо в сочетании с дополнительными видами терапии, согласно настоящему описанию или в соответствии с другими известными в данной области процедурами. Системное введение может включать, например, внутрилегочное введение (в виде ингаляции, с использованием небулайзера и т.п.), внутривенное, подкожное, внутримышечное введение, введение с помощью катетера, назофарангеальное введение, трансдермальное введение или пероральное введение/введение через желудочно-кишечный тракт, которые хорошо известны в данной области.

В одном варианте в рамках любого из способов лечения или профилактики согласно настоящему изобретению киНК может вводиться субъекту локально или в локальные ткани, согласно настоящему описанию или как это известно в данной области, либо по отдельности в рамках монотерапии, либо в сочетании с дополнительными видами терапии, известными в данной области. Локальное введение может включать, например, ингаляцию, введение с помощью небулайзера, катетеризацию, прямую инъекцию, кожное/чрескожное введение, стентирование, закапывание ушных/глазных капель или введение в портальную вену, с достижением соответствующих тканей, или любые другие методики, способы или процедуры локального введения, известные в данной области.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу введения молекул и композиций киНК согласно настоящему изобретению во внутреннее ухо, включающему контактирование киНК с клетками, тканями или структурами внутреннего уха, в условиях, подходящих для введения. В одном варианте указанное введение включает способы и устройства, описанные в патентах США № 5421818, 5476446, 5474529, 6045528, 6440102, 6685697, 6120484 и 5572594, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки, а также методики, описанные в следующих работах: Silverstein, 1999, Ear Nose Throat J., 78, 598-8, 600; и Jackson and Silverstein, 2002, Otolaryngol Clin North Am., 35, 639-53, и адаптированные для использования молекул киНК согласно настоящему изобретению.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени у субъекта или в организме, включающему контактирование субъекта или организма с одной или несколькими молекулами киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме.

Молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут быть сконструированы таким образом, чтобы они осуществляли отрицательную регуляцию или ингибирование экспрессии гена-мишени посредством воздействия на РНКи множества молекул нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению используют для достижения направленного воздействия на различные ДНК, соответствующие гену-мишени, например, посредством достижения гетерохроматического молчания или ингибирования на уровне транскрипции. В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению используют для достижения направленного воздействия на различные РНК, соответствующие гену-мишени, например, посредством расщепления целевой РНК или ингибирования на уровне трансляции. Не ограничивающие примеры таких РНК включают матричную РНК (мРНК), некодирующую РНК (нкРНК) или регуляторные элементы (см., например, Mattick, 2005, Science, 309, 1527-1528; и Claverie, 2005, Science, 309, 1529-1530), которые включают миРНК и другие малые РНК, чередующиеся сплайсинг-варианты РНК генов-мишеней, модифицированные на посттранскрипционной стадии РНК генов-мишеней, пре-мРНК генов-мишеней и/или матричные РНК. Если процесс альтернативного сплайсинга создает семейство транскриптов, которые различаются по использованию соответствующих экзонов, то настоящее изобретение может использоваться для ингибирования генной экспрессии за счет воздействия на соответствующие экзоны для достижения специфического ингибирования или для дискриминирующего различения функций членов генного семейства. Так, например, белок, который содержит трансмембранный домен, полученный в результате альтернативного сплайсинга, может экспрессироваться как в мембран-связанной форме, так и в секретируемой форме. Использование настоящего изобретения для достижения направленного воздействия на экзон, содержащего трансмембранный домен, может позволить выявить функциональные последствия направленного фармацевтического воздействия на мембран-связанную форму в сравнении с воздействием на секретируемую форму белка. Не ограничивающие примеры вариантов применения настоящего изобретения, относящихся к направленному воздействию на указанные молекулы РНК, включают терапевтическое применение фармацевтических композиций, косметический вариант применения, применение в ветеринарии, создание фармацевтических композиций, молекулярную диагностику и применение для исследований генной функции, а также для картирования, например, с использованием картирования на основе полиморфизма по одному нуклеотиду с использованием молекул киНК согласно настоящему изобретению. Такие варианты применения могут быть осуществлены с использованием известных генных последовательностей или на основе частичных последовательностей, известных на основании информации о последовательности экспрессированного фрагмента (EST).

В другом варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению используют для направленного воздействия на консервативные последовательности, соответствующие одному или нескольким генным семействам, таким как генные семейства, характеризующиеся гомологичными последовательностями. Соответственно, молекулы киНК, направленно воздействующие на множество генов-мишеней или целевых РНК, могут обеспечивать повышенный терапевтический эффект. В одном варианте настоящее изобретение относится к направленному воздействию (расщеплению молекулы или ингибированию экспрессии или функции) на последовательности более чем одного гена-мишени, с использованием одной молекулы киНК, за счет целевого воздействия на консервативные последовательности соответствующего гена-мишени.

В одном варианте молекулы киНК могут использоваться для изучения путей функционирования гена в рамках различных вариантов применения. Так, например, настоящее изобретение может использоваться для ингибирования активности одного или нескольких генов-мишеней на определенном метаболическом пути, с целью определения функции неохарактеризованного одного или нескольких генов путем анализа функции гена, анализа функции мРНК или анализа процесса трансляции. Настоящее изобретение может использоваться для определения потенциальных путей функционирования генов-мишеней, вовлекаемых в различные заболевания или состояния, с целью выработки стратегий разработки фармацевтических композиций. Настоящее изобретение может также использоваться для понимания путей генной экспрессии, вовлекаемых, например, в развитие заболеваний, расстройств, признаков или состояний согласно настоящему описанию или иначе известных в данной области.

В одном варианте одна или несколько молекул киНК и/или способы согласно настоящему изобретению используют для достижения отрицательной регуляции экспрессии одного или нескольких генов, которые кодируют РНК, депонированные в Genbank с соответствующими номерами доступа, например гены-мишени, кодирующие одну или несколько последовательностей РНК, депонированные в Genbank с соответствующими номерами доступа, например номерами доступа в Genbank (№), указанными в предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923536 и РСТ/US03/05028, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу, включающему: (а) создание библиотеки конструкций киНК, обладающих заданным уровнем сложности; и (b) тестирование конструкций киНК согласно (а), в условиях, подходящих для определения целевых сайтов РНКи в последовательности целевой РНК. В одном варианте молекулы киНК согласно (а) содержат цепи фиксированной длины, например, включающие в длину примерно 23 нуклеотида. В другом варианте молекулы киНК согласно (а) имеют различную длину, например содержат цепи, включающие от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов в длину (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В одном варианте соответствующий тест может включать восстановленную in vitro систему тестирования киНК согласно настоящему описанию. В другом варианте указанный тест может включать систему культивирования клеток, в которой экспрессируется целевая РНК. В другом варианте анализируют фрагменты целевой РНК для выявления уровня расщепления, например, путем гель-электрофореза, нозерн-блоттинга или тестов на защиту от РНКазы, для определения наиболее подходящих одного или нескольких сайтов-мишеней в последовательности целевой РНК. Последовательность целевой РНК может быть получена по известным в данной области методам, например путем клонирования и/или транскрипции в системах in vitro и в ходе клеточной экспрессии в системах in vivo.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу, включающему: (а) создание рандомизированной библиотеки конструкций киНК, обладающих заданной степенью сложности, такой как 4N, где N обозначает число спаренных по основаниям нуклеотидов в каждой из цепей конструкции киНК (например, для конструкции киНК, содержащей 21 нуклеотид в смысловой и антисмысловой цепях с 19 парами оснований, сложность будет составлять 419); и (b) тестирование конструкции киНК согласно (а) в условиях, подходящих для определения целевых сайтов РНКи в последовательности целевой РНК. В другом варианте молекулы киНК согласно (а) содержат цепи фиксированной длины, например, включающие в длину примерно 23 нуклеотида. В еще одном варианте молекулы киНК согласно (а) имеют различную длину, например содержат цепи, включающие от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов в длину (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В одном варианте данный тест может включать тест в рамках восстановленной in vitro системы для анализа киНК, согласно приведенному в примере 6 описанию. В другом варианте указанный тест может включать систему культивирования клеток, в которой целевая РНК экспрессируется. В другом варианте проводят анализ фрагментов целевой РНК для выявления уровня расщепления, например, с помощью гель-электрофореза, нозерн-блоттинга или тестов на защиту от РНКазы, для определения наиболее подходящих одного или нескольких сайтов-мишеней в составе последовательности целевой РНК. Последовательность целевой РНК может быть получена по известным в данной области методам, например путем клонирования и/или транскрипции в системах in vitro и в ходе клеточной экспрессии в системах in vivo.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу, включающему: (а) анализ последовательности целевой РНК, кодируемой геном-мишенью; (b) синтез одного или множества наборов молекул киНК, обладающих комплементарностью по последовательности к одному или нескольким участкам РНК согласно (а); и (с) тестирование молекул киНК согласно (b) в условиях, подходящих для определения мишеней РНКи в последовательности целевой РНК. В одном варианте указанные молекулы киНК согласно (b) содержат цепи фиксированной длины, например, включающие в длину примерно 23 нуклеотида. В другом варианте молекулы киНК согласно (b) имеют разную длину, например содержат цепи, включающие от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов в длину (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В одном варианте соответствующий тест может включать восстановленную in vitro систему анализа киНК согласно настоящему описанию. В другом варианте указанный тест может включать систему культивирования клеток, в которой экспрессируется целевая РНК. Фрагменты целевой РНК анализируют для выявления уровня расщепления, например, с помощью гель-электрофореза, нозерн-блоттинга или тестов на защиту от РНКазы, для определения наиболее подходящих одного или нескольких сайтов-мишеней в составе последовательности целевой РНК. Последовательность целевой РНК может быть получена по известным в данной области методам, например путем клонирования и/или транскрипции в системах in vitro и в ходе клеточной экспрессии в системах in vivo.

Термин «сайт-мишень»/»целевой сайт» означает последовательность внутри целевой РНК, на которую происходит/в отношении которой осуществляется «нацеливание»/«направленное воздействие» для достижения расщепления, опосредованного участием конструкции киНК, которая содержит в своем антисмысловом участке последовательности, комплементарные целевой последовательности.

Фраза «выявляемый уровень расщепления» относится к расщеплению целевой РНК (и образованию расщепленных продуктов РНК) до уровня, достаточного для обнаружения продуктов расщепления, который превышает фоновый уровень продуктов РНК, образуемых при случайной деградации целевой РНК. Образование продуктов расщепления на уровне 1-5% от целевой РНК является достаточным количеством, позволяющим выявить в рамках большинства методов детекции превышение получаемых показателей над фоном.

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей молекулу киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. В другом варианте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными и которые оказывают направленное воздействие на один или несколько генов, в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. В другом варианте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания, признака или состояния у субъекта, включающему введение указанному субъекту композиции согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для диагностики указанных заболеваний, признака или состояния у субъекта. В другом варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания, признака или состояния, таких как метаболические и/или сердечно-сосудистые заболевания, признаки, состояния или расстройства у субъекта, включающему введение указанному субъекту композиции согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для лечения или предупреждения заболевания, признака или состояния у субъекта, в качестве отдельного агента или в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими соединениями.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу подтверждения достижения направленного воздействия на ген-мишень, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; (b) введение молекулы киНК в клетку, ткань, субъекту или в организм в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, ткани у субъекта или в организме; и (с) определение функции гена путем тестирования наличия каких-либо фенотипических изменений в клетке, ткани, у субъекта или в организме.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу подтверждения направленного воздействия, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; (b) введение молекулы киНК в биологическую систему в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени в биологической системе; и (с) определение функции гена путем тестирования наличия каких-либо фенотипических изменений в биологической системе.

Термин «биологическая система» в контексте настоящего описания используется для обозначения материала, в очищенной или в неочищенной форме, взятого из биологических источников, которые могут включать, без ограничения, организм человека или животного, где указанная система содержит в своем составе компоненты, необходимые для проявления активности РНКи. Термин «биологическая система» включает, например, клетку, ткань, субъекта или организм, или соответствующий экстрагированный из них элемент. Термин «биологическая система» также включает установленные системы РНКи, которые могут использоваться в системах тестирования in vitro.

Термин «фенотипическое изменение» используется для обозначения любого выявляемого изменения в клетке, которое происходит в ответ на контакт с молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (или обработку такой молекулой) (например, киНК). Такие выявляемые изменения включают, без ограничения, изменения по форме, размеру, уровню пролиферации, подвижности, экспрессии белка или экспрессии РНК или по другим физическим или химическим изменениям, которые могут быть оценены с использованием известных методик. Выявляемые изменения могут также включать экспрессию репортерных генов/молекул, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или различные метки-фрагменты, которые используются для идентификации экспрессированного белка или любого другого клеточного компонента, уровень которого можно определить.

В одном варианте настоящее изобретение относится к набору, содержащему молекулу киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной и которая может использоваться для модуляции экспрессии гена-мишени в биологической системе, включающей, например, клетку, ткань, субъект или организм. В другом варианте настоящее изобретение относится к набору, содержащему более чем одну молекулу киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными и которые могут использоваться для модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени, в биологической системе, включающей, например, клетку, ткань, субъект или организм.

В одном варианте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей одну или несколько молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными. В другом варианте указанная клетка, содержащая молекулу киНК согласно настоящему изобретению, представляет собой клетку млекопитающего. В еще одном варианте указанная клетка, содержащая молекулу киНК согласно настоящему изобретению, представляет собой человеческую клетку.

В одном варианте синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, включает: (а) синтез двух комплементарных цепей молекулы киНК; (b) совместный отжиг двух комплементарных цепей в условиях, подходящих для получения молекулы двухцепочечной киНК. В другом варианте синтез двух комплементарных цепей молекулы киНК проводят в рамках твердофазного синтеза олигонуклеотидов. В еще одном варианте синтез двух комплементарных цепей молекулы киНК проводят в рамках процедуры тандемного синтеза олигонуклеотидов в твердой фазе.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу синтеза молекулы дуплексной киНК, включающему: (а) синтез олигонуклеотидной последовательности первой цепи молекулы киНК, где олигонуклеотидная последовательность первой цепи включает расщепляемую линкерную молекулу, которая может использоваться в качестве скелетной затравки для синтеза олигонуклеотидной последовательности второй цепи киНК; (b) синтез олигонуклеотидной последовательности второй цепи молекулы киНК на скелетной затравке олигонуклеотидной последовательности первой цепи, где олигонуклеотидная последовательность второй цепи также включает химический фрагмент, который может использоваться для очистки дуплекса киНК; (с) расщепление линкерной молекулы согласно (а) в условиях, подходящих для гибридизации двух олигонуклеотидных цепей киНК с образованием стабильного дуплекса; и (d) очистку дуплекса киНК с использованием химического фрагмента олигонуклеотидной последовательности второй цепи. В одном варианте расщепление линкерной молекулы согласно (с) проводят в условиях снятия защиты от олигонуклеотида, например в условиях гидролиза с использованием алкиламинового основания, такого как метиламин. В одном варианте указанный способ синтеза включает твердофазный синтез на твердой подложке, такой как стекло с контролируемым размером пор (CPG) или полистирол, где первую последовательность согласно (а) синтезируют на расщепляемом линкере, таком как сукцинильный линкер, с использованием твердой подложки в качестве скелетной затравки. Расщепляемый линкер согласно (а), используемый в качестве скелетной затравки для синтеза второй цепи, может иметь близкую реакционную способность к дериватизированному линкеру на твердой подложке, так что расщепление дериватизированного линкера на твердой подложке и расщепляемого линкера согласно (а) происходит одновременно. В другом варианте химический фрагмент (b), который может использоваться для выделения присоединенной олигонуклеотидной последовательности, включает тритильную группу, например диметокситритильную группу, которая может использоваться в стратегии тритильного синтеза, согласно настоящему описанию. В еще одном варианте в ходе очистки удаляют химический фрагмент, такой как диметокситритильная группа, например, с использованием для этого кислых условий.

В еще одном варианте способ синтеза киНК представляет собой синтез в фазе раствора или синтез в гибридной фазе, где обе цепи дуплекса киНК синтезируют в тандемном варианте с использованием расщепляемого линкера, присоединенного к первой последовательности, который действует как скелетная затравка для синтеза второй последовательности. Расщепление линкера в условиях, подходящих для гибридизации отдельных цепей последовательности киНК, приводит к образованию молекулы двухцепочечной киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу синтеза молекулы дуплексной киНК, включающему: (а) синтез олигонуклеотидной последовательности одной цепи молекулы киНК, где указанная последовательность включает расщепляемую линкерную молекулу, которая может использоваться в качестве скелетной затравки для синтеза другой олигонуклеотидной последовательности; (b) синтез второй олигонуклеотидной последовательности, обладающей комплементарностью к последовательности первой цепи, на основе скелетной затравки согласно (а), где вторая последовательность включает другую цепь молекулы двухцепочечной киНК и где вторая последовательность также включает химический фрагмент, который может использоваться для выделения присоединенной олигонуклеотидной последовательности; (с) очистку продукта согласно (b) с использованием химического фрагмента олигонуклеотидной последовательности второй цепи в условиях, подходящих для выделения полноразмерной последовательности, включающей обе олигонуклеотидные цепи киНК, соединенные расщепляемым линкером, в условиях, подходящих для гибридизации двух олигонуклеотидных цепей киНК с образованием стабильного дуплекса. В одном варианте расщепление линкерной молекулы согласно (с) происходит в ходе снятия защиты с олигонуклеотида, например в условиях гидролиза. В другом варианте расщепление линкерной молекулы согласно (с) происходит после снятия защиты с олигонуклеотида. В другом варианте способ синтеза включает твердофазный синтез на твердой подложке, такой как стекло с контролируемым размером пор (CPG) или полистирол, где первую последовательность (а) синтезируют на расщепляемом линкере, таком как сукцинильный линкер, с использованием твердой подложки в качестве скелетной затравки. Расщепляемый линкер согласно (а), используемый в качестве скелетной затравки при синтезе второй цепи, может включать аналогичную реакционную способность или отличающуюся реакционную способность относительно дериватизированного линкера на твердой подложке, так что расщепление дериватизированного линкера на твердой подложке и расщепляемого линкера согласно (а) происходит либо одновременно, либо последовательно. В одном варианте химический фрагмент согласно (b), который может использоваться для выделения присоединенной олигонуклеотидной последовательности, включает тритильную группу, например диметокситритильную группу.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу создания молекулы двухцепочечной киНК в рамках одностадийной процедуры синтеза, включающему: (а) синтез олигонуклеотида, содержащего первую и вторую последовательности, где первая последовательность комплементарна второй последовательности, и где первую олигонуклеотидную последовательность соединяют со второй олигонуклеотидной последовательностью через расщепляемый линкер, и где концевая 5'-защитная группа, например 5'-О-диметокситритильная группа (5'-О-DMT), остается на олигонуклеотиде, имеющем вторую последовательность; (b) снятие защиты с олигонуклеотида, за счет чего происходит расщепление линкера, соединяющего две олигонуклеотидных последовательности; и (с) очистку продукта согласно (b) в условиях, подходящих для выделения молекулы двухцепочечной киНК, например, с использованием стратегии тритильного синтеза согласно настоящему описанию.

В другом варианте способ синтеза молекул киНК согласно настоящему изобретению включает стратегию, описанную в патентах США (Scaringe et al., патенты США №№ 5889136; 6008400; и 6111086), включенных в настоящее описание полностью в качестве ссылки.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкциям киНК, которые вовлекаются в процесс РНКи против целевого полинуклеотида (например, целевой РНК или целевой ДНК), где указанная конструкция киНК включает одну или несколько химических модификаций, например одну или несколько химических модификаций, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, которые повышают нуклеазную резистентность конструкции киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК, которые характеризуются повышенной нуклеазной резистентностью, включающему (а) встраивание нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, обладающих повышенной резистентностью к нуклеазе.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с улучшенными токсикологическими профилями (например, обладающих ослабленными иммуномодулирующими свойствами или их отсутствием), включающему (а) встраивание нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII (например, мотивов киНК, проиллюстрированных в таблице I) или любым их сочетанием, в молекулу киНК; и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, обладающих улучшенными токсикологическими профилями.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу создания композиций киНК, обладающих улучшенными токсикологическими профилями (например, обладающих ослабленными иммуномодулирующими свойствами или их отсутствием), включающему (а) получение композиции киНК, включающей молекулу киНК согласно настоящему изобретению и вектор доставки или частицы, используемые для доставки, согласно настоящему описанию или согласно любой известной в данной области методике; и (b) тестирование композиции с киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения композиций киНК, обладающих улучшенными токсикологическими профилями.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК, которые не стимулируют ответ интерферона (например, имеет место отсутствие ответа интерферона или ослабленный ответ интерферона) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) встраивание нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII (например, мотивов киНК, проиллюстрированных в таблице I) или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, которые не стимулируют ответа интерферона.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу создания композиций киНК, которые не стимулируют ответ интерферона (например, имеет место отсутствие ответа интерферона или ослабленный ответ интерферона) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) получение композиции киНК, включающей молекулу киНК согласно настоящему изобретению и вектор доставки или частицы, используемые для доставки, согласно настоящему описанию или согласно любой известной в данной области методике, и (b) тестирование композиции киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения композиций киНК, которые не стимулируют ответа интерферона. В одном варианте указанный интерферон включает интерферон-альфа.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК, которые не стимулируют воспалительный или провоспалительный цитокиновый ответ (например, имеет место отсутствие ответа цитокина или ослабленный ответ цитокина) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) встраивание нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII (например, мотивов киНК, проиллюстрированных в таблице I) или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, которые не стимулируют ответа цитокина. В одном варианте указанный цитокин включает интерлейкин, такой как интерлейкин-6 (IL-6) и/или фактор некроза опухолевой ткани-альфа (TNF-α).

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу создания композиций киНК, которые не стимулируют воспалительный или провоспалительный цитокиновый ответ (например, имеет место отсутствие ответа цитокина или ослабленный ответ цитокина) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) получение композиции киНК, включающей молекулу киНК согласно настоящему изобретению и вектор доставки или частицы, используемые для доставки, согласно настоящему описанию или согласно любой известной в данной области методике, и (b) тестирование композиции с киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения композиций киНК, которые не стимулируют ответа цитокина. В одном варианте указанный цитокин включает интерлейкин, такой как интерлейкин-6 (IL-6) и/или фактор некроза опухолевой ткани-альфа (TNF-α).

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК, которые не стимулируют ответ Toll-подобного рецептора (NLR) (например, имеет место отсутствие TLR ответа или ослабленный TLR ответ) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) встраивание нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII (например, мотивов киНК, проиллюстрированных в таблице I) или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, которые не стимулируют TLR ответа. В одном варианте TLR включает TLR3, TLR7, TLR8 и/или TLR9.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения композиций киНК, которые не стимулируют ответ Toll-подобного рецептора (NLR) (например, имеет место отсутствие TLR ответа или ослабленный TLR ответ) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) получение композиции киНК, содержащей молекулу киНК согласно настоящему изобретению и вектор доставки или частицы, используемые для доставки, согласно настоящему описанию или согласно любой известной в данной области методике, и (b) тестирование композиции киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения композиций киНК, которые не стимулируют ответа TLR. В одном варианте TLR включает TLR3, TLR7, TLR8 и/или TLR9.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически синтезированной двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через процесс интерференции РНК (РНКи), где: (а) каждая цепь указанной молекулы киНК включает от примерно 18 до примерно 38 нуклеотидов в длину; (b) одна цепь указанной молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной степенью комплементарности к указанной целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК; и (с) где нуклеотидные части в составе указанной молекулы киНК химически модифицированы для снижения иммуностимулирующих свойств молекулы киНК до уровня, который ниже, чем указанные свойства у соответствующей немодифицированной молекулы киНК. Считается, что такие молекулы киНК обладают улучшенным токсикологическим профилем, в сравнении с немодифицированной или минимально модифицированной киНК.

Фраза «улучшенный токсикологический профиль» в контексте настоящего описания означает, что химически модифицированная или изготовленная конструкция киНК демонстрирует сниженную токсичность в клетке, у субъекта или в организме, в сравнении с немодифицированной или неформулированной киНК или с молекулой киНК, имеющей меньший уровень модификации или такие модификации, которые менее эффективны с позиции улучшения токсикологических характеристик. Такие молекулы киНК также рассматриваются как обладающие «повышенной активностью РНКи». В не ограничивающем примере молекулы и композиции киНК с улучшенными токсикологическими профилями ассоциированы со сниженными иммуностимулирующими свойствами, такими как сниженный, уменьшенный или ослабленный иммуностимулирующий ответ в клетке, у субъекта или организме, в сравнении с немодифицированной или неформулированной киНК или с молекулой киНК, имеющей меньшие модификации или модификации, которые менее эффективны с позиции улучшения токсикологических параметров. Такой улучшенный токсикологический профиль характеризуется подавленной или сниженной иммуностимуляцией, такой как снижение или подавление индукции интерферонов (например, интерферона-альфа), воспалительных интерлейкинов (например, интерлейкинов, таких как IL-6 и/или TNF-альфа) и/или toll-подобных рецепторов (таких как TLR-3, TLR-7, TLR-8 и/или TLR-9. В одном варианте молекула или композиция на основе киНК с улучшенным токсикологическим профилем не включает рибонуклеотидов. В одном варианте молекула или композиция киНК с улучшенным токсикологическим профилем включает менее 5 рибонуклеотидов (например, 1, 2, 3 или 4 рибонуклеотида). В одном варианте молекула или композиция киНК с улучшенным токсикологическим профилем включает Stab 7, Stab 8, Stab 11, Stab 12, Stab 13, Stab 16, Stab 17, Stab 18, Stab 19, Stab 20, Stab 23, Stab 24, Stab 25, Stab 26, Stab 27, Stab 28, Stab 29, Stab 30, Stab 31, Stab 32, Stab 33, Stab 34, Stab 35, Stab 36 или любое их сочетание (см. таблица I). В тексте настоящего описания все числовые показатели в химических структурах Stab включают и 2'-фтор- и 2'-OCF3 варианты химических структур, показанных в таблице I. Например, «Stab 7/8» относится и к Stab 7/8, и к Stab 7F/8F и т.п. В одном варианте молекула или композиция киНК с улучшенным токсикологическим профилем включает молекулу киНК согласно настоящему изобретению и композицию, описанную в заявке на патент США № 20030077829, включенную в настоящее описание полностью в качестве ссылки вместе с рисунками.

В одном варианте уровень иммуностимулирующего ответа, ассоциированного с данной молекулой киНК, может быть измерен в соответствии с приведенной в описании методикой или в соответствии с другим известным в данной области способом, например путем определения уровня PKR/интерферонового ответа, пролиферации, B-клеточной активации и/или продукции цитокинов в соответствующих тестах, используемых для количественной оценки иммуностимулирующего ответа конкретных молекул киНК (см., например, Leifer et al., 2003, J Immonother. 26, 313-9; и патент США № 5968909, включенный в настоящее описание полностью в качестве ссылки). В одном варианте сниженный иммуностимулирующий ответ определяется значениями в диапазоне от примерно 10% до примерно 100% в сравнении с молекулой немодифицированной или минимально модифицированной киНК, например, выражается снижением иммуностимулирующего ответа примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. В одном варианте иммуностимулирующий ответ, ассоциированный с молекулой киНК, может модулироваться уровнем химической модификации. Так, например, молекула киНК, включающая модифицированные нуклеотиды на уровне от примерно 10% до примерно 100%, в частности примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% от всех нуклеотидных позиций в молекуле киНК, могут быть отобраны применительно к соответствующей степени иммуностимулирующих свойств согласно настоящему описанию.

В одном варианте степень снижения иммуностимулирующего ответа выбирают для оптимизации активности РНКи. Например, сохранение определенной степени иммуностимуляции может быть предпочтительно для лечения вирусной инфекции, где менее чем 100% снижение иммуностимуляции может быть предпочтительно для достижения максимальной антивирусной активности (в частности, снижение иммуностимуляции примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%), тогда как ингибирование экспрессии эндогенного целевого гена может быть предпочтительно в случае молекул киНК, которые обладают минимальными стимулирующими свойствами, с целью предупреждения неспецифической токсичности или нецелевых эффектов (в частности, снижение иммуностимуляции от примерно 90% до примерно 100%).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически синтезированной двухцепочечной киНК, которая направляет расщепление целевой РНК через процесс интерференции РНК (РНКи), где: (а) каждая цепь указанной молекулы киНК составляет в длину от примерно 18 до примерно 38 нуклеотидов; (b) одна цепь указанной молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной степенью комплементарности к указанной целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК; и (с) где один или несколько нуклеотидов в указанной молекуле киНК химически модифицированы для снижения иммуностимулирующих свойств молекулы киНК до уровня, который ниже, чем у соответствующей молекулы немодифицированной киНК. В одном варианте каждая цепь включает по меньшей мере примерно 18 нуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидам в другой цепи.

В другом варианте молекула киНК, в которую введены модифицированные нуклеотиды с целью снижений иммуностимулирующих свойств указанной молекул киНК, включает антисмысловой участок, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную к нуклеотидной последовательности целевого гена или его части, и также включает смысловой участок, где указанный смысловой участок имеет нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична нуклеотидной последовательности указанного целевого гена или его части. В другом варианте антисмысловой участок и смысловой участок включают от примерно 18 до примерно 38 нуклеотидов, где указанный антисмысловой участок включает по меньшей мере примерно 18 нуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидам в смысловом участке. В одном варианте осуществления настоящего изобретения пиримидиновые нуклеотиды в смысловом участке представляют собой 2'-О-метилпиримидиновые нуклеотиды. В другом варианте пуриновые нуклеотиды в смысловом участке представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В еще одном варианте пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды в указанном антисмысловом участке представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды. В еще одном варианте пуриновые нуклеотиды в указанном антисмысловом участке представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения пуриновые нуклеотиды, присутствующие в указанном антисмысловом участке, включают 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В другом варианте указанный антисмысловой участок включает фосфоротиоатную межнуклеотидную связь на 3'-конце указанного антисмыслового участка. В другом варианте антисмысловой участок включает глицерильную модификацию на 3'-конце указанного антисмыслового участка.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения молекула киНК, в которую включены модифицированные нуклеотиды с целью снижения иммуностимулирующих свойств указанной молекулы киНК, может включать любые структурные особенности молекул киНК согласно настоящему описанию. В других вариантах молекула киНК, в которую введены модифицированные нуклеотиды с целью снижения иммуностимулирующих свойств указанной молекулы киНК, может включать любые химические модификации молекул киНК согласно настоящему описанию.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекулы химически синтезированной двухцепочечной киНК, содержащей химически модифицированные нуклеотиды, которые вводятся с целью снижения иммуностимулирующих свойств указанной молекулы киНК, включающему: (а) введение одного или нескольких модифицированных нуклеотидов в молекулу киНК и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекулы киНК, обладающей сниженными иммуностимулирующими свойствами, в сравнении с соответствующей молекулой киНК, содержащей немодифицированные нуклеотиды. Каждая цепь молекулы киНК включает в длину от примерно 18 до примерно 38 нуклеотидов. Одна цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной степенью комплементарности к целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через процесс интерференции РНК. В одном варианте сниженные иммуностимулирующие свойства включают подавленную или сниженную индукцию воспалительных или провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-6 (IL-6) или фактор некроза опухолевой ткани (TNF-α), в ответ на введение киНК в клетку, ткань или организм. В другом варианте сниженные иммуностимулирующие свойства включают подавленную или сниженную индукцию Toll-подобных рецепторов (TLR), таких как TLR3, TLR7, TLR8 или TLR9, в ответ на введение киНК в клетку, ткань или организм. В другом варианте сниженные иммуностимулирующие свойства включают подавленную или сниженную индукцию интерферонов, таких как интерферон-альфа, в ответ на введение киНК в клетку, ткань или организм.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкциям киНК, которые опосредуют процесс РНКи против целевого полинуклеотида, где указанная конструкция киНК включают одну или несколько химических модификаций согласно настоящему описанию, которые модулируют связывающую афинность между смысловой и антисмысловой цепями указанной конструкции киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной связывающей афинностью между смысловой и антисмысловой цепями молекулы киНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной связывающей афинностью между смысловой и антисмысловой цепями молекулы киНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкциям киНК, которые опосредуют процесс РНКи против целевого полинуклеотида, где указанная конструкция киНК включает одну или несколько химических модификаций согласно настоящему описанию, которые модулируют связывающую афинность между антисмысловой цепью конструкции киНК и комплементарной последовательностью целевой РНК в клетке.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкциям киНК, которые опосредуют процесс РНКи против целевого полинуклеотида, где указанная конструкция киНК включает одну или несколько химических модификаций согласно настоящему описанию, которые модулируют связывающую афинность между антисмысловой цепью конструкции киНК и комплементарной последовательностью целевой ДНК в клетке.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной связывающей афинностью между антисмысловой цепью молекулы киНК и комплементарной последовательностью целевой РНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, обладающих повышенной связывающей афинностью между антисмысловой цепью молекулы киНК и комплементарной последовательностью целевой РНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной связывающей афинностью между антисмысловой цепью молекулы киНК и комплементарной последовательностью целевой ДНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, обладающих повышенной связывающей афинностью между антисмысловой цепью молекулы киНК и комплементарной последовательностью целевой ДНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкциям киНК, которые опосредуют процесс РНКи против целевого полинуклеотида, где указанная конструкция киНК включает одну или несколько химических модификаций согласно настоящему описанию, которые модулируют полимеразную активность клеточной полимеразы, способной генерировать дополнительные эндогенные молекулы киНК, обладающие гомологией по последовательности к конструкции химически модифицированной киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК, способных опосредовать процесс повышения полимеразной активности клеточной полимеразы, способной генерировать дополнительные эндогенные молекулы киНК, обладающие гомологией по последовательности к молекуле химически модифицированной киНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, способных опосредовать процесс повышения полимеразной активности клеточной полимеразы, способной генерировать дополнительные эндогенные молекулы киНК, обладающие гомологией по последовательности к молекуле химически модифицированной киНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкциям химически модифицированной киНК, которые опосредуют процесс РНКи против целевого полинуклеотида в клетке, где указанные химические модификации не оказывают существенного влияния на взаимодействие киНК с целевой молекулой РНК, молекулой ДНК и/или белками или другими факторами, которые обязательны для процесса РНКи, в таком варианте, который мог бы снизить эффективность РНКи, опосредованную участием таких конструкций киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной специфичностью РНКи против полинуклеотидных мишеней, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной специфичностью РНКи. В одном варианте повышенная специфичность включает сниженные нецелевые эффекты в сравнении с молекулой немодифицированной киНК. Например, введение концевых кэп-фрагментов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи или участке молекулы киНК согласно настоящему изобретению может придавать киНК повышенную специфичность за счет устранения возможности функционирования смысловой цепи и смыслового участка в качестве матрицы в процессе активной РНКи против соответствующей мишени, комплементарной к смысловой цепи или смысловому участку.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной активностью РНКи против целевого полинуклеотида, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или их любым сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной активностью РНКи.

В еще одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной активностью РНКи против целевой РНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или их любым сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной активностью РНКи против целевой РНК.

В еще одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной активностью РНКи против целевой ДНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или их любым сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной активностью РНКи против целевой ДНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкциям киНК, которые опосредуют процесс РНКи против целевого полинуклеотида, где указанная конструкция киНК включает одну или несколько химических модификаций согласно настоящему описанию, которые модулируют поглощение клеткой конструкции киНК, такой как конструкция киНК, конъюгированная с холестерином.

В еще одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК против целевого полинуклеотида с повышенной способностью к поглощению клетками, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или их любым сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной способностью к клеточному поглощению.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкциям киНК, которые опосредуют процесс РНКи против целевого полинуклеотида, где указанная конструкция киНК включают одну или несколько химических модификаций согласно настоящему описанию, которые повышают биодоступность таких конструкций киНК, например, за счет присоединения полимерных конъюгатов, таких как полиэтиленгликоль, или эквивалентных конъюгатов, которые улучшают фармакокинетику конструкции киНК, или за счет присоединения конъюгатов, которые направляют конструкцию в специфические типы тканей или специфические типы клеток in vivo. Не ограничивающие примеры таких конъюгатов описаны в заявке на патент США, серийный номер 10/201394 (Vargееse et al.), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК согласно настоящему изобретению с повышенной биодоступностью, включающему (а) введение конъюгата в структуру молекулы киНК и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекулы киНК с повышенной биодоступностью. Такие конъюгаты могут включать лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие локализацию белка, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; производные холестерина; полиамины, такие как спермин или спермидин, и другие.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая включает первую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности целевой РНК или ее части, и вторую последовательность, комплементарную к указанной первой последовательности, где указанная вторая последовательность химически модифицирована таким образом, что она больше не может действовать в качестве ведущей последовательности для эффективного участия в интерференции РНК и/или распознаваться клеточными белками, которые способствуют РНКи. В одном варианте первая нуклеотидная последовательность киНК химически модифицирована согласно настоящему описанию. В одном варианте первая нуклеотидная последовательность киНК не модифицирована (например, представляет собой суммарную РНК).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая включает первую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности целевой РНК или ее части, и вторую последовательность, обладающую комплементарностью к указанной первой последовательности, где указанная вторая последовательность разработана или модифицирована таким образом, что препятствует ее поступлению в путь РНКи в качестве ведущей последовательности или в качестве последовательности, которая комплементарна к последовательности целевой нуклеиновой кислоты (например, РНК). В одном варианте первая нуклеотидная последовательность киНК химически модифицирована согласно настоящему описанию. В одном варианте первая нуклеотидная последовательность киНК не модифицирована (например, полностью представляет РНК). Такая архитектура или такие модификации, как ожидается, будут повышать активность киНК и/или улучшать специфичность молекул киНК согласно настоящему изобретению. Ожидается также, что указанные модификации будут минимизировать любые нецелевые эффекты и/или ассоциированную с ними токсичность.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая включает первую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности целевой РНК или ее части, и вторую последовательность, обладающую комплементарностью к указанной первой последовательности, где указанная вторая последовательность не способна действовать в качестве ведущей последовательности для участия в интерференции РНК. В одном варианте первая нуклеотидная последовательность киНК химически модифицирована согласно настоящему описанию. В одном варианте первая нуклеотидная последовательность киНК не модифицирована (например, представляет собой полностью РНК).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая включает первую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности целевой РНК или ее части, и вторую последовательность, обладающую комплементарностью к указанной первой последовательности, где указанная вторая последовательность не содержит терминальную 5'-гидроксильную (5'-OH) или 5'-фосфатную группы.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая включает первую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности целевой РНК или ее части, и вторую последовательность, обладающую комплементарностью к указанной первой последовательности, где указанная вторая последовательность включает концевой кэп-фрагмент на 5'-конце указанной второй последовательности. В одном варианте концевой кэп-фрагмент включает безосновный инвертированный фрагмент, инвертированный дезокси безосновный фрагмент, инвертированный нуклеотидный фрагмент, группу, показанную на фиг. 10, алкильную или циклоалкильную группы, гетероцикл или любую другую группу, которая препятствует активности РНКи, где вторая последовательность служит в качестве ведущей последовательности или матрицы для РНКи.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая включает первую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности целевой РНК или ее части, и вторую последовательность, обладающую комплементарностью к указанной первой последовательности, где указанная вторая последовательность включает концевой кэп-фрагмент на 5'-конце и 3'-конце указанной второй последовательности. В одном варианте каждый концевой кэп-фрагмент включает безосновный инвертированный фрагмент, инвертированный дезокси безосновный фрагмент, инвертированный нуклеотидный фрагмент, группу, показанную на фиг. 10, алкильную или циклоалкильную группы, гетероцикл или любую другую группу, которая препятствует проявлению активности РНКи, где вторая последовательность служит в качестве ведущей последовательности или матрицы для РНКи.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК согласно настоящему изобретению с повышенной специфичностью для осуществления отрицательной регуляции или ингибирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК, такой как ген или ее соответствующая РНК), включающему (а) введение одной или нескольких химических модификаций в структуру молекулы киНК и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с улучшенной специфичностью. В другом варианте химическая модификация, используемая для повышения специфичности, включает концевые кэп-модификации на 5'-конце, 3'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах, молекулы киНК. Концевые кэп-модификации могут включать, например, структуру, показанную на фиг. 10 (например, инвертированные дезокси безосновные фрагменты), или любую другую модификацию, которая придает части молекулы киНК (например, смысловой цепи) неспособность участвовать в интерференции РНК против последовательности нецелевой нуклеиновой икслоты. В не ограничивающем примере молекула киНК сконструирована таким образом, что только антисмысловая последовательность молекулы киНК может служить в качестве ведущей последовательности в RISC-опосредованной деградации соответствующей последовательности целевой РНК. Это сопровождается тем, что смысловая последовательность киНК делается неактивной из-за введения в нее химических модификаций, которые препятствуют распознаванию смысловой цепи в качестве ведущей последовательности механизмом РНКи. В одном варианте такие химические модификации включают любую химическую группу на 5'-конце смысловой цепи киНК или любую другую группу, которая может придать смысловой цепи неактивность в качестве ведущей последовательности в процессе интерференции РНК. Такие модификации, например, могут приводить к образованию молекулы, в которой 5'-конец смысловой цепи уже не содержит свободной 5'-гидроксильной (5'-OH) или свободной 5'-фосфатной группы (например, фосфат, дифосфат, трифосфат, циклический фосфат и т.п.). Не ограничивающие примеры таких конструкций киНК, приведенных в настоящем описании, включают, например, «Stab 9/10», «Stab 7/8», «Stab 7/19», «Stab 17/22», «Stab 23/24», «Stab 24/25» и «Stab 24/26» (например, любую киНК, включающую Stab 7, 9, 17, 23 или 24 в смысловых цепях) и их варианты (см. таблица I), где 5'-конец и 3'-конец смысловой цепи киНК не включают гидроксильную группу или фосфатную группу. Согласно настоящему описанию, символьные знаки в обозначении химических структур Stab включают и 2'-фтор-, и 2'-ОCF3 варианты химических структур, приведенных в таблице I. Например, термин «Stab 7/8» относится и к Stab 7/8, и к Stab 7F/8F.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК согласно настоящему изобретению с повышенной специфичностью для осуществления отрицательной регуляции или ингибирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК, такой как ген или ее соответствующая РНК), включающему введение одной или нескольких химических модификаций в структуру молекулы киНК, которые устраняют возможность активности цепи или части молекул киНК в качестве матрицы или ведущей последовательности в процессе РНКи. В одном варианте неактивная цепь или смысловой участок молекулы киНК представляет собой смысловую цепь или смысловой участок молекулы киНК, например цепь или участок киНК, который не обладает комплементарностью к последовательности целевой нуклеиновой кислоты. В одном варианте такие химические модификации включают любую химическую группу на 5'-конце смысловой цепи или участка киНК, которая не включает 5'-гидроксильную (5'-OH) или 5'-фосфатную группу или любую другую группу, которая служит для того, чтобы сделать смысловую цепь или смысловой участок не активными в качестве ведущей последовательности в процессе интерференции РНК. Не ограничивающие примеры таких конструкций киНК, описанные в настоящем изобретении, включают такие конструкции, как «Stab 9/10», «Stab 7/8», «Stab 7/19», «Stab 17/22», «Stab 23/24», «Stab 24/25» и «Stab 24/26» (например, любую киНК, включающую Stab 7, 9, 17, 23 или 24 в смысловых цепях) и их варианты (см. таблица I), где 5'-конец и 3'-конец смысловой цепи киНК не включают гидроксильную группу или фосфатную группу. Согласно настоящему описанию символьные знаки в обозначении Stab химических структур включают и 2'-фтор-, и 2'-ОCF3 варианты химических структур, приведенных в таблице I. Например, термин «Stab 7/8» относится и к Stab 7/8, и к Stab 7F/8F.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу скринигга молекул киНК, которые активны в опосредовании интерференции РНК против последовательности целевой нуклеиновой кислоты, включающему (а) получение множества немодифицированных молекул киНК, (b) скрининг молекул киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, которые демонстрируют активность в опосредовании интерференции РНК против последовательности целевой нуклеиновой кислоты, и (с) введение химических модификаций (например, химических модификаций согласно настоящему описанию или иных известных в данной области) в молекулы активных киНК согласно пункту (b). В одном варианте указанный способ также включает повторный скрининг молекул химически модифицированных киНК согласно стадии (с) в условиях, подходящих для выделения молекул химически модифицированных киНК, которые активно опосредуют интерференцию РНК против последовательности целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу скрининга химически модифицированных молекул киНК, которые активно опосредуют интерференцию РНК против последовательности целевой нуклеиновой кислоты, включающему (а) получение множества молекул химически модифицированных молекул киНК (например молекул киНК согласно настоящему описанию или иных, известных в данной области), и (b) скрининг молекул киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул химически модифицированных киНК, которые активны в опосредовании интерференции РНК против последовательности целевой нуклеиновой кислоты.

Термин «лиганд» относится к любому соединению или молекуле, таким как лекарственное средство, пептид, гормон или нейротрансмиттер, которые способны взаимодействовать с другим соединением, таким как рецептор, либо непосредственно, либо опосредованно. Рецептор, который взаимодействует с лигандом, может присутствовать на поверхности клетки или, альтернативно, может представлять собой внутриклеточный рецептор. Взаимодействие лиганда с рецептором может приводить к биохимической реакции, или это может быть просто физическое взаимодействие или ассоциация.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК согласно настоящему изобретению с повышенной биодоступностью, включающему (а) объединение композиции экципиента с молекулой киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной биодоступностью. Такие эксципиенты включают полимеры, такие как циклодекстрины, липиды, катионные липиды, полиамины, фосфолипиды, наночастицы, рецепторы, лиганды и другие.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК согласно настоящему изобретению с повышенной биодоступностью, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или их любым сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной биодоступностью.

В другом варианте полиэтиленгликоль (ПЭГ) может быть ковалентно присоединен к соединениям киНК согласно настоящему изобретению. Присоединенные ПЭГ могут иметь любой молекулярный вес, предпочтительно от примерно 100 до примерно 50000 дальтон (Да).

Настоящее изобретение может использоваться либо само по себе, либо как компонент набора, включающего по меньшей мере один из реагентов, необходимых для осуществления процесса введения РНК in vitro или in vivo с целью тестирования образцов и/или субъектов. Например, предпочтительные компоненты указанного набора включают молекулу киНК согласно настоящему изобретению и носитель, который способствует введению киНК в интересующие клетки согласно настоящему описанию (например, с использованием липидов и других способов трансфекции, известных в данной области, см., например, Beigelman et al., US 6395713). Указанный набор также может использоваться для целевой валидации, например для определения генной функции и/или активности гена, или в процессе оптимизации лекарственного препарата, а также при разработке лекарственных препаратов (см., например, Usman et al., USSN 60/402996). Такой набор может также включать инструкцию для пользователей, позволяющую применять на практике набор согласно настоящему изобретению.

Термин «короткая интерферирующая нуклеиновая кислота», «киНК», «короткая интерферирующая РНК», «киРНК», «молекула короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты», «молекула короткого интерферирующего олигонуклеотида» или «молекула химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания относится к любой молекуле нуклеиновой кислоты, способной осуществлять ингибирование или отрицательную регуляцию генной экспрессии или вирусной репликации опосредованием интерференции РНК «РНКи» или в процессе молчания гена в специфичном для последовательности режиме. Указанные термины могут относиться как к отдельным молекулам нуклеиновой кислоты, так и к множеству таких молекул нуклеиновой кислоты или к объединению таких молекул нуклеиновой кислоты. Соответственно, киНК может представлять собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающую самокоплементарный смысловой и антисмысловой участки, где указанный антисмысловой участок включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части. При этом киНК может быть собрана из двух отдельных олигонуклеотидов, где одна цепь представляет собой смысловую цепь, а другая цепь представляет собой антисмысловую цепь, где антисмысловая и смысловая цепи являются самокомплементарными (то есть каждая цепь включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности другой цепи); так что в том случае, когда антисмысловая цепь и смысловая цепь формируют дуплекс или двухцепочечную структуру, например, где участок двухцепочечной молекулы содержит от примерно 15 до примерно 30, в частности примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 пар оснований, антисмысловая цепь включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловая цепь включает нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части (в частности, от примерно 15 до примерно 25 или более нуклеотидов молекулы киНК комплементарны целевой нуклеиновой кислоте или ее части). Альтернативно, киНК может быть собрана из одного нуклеотида в том случае, когда самокомплементарные смысловой и антисмысловой участки молекулы киНК соединяются с помощью одного или нескольких линкеров на основе нуклеиновой кислоты или на основе одного или нескольких линкеров, отличных от нуклеиновой кислоты. Указанная киНК может представлять собой полинуклеотид, имеющий дуплексную структуру, структуру асимметричного дуплекса, шпилечную структуру или асимметричную шпилечную вторичную структуру, содержащий самокомплементарные смысловой и антисмысловой участки, где указанный антисмысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле отдельной нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части. Указанная киНК может представлять собой кольцевой одноцепочечный полинуклеотид, содержащий две или более петлевых структур и стебель, включающий самокомплементарные смысловой и антисмысловой участки, где указанный антисмысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и где указанный кольцевой полинуклеотид может быть подвергнут процессингу in vivo или in vitro с получением активной молекулы киНК, способной участвовать в процессе РНКи. Указанная киНК может также включать одноцепочечный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности в молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части (например, когда в случае такой молекулы киНК не требуется наличия в данной молекуле киНК нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части), где указанный одноцепочечный полинуклеотид может также включать концевую фосфатную группу, такую как 5'-фосфат (см., например, Martinez et al., 2002, Cell, 110, 563-574 и Schwatz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568) или 5'-, 3'-дифосфат. В некоторых вариантах молекула киНК согласно настоящему изобретению включает отдельные смысловые и антисмысловые последовательности или участки, где указанные смысловые и антисмысловые участки ковалентно соединяются с помощью нуклеотидных или ненуклеотидных линкерных молекул, известных в данной области, или, в альтернативном варианте, могут быть нековалентно соединены силами ионного взаимодействия, водородными связями, силами Ван-дер-вальса, по типу гидрофобных взаимодействий и/или путем слипания. В некоторых вариантах молекулы киНК согласно настоящему изобретению включают нуклеотидную последовательность, которая комплементарна последовательности целевого гена. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению взаимодействует с нуклеотидной последовательностью целевого гена таким образом, что вызывает ингибирование экспрессии целевого гена. В этой связи молекулы киНК необязательно ограничиваются теми молекулами, которые содержат только РНК, но также охватывают химически модифицированные нуклеотиды и фрагменты ненуклеотидной природы. В некоторых вариантах молекулы короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению не содержат нуклеотидов, включающих 2'-гидрокси (2'-OH) группу. Заявитель описывает в рамках некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения короткие интерферирующие нуклеиновые кислоты, в случае которых не требуется наличия нуклеотидов, содержащих 2'-гидроксигруппу, для их участия в процессе РНКи, и в этой связи молекулы короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, в необязательном варианте, не включают какие-либо рибонуклеотиды (например, нуклеотиды, содержащие 2'-OH группу). Такие молекулы киНК, в случае которых не требуется наличия рибонуклеотидов в молекуле киНК для их участия в РНКи, могут, тем не менее, содержать присоединенные один или несколько линкеров или другие присоединенные или ассоциированные группы, фрагменты или цепи, содержащие один или несколько нуклеотидов с 2'-OH группами. Необязательно, молекулы киНК могут включать рибонуклеотиды примерно в 5, 10, 20, 30, 40 или 50% от всех нуклеотидных позиций. Молекулы модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут также описываться как короткие модифицированные интерферирующие олигонуклеотиды «siMON». Соответственно, в контексте настоящего описания применение термина киНК эквивалентно другим терминам, используемым для описания молекул нуклеиновой кислоты, которые способны вовлекаться в специфичный по последовательности процесс РНКи, таким как, например, термины короткая интерферирующая РНК (киРНК), двухцепочечная РНК (дцРНК), микроРНК (миРНК), короткая шпилечная РНК (кшРНК), короткий интерферирующий олигонуклеотид, короткая интерферирующая нуклеиновая кислота, короткий интерферирующий модифицированный олигонуклеотид, химически модифицированная киРНК, молчащая РНК на стадии пост-транскрипции гена (ptgsРНК) и другие. Не ограничивающие примеры молекул киНК согласно настоящему изобретению проиллюстрированы на фиг. 4-6 и в таблице II. Такие молекулы отличаются от других молекул нуклеиновой кислоты, полученных по методикам, известным в данной области, которые вовлекаются в ингибирование экспрессии гена, такие как рибозимы, антисмысловые молекулы, триплекс-формирующие молекулы, аптамеры, 2,5-А-химерные молекулы или «ложные» олигонуклеотиды.

Термины «интерференция РНК» или «РНКи» обозначают биологический процесс ингибирования или отрицательной регуляции генной экспрессии в клетке, в соответствии с общими представлениями, имеющимися в данной области, и который опосредован участием в нем молекул короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (см., например, Zamore and Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524; и Vaughn and Martienssen, 2005, Science, 309, 1525-1526; Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; и Kreutzer et al., Международная РСТ публикация № WO 00/44895; Zernicka-Goetz et al., Международная РСТ публикация № WO 01/36646; Fire, Международная РСТ публикация № WO 99/32619; Plaetnick et al., Международная РСТ публикация № WO 00/01846; Mello and Fire, Международная РСТ публикация № WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, Международная РСТ публикация № WO 99/07409; и Li et al., Международная РСТ публикация № WO 00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; и Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart et al., 2002, Gene & Dev, 16, 1616-1626; и Reinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831). Кроме того, в контексте настоящего описания термин РНКи используется эквивалентно с терминами, обычно применяемыми для описания специфичной по последовательности интерференции РНК, такой как пост-транскрипционное молчание гена, ингибирование на уровне трансляции, ингибирование на уровне транскрипции или эпигенез. Так, например, молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут использоваться для достижения эпигенетического молчания генов как на посттранскрипционном уровне, так и на претранскрипционном уровне. В рамках не ограничивающего примера эпигенетическая модуляция генной экспрессии молекулами киНК согласно настоящему изобретению может возникать в результате киНК-опосредованной модификации структуры хроматина или характера метилирования, ведущей к изменению генной экспрессии (см., например, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837, Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; и Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237). В рамках другого не ограничивающего примера модуляция генной экспрессии под действием молекул киНК согласно настоящему изобретению может стать результатом киНК-опосредованного расщепления РНК (кодирующей или некодирующей РНК) через образование комплекса RISC или, альтернативно, в ходе ингибирования на уровне трансляции, известного в данной области. В другом варианте модуляция генной экспрессии под действием молекул киНК согласно настоящему изобретению может стать результатом ингибирования на уровне транскрипции (см., например, Janowski et al., 2005, 1, 216-222).

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой олигонуклеотид, формирующий дуплекс «DFO» (см., например, фиг. 14-15 и Vaish et al, USSN 10/727780, зарегистрированный 3 декабря 2003 года, и международную PCT заявку на патент № US04/16390, зарегистрированную 24 мая 2004 года).

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой полифункциональную киНК (см., например, фиг. 16-28 и Jadhav et al, USSN 60/543480, зарегистрированный 10 февраля 2004 года, и международную PCT заявку на патент № US04/16390, зарегистрированную 24 мая 2004 года). В одном варианте полифункциональная киНК согласно настоящему изобретению может включать последовательность, направленно воздействующую, например, на два или более участка целевой РНК (см., например, целевые последовательности, приведенные в таблицах II и III). В одном варианте полифункциональная киНК согласно настоящему изобретению может включать последовательность, направленно воздействующую на одну или несколько мишеней, включая кодирующие участки и некодирующие участки SREBP1.

Термин «асимметричная шпилечная структура» в контексте настоящего описания обозначает молекулу линейной киНК, включающую антисмысловой участок, петлевой участок, который может включать нуклеотиды или фрагменты ненуклеотидной природы, и смысловой участок, который включает меньшее количество нуклеотидов, чем антисмысловой участок, до такого предела, чтобы смысловой участок имел достаточное количество комплементарных нуклеотидов для спаривания по основаниям с антисмысловым участком и мог образовывать дуплекс с петлевой структурой. Например, молекула асимметричной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению может включать антисмысловой участок с длиной, достаточной для опосредования РНКи в клетке или системе in vitro (в частности, от примерно 15 до примерно 30 или примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов), и петлевой участок, включающий от примерно 4 до примерно 12 (в частности, примерно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) нуклеотидов, и смысловой участок, содержащий от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) нуклеотидов, которые комплементарны антисмысловому участку. Молекула асимметричной шпилечной киНК может включать также 5'-концевую фосфатную группу, которая может быть химически модифицирована. Петлевая часть молекулы асимметричной шпилечной киНК может включать нуклеотиды, фрагменты ненуклеотидной природы, линкерные молекулы или конъюгированные молекулы согласно настоящему изобретению.

Термин «асимметричный дуплекс» в контексте настоящего описания обозначает молекулу киНК, включающую две отдельные цепи, которые содержат смысловой участок и антисмысловой участок, где указанный смысловой участок включает меньшее число нуклеотидов, чем антисмысловой участок, до такого предела, чтобы смысловой участок имел достаточное количество комплементарных нуклеотидов для спаривания по основаниям с антисмысловым участком и мог сформировать дуплекс. Например, молекула асимметричной дуплексной киНК согласно настоящему изобретению может включать антисмысловой участок с длиной, достаточной для участия в РНКи в клетке или системе in vitro (в частности, от примерно 15 до примерно 30 или примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов), и смысловой участок, содержащий от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) нуклеотидов, которые комплементарны антисмысловому участку.

Термин «ингибитор РНКи» в контексте настоящего описания обозначает любую молекулу, которая может осуществлять отрицательную регуляцию, снижать или ингибировать функцию или активность интерференции РНК в клетке или в организме. Ингибитор РНКи может осуществлять отрицательную регуляцию, снижать или ингибировать РНКи (например, РНКи-опосредованное расщепление целевого полинуклеотида, осуществлять ингибирование трансляции или приводить к транскрипционному молчанию) путем взаимодействия с функцией любого компонента на пути РНКи или создания препятствий такой функции, включая белковые компоненты, такие как RISC, или компоненты нуклеиновой кислоты, такие как миРНК или киРНК. Ингибитор РНКи может представлять молекулу киНК, антисмысловую молекулу, аптамер или малую молекулу, которая взаимодействует с функцией или препятствует функции RISC, миРНК или киРНК или любого другого компонента на пути РНКи в клетке или в организме. За счет достижения ингибирования РНКи (например, РНКи-опосредованного расщепления целевого полинуклеотида, ингибирования трансляции или транскрипционного молчания), ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может использоваться для модуляции (например, для позитивной регуляции или отрицательной регуляции) экспрессии целевого гена. В одном варианте ингибитор РНК согласно настоящему изобретению используется для позитивной регуляции генной экспрессии путем создания препятствий, интерферирования (например, за счет снижения или предотвращения) эндогенной отрицательной регуляции или ингибирования генной экспрессии по пути ингибирования трансляции, транскрипционного молчания или RISC-опосредованного расщепления полинуклеотидов (например, мРНК). Соответственно, в рамках пути, создающего препятствия механизму эндогенной репрессии, молчания или ингибирования генной экспрессии, ингибиторы РНКи согласно настоящему изобретению могут применяться для позитивной регуляции генной экспрессии при лечении заболеваний, признаков или состояний, определяемых отсутствием функции. В одном варианте термин «ингибитор РНКи» используется вместо термина «киНК» в различных вариантах настоящего изобретения, например применительно к описанию эффекта повышения генной экспрессии для целей лечения заболеваний, признаков и/или состояний, связанных с отсутствием функции.

Термин «аптамер» или «аптамер нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания обозначает полинуклеотид, который специфически связывается с молекулой-мишенью, где указанная молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность, которая отличается от последовательности, распознаваемой целевой молекулой в ее природном окружении. Альтернативно, аптамер может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая связывается с молекулой-мишенью, где указанная молекула-мишень в естественном состоянии не связывается с нуклеиновой кислотой. Указанная молекула-мишень может представлять собой любую интересующую молекулу. Например, аптамер может использоваться для связывания с лиганд-связывающим доменом белка, что устраняет возможность взаимодействия природного лиганда с белком. Это один из не ограничивающих примеров его использования, тогда как специалисты в данной области хорошо понимают, что имеются другие варианты, которые могут легко быть получены с использованием известных методик (см., например, Gold et al., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brode and Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Сurr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotеchnol., 74, 27; Hermann and Patel, 2000, Science, 287, 820; и Jayasena, 1999, Clinicаl Chemistry, 45, 1628). Молекулы аптамера согласно настоящему изобретению могут быть химически модифицированы в соответствии с процедурами, известными в данной области или приведенными в настоящем описании.

Термин «антисмысловая нуклеиновая кислота» в контексте настоящего описания относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая связывается с целевой РНК посредством взаимодействия по типу РНК-РНК или РНК-ДНК, или РНК-ПНК (протеиновая нуклеиновая кислота; Egholm et al., 1993 Nature 365, 566) и в этой связи изменяет активность целевой РНК (см. обзор Штейна и Ченга (Stein and Cheng, 1993 Science 261, 1004) и патент США № 5849902 (Wolf et al.)) за счет пространственного взаимодействия или посредством РНКаза Н-опосредованного распознавания мишени. В типичном случае антисмысловые молекулы комплементарны к целевой последовательности на протяжении одной непрерывной последовательности антисмысловой молекулы. Однако в некоторых вариантах антисмысловая молекула может связываться с субстратом, так что субстратная молекула формирует петлю, и/или антисмысловая молекула может связываться так, что антисмысловая молекула формирует петлю. Таким образом, антисмысловая молекула может быть комплементарна двум (или даже больше) не непрерывным субстратным последовательностям, или две (или даже больше) не непрерывных части последовательности антисмысловой молекулы могут быть комплементарны целевой последовательности, или имеют место оба варианта. Обзор имеющихся в настоящее время стратегий работы с антисмысловыми молекулами приведен в литературе (см. Schmajuk et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 21783-21789, Delihas et al., 1997, Nature, 15, 751-753, Stein et al., 1997, Antisense N. A. Drug Dev., 7, 151, Crooke, 2000, Methods Enzymol., 313, 3-45; Crooke, 1998, Biotech. Genet. Eng. Rev., 15, 121-157, Сrooke, 1997, Ad. Pharmacol., 40, 1-49). Кроме того, антисмысловая ДНК или антисмысловая ДНК, модифицированная 2'-MOE или с использованием других модификаций, известных в данной области, могут применяться для направленного воздействия на РНК посредством взаимодействия по типу РНК-ДНК, с достижением активации РНКазы Н, которая расщепляет целевую РНК в дуплексе. Антисмысловые олигонуклеотды могут включать один или более участков, активирующих РНКазу Н, которые способны активировать расщепление целевой РНК РНКазой Н. Антисмысловая ДНК может быть синтезирована химически или может быть экспрессирована при использовании вектора экспрессии на основе одноцепочечной ДНК или его эквивалента. Антисмысловые молекулы согласно настоящему изобретению могут быть химически модифицированы в соответствии с известными в данной области процедурами или в соответствии с настоящим описанием.

Термин «модулировать» означает, что экспрессия гена или уровень молекулы РНК или эквивалентных молекул РНК, кодирующих один или несколько белков или белковых субъединиц, или определяющих активность одного или нескольких белков или белковых субъединиц, подвергается позитивной или отрицательной регуляции, так что экспрессия, ее уровень или ее активность становятся выше или ниже, чем это наблюдается в отсутствие модулятора. Так, например, термин «модулировать» может означать «ингибировать», но использование слова «модулировать» не ограничено данным определением.

Термины «ингибировать», «осуществлять отрицательную регуляцию» или «снижать» в контексте настоящего описания означают, что экспрессия гена или уровень молекул РНК или эквивалентных молекул РНК, кодирующих один или несколько белков или белковых субъединиц или определяющих активность одного или нескольких белков или белковых субъединиц, снижается до уровня, меньше того, который наблюдается в отсутствие молекул нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению. В одном варианте ингибирование, отрицательная регуляция или снижение уровня молекул киНК происходит ниже уровня, наблюдаемого в присутствии неактивной или ослабленной молекулы. В другом варианте ингибирование, отрицательная регуляция или снижение уровня молекул киНК происходит ниже уровня, наблюдаемого в присутствии, например, молекулы киНК со скрученной последовательностью или с ошибочными спариваниями. В другом варианте ингибирование, отрицательная регуляция или снижение генной экспрессии молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению выше в присутствии молекулы нуклеиновой кислоты, чем в ее отсутствие. В одном варианте ингибирование, отрицательная регуляция или снижение генной экспрессии ассоциированы с посттранскрипционным молчанием, таким как РНКи-опосредованное расщепление молекулы целевой нуклеиновой кислоты (например, РНК) или ингибирование трансляции. В одном варианте ингибирование, отрицательная регуляция или снижение генной экспрессии ассоциированы с посттранскрипционным молчанием, таким как в случае изменений, связанных с характером метилирования ДНК и структурой хроматина ДНК.

Термин «позитивная регуляция» или «усиление» в контексте настоящего описания означает, что экспрессия гена или уровень молекул РНК или эквивалентных РНК молекул, кодирующих один или несколько белков или белковых субъединиц или определяющих активность одного или нескольких белков или белковых субъединиц, возрастает выше уровня, наблюдаемого в отсутствие молекул нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению. В одном варианте позитивная регуляция или усиление генной экспрессии под действием молекулы киНК превышает уровень, наблюдаемый в присутствии неактивной или ослабленной молекулы. В другом варианте позитивная регуляция или усиление генной экспрессии молекулами киНК превышает тот уровень, который отмечается в присутствии, например, молекулы киНК со скрученной последовательностью или с ошибочными спариваниями. В другом варианте позитивная регуляция или усиление генной экспрессии под действием молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению выше в присутствии молекулы нуклеиновой кислоты, чем в ее отсутствие. В одном варианте позитивная регуляция или усиление генной экспрессии ассоциированы с генным молчанием по механизму ингибирования РНК, такому как РНКи-опосредованное расщепление или молчание кодирующей или некодирующей целевой РНК, которая осуществляет отрицательную регуляцию, ингибирует или вызывает молчание на уровне экспрессии интересующего гена, подлежащего позитивной регуляции. Отрицательная регуляция генной экспрессии может быть, например, индуцирована кодирующей РНК или кодируемым ею белком, например, по механизму отрицательной обратной связи или по механизму антагонистических эффектов. Отрицательная регуляция генной экспрессии может быть, например, индуцирована некодирующей РНК, характеризующейся регуляторным контролем над интересующим геном, например, за счет достижения молчания экспрессии гена через ингибирование трансляции, изменение структуры хроматина, характера метилирования, RISC-опосредованное расщепление РНК или ингибирование трансляции. Соответственно, ингибирование или отрицательная регуляция мишеней, которые осуществляют отрицательную регуляцию, супрессию или вызывают молчание интересующего гена, может использоваться для позитивной регуляции или усиления экспрессии интересующего гена применительно к варианту терапевтического использования.

В одном варианте ингибитор РНК согласно настоящему изобретению используется для позитивной регуляции генной экспрессии посредством ингибирования механизма РНКи или генного молчания. Например, ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может использоваться для лечения заболеваний и состояний, определяемых отсутствием функции, за счет позитивной регуляции генной экспрессии, такой как в случае гаплоидной недостаточности, где одна аллель данного гена несет мутацию (например, рамочный сдвиг, миссенс- или нонсенс-мутацию), что приводит к потере функции белка, кодируемого мутантной аллелью. В таких случаях ингибитор РНКи может использоваться для позитивной регуляции экспрессии белка, кодируемого аллелью дикого типа или функциональной аллелью, что приводит к коррекции гаплоидной недостаточности за счет компенсации мутантной или null-аллели. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению используется для отрицательной регуляции экспрессии токсического действия функциональной аллели, где одновременно используется ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению для целей позитивной регуляции экспрессии аллели дикого типа или функциональной аллели, как это происходит при лечении заболеваний, признаков или состояний согласно настоящему описанию или в рамках других вариантов применения, известных в данной области (см., например, Rhodes et al., 2004, PNAS USA, 101:11147-11152; и Meisler et al., 2005, The Journal of Clinical Investigation, 115: 2010-2017).

Термины «ген», или «целевой ген», или «целевая ДНК» в контексте настоящего описания используются для обозначения нуклеиновой кислоты, которая кодирует РНК, например, для обозначения последовательностей нуклеиновой кислоты, включающих, без ограничения, структурные гены, кодирующие полипептид. Ген или целевой ген может также кодировать функциональную РНК (фРНК) или некодирующую РНК (нкРНК), такую как малая временная РНК (мвРНК), микроРНК (миРНК), малая ядерная РНК (мяРНК), короткая интерферирующая РНК (киРНК), малая ядрышковая РНК (мяРНК), рибосомальная РНК (рРНК), транспортная РНК (тРНК) и ее РНК-предшественники. Такие некодирующие РНК могут служить в качестве молекул целевой нуклеиновой кислоты для киНК-опосредованной интерференции РНК при модуляции активности фРНК или мяРНК, вовлекаемых в функциональные или регуляторные клеточные процессы. В этой связи абберантная активность фРНК или мяРНК, ведущая к заболеванию, может модулироваться молекулами киНК согласно настоящему изобретению. Молекулы киНК, направленно воздействующие на фРНК и мяРНК, могут также использоваться для целей манипуляции или для изменения генотипа или фенотипа субъекта, организма или клетки, путем встраивания в клеточные процессы, такие как геномный импринтинг, транскрипция, трансляция или процессинг нуклеиновых кислот (например, трансаминирование, метилирование и т.п.). Целевой ген может представлять собой ген, полученный из клетки, это может быть эндогенный ген, трансген или экзогенные гены, такие как гены патогена, такого как вирус, который имеется в клетке после инфекции. Клетка, содержащая целевой ген, может быть получена из любого организма или может содержаться в любом организме, например из растения/в растении, из животного/в животном, из простейшего/в простейшем, из вируса/в вирусе, из бактерии/в бактерии или из гриба/в грибе. Не ограничивающие примеры растений включают однодольные, двудольные или голосеменные растения. Не ограничивающие примеры животных включают позвоночных или безпозвоночных животных. Не ограничивающие примеры грибов включают плесени или дрожжи. Соответствующий обзор приведен в работе Снайдера и Герштейна (Snyder and Gerstein, 2003, Science, 300, 258-260).

Термин «неканоническая пара оснований» в контексте настоящего описания обозначает любую пару оснований, не соответствующих правилу Уотсона-Крика, такие как ошибочные спаривания и/или пары оснований, соответствующие гипотезе «качелей», включая флип-спаривания, ошибочные спаривания одной водородной связью, ошибочные спаривания транс-типа, взаимодействия трех оснований и взаимодействия четырех оснований. Не ограничивающие примеры таких неканонических пар оснований включают, без ограничения, АС реверсию Hoogsteen, АС спаривание по типу «качелей», AU реверсию Hoogsteen, GU пары, соответствующие гипотезе «качелей», АА N7 амино, СС-2-карбонил-амино(Н1)-N3-амино(Н2), GA сдвиг, UC 4-карбониламино, UU иминокарбонил, AC реверсная пара, соответствующая гипотезе «качелей», AU Hoogsteen, AU реверсное спаривание, соответствующее правилу Уотсона-Крика, CG реверсию, соответствующую правилу Уотсона-Крика, GC N3-амино-амино N3, AA N1-аминосимметрическое спаривание, AA N7-аминосимметрическое спаривание, GA N7-N1-аминокарбонил, GA+ карбониламино N7-N1, GG N1-карбонилсимметрическое спаривание, GG N3-аминосимметрическое спаривание, CC карбониламиносимметрическое спаривание, CC N3 аминосимметрическое спаривание, UU 2-карбонилиминосимметрическое спаривание, UU 4-карбонилиминосимметрическое спаривание, AA амино-N3, AA N1-амино, AC-амино-2-карбонил, AC N3-амино, AC N7-амино, AU амино-4-карбонил, AU N1-имино, AU N3-имино, AU N7-имино, СС карбониламино, GA амино-N1, GA амино-N7, GA-карбониламино, GA N3-амино, GC амино-N3, GC карбониламино, GC N3-амино, GC N7-амино, GG амино-N7, GG карбонилимино, GG N7-амино, GU амино-2-карбонил, GU-карбонилимино, GU имино-2-карбонил, GU N7-имино, psiU имино-2-карбонил, UC 4-карбониламино, UC иминокарбонил, UU имино-4-карбонил, AC C2-H-N3, GA карбонил-C2-Н, UU имино-4-карбонил-2-карбонил-С5-Н, АС амино(А) N3(С)-карбонил, GC иминоаминокарбонил, Gpsi имино-2-карбониламино-2-карбонил и GU иминоамино-2-карбонильные пары оснований.

Термин «целевой»/«мишень» в контексте настоящего описания обозначает любой целевой белок, пептид или полипептид, такие как белок, пептид или полипептид, кодируемые последовательностями, депонированными в Genbank c номерами доступа, приведенными в настоящем описании и/или в предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923 536 и/или в PCT/US03/05028, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок. Термин «целевой»/«мишень» также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты или к целевым полинуклеотидным последовательностям, кодирующим любой целевой белок, пептид или полипептид, такие как белки, пептиды или полипептиды, кодируемые последовательностями с номерами доступа в Genbank, приведенными в настоящем описании и/или предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923536 и/или USSN PCT/US03/05028. Интересующая мишень может включать целевые нуклеотидные последовательности, такие как целевая ДНК или целевая РНК. Термин «целевой»/«мишень» также используется для обозначения других последовательностей, таких как различающиеся изоформы, мутантные целевые гены, сплайсинг-варианты целевых полинуклеотидов, целевые полиморфизмы и некодирующие (например, нкРНК, миРНК, мвРНК) или другие регуляторные полинуклеотидные последовательности согласно настоящему описанию. В этой связи в различных вариантах осуществления настоящего изобретения молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно изобретению (например, киНК), обладающая комплементарностью к целевой РНК, может использоваться для ингибирования или отрицательной регуляции активности миРНК или другой нкРНК. В одном варианте ингибирование активности миРНК или нкРНК может использоваться для отрицательной регуляции или ингибирования генной экспрессии (например, генов-мишеней согласно настоящему описанию или других генов-мишеней, известных в данной области), которые зависят от активности миНК или нкРНК. В другом варианте ингибирование активности миРНК или нкРНК молекулами двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (например, киРНК), обладающими комплементарностью к миРНК или нкРНК, может использоваться для позитивной регуляции или усиления экспрессии целевого гена (например, генов-мишеней согласно настоящему описанию или иных, известных в данной области), где экспрессия таких генов подвергается отрицательной регуляции, супрессируется, или такие гены становятся молчащими под действием миРНК или нкРНК. Такая позитивная регуляция генной экспрессии может использоваться для лечения заболеваний и состояний, ассоциированных с потерей функций или гаплоидной недостаточностью, известных в данной области (например, в случае мышечных дистрофий, муковисцидоза или неврологических заболеваний и состояний, приведенных в настоящем описании, таких как эпилепсия, включая тяжелую миоклоническую эпилепсию новорожденных или синдром Дравета).

Термин «целевой метаболический путь» в контексте настоящего описания означает любую мишень, вовлекаемую в пути генной экспрессии или активности гена. Так, например, любая данная мишень может иметь родственные целевые пути, которые могут включать путь против хода считывания информации, по ходу считывания информации или гены-модификаторы, локализованные на указанном биологическом пути. Указанные целевые гены биологического пути могут обеспечивать аддитивные или синергические эффекты при лечении заболеваний, состояний или признаков согласно настоящему изобретению.

В одном варианте мишенью является любая целевая РНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является любая целевая ДНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является любая целевая мРНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является любая целевая миРНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является любая целевая киРНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является любая целевая мвРНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является цель или целевой путь или их часть.

В одном варианте мишенью является любая (например, одна или несколько) из целевых последовательностей согласно настоящему описанию и/или приведенная в предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923536 и/или PCT/US03/05028 или их части. В одном варианте мишенью является любая (например, одна или несколько) из целевых последовательностей, проиллюстрированных в таблице II, или их часть. В другом варианте мишенью является киРНК, миРНК или мвРНК, соответствующая любой (например, одной или нескольким) целевой последовательности верхней цепи или нижней цепи, показанным в таблице II, или их части. В другом варианте мишенью является любая киРНК, миРНК или мвРНК, соответствующие любой (например, одной или нескольким) последовательности согласно настоящему описанию или приведенной в предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923536 и/или PCT/US03/05028.

Термин «гомологичная последовательность» обозначает нуклеотидную последовательность, которая имеет общность с одной или несколькими полинуклеотидными последовательностями, такими как гены, генные транскрипты и/или некодирующие полинуклеотиды. Например, гомологичная последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, которая имеет общность с двумя или более генами, кодирующими родственные, но различающиеся белки, такие как различные представители одного генного семейства, различные белковые эпитопы, различные белковые изоформы или полностью дивергентные гены, такие как для цитокина и его соответствующих рецепторов. Гомологичная последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, которая имеет общность с двумя или более некодирующими полинуклеотидами, такими как некодирующие ДНК или РНК, регуляторные последовательности, интроны и сайты контроля или регуляции транскрипции. Гомологичные последовательности могут также включать консервативные участки последовательности, общие для более чем одной полинуклеотидной последовательности. Указанная гомология необязательно должна быть полной гомологией (то есть 100%), поскольку частично гомологичные последовательности также входят в область настоящего изобретения (например, последовательности, гомологичные на 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80% и т.п.)

Термин «консервативный участок последовательности» обозначает нуклеотидную последовательность одного или нескольких участков в полинуклеотиде, которые не варьируют по составу в значительной мере между поколениями или от одной биологической системы, одного субъекта или организма к другой биологической системе, другому субъекту или организму. Полинуклеотид может включать как кодирующие, так и некодирующие ДНК и РНК.

Термин «смысловой участок» обозначает нуклеотидную последовательность молекулы киНК, обладающую комплементарностью к антисмысловому участку молекулы киНК. Кроме того, смысловой участок молекулы киНК может включать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающей гомологией к последовательности целевой нуклеиновой кислоты. В одном варианте смысловой участок молекулы киНК обозначен как смысловая цепь или цепь-»пассажир».

Термин «антисмысловой участок» обозначает нуклеотидную последовательность молекулы киНК, обладающую комплементарностью к последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Кроме того, антисмысловой участок молекулы киНК может необязательно включать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую комплементарностью к смысловому участку молекулы киНК. В одном варианте антисмысловой участок молекулы киНК обозначен как антисмысловая цепь или ведущая цепь.

Термин «целевая нуклеиновая кислота» или «целевой полинуклеотид» обозначает любую последовательность нуклеиновой кислоты (например, любую мишень и/или любую целую последовательность метаболического пути), экспрессия или активность которой подвергается модуляции. Целевая нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК. В одном варианте целевая нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению представляет собой целевую ДНК или целевую РНК.

Термин «комплементарность» означает, что нуклеиновая кислота может образовывать одну или несколько водородных связей с последовательностью другой нуклеиновой кислоты, либо в соответствии с правилом Уотсон-Крика, либо других нетрадиционных типов, приведенных в настоящем описании. В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, где каждая цепь включает в длину от примерно 15 до 30 нуклеотидов, характеризуется уровнем комплементарности на уровне от примерно 10% до примерно 100% (в частности, например, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%) между двумя цепями молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В другом варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, где одна цепь представляет собой смысловую цепь, а другая представляет собой антисмысловую цепь, где каждая цепь включает в длину от 15 до 30 нуклеотидов, характеризуется уровнем комплементарности на уровне от по меньшей мере примерно 10% до примерно 100% (в частности, по меньшей мере примерно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%) между нуклеотидной последовательностью антисмысловой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты и нуклеотидной последовательностью молекулы соответствующей целевой нуклеиновой кислоты, такой как целевая РНК, или целевая мРНК, или вирусная РНК. В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, где одна цепь включает нуклеотидную последовательность, которая обозначена как смысловой участок, а другая цепь включает нуклеотидную последовательность, которая обозначена как антисмысловой участок, и где каждая цепь включает в длину от 15 до 30 нуклеотидов, характеризуется уровнем комплементарности на уровне от примерно 10% до примерно 100% (в частности, примерно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%) между смысловым участком и антисмысловым участком молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Применительно к молекулам нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению энергия свободной связи между молекулой нуклеиновой кислоты и ее комплементарной последовательностью является достаточной для осуществления соответствующей функции нуклеиновой кислоты, например активности РНКи. Определение энергии свободной связи применительно к молекулам нуклеиновой кислоты известно в данной области (см., например, Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp. 123-133; Frier et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109;3783-3785). Выраженный в процентах уровень комплементарности указывает на процентную долю непрерывающейся цепи остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые образуют водородные связи (например, при спаривании оснований, в соответствии с правилом Уотсона-Крика) со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, когда 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов из общего числа 10 нуклеотидов в первом олигонуклеотиде спариваются по основаниям со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей 10 нуклеотидов, что соответствует уровню комплементарности 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% соответственно). В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению обладает полной комплементарностью между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК. В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению полностью комплементарна молекуле соответствующей целевой нуклеиновой кислоты. Термин «полностью комплементарна/комплементарен» означает, что все непрерывные цепи остатков последовательности нуклеиновой кислоты образуют водородные связи с тем же числом непрерывных цепей остатков во второй последовательности нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает от примерно 15 до примерно 30 или более (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более) нуклеотидов, которые комплементарны молекулам одной или нескольких целевых нуклеиновых кислот или их части. В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению характеризуется частичной комплементарностью (то есть имеет комплементарность ниже 100%) между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты. Например, частичная комплементарность может включать различные ошибочные спаривания или не спаренные по основаниям нуклеотиды (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более ошибочных спариваний или не спаренных по основаниям нуклеотидов) в структуре молекулы киНК, что может приводить к образованию вздутий, петлевых структур или выступающих фрагментов между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, характеризуется наличием полной комплементарности между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, полностью комплементарна к молекуле соответствующей целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, характеризуется частичной комплементарностью (то есть комплементарностью ниже 100%) между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы нуклеиновой кислоты и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты. Например, частичная комплементарность может включать различные ошибочные спаривания или наличие не спаренных по основаниями нуклеотидов (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более ошибочных спариваний или не спаренных по основаниям нуклеотидов, таких как нуклеотидные вздутия) в молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, структура которой приводит к появлению вздутий, петлевых структур или выступающих фрагментов между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению представляет собой микроРНК (миРНК). Термин «микроРНК» или «миРНК» обозначает малую двухцепочечную РНК, которая регулирует экспрессию целевых матричных РНК путем либо расщепления мРНК, либо репрессии на уровне трансляции/ингибирования, либо по механизму гетерохроматического молчания (см., например, Ambros, 2004, Nature, 431, 350-355; Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297; Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9; He et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531; Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28; и Sethupathy et al., 2006, RNA, 12:192-197). В одном варианте микроРНК согласно настоящему изобретению характеризуется частичной комплементарностью (то есть комплементарностью ниже 100%) между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы миРНК или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы миРНК и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты. Например, частичная комплементарность может включать различные ошибочные спаривания или наличие не спаренных по основаниями нуклеотидов (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более ошибочных спариваний или не спаренных по основаниям нуклеотидов, таких как нуклеотидные вздутия) в молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, структура которой приводит к появлению вздутий, петель или выступающих фрагментов между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком миРНК или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком миРНК и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которые осуществляют отрицательную регуляцию или снижают экспрессию целевого гена, используются для предупреждения или лечения заболеваний, расстройств, состояний или признаков у субъекта или в организме согласно настоящему описанию или других, известных в данной области.

Термины «пролиферативное заболевание» или «рак» в контексте настоящего описания обозначают любое заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, характеризующиеся нерегулируемым клеточным ростом или репликацией, в соответствии с известными в настоящее время данными, и включают лейкозы, например острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ) и хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), СПИД-родственные виды рака, такие как саркома Капоши, рак молочной железы, рак кости, включающий такие формы, как остеосаркома, хондросаркома, саркома Эвинга, фибросаркомы, гигантоклеточные опухоли, адамантиномы и хордомы, опухоли головного мозга, такие как менингиомы, глиобластомы, астроцитомы низкой степени выраженности, олигодендроцитомы, опухоли гипофиза, шванномы и метастазирующий рак головного мозга, рак головы и шеи, включающий различные лимфомы, такие как лимфома клеток мантии, неходжкинская лимфома, аденома, плоскоклеточная карцинома, карцинома гортани, рак желчного пузыря и желчных протоков, рак сетчатки, такой как ретинобластома, рак пищевода, рак желудка, множественная миелома, рак яичника, рак матки, рак щитовидной железы, рак яичка, рак эндометрия, меланому, колоректальный рак, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак легкого (включая немелкоклеточный рак легкого), рак поджелудочной железы, саркомы, опухоль Уилмса, цервикальный рак, рак головы и шеи, рак кожи, назофарингеальную карциному, липосаркому, эпителиальную карциному, карциному клеток почки, аденокарциному желчного пузыря, околоушную аденокарциному, саркому эндометрия, формы рака, характеризующиеся множественной лекарственной резистентностью к применяемым для лечения препаратам; и пролиферативные заболевания и состояния, такие как неоваскуляризация, ассоциированная с опухолевым ангиогенезом, дегенерация желтого пятна (например, сырая/сухая АMD), неоваскуляризация роговицы, диабетическая ретинопатия, неоваскулярная глаукома, миопическия дегенерация и другие пролиферативные заболевания и состояния, такие как рестеноз и поликистоз почки, а также любой другой вид рака или пролиферативного заболевания, состояния, признака, генотипа или фенотипа, которые могут реагировать на модуляцию экспрессии связанного с заболеванием гена в клетке или ткани, применяемую отдельно или в сочетании с другими видами терапии.

Термины «воспалительное заболевание» или «воспалительное состояние» в контексте настоящего описания обозначают любое заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, характеризующиеся наличием воспалительного или аллергического процесса, в соответствии с известными в настоящее время данными, такие как воспаление, острое воспаление, хроническое воспаление, респираторное заболевание, атеросклероз, псориаз, дерматит, рестеноз, астма, аллергический ринит, атопический дерматит, септический шок, ревматоидный артрит, воспалительная болезнь кишечника, воспалительная болезнь тазовой области, боль, воспалительное заболевание глаза, глютеновая болезнь, синдром Лея, недостаточность глицеролкиназы, семейная эозинофилия (FE), аутосомальная рецессивная спастическая атаксия, воспалительное заболевание гортани, туберкулез, хронический холецистит, бронхэктазия, силикоз и другие пневмокониозы, а также любое другое воспалительное заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, которые могут реагировать на модуляцию экспрессии связанного с заболеванием гена в клетке или ткани, применяемую отдельно или в сочетании с другими видами терапии.

Термины «аутоиммунное заболевание» или «аутоиммунное состояние» в контексте настоящего описания обозначают любое заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, характеризующиеся аутоиммунитетом, в соответствии с известными в настоящее время данными, такие как рассеянный склероз, сахарный диабет, волчанка, глютеновая болезнь, болезнь Крона, язвенный колит, синдром Гийена-Барре, склеродерма, синдром Гудпасчера, гранулематоз Вегенера, аутоиммунная эпилепсия, энцефалит Расмуссена, первичный билиарный склероз, склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, болезнь Аддисона, тиреоидит Хашимото, фибромиалгия, синдром Меньера, реакция отторжения трансплантата (например, предупреждение отторжения аллотрансплантата), злокачественная анемия, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, дерматомиозит, синдром Шегрена, волчаночный эритематоз, рассеянный склероз, тяжелая псевдопаралитическая миастения, синдром Рейтера, болезнь Грейвса и любые другие аутоиммунные заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, которые могут реагировать на модуляцию экспресии связанного с заболеванием гена в клетке или ткани, применяемую отдельно или в сочетании с другими видами терапии.

Термин «инфекционное заболевание» в контексте настоящего описания обозначает любое заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, ассоциированные с инфекционным агентом, таким как вирус, бактерии, грипп, прион или паразит. Не ограничивающие примеры различных вирусных генов, которые могут быть мишенью для используемых молекул киНК согласно настоящему изобретению, включают вирус гепатита С (HCV, например, депонированный в GenBank с номерами доступа №№ D11168, D50483.1, L38318 и S82227), вирус гепатита B (HBN, например, депонированный в GenBank с номером доступа № AF100308.1), вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1, например, депонированный в Genbank с номером доступа № U51188), вирус иммунодефицита человека типа 2 (ВИЧ-2, например, депонированный в Genbank с номером доступа № Х60667), вирус лихорадки Западного Нила (WNV, например, депонированный в GenBank с номером доступа № NC_001563), цитомегаловирус (CMV, например, депонированный в GenBank с номером доступа № NC_001347), респираторно-синцитиальный вирус (RSV, например, депонированный в GenBank с номером доступа № NC_001781), вирус гриппа (например, депонированный в GenBank с номером доступа № AF037412), риновирус (например, депонированный в GenBank с номерами доступа № D00239, Х02316, X01087, L24917, M16248, K02121, X01087), папилломавирус (например, депонированный в GenBank с номером доступа № NC_001353), вирус простого герпеса (HSV, например, депонированный в GenBank с номером доступа № NC_001345) и другие вирусы, такие как HTLV (например, депонированный в GenBank с номером доступа № AJ430458). В связи с высокой вариабельностью по последовательности, свойственной геномам многих вирусов, отбираемые для широкого диапазона терапевтического применения молекулы киНК будут, скорее всего, включать консервативные участки вирусного генома. Не ограничивающие примеры консервативных участков вирусных геномов включают, без ограничения, 5'-некодирующие участки (NCR), 3'-некодирующие участки (NCR) и/или внутренние рибосомальные сайты, определяющие вход вирусных частиц (IRES). Молекулы киНК, разработанные для применения их против консервативных участков различных вирусных геномов, позволяют достичь эффективного ингибирования репликации вирусов у пациентов разных групп и могут обеспечивать эффективность молекул киНК против вирусных квазивидов, которые возникают из-за мутации в неконсервативных участках вирусного генома. Не ограничивающие примеры бактериальных инфекций включают актиномикоз, сибирскую язву, аспергиллез, бактеремию, бактериальные инфекции и микозы, инфекции Bartonella, ботулизм, бруцеллез, инфекции Burkholderia, инфекции Campilobacter, кандидиаз, болезнь кошачьих царапин, хламидийные инфекции, холеру, инфекции Clostridium, кокцидиомикоз, перекрестную инфекцию, криптококкоз, дерматомикозы, дифтерию, эрлихиоз, инфекции Escherechia coli, фасцит, некротизирующие инфекции, инфекции Fusobacterium, газовую гангрену, инфекции грамотрицательными бактериями, инфекции грамположительными бактериями, гистоплазмоз, импетиго, инфекции Klebsiella, легионеллез, лепру, лептоспироз, инфекции Listeria, болезнь Лайма, мадуромикоз, мелиоидоз, инфекции Mycobacterium, микоплазменные инфекции, микозы, инфекции Nocardia, онихомикоз, орнитоз, чуму, пневмококковые инфекции, инфекции Pseudomonas, ку-лихорадку, лихорадку укуса крысы, рецидивирующую лихорадку, ревматическую лихорадку, рикеттиозные инфекции, пятнистую лихорадку Скалистых гор, сальмонеллезные инфекции, скарлатину, цуцугамуши, сепсис, болезни, передающиеся половым путем - бактериальные инфекции, бактериальные кожные заболевания, стафилококковые инфекции, стрептококковые инфекции, столбняк, клещевые протозоозы, туберкулез, туляремию, брюшной тиф, сыпной тиф, эпидемическое заболевание, передающееся вшами, вибриоинфекции, тропическую фрамбезию, иерсиниозы, зоонозы и зигомикоз. Не ограничивающие примеры грибных инфекций включают аспергиллез, бластомикоз, кокцидиомикоз, криптококкоз, грибные инфекции ногтей рук и пальцев стопы, грибковый синусит, гистоплазмоз, мукоромикоз, грибковую инфекцию ногтей, паракокцидиомикоз, споротрихоз, лихорадка долины (кокцидиомикоз) и аллергию на плесневые грибы.

Термин «неврологическое заболевание» обозначает любое заболевание, расстройство или состояние, поражающее центральную или периферическую нервную систему, включающие СДВГ, неврологические осложнения СПИДа, отсутствие прозрачной перегородки, приобретенную эпилептиформную афазию, острый диссеминированный энцефаломиелит, адренолейкодистрофию, агенизию мозолистого тела, агнозию, синдром Аикарди, болезнь Александера, болезнь Альперса, альтернирующую гемиплегию, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, анэнцефалию, аневризму, синдром Ангельмана, ангиоматоз, аноксию, афазию, апраксию, арахноидальные кисты, арахноидит, синдром Арнольда-Киари, артериовенозную мальформацию, аспартам, синдром Аспергера, атаксию-телангиэктазию, атаксию, синдром дефицита внимания с гиперактивностью, аутизм, автономную дисфункцию, боль в спине, синдром Барта, болезнь Баттена, болезнь Бехчета, паралич Белла, доброкачественный эссенциальный блефароспазм, доброкачественную фокальную амиотрофию, доброкачественную интракрониальную гипертензию, синдром Бернхардта-Рота, болезнь Бинсвангера, блефароспазм, синдром Блоха-Сульцбергера, повреждения плечевого сплетения новорожденных, повреждения плечевого сплетения, синдром Брэдбери-Эглстона, аневризма головного мозга, повреждения головного мозга, опухоли головного и спинного мозга, синдром Брауна-Секварда, бульбоспинальную мышечную атрофию, болезнь Канавана, туннельный синдром запястья, каузалгия, каверномы, кавернозную ангиому, кавернозную мальформацию, синдром паралича шейного отдела, синдром центрального паралича, синдром центральной боли, краниальные расстройства, мозжечковую дегенерацию, мозжечковую гипоплазию, церебральную аневризму, аневризму головного мозга, артериосклероз головного мозга, атрофию головного мозга, алиментарный полиневрит, церебральный гигантизм, церебральную гипоксию, церебральный паралич, церебро-окуло-фациоскелетный синдром, болезнь Шарко-Мари-Тутта, порок Киари, хорею, хореоакантоцитоз, хроническую воспалительную демиелинезирущую полинейропатию (CIDP), хроническую ортостатическую неустойчивость, хроническую боль, синдром Кокейна тип II, синдром Коффина-Лоури, кому, включая персистентное вегетативное состояние, синдром комплексной региональной боли, врожденную лицевую диплегию, врожденную миастению, врожденную миопатию, врожденные кавернозные мальформации сосудов, кортикобазальную дегенерацию, краниальный артериит, краниосиностоз, болезнь Кройцфельдта-Якоба, кумулятивные травматические расстройства, синдром Кушинга, инклюзионную болезнь (CIBD), цитомегаловирусную инфекцию, синдром танцующих глаз-танцующих ног, болезнь Денди-Уокера, болезнь Даусона, синдром Д'Морсьера, паралич Дежерине-Клюмпке, мультиинфарктную деменцию, деменцию субкортикальную, деменция, сопровождающуюся наличием тел Леви, дерматомиозит, развивающееся поражение органов, синдром Девикса, диабетическую невропатию, рассеянный склероз, синдром Дравета, семейную вегетативную дисфункцию, дисграфию, дислексию, дисфагию, поражение органа, дистонию, эпилептическую энцефалопатию младенцев, синдром Эмпти Селла, эпидемический летаргический энцефалит, энцефалит и менингит, энцефалоцеле, энцефалопатию, энцефалотригеминальный ангиоматоз, эпилепсию, спастический спинальный паралич, паралич Эрба-Душенна и Дежерине-Клюмпке, болезнь Фабри, синдром Фара, обмороки, семейную вегетативную дистонию, семейную гемангиому, семейную идиопатическую кальцификацию базальных ганглиев, семейный спастический паралич, фибрильные судороги (например, GEFS и GEFS-плюс), синдром Фишера, клапанный синдром младенца, атаксию Фридрейха, болезнь Гоше, синдром Герстманна, болезнь Герстманна-Штраусслера-Шайнкера, гигантоклеточный артериит, гигантоклеточную инклюзионную болезнь, лейкодистрофию глобоидных клеток, глоссофарингеальную невралгию, синдром Гийена-Барра, HTLV-1-ассоциированную миелопатию, болезнь Халлервордена-Шпатца, повреждение головы, головную боль, длительную гемикранию, гемифациальный спазм, альтернирующую гемиплегию, наследственные невропатии, наследственную спастическую параплегию, наследственную атактическую полиневритиформную патологию, ушную инфекцию опоясывающим герпесом, опоясывающий герпес, синдром Хираяма, нарушение дифференцировки переднего мозга в полушариях и долях, болезнь Хантингтона, гидроэнцефалию, гидроцефалию при нормальном давлении, гидроцефалию, гидромиелию, гиперкортизолицизм, гиперсомнию, гипертонию, гипотонию, гипоксию, иммунный энцефаломиелит, миозит с инклюзионными телами, недостаточную пигментацию, гипотонию младенцев, болезнь депонирования фитановой кислоты у младенцев, болезнь Рефума младенцев, спазмы младенцев, воспалительную миопатию, липодистрофию кишечника, интракраниальные цисты, внутричерепную гипертензию, синдром Исаакса, синдром Жубера, синдром Киреса-Сэйра, болезнь Кеннеди, синдром Кинсбурна, синдром Кляйна-Левина, синдром Клиппеля-Фейля, синдром Клиппеля-Тренона (KTS), синдром Клювера-Буси, корсаковский синдром, болезнь Крабе, болезнь Кугельберга-Веландера, маленькое Куру, миастенический синдром Ламберта-Итона, синдром Ландау-Клеффнера, ущемление латерального кожного нерва бедра, латеральный мозговой синдром, неспособность к обучению, болезнь Лея, синдром Линно-Гасто, синдром Лэша-Найхана, лейкодистрофию, синдром Левина-Критчли, деменцию с телами Леви, Лиссэнцефалию, синдром замкнутого пространства, болезнь Лу-Герига, неврологические осложнения при волчанке, болезнь Лайма - неврологические осложнения, болезнь Мачадо-Джозефа, макрэнцефалию, мегалэнцефалию, синдром Мелкерссона-Розенталя, менингит, болезнь Менкеса, болезнь Рото-Бернгардта, метахромную лейкодистрофию, микроцефалию, мигрень, синдром Миллера-Фишера, мини-инсульты, митохондриальную миопатию, синдром Мебиуса, амиотрофию одной конечности, патологии двигательных нейронов, болезнь Мойямойя, муколипидозы, мукополисахаридозы, мультиинфарктную деменцию, мультифокальную двигательную невропатию, рассеянный склероз, множественную системную атрофию с ортостатической гипотензией, множественную системную атрофию, мышечную дистрофию, миастению врожденную, тяжелую псевдопаралитическую миастению, миелокластный рассеянный склероз, миоклоническую энцефалопатию младенцев, миоклонию, миопатию врожденную, миопатию токсическую, миопатию, миотонию врожденную, миотонию, нарколепсию, нейроакантоцитоз, нейродегенерацию с накоплением железа в головном мозге, нейрофиброматоз, нейролептический злокачественный синдром, неврологические осложнения СПИД, неврологические проявления болезни Помпе, нейромиелит зрительного нерва, нейромиотонию, нейрональный восковидный липофусциноз, расстройства нейрональной миграции, невропатию наследственную, нейросаркоидоз, нейротоксичность, кавернозный невус, болезнь Ниманна-Пика, синдром О'Салливана-МакЛауда, затылочную невралгию, последствия скрытой спинальной дизрафии, синдром Охтахара, оливопентоцеребеллярную атрофию, опсонию-миоклонию, ортостатическую гипотензию, синдром Оверуза, боль - хроническую, паранеопластический синдром, перестезию, болезнь Паркинсона, пармиотонию врожденную, пароксизмальный хореоатетоз, пароксизмальную гемикранию, болезнь Парри-Ромберга, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, синдром Пена Шокейра II, периневральные цисты, периодические параличи, периферическую невропатию, перивентрикулярную лейкомаляцию, персистирующее вегетативное состояние, первазивные расстройства развития, болезнь накопления фитановой кислоты, болезнь Пика, пириформный синдром, опухоли щитовидной железы, полимиозит, болезнь Помпе, перэнцефалию, постполимиелитный синдром, постгерпетическую невралгию, постинфекционный энцефаломиелит, постуральную гипотензию, постуральный ортостатический тахикардийный синдром, постуральный тахикардийный синдром, первичный боковой склероз, болезни приона, прогрессирующую гемифациальную атрофию, прогрессирующую двигательную атаксию, прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию, прогрессирующую склерозирующую полиодистрофию, прогрессирующий супрануклеарный паралич, ложную опухоль головного мозга, пиридоксин-зависимые и пиридоксин-отзывчивые судорожные расстройства, синдром Рамсея-Ханта типа I, синдром Рамсея-Ханта типа II, энцефалит Расмуссена и другие аутоиммунные эпилепсии, синдром рефлексной симпатетической дистрофии, болезнь Рефсума, болезнь Рефсума младенцев, повторяющееся двигательное расстройство, повторяющиеся стресс-повреждения, синдром усталых ног, миелопатию, ассоциированную с ретровирусами, синдром Ретта, синдром Рейя, синдром Рили-Дея, головную боль SUNCT, цисты поясничных нервных корешков, танец святого Вита, болезнь слюной железы, болезнь Сандхоффа, болезнь Шилдера, шизэнцефалию, судорожные расстройства, септооптическую дисплазию, тяжелую миоклоническую эпилепсию новорожденных (SMEI), синдром укачивания ребенка, опоясывающий лишай, синдром Шая-Дрегера, синдром Шегрена, приступы апное во сне, расстройство сна, синдром Сото, мышечную спастичность, расщелину позвоночника, инфаркт спинного мозга, повреждение спинного мозга, опухоли спинного мозга, спинальную мышечную атрофию, спиноцеребеллярную атрофию, синдром Стила-Рихардсона-Ольшевского, синдром Стиффа-Персона, дегенерацию полосатого тела, инсульт, синдром Стерджа-Уэбера, подострый склерозирующий панэнцефалит, субкортикальную артериосклеротическую энцефалопатию, расстройства глотания, хорею Сиденгама, обмороки, сифилитический спинальный склероз, сирингогидромиелию, сирингомиелию, системную красную волчанку, сухотку спинного мозга, тардивную дискинезию, цисты Тарлова, болезнь Тау-Сакса, височный артериит, синдром фиксации спинного мозга в области крестца, болезнь Томсена, синдром сдавления плечевого сплетения и подключичной артерии, тиреотоксическую миопатию, тригеминальную невралгию, паралич Тодда, синдром Туретта, преходящее нарушение мозгового кровообращения, трансмессивные спонгиформные энцефалопатии, поперечный миелит, травматическое повреждение головного мозга, тремор, трегиминальную невралгию, тропический спастический парапарез, туберозный склероз, эректильную сосудистую опухоль, васкулит, включая височный артериит, болезнь фон Экономо, болезнь Гиппеля-Линдау (VHL), болезнь фон Реклингхауссена, синдром Валленберга, болезнь Верднига-Хоффмана, синдром Верницке-Корсакова, синдром Веста, болезнь Уипла, синдром Уильямса, болезнь Уилсона, Х-сцепленную спинальную и бульбарную мышечную атрофию и синдром Целлвегера.

Термин «респираторное заболевание» обозначает любое заболевание или состояние, поражающее дыхательный тракт, такое как астма, хроническая обструктивная болезнь легких или «ХОБД», аллергический ринит, синусит, легочная вазоконстрикция, воспаление, аллергии, затрудненное дыхание, респираторный дистресс-синдром, муковисцидоз, легочная гипертензия, легочная вазоконстрикция, эмфизема и любое другое респираторное заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, которые могут отвечать на модуляцию экспрессии гена, связанного с заболеванием, в клетке или ткани, индивидуально или в сочетании с другими видами терапии.

Термин «заболевание органов зрения» в контексте настоящего описания обозначает любое заболевание, состояние, признак генотип или фенотип глаза и родственных структур, известных в данной области, таких как цистоидный отек желтого пятна, звездчатый хиалоз, патологическая миопия и стафилома задней склеры, токсокароз (мигрирующие глазные личинки), окклюзия вены сетчатки, отслоение заднего стекловидного тела, тракционные разрывы сетчатки, эпиретинальная мембрана, диабетическая ретинопатия, дегенерация решетчатой структуры, окклюзия вены сетчатки, окклюзия артерии сетчатки, макулярная дегенерация (например, возрастная дегенерация желтого пятна, такая как сырая AMD или сухая AMD), токсоплазмоз, хороидальная меланома, приобретенный ретиносхизис, бляшки Холенхорста, идиопатическая центральная серозная хореоретинопатия, макулярная перфорация, синдром окулярного гистоплазмоза, макроаневризма сетчатки, пигментированный ретинит, отслоение сетчатки, гипертензивная ретинопатия, отслоение пигментированного эпителия сетчатки (RPE), папиллофлебит, окулярный ишемический синдром, болезнь Коатса, милиарная аневризма Лебера, конъюнктивальная неоплазма, аллергический конъюнктивит, весенний катар, острый бактериальный конъюнктивит, аллергический конъюнктивит и весенний кератоконъюнктивит, вирусный конъюнктивит, бактериальный конъюнктивит, хламидийный и гонококковый конъюнктивит, конъюнктивальное повреждение, эписклерит, склерит, утолщение конъюнктивы, птеригий, поверхностный лимбический кератоконъюнктивит (SLK Теодора), токсический конъюнктивит, конъюнктивит с псевдомембраной, крупнопапиллярный конъюнктивит, пограничная дегенерация Терьена, акантамебный кератит, грибковый кератит, нитчатый кератит, бактериальный кератит, сухой кератит/синдром сухого глаза, бактериальный кератит, кератит, вызванный простым герпесом, стерильные корнеальные инфильтраты, фликтенулез, корнеальная абразия и рекуррентная корнеальная эрозия, инородное тело в роговице, ожоги роговицы, эпителиальная дистрофия базальной мембраны (EBMD), поверхностная пятнистая кератопатия Тайгсона, раневое поражение роговицы, узелковая дегенерация Сальцманна, эндотелиальная дистрофия Фукса, неполный вывих кристаллических линз, глаукома Цилиари-Блока, первичная открытоугольная глаукома, синдром дисперсии пигмента и пигментированная глаукома, синдром псевдоэксфолиации и псевдоэксфолиативная глаукома, увеит передней камеры, первичная открытоугольная глаукома, увеальная глаукома и глаукомоциклитный кризис, синдром дисперсии пигмента и пигментарная глаукома, острая закрытоугольная глаукома, увеит передней камеры, гифема, глаукома угольной рецессии, глаукома, вызванная линзами, синдром псевдоэксфолиации и псевдоэксфолиативная глаукома, синдром Аксенфильда-Ригера, неоваскулярная глаукома, воспаление сетчатки и pars plana, хороидальный разрыв, синдром ретракции Дуана, токсическая/пищевая невропатия зрительного нерва, аберрантная регенерация краниального нерва III, массивное интракраниальное поражение, фистула сонного-пещеристого синуса, ишемическая невропатия задней части зрительного нерва, отек диска зрительного нерва и папилледема, паралич краниального нерва III, паралич краниального нерва IV, паралич краниального нерва VI, паралич краниального нерва VII (лицевого нерва), синдром Хорнера, межъядерная офтальмоплегия, гипоплазия зрительного нерва головы, врожденные ямки в диске зрительного нерва, зрачок Вестфалле-Пильтца, друзы в зрительном нерве головы, демиелинизирующая невропатия зрительного нерва (неврит зрительного нерва, ретробульбарный оптический неврит), слепота преходящая и преходящее нарушение мозгового кровообращения, ложная опухоль головы, аденома гипофиза, контагиозный моллюск, каналикулит, бородавки и папилломы, педикулез и фтириаз, блефарит, ячмень (на глазу), пресептальный целлюлит, халазион, плоскоклеточная карцинома, поражение Herpes Zoster Ophthalmicus, педикулез и фтириаз, перелом потоком воздуха, хроническая эпифора, дакриоцистит, блефарит, вызванный простым герпесом, орбитальный целлюлит, заворот века в пожилом возрасте и плоскоклеточная карцинома.

Термин «кожное заболевание» используется для обозначения любого заболевания или состояния кожи, дермы или любой входящей в их состав субструктуры, такой как волосы, фолликулы и т.п. Кожные заболевания, расстройства, состояния и признаки могут включать псориаз, эктопический дерматит, различные виды рака кожи, такие как меланома или плоскоклеточная карцинома, облысение, выпадение волос, изменения пигментации и любое другое заболевание, состояние или признак, ассоциированные с кожей, дермой или их структурами.

Термин «заболевание органов слуха» используется для обозначения любого заболевания или состояния системы органов слуха, включающей ухо, такое как внутренней ухо, среднее ухо, наружное ухо, слуховой нерв и любые другие содержащиеся в них субструктуры. Заболевания, расстройства, состояния и признаки, относящиеся к системе органов слуха, могут включать ослабление слуха, глухоту, звон в ушах, болезнь Меньера, вертиго, расстройство баланса и двигательные расстройства, а также любое другое заболевание, состояние или признак, ассоциированные с ухом или его структурами.

Термин «метаболическое заболевание» используется для обозначения любого заболевания или состояния, воздействующего на метаболические пути, согласно известным в настоящее время данным. Метаболическое заболевание может приводить к развитию аномального метаболического процесса, либо врожденного, связанного с наследственной ферментативной аномалией (врожденные ошибки метаболизма), либо приобретенного, связанного с заболеванием эндокринного органа или недостаточностью метаболически важного органа, такого как печень. В одном варианте метаболическое заболевание включает гиперлипидемию, гиперхолестеринемию, сердечно-сосудистое заболевание, атеросклероз, гипертензию, диабет (например, диабет типа I и/или II), инсулинрезистентность и/или ожирение.

Термин «сердечно-сосудистое заболевание» в контексте настоящего описания используется для обозначения заболевания или состояния, поражающих сердце и сосудистую систему, которые включают, без ограничения, ишемическую болезнь сердца (ИБС), органическое поражение сосудов головного мозга (CVD), стеноз аорты, заболевание периферических сосудов, атеросклероз, артериосклероз, инфаркт миокарда (сердечный приступ), цереброваскулярное заболевание (инсульт), преходящее нарушение кровообращения (TIA), стенокардию (стабильную и нестабильную), предсердную фибрилляцию, аритмию, патологию сердечных клапанов, застойную сердечную недостаточность, гиперхолестеринемию, гиперлипопротеинемию типа I, гиперлипопротеинемию типа II, гиперлипопротеинемию типа III, гиперлипопротеинемию типа IV, гиперлипопротеинемию типа V, вторичную гипертриглицеридемию и семейную недостаточность по лецитин-холестерин-ацилтрансферазе.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения каждая последовательность молекул киНК согласно настоящему изобретению включает независимо от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов в длину, в конкретных вариантах от примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов в длину. В другом варианте дуплексы киНК согласно настоящему изобретению независимо включают от примерно 15 до примерно 30 пар оснований (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В одном варианте одна или несколько цепей молекулы киНК согласно настоящему изобретению независимо включает от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), которые комплементарны молекуле целевой нуклеиновой кислоты. В еще одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению содержат шпилечные или кольцевые структуры, содержащие от примерно 35 до примерно 55 (в частности, примерно 35, 40, 45, 50 или 55) нуклеотидов в длину или от примерно 38 до примерно 44 (в частности, примерно 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44) нуклеотидов в длину и включают от примерно 15 до примерно 25 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) пар оснований. Репрезентативные примеры молекул киНК согласно настоящему изобретению проиллюстрированы в таблице II и/или на фиг. 4-5.

В контексте настоящего описания термин «клетка» используется в общепринятом биологическом смысле и не относится к целому многоклеточному организму, например, конкретно не относится к человеку. Клетка может находиться в организме, то есть может находиться в организме птиц, растений и млекопитающих, таких как человек, корова, овца, пчелы, обезьяны, свинья, собаки и кошки. Данная клетка может быть прокариотической (например, бактериальной клеткой) или эукариотической (например, может быть клеткой млекопитающего или растительной клеткой). Указанная клетка может иметь соматическое происхождение или представлять собой клетку зародышевой линии, тотипотентной или плюрипотентной, делящейся или неделящейся. Указанная клетка может также быть получена из гаметы или из эмбриона, из стволовой клетки или полностью дифференцированной клетки, или она может их включать. Указанная клетка может представлять собой выделенную клетку, очищенную клетку или по существу очищенную клетку, в соответствии с представлениями, принятыми в данной области.

Молекулы киНК согласно настоящему изобретению добавляют непосредственно или они могут быть подвергнуты комплексообразованию с катионными липидами, могут быть введены в состав липосом или могут быть любым иным образом доставлены к целевым клеткам или тканям. Нуклеиновая кислота или комплексы на основе нуклеиновой кислоты могут быть введены в локальном режиме в соответствующие ткани ex vivo или in vivo посредством локальной доставки в легкое, при их включении в биополимеры или в отсутствие такого включения. В конкретных вариантах молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включают последовательности, показанные в таблице II или на фиг. 4-5. Примеры таких молекул нуклеиновой кислоты состоят по существу из последовательностей, определенных в указанных таблицах и на чертежах. Кроме того, химически модифицированные конструкции, описанные в таблице I, и композиции на основе нанолипидных частиц (LNP), показанные в таблице IV, могут использоваться в любой из последовательностей киНК или в группе последовательностей киНК согласно настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клеткам млекопитающих, содержащих одну или несколько молекул киНК согласно настоящему изобретению. Одна или несколько указанных молекул киНК согласно настоящему изобретению могут использоваться для независимого направленного воздействия на одни и те же или разные сайты в целевом полинуклеотиде согласно настоящему изобретению.

Термин «РНК» используется для обозначения молекулы, включающей по меньшей мере один рибонуклеотидный остаток. Термин «рибонуклеотид» используется для обозначения нуклеотида, содержащего гидроксильную группу в 2'-положении β-D-рибофуранозного фрагмента. Данные термины включают двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, выделенную РНК, такую как частично очищенная РНК, по существу чистая РНК, синтетическую РНК, полученную рекомбинантными методами РНК, а также измененную РНК, которая отличается от природной РНК за счет внесения в нее добавки, делеции, замещения и/или изменения одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут включать добавление материала ненуклеотидной природы, такие как добавки, содержащиеся на одном или обоих концах молекулы киНК или введенные внутрь молекулы, например, локализованные в одном или нескольких нуклеотидах в составе РНК. Нуклеотиды в составе молекул киНК согласно настоящему изобретению могут также включать нестандартные нуклеотиды, такие как неприродные нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды, или дезоксинуклеотиды. Указанные измененные РНК могут рассматриваться как аналоги, в частности аналоги природных РНК.

Термин «субъект» используется для обозначения организма, который является донором или реципиентом эксплантируемых клеток или представляет собой сами клетки. Термин «субъект» также относится к организму, в который могут вводиться молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Рассматриваемый в настоящем изобретении «субъект» может представлять собой млекопитающего или клетки млекопитающего, в том числе человека или клетки человека. В одном варианте указанный термин относится к ребенку (например, к субъектам, которые моложе 1 месяца или возраст которых составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев). В одном варианте указанный термин относится к детям более позднего возраста (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 лет). В одном варианте указанный термин относится к субъекту пожилого возраста (например, к субъектам в возрасте примерно 65 лет).

Термин «химическая модификация» используется для описания любой модификации химической структуры нуклеотидов, которые отличаются от нуклеотидов в нативной киРНК или РНК. Термин «химическая модификация» охватывает такие варианты, как добавление, замещение или модификация нативных нуклеозидов и нуклеотидов в составе киРНК или РНК модифицированными нуклеозидами и модифицированными нуклеотидами, согласно настоящему описанию или согласно известной в данной области информации. Не ограничивающие примеры таких химических модификаций включают, без ограничения, композиции, описываемые любой из формул I, II, III, IV, V, VI или VII согласно настоящему описанию, нуклеотиды, содержащие фосфоротиоатные межнуклеотидные связи, 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилрибонуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторрибонуклеотиды, 4'-тиорибонуклеотиды, 2'-О-трифторметилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды (см., например, USSN 10/981966, зарегистрированный 5 ноября 2004 года, включенный в настоящее описание в качестве ссылки), FANA, нуклеотиды с «универсальным основанием», «ациклические» нуклеотиды, 5-С-метилнуклеотиды, модификации, включающие введение терминальных глицерильных и/или инвертированных дезокси-безосновных остатков, или модификацию, описываемую любой из формул I-VII согласно настоящему описанию. В одном варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (например, дцРНК, киНК и т.п.) частично модифицированы посредством химических модификаций (в частности, модифицированы примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%). В другом варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (например, дцРНК, киНК и т.п.) полностью модифицированы за счет химических модификаций (например, модифицированы почти на 100%).

Термин «фосфоротиоат» в контексте настоящего описания относится к межнуклеотидной связи в соединении формулы I, где Z и/или W включают атом серы. Соответственно, термин фосфоротиоат относится как к фосфоротиоатным, так и к фосфородитиоатным межнуклеотидным связям.

Термин «фосфоноацетат» в контексте настоящего описания относится к межнуклеотидной связи в соединении формулы I, где Z и/или W включают ацетильную или защищенную ацетильную группу.

Термин «тиофосфоноацетат» в контексте настоящего описания относится к межнуклеотидной связи в соединении формулы I, где Z включает ацетильную или защищенную ацетильную группу и W включает атом серы, или, альтернативно, W включает ацетильную или защищенную ацетильную группу и Z включает атом серы.

Термин «универсальное основание» в контексте настоящего описания относится к аналогам нуклеотидного основания, которые могут образовывать пары оснований с каждым из природных оснований ДНК/РНК, при наличии небольшой дискриминации между ними. Не ограничивающие примеры универсальных оснований включают С-фенильные, С-нафтильные и другие ароматические производные, инозин, азолкарбоксамиды и нитроазоловые производные, такие как 3-нитропиррол, 4-нитроиндол, 5-нитроиндол и 6-нитроиндол, известные в данной области (см., например, Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447).

Термин «ациклический нуклеотид» в контексте настоящего описания относится к любому нуклеотиду, содержащему ациклический рибозный сахар, например, где любой из рибозных атомов углерода (С1, C2, C3, C4 или С5) независимо или в сочетании удалены из нуклеотида.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, по отдельности или в сочетании с другими лекарственными препаратами, могут использоваться для предупреждения или лечения заболеваний, расстройств, состояний или признаков согласно настоящему описанию или иных, известных в данной области, у субъекта или в организме.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут вводиться субъекту или могут вводиться в любые соответствующие клетки, которые, как это известно специалистам в данной области, подходят для такой цели, по отдельности или в сочетании с одним или несколькими лекарственными препаратами, в условиях, подходящих для лечения.

В другом варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут использоваться в сочетании с другими известными режимами лечения, применяемыми для профилактики или лечения заболеваний, расстройств или состояний у субъекта или в организме. Так, например, описанные молекулы могут использоваться в сочетании с одним или несколькими известными соединениями, режимами лечения или процедурами, применяемыми для лечения заболеваний, расстройств, состояний и признаков согласно настоящему описанию у субъекта или в организме, в соответствии с известными в данной области подходами.

В одном варианте настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну молекулу киНК согласно настоящему изобретению, в рамках способа, который позволяет экспрессию молекулы киНК. Например, указанный вектор может содержать одну или несколько последовательностей, кодирующих обе цепи молекулы киНК, включающей дуплекс. Указанный вектор может также содержать одну или несколько последовательностей, кодирующих одну молекулу нуклеиновой кислоты, которая является самокомплементарной и в этой связи формирует молекулу киНК. Не ограничивающие примеры таких векторов экспрессии описаны в литературе (Paul et al., 2002, Nature Biotechnology 19, 505; Miyagashi and Taira, 2002, Nature Biotechnology 19, 497; Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; и Novina et al., Nature Medicine, обновленная публикация он-лайн doi:10.1038/nm725.

В другом варианте настоящее изобретение относится к клетке млекопитающего, например к клетке человека, включающей вектор экспрессии согласно настоящему изобретению.

В еще одном варианте вектор экспрессии согласно настоящему изобретению включает последовательность молекулы киНК, характеризующейся комплементарностью к молекуле РНК, депонированной в Genbank с номерами доступа, приведенными в предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923536 и/или PCT/US03/05028.

В одном варианте вектор экспрессии согласно настоящему изобретению включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую две или более молекул киНК, которые могут быть одинаковыми или могут различаться.

В другом аспекте настоящего изобретения молекулы киНК, которые взаимодействуют с молекулами целевой РНК и осуществляют отрицательную регуляцию гена, кодирующего молекулы целевой РНК (например, молекулы целевой РНК, депонированные в Genbank с номерами доступа, приведенными в настоящем описании), экспрессируются на основе единиц транскрипций, встроенных в векторы на основе ДНК или РНК. Указанные рекомбинантные векторы могут представлять собой плазмиды на основе ДНК или вирусные векторы. Вирусные векторы, экспрессирующие киНК, могут быть сконструированы на основе приведенных выше векторов, включающих, без ограничения, аденоассоциированный вирус, ретровирус, аденовирус или альфавирус. Рекомбинантные векторы, способные к экспрессии молекул киНК, могут быть получены согласно настоящему описанию и могут персистировать в целевых клетках. Альтернативно, могут использоваться вирусные векторы, которые обеспечивают временную экспрессию молекул киНК. Такие векторы могут вводиться повторно, при необходимости. После экспрессии молекулы киНК связываются и осуществляют отрицательную регуляцию функции или экспрессии гена через интерференцию РНК (РНКи). Доставка векторов, экспрессирующих киНК, может быть системной, например, проводимой путем внутривенного или внутримышечного введения, путем введения в целевые клетки, эксплантированные от субъекта с последующим введением вновь в организм субъекта, или с помощью других способов, которые способствуют встраиванию вектора в желательную целевую клетку.

Термин «векторы» используется для обозначения любой методики, основанной на нуклеиновой кислоте и/или на вирусах, применяемой для доставки желательной нуклеиновой кислоты.

Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны специалистам на основе приведенного описания предпочтительных вариантов его осуществления и из прилагаемой формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 дана иллюстрация не ограничивающего примера схемы синтеза молекул киНК. Комплементарные последовательности цепей киНК, цепи 1 и цепи 2, синтезируют в тандеме и соединяют с помощью расщепляемой связи, такой как нуклеотидный сукцинат или безосновный сукцинат, которые могут быть одинаковыми или могут отличаться от расщепляемого линкера, используемого для твердофазного синтеза на твердой подложке. Указанный синтез может проводиться либо в твердой фазе, либо в фазе раствора, в приведенном примере синтез проводится в твердой фазе. Указанный синтез проводится таким образом, что защитная группа, такая как диметокситритильная группа, остается интактной на концевом нуклеотиде тандемного олигонуклеотида. При расщеплении и снятии защиты с олигонуклеотида, две цепи киНК спонтанно гибридизуются с образованием дуплекса киНК, что позволяет осуществлять очистку дуплекса за счет использования свойств концевой защитной группы, например с использованием тритила в методе очистки, где выделяют только дуплексы/олигонуклеотиды с концевой защитной группой.

На фиг. 2 показан масс-спектр MALDI-TOF очищенного дуплекса киНК, синтезированного по способу согласно настоящему изобретению. Два приведенных пика соответствуют расчетной массе отдельных цепей последовательности киНК. Этот результат показывает, что дуплекс киНК, полученный в ходе тандемного синтеза, может быть очищен в виде одной единицы с использованием простой методики тритильной очистки.

На фиг. 3 дана иллюстрация не ограничивающего примера деградации целевой РНК, участвующей в РНКи. Двухцепочечная РНК (дцРНК), которая генерируется РНК-зависимой РНК-полимеразой (RdRP) из чужеродной одноцепочечной РНК, например, вирусной РНК, транспозона или другой экзогенной РНК, активирует фермент DICER, который, в свою очередь, генерирует дуплексы киНК. Альтернативно, синтезированная или экспрессированная киНК может быть введена непосредственно в клетку с использованием соответствующих способов. При этом образуется активный комплекс киНК, который распознает целевую РНК, что приводит к деградации целевой РНК эндонуклеазным комплексом RISC или в ходе синтеза дополнительной РНК по механизму РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), которая может активировать DICER, приводя к образованию дополнительных молекул киНК, что усиливает ответ по механизму РНКи.

На фиг. 4A-F проиллюстрированы не ограничивающие примеры конструкций химически модифицированных киНК согласно настоящему изобретению. На приведенных чертежах N обозначает любой нуклеотид (аденозин, гуанозин, цитозин, уридин или необязательно тимидин, где тимидин, например, может быть замещен в пределах выступающих участков, обозначенных (N N). Приведены различные модификации смысловой и антисмысловой цепей в конструкции киНК. Указанные (N N) нуклеотидные положения могут быть химически модифицированы в соответствии с приведенным описанием (например, с использованием 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтормодификаций и т.п.) и могут быть получены из соответствующей целевой последовательности нуклеиновой кислоты либо иным способом (см., например, фиг. 6С). Кроме того, последовательности, показанные на фиг. 4, могут необязательно включать рибонуклеотид в 9-м положении, считая от 5'-конца в смысловой цепи, или в 11-м нуклеотидном положении от 5'-конца ведущей цепи, при отсчете 11 нуклеотидного положения от 5'-конца ведущей цепи (см. фиг. 6С).

Фиг. 4А: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям и где все присутствующие нуклеотиды представляют собой рибонуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Антисмысловая цепь включает 21 нуклеотид и необязательно содержит 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК и где все присутствующие нуклеотиды представляют собой рибонуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная как «s», в необязательном варианте соединяет (N N) нуклеотиды в антисмысловой цепях.

Фиг. 4B: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, и все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Антисмысловая цепь включает 21 нуклеотид и необязательно содержит 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтормодифицированные нуклеотиды, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксиринуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная как «s», в необязательном варианте соединяет (N N) нуклеотиды в смысловой и антисмысловой цепях.

Фиг. 4С: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, содержащая 5'- и 3'-концевые кэп-фрагменты, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-О-метил- или 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или любые химические модификации согласно настоящему описанию. Антисмысловая цепь, включающая 21 нуклеотид, необязательно содержит 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная в виде «s», в необязательном варианте соединяет (N N) нуклеотиды в смысловой и антисмысловой цепях.

Фиг 4D: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, содержащие 5'- и 3'-концевые кэп-фрагменты, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или любые химические модификации согласно настоящему описанию, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды. Антисмысловая цепь включает 21 нуклеотид, которые необязательно содержат 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная в виде «s», в необязательном варианте соединяет (N N) нуклеотиды в антисмысловой цепи.

Фиг 4Е: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, содержащие 5'- и 3'-концевые кэп-фрагменты, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или любые химические модификации согласно настоящему описанию. Антисмысловая цепь включает 21 нуклеотид и необязательно содержит 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная в виде «s», необязательно соединяет (N N) нуклеотиды в антисмысловой цепи.

Фиг. 4F: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, содержащие 5'- и 3'-концевые кэп-фрагменты, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды. Антисмысловая цепь включает 21 нуклеотид и необязательно содержит 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК, а также содержит одну 3'-концевую фосфоротиоатную межнуклеотидную связь, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная в виде «s», необязательно соединяет (N N) нуклеотиды в антисмысловой цепи. Антисмысловая цепь конструкций A-F включает последовательность, комплементарную любой последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Кроме того, в том случае, когда глицерильный фрагмент (L) присутствует на 3'-конце антисмысловой цепи в любой конструкции, показанной на фиг. 4A-F, модифицированная межнуклеотидная связь является необязательной.

На фиг. 5A-F проиллюстрированы не ограничивающие примеры конкретных последовательностей химически модифицированных киНК согласно настоящему изобретению. Варианты A-F относятся к химическим модификациям, приведенным на фиг. 4А-F, применительно к репрезентативной последовательности киНК. Такие химические модификации могут быть использованы в любой последовательности киНК применительно к любой мишени. Кроме того, последовательности, показанные на фиг. 5, могут необязательно включать рибонуклеотид в 9-м положении от 5'-конца смысловой цепи или в 11-м положении от 5'-конца ведущей цепи, при отсчете 11 нуклеотидного положения от 5'-конца ведущей цепи (фиг. 6С). Кроме того, последовательности, показанные на фиг. 5, могут необязательно включать концевые рибонуклеотиды примерно до 4 положения на 5'-конце антисмысловой цепи (например, в положении примерно 1, 2, 3 или 4 концевого рибонуклеотида на 5'-конце антисмысловой цепи).

На фиг. 6А-С приведены не ограничивающие примеры различных конструкций киНК согласно настоящему изобретению.

Примеры, проиллюстрированные на фиг. 6А (конструкции 1, 2 и 3), характеризуются наличием 19 репрезентативных пар оснований; однако различные варианты осуществления настоящего изобретения могут включать любое число пар оснований согласно настоящему описанию. Выделенные скобками участки соответствуют положению нуклеотидов в выступающих фрагментах, которые включают, например, примерно 1, 2, 3 или 4 нуклеотида в длину, предпочтительно примерно 2 нуклеотида. Конструкции 1 и 2 могут использоваться независимо для достижения активности РНКи. Конструкция 2 может включать полинуклеотидный или ненуклеотидный линкер, который, в необязательном варианте, может быть сконструирован в виде биодеградируемого линкера. В одном варианте петлевая структура, показанная в конструкции 2, может включать биодергадируемый линкер, который приводит к образованию конструкции 1 in vivo и/или in vitro. В другом примере конструкция 3 может использоваться для создания конструкции 2, на основе тех же принципов, что и в случае линкера, используемого для создания активной конструкции 2 киНК in vivo и/или in vitro, где необязательно может использоваться другой биодеградируемый линкер для создания активной конструкции 1 киНК in vivo и/или in vitro. Соответственно, стабильность и/или активность конструкций киНК может модулироваться при разработке конструкции киНК, используемой in vivo и/или in vitro и/или in vitro.

Примеры, проиллюстрированные на фиг. 6B, отражают различные вариации в молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такой как микроРНК, которая может включать выступающие фрагменты, вздутия, петли и стеблевые петли, возникающие в результате частичной комплементарности. Такие мотивы, содержащие вздутия, петли и стеблевые петли, рассматриваются в основном как характеристики миРНК. Указанные вздутия, петли и стеблевые петли возникают в результате наличия любой степени частичной комплементарности, такой как при наличии ошибочных спариваний или вздутий, которые включают примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более нуклеотидов в одной или обеих цепях молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

В примере, проиллюстрированном на фиг. 6С, показана модель молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, включающей дуплекс из 19 пар оснований, на основе двух последовательностей из 21 нуклеотида, содержащих динуклеотидные 3'-выступающие фрагменты. Верхняя цепь (1) отображает смысловую цепь (цепь-«пассажир»), средняя цепь (2) отображает антисмысловую цепь (ведущая цепь), и нижняя цепь (3) представляет собой целевую полинуклеотидную последовательность. Выступающие динуклеотидные фрагменты (NN) могут включать последовательность, полученную из целевого полинуклеотида. Так, например, 3'-(NN) последовательность в ведущей цепи может быть комплементарна 5'-[NN] последовательности целевого полинуклеотида. Кроме того, 5'-(NN) последовательность цепи-«пассажира» может включать такую же последовательность, что и 5'-[NN] последовательность целевого полинуклеотида. В других вариантах выступающие фрагменты (NN) не были получены из целевой полинуклеотидной последовательности, например, в том случае, когда 3'-(NN) последовательность ведущей цепи не комплементарна 5'-[NN] последовательности целевого полинуклеотида, и 5'-(NN) последовательность цепи-«пассажира» может включать последовательность, отличную от 5'-[NN] последовательности целевого полинуклеотида. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения любые (NN) нуклеотиды химически модифицированы, например, включают модификации 2'-О-метилом, 2'-дезокси-2'-фтором и/или имеют другие модификации согласно настоящему описанию. Кроме того, цепь-«пассажир» может включать рибонуклеотидную позицию N в цепи-«пассажире». Применительно к показанным на чертеже 19 репрезентативных пар оснований в 21-мерном дуплексе, локализация N может быть удалена от 3'-конца цепи-«пассажира» на 9 нуклеотидов. Однако, в случае дуплексов варьирующейся длины, положение N определяется относительно 5'-конца ведущей цепи путем отсчета 11 нуклеотидов от 5'-конца ведущей цепи и выбора соответствующих спаренных по основаниям нуклеотидов в цепи-«пассажире». Расщепление Ago2 происходит между положениями 10 и 11, как указано на чертеже стрелкой. В дополнительных вариантах имеются два рибонуклеотида, NN, в положениях 10 и 11 относительно 5'-конца ведущей цепи, определяемых путем отсчета 10 и 11 нуклеотидных положений от 5'-конца ведущей цепи и выбора соответствующих спаренных по основанию нуклеотидов в цепи-«пассажире».

На фиг. 7А-С показана диаграмма, иллюстрирующая схему, которая была использована при создании кассет экспрессии для целей получения шпилечных конструкций киНК.

Фиг. 7А: Олигомер ДНК синтезируют с использованием последовательности сайта 5'-рестрикции (R1), за которой следует участок, имеющий последовательность, идентичную заданной целевой последовательности (смысловой участок киНК), где указанный смысловой участок включает, например, примерно 19, 20, 21 или 22 нуклеотида (N) в длину, и за указанной последовательностью следует петлевая последовательность с определенной последовательностью (X), включающая, например, от примерно 3 до примерно 10 нуклеотидов.

Фиг. 7B: Затем полученную синтетическую конструкцию подвергают расширению с помощью ДНК-полимеразы с образованием шпилечной структуры, имеющей самокомплементарную последовательность, на основе которой получают транскрипт киНК, который специфичен для целевой последовательности и содержит самокомплементарные смысловой и антисмысловой участки.

Фиг. 7С: Указанную конструкцию нагревают (например, приблизительно до 95°С) для линеаризации последовательности, что позволяет достичь расширения комплементарной второй цепи ДНК с использованием праймера к последовательности 3'-рестрикции первой цепи. Далее двухцепочечную ДНК встраивают в соответствующий вектор для экспрессии в клетках. Указанная конструкция может быть получена таким образом, что при транскрипции образуется 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, например, путем создания методами генной инженерии сайтов рестрикции и/или за счет использования поли-U участков терминации, как описано в работе Пола с соавт. (Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505-508).

Фиг. 8А-С представляет собой диаграмму, иллюстрирующую схему, которая была использована при создании кассеты экспрессии для получения конструкций двухцепочечных киНК.

Фиг. 8А: Олигомер ДНК синтезируют с использованием последовательности сайта 5'-рестрикции (R1), за которой следует участок, имеющий последовательность, идентичную заданной целевой последовательности (смысловой участок киНК), где указанный смысловой участок включает, например, примерно 19, 20, 21 или 22 нуклеотида (N) в длину, и за указанной последовательностью следует сайт 3'-рестрикции (R2), который соседствует с петлевой последовательностью определенной последовательности (X).

Фиг 8B: Затем полученную синтетическую конструкцию подвергают расширению с помощью ДНК-полимеразы с образованием шпилечной структуры, имеющей самокомплементарную последовательность.

Фиг 8С: Далее указанную конструкцию процессируют с использованием ферментов рестрикции, специфичных к R1 и R2, с получением двухцепочечной ДНК, которую затем встраивают в соответствующий вектор для экспрессии в клетках. Кассету транскрипции разрабатывают таким образом, чтобы каждая сторона дцДНК была фланкирована U6 промоторным участком, что позволяет создать по отдельности смысловую и антисмысловую цепи киНК. К указанным конструкциям могут быть добавлены поли-Т-терминирующие последовательности для создания U-выступающих фрагментов в полученном транскрипте.

Фиг. 9А-Е представляет собой диаграмму, иллюстрирующую способ, который был использован для определения сайтов-мишеней для киНК-опосредованного процесса РНКи, в составе конкретной целевой последовательности нуклеиновой кислоты, такой как матричная РНК.

Фиг. 9А: Синтезируют совокупность олигонуклеотидов киНК, где антисмысловой участок конструкции киНК комплементарен к сайтам-мишеням вдоль всей последовательности целевой нуклеиновой кислоты и где смысловой участок включает последовательность, комплементарную антисмысловому участку киНК.

Фиг. 9B и C: (фиг. 9B) Последовательности объединяют и встраивают в векторы, так что (фиг. 9С) трансфекция вектора в клетки приводит к экспрессии киНК.

Фиг. 9D: Клетки сортируют на основе наличия фенотипических изменений, которые ассоциированы с модуляцией последовательности целевой нуклеиновой кислоты.

Фиг. 9Е: киНК выделяют из отсортированных клеток и секвенируют для идентификации эффективных сайтов-мишеней в последовательности целевой нуклеиновой кислоты.

На фиг. 10 проиллюстрированы не ограничивающие примеры различных химических стабилизирующих структур (1-10), которые могут использоваться, например, для стабилизации 3'-конца в последовательностях киНК согласно настоящему изобретению и которые включают: (1) [3-3']-инвертированную дезоксирибозу; (2) дезоксирибонуклеотид; (3) [5'-3']-3'-дезоксирибонуклеотид; (4) [5'-3']-рибонуклеотид; (5) [5'-3']-3'-О-метилрибонуклеотид; (6) 3'-глицерил; (7) [5'-3']-3'-дезоксирибонуклеотид; (8) [3'-3']-дезоксирибонуклеотид; (9) [5'-2']-дезоксирибонуклеотид; и (10) [5-3']-дидезоксирибонуклеотид. Кроме модифицированных и немодифицированных химических структур скелета, приведенных на чертеже, указанные химические структуры могут быть объединены с различными другими скелетными модификациями согласно настоящему описанию, например, со скелетными модификациями формулы I. Кроме того, 2'-дезоксинуклеотид, показанный в виде 5'-концевых модификаций, может быть представлен иначе модифицированным или вовсе не модифицированным нуклеотидом или фрагментом ненуклеотидной природы согласно настоящему описанию, например, может включать модификации, соответствующие любой из формул I-VII или любому их сочетанию.

На фиг. 11 показан не ограничивающий пример, иллюстрирующий стратегию, которая была использована для идентификации конструкций химически модифицированных киНК согласно настоящему изобретению, которые обладают резистентностью к нуклеазе, при одновременном сохранении способности опосредовать активность РНКи. Химические модификации вводят в конструкцию киНК с учетом выявленных параметров сборки (например, при встраивании 2'-модификаций, модификаций основания, скелетных модификаций, концевых кэп-модификаций и т.п.). Модифицированную конструкцию подвергают тестированию в соответствующей системе (например, в сыворотке крови человека для оценки нуклеазной резистентности, как это показано на чертеже, или на модели животных для оценки ФК параметров /характеристик доставки). Параллельно, конструкцию киНК тестируют на наличие РНКи активности, например, в системе культуры клеток, такой как тест на люциферазный репортер. Затем идентифицируют конструкции лидерных киНК, которые обладают конкретными характеристиками, при одновременном сохранении РНКи активности, и которые могут быть далее подвергнуты соответствующей модификации, и вновь проводят количественный анализ. Такого же рода подход может быть использован для идентификации киНК-конъюгированных молекул с улучшенными фармакокинетическими профилями, способностью к доставке и РНКи активностью.

На фиг. 12 приведены не ограничивающие примеры молекул фосфорилированных киНК согласно настоящему изобретению, включающих линейные и дуплексные конструкции, а также их асимметрические производные.

На фиг. 13 приведены не ограничивающие примеры химически модифицированных концевых фосфатных групп согласно настоящему изобретению.

На фиг. 14А приведены не ограничивающие примеры технологии, используемой для создания самокомплементарных конструкций DFO на основе палиндромных и/или повторяющихся последовательностей нуклеиновой кислоты, которые идентифицированы в целевой последовательности нуклеиновой кислоты. (i) В целевой последовательности нуклеиновой кислоты идентифицируют палиндромную или повторяющуюся последовательность. (ii) Создают последовательность, которая комплементарна последовательности целевой нуклеиновой кислоты и палиндромной последовательности. (iii) Инвертированную повторяющуюся последовательность непалиндромной/повторяющейся части комплементарной последовательности присоединяют к 3'-концу комплементарной последовательности для получения самокомплементарной молекулы DFO, включающей последовательность, комплементарную целевой нуклеиновой кислоте. (iv) Молекула DFO может подвергаться самосборке с образованием двухцепочечного олигонуклеотида. На фиг. 14B приведен не ограничивающий репрезентативный пример олигонуклеотидной последовательности, образующей дуплекс. На фиг. 14С приведен не ограничивающий пример, иллюстрирующий схему самосборки репрезентативной олигонуклеотидной последовательности, формирующей дуплекс. На фиг. 14D показан не ограничивающий пример, иллюстрирующий схему самосборки репрезентативной олигонуклеотидной последовательности, формирующей дуплекс, с последующим взаимодействием с последовательностью целевой нуклеиновой кислоты, приводящим к модуляции генной экспрессии.

На фиг. 15 приведен не ограничивающий пример архитектуры самокомплементарных конструкций DFO на основе палиндромных и/или повторяющихся последовательностей нуклеиновых кислот, которые включены в конструкции DFO и которые содержат последовательность, комплементарную к любой целевой последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. Встраивание указанных палиндромных/повторяющихся последовательностей позволяет создать конструкции DFO определенной архитектуры, формирующие дуплекс, в которых каждая цепь способна опосредовать экспрессию целевого гена, например, в процессе РНКи. Вначале идентифицируют целевую последовательность. Далее создают комплементарную последовательность, при этом в данную комплементарную последовательность вводят нуклеотидные или ненуклеотидные модификации (показанные как X или Y), которые генерируют образование искусственного палиндрома (показанного на чертеже в виде XYXYXY). Указанный инвертированный повтор непалиндромной/повторяющейся комплементарной последовательности присоединяют к 3'-концу комплементарной последовательности с получением самокомплементарной DFO, включающей последовательность, комплементарную к целевой нуклеиновой кислоте. Указанный DFO может подвергаться самосборке с образованием двухцепочечного олигонуклеотида.

На фиг. 16 проиллюстрированы не ограничивающие примеры полифункциональных молекул киНК согласно настоящему изобретению, включающих две отдельные полинуклеотидные последовательности, каждая из которых способна опосредовать РНКи, направляющий расщепление различных целевых последовательностей нуклеиновой кислоты. На фиг. 16А приведен не ограничивающий пример полифункциональной молекулы киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый и второй комплементарные участки расположены на 3'-концах каждой полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК. Указанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью применительно к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны к последовательностям целевой нуклеиновой кислоты. На фиг. 16B приведен не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый и второй комплементарные участки расположены на 5'-концах каждой полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью применительно к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны к последовательностям целевой нуклеиновой кислоты.

На фиг. 17 приведены не ограничивающие примеры молекул полифункциональных киНК согласно настоящему изобретению, включающих одну полинуклеотидную последовательность, которая содержит различные участки, каждый из которых способен вовлекаться в РНКи, направляющую расщепление различных последовательностей целевой нуклеиновой кислоты. На фиг. 17А приведен не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где второй комплементарный участок расположен на 3'-конце полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны целевым последовательностям нуклеиновой кислоты. На фиг. 17B показан не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый комплементарный участок расположен на 5'-конце полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны целевым последовательностям нуклеиновой кислоты. В одном варианте, указанные конструкции полифункциональной киНК подвергаются процессингу in vivo или in vitro с образованием конструкций полифункциональных киНК, как показано на фиг. 16.

На фиг. 18 показаны не ограничивающие примеры молекул полифункциональных киНК согласно настоящему изобретению, включающих две отдельные полинуклеотидные последовательности, каждая их которых способна опосредовать РНКи, направляющую расщепление различных целевых последовательностей нуклеиновой кислоты, где конструкция полифункциональной киНК также включает самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок, что позволяет создать более короткие конструкции бифункциональных киНК, которые могут опосредовать интерференцию РНК против различных целевой последовательностей нуклеиновой кислоты. На фиг. 18А показан не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый и второй комплементарные участки расположены на 3'-концах каждой полинуклеотидной последовательности в полифункциональных киНК, и где первый и второй комплементарные участки включают самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны целевым последовательностям нуклеиновой кислоты. На фиг. 18В показан не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый и второй комплементарные участки расположены на 5'-концах каждой полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК, и где первый и второй комплементарные участки также включают самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны целевым последовательностям нуклеиновой кислоты.

На фиг. 19 показаны не ограничивающие примеры молекул полифункциональных киНК согласно настоящему изобретению, включающих одну полинуклеотидную последовательность, которая содержит различные участки, каждый из которых способен опосредовать РНКи, направляющую расщепление различных целевых последовательностей нуклеиновой кислоты, и где конструкция полифункциональной киНК также включает самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок, что позволяет создать более короткие конструкции бифункциональных киНК, которые могут опосредовать интерференцию РНК против различных целевых последовательностей нуклеиновой кислоты. На фиг. 19А показан не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где второй комплементарный участок расположен на 3'-конце полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК, и где первый и второй комплементарные участки также включают самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны к целевым последовательностям нуклеиновой кислоты. На фиг. 19B показан не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый комплементарный участок расположен на 5'-конце полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК и где первый и второй комплементарные участки также включают самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны к целевой последовательности нуклеиновой кислоты. В одном варианте указанные конструкции полифункциональной киНК подвергаются процессингу in vivo или in vitro с образованием конструкции полифункциональной киНК, как показано на фиг. 18.

На фиг. 20 показан не ограничивающий пример, иллюстрирующий, как молекулы полифункциональных киНК согласно настоящему изобретению могут направленно воздействовать на две отдельные молекулы целевой нуклеиновой кислоты, такие как отдельные молекулы РНК, кодирующие различные белки (например, любые мишени согласно настоящему изобретению), например, на цитокин и его соответствующий рецептор, на различные вирусные штаммы, на вирусный и клеточный белок, вовлекаемый в вирусную инфекцию или репликацию, или различные белки, вовлекаемые в общий или дивергентный биологический путь, связанный с поддержанием прогрессирования болезни. Каждая цепь конструкции полифункциональной киНК включает участок, комплементарный к отдельным молекулам целевой нуклеиновой кислоты. Указанную молекулу полифункциональной киНК разрабатывают таким образом, что каждая цепь киНК может быть использована в составе комплекса RISС для инициации процесса интерференции РНК, вовлекаемого в расщепление соответствующей мишени. Параметры указанной архитектуры могут включать дестабилизацию каждого конца конструкции киНК (см,. например, Schwarz et al., 2003, Cell, 115, 199-208). Такая дестабилизация может быть достигнута, например, при использовании гуанозин-цитидиновых пар оснований, чередующихся пар оснований (например, неканонических пар, соответствующих модели «качелей») или дестабилизирующих химически модифицированных нуклеотидов в концевых нуклеотидных положениях, в соответствии с известными в настоящее время данными.

На фиг. 21 приведен не ограничивающий пример, иллюстрирующий, как молекулы полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению могут направленно воздействовать на две отдельные целевые последовательности нуклеиновой кислоты в составе одной молекулы целевой нуклеиновой кислоты, таких как чередующиеся кодирующие участки РНК, кодирующие и некодирующие участки РНК или чередующиеся участки сплайсинг-вариантов РНК. Каждая цепь конструкции полифункциональной киНК включает участок, комплементарный к отдельным участкам молекулы целевой нуклеиновой кислоты. Указанная молекула полифункциональной киНК разработана таким образом, что каждая цепь киНК может использоваться в составе комплекса RISС для инициации процесса интерференции РНК, опосредующего расщепление соответствующего целевого участка. Параметры указанной архитектуры могут включать дестабилизацию каждого конца конструкции киНК (см., например, Schwarz et al., 2003, Cell, 115, 199-208). Такая дестабилизация может быть достигнута, например, при использовании гуанозин-цитидиновых пар оснований, чередующихся пар оснований (например, неканонических пар, соответствующих модели «качелей») или дестабилизирующих химически модифицированных нуклеотидов в концевых нуклеотидных положениях, в соответствии с известными в настоящее время данными.

На фиг. 22(А-Н) приведены не ограничивающие примеры присоединенных конструкций полифункциональных киНК согласно настоящему изобретению. В приведенных примерах линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер) соединяет два участка киНК (например, соединяет вместе два смысловых, два антисмысловых или, альтернативно, смысловой и антисмысловой участки). Отдельные смысловые (или смысловые и антисмысловые) последовательности, соответствующие первой целевой последовательности и второй целевой последовательности, гибридизируют с соответствующей смысловой и/или антисмысловой последовательностями в полифункциональной киНК. Дополнительно, различные конъюгаты, лиганды, аптамеры, полимеры или репортерные молекулы могут быть присоединены к линкерному участку для достижения селективного или улучшенного характера доставки и/или с целью создания улучшенных фармакокинетических свойств.

На фиг. 23 показан не ограничивающий пример различных дендримерных архитектур полифункциональных киНК.

На фиг. 24 показан не ограничивающий пример различных супрамолекулярных архитектур полифункциональных киНК.

На фиг. 25 приведен не ограничивающий пример дайсера (dicer), позволяющего достичь соответствующей структуры полифункциональной киНК, с использованием 30-нуклеотидной конструкции-предшественника киНК. Далее дуплекс из 30 пар оснований расщепляют дайсером с получением продуктов с 22 и 8 парами оснований на любом конце (фрагменты из 8 пар оснований не показаны). Для простоты описания, выступающие фрагменты, созданные дайсером, не показаны, но эти данные могут быть предоставлены. Показаны три целевые последовательности. Требуемое перекрывание последовательности по идентичности выделено на череже в виде серых прямоугольников. N-положения родительских киНК из 30 пар оснований представляют собой предполагаемые сайты 2'-OH-положений, делающих возможным расщепление дайсером, в случае тестирования в условиях стабилизированных химических структур. Следует отметить, что процессинг 30-мерного дуплекса дайсерной РНКазой III не создает точного расщепления по механизму 22+8, но, скорее, позволяет получить серию родственных продуктов (где продукт 22+8 относится к основныму сайту). Таким образом, процессинг дайсером приводит к получению серии активных киНК.

На фиг. 26 показан не ограничивающий пример архитектуры многофункциональных киНК, полученных с помощью дайсера на основе 40-нуклеотидной конструкции-предшественника киНК. Дуплекс из 40 пар оснований расщепляют дайсером на продукты по 20 пар оснований с любого конца. Для простоты описания, выступающие фрагменты, созданные дайсером, не показаны, но эти данные могут быть предоставлены. Показаны четыре целевые последовательности. Целевые последовательности, обладающие гомологией, обведены прямоугольником. Указанный формат конструкций может быть использован для получения более крупных РНК. Если химически стабилизированные киНК связываются дайсером, то стратегически расположенные рибонуклеотидные связи можно использовать для создания продуктов расщепления, которые позволяют получить более широкий репертуар полифункциональных структур по их архитектуре. Например, продукты расщепления не будут ограничены стандартом дайсера примерно в 22 нуклеотида, но можно создать конструкции полифункциональных киНК с перекрывающейся идентичностью к целевой последовательности, варьирующей в диапазоне от примерно 3 до примерно 15 нуклеотидов.

На фиг. 27 показан не ограничивающий пример дополнительных вариантов конструкции полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению. В одном примере конъюгат, лиганд, аптамер, метку или другой фрагмент присоединяют к участку полифункциональной киНК, что позволяет достичь улучшенного характера доставки или улучшенного фармакокинетического профиля.

На фиг. 28 показан не ограничивающий пример дополнительных вариантов конструкции полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению. В одном примере конъюгат, лиганд, аптамер, метку или другой фрагмент присоединяют к участку полифункциональной киНК, с достижением улучшенного характера доставки или улучшенного фармакокинетического профиля.

На фиг. 29 приведен не ограничивающий пример холестерин-связанного фосфорамидита, который может использоваться для синтеза холестериновых конъюгатов с молекулами киНК согласно настоящему изобретению. Показан пример, включающий холестериновый фрагмент, присоединенный к 5'-концу смысловой цепи молекулы киНК.

На фиг. 30 показан не ограничивающий пример ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием различных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайт 262.

На фиг. 31 показан не ограничивающий пример ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием различных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайт 263.

На фиг. 32 показан не ограничивающий пример ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием различных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайт 1583.

На фиг. 33 показан не ограничивающий пример зависимого от дозы ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием двух разных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайт 1583.

На фиг. 34 показан не ограничивающий пример зависимого от дозы ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием двух разных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайт 1583.

На фиг. 35 показан не ограничивающий пример ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием различных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайты 262 и 263.

На фиг. 36 показан не ограничивающий пример зависимого от дозы ингибирования экспрессии РНК HСV in vitro с использованием Stab 25 и Stab 29 конструкций киНК, направленно воздействующих на сайты 327, 282 и 304 в РНК.

На фиг. 37 показан не ограничивающий пример ингибирования in vivo ДНК HBV у мышей с использованием композиций на основе молекул киНК согласно настоящему изобретению LNP-086 и LNP-061 с различными структурами выступающих фрагментов. Активные конструкции киНК LNP-086 и LNP-061 оценивают в сравнении с контрольными группами введения ФБР и ивертированных контрольных композиций. Как показано на чертеже, конструкции киНК с 2'-O-метильными выступающими фрагментами обеспечивают мощную анти-HBV активность в рамках данной модели.

На фиг. 38 показан не ограничивающий пример опосредованного HBV263M-LNP-086 снижения уровней ДНК HBV в сыворотке in vivo у HBV-реплицирующих мышей, которым вводят дозы 0,3, 1 или 3 мг/кг/день в течение трех дней, в сравнении с животными в группах введения контрольной киНК или ФБР. Уровни сывороточных ДНК HBV были эквивалентны в группах введения контрольной киНК и ФБР, что указывает на специфичность по последовательности анти-HBV активности и отсутствие неспецифических липидных эффектов.

На фиг. 39 показан не ограничивающий пример опосредованного HBV263M-LNP-086 снижения уровней HBV HBsAg в сыворотке in vivo у HBV-реплицирующих мышей, которым вводят дозы 0,3, 1 или 3 мг/кг/день в течение трех дней, в сравнении с животными в группах введения контрольной киНК или ФБР. Уровни сывороточного HBV HBsAg были эквивалентны в группах введения контрольной киНК и ФБР, что указывает на специфичность по последовательности анти-HBV активности и отсутствие неспецифических липидных эффектов.

На фиг. 40 приведен не ограничивающий пример, иллюстрирующий длительность киНК-опосредованного снижения уровней HBV на модели мышей с HBV инфекцией. HBV-реплицирующим мышам вводят HBV263M-LNP-086 или HBV263Minv-LNP-086 в дозах 3 мг/кг/день в течение трех дней, с последующим анализом сывороточных титров HBV в дни 3, 7 и 14 после введения последней дозы. Как показано на чертеже, анти-HBV активность является длительной, так что значительная активность все еще наблюдается в 7 день (снижение 2,0 log 10) и день 14 (снижение 1,5 log 10).

На фиг. 41 приведен не ограничивающий пример специфичного расщепления РНК HBV в печени, опосредованного введением активной композиции HBV263M-LNP-086 на модели мышей с HBV инфекцией. Мышам, реплицирующим HBV, вводят дозы HBV263M-LNP-086, равные 0,3, 1, 3, 10 мг/кг/день, или, в качестве контроля, HBV263invM-LNP в дозе 10 мг/кг/день в течение трех дней, и через три дня после введения последней дозы определяют уровни РНК HBV в печени. Наблюдается зависимое от дозы снижение уровня РНК HBV в печени, которое достигает снижения до 90%, 66,5%, 18% и 4%, отмечаемое в группах введения 10, 3, 1 и 0,3 мг/кг HBV263M-LNP, соответственно, в сравнении с введением контрольной композиции HBV263invM-LNP-086 в дозе 10 мг/кг.

На фиг. 42 приведен не ограничивающий пример, демонстрирующий, что снижение уровня РНК HBV в печени связано с РНКи-опосредованным расщеплением РНК HBV. Используют анализ быстрой амплификации по 5'-концам кДНК (RACE) для выявления расщепления РНК HBV в предполагаемом сайте. HBV-реплицирующим мышам вводят HBV263M-LNP-086 или HBV263Мinv-LNP-086 в дозе 3 мг/кг/день в течение 3 дней. Животных умерщвляют через 3, 7 и 14 дней после введения последней дозы и выделяют суммарную печеночную РНК. Ожидалось, что лигирование адапторной последовательности со свободными 5'-концами популяции РНК и проведение далее реакции по процедуре ОТ-ПЦР с адапторными и HBV-специфическими праймерами должно привести к образованию ПЦР продукта с 145 парами оснований, если РНК HBV была расщеплена в заданном сайте-мишени. Как показано на чертеже, ожидаемый продукт амплификации выявляется в образцах, обработанных активной HBV263 киНК, в каждой анализируемой точке, но не в контрольных образцах HBV263. Далее продукты ПЦР подвергают субклонированию и секвенируют, и в результате проведенного анализа было подтверждено корректное соединение между адапторной последовательностью и предполагаемым сайтом расщепления HBV263 киНК. Данный результат показывает, что снижение уровня РНК HBV, наблюдаемое в печени, связано со специфическим РНКи-опосредованным расщеплением РНК HBV в печени. Кроме того, выявление продуктов специфического расщепления РНК HBV в анализируемых точках 7 и 14 дни, указывает на то, что длительная активность киНК против HBV связана с продолжающимся расщеплением РНК HBV.

На фиг. 43 приведен не ограничивающий пример, иллюстрирующий фармакокинетические свойства HBV263M-LNP-086, определенные у мышей после введения однократной дозы 3 мг/кг. Был использован метод гибридизации для выявления HBV263М киНК в плазме и в печени с течением времени. HBV263М быстро элиминируется из плазмы с периодом элиминации T1/2, равным примерно 1,7 часа. Однако HBV263М выявлялся в печени в течение 14-дневного периода отбора и анализа образцов и имел период элиминации Т1/2, равный 4 дням. Максимальная концентрация, равная 31,3±17,8 нг/мг (среднее значение ± стандартное отклонение), наблюдается в печени через 1 час и соответствует 65±32% от дозы киНК. На 14 день в печени остается в интактном виде 1,4±0,7% от дозы. Длительная опосредованная киНК анти-HBV активность, наблюдаемая на модели мышей, хорошо коррелирует с указанным временем пребывания киНК в печени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Механизм действия молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению

В приведенном ниже тексте дается обсуждение предполагаемого механизма интерференции РНК, опосредованного участием короткой интерферирующей РНК, в соответствии с известными в настоящее время данными, при этом следует отметить, что приведенное обсуждение не является ограничивающим и его не следует рассматривать как указание на достигнутый уровень техники в данной области. В настоящем изобретении заявитель демонстрирует, что химически модифицированные короткие интерферирующие нуклеиновые кислоты обладают аналогичной или улучшенной способностью опосредовать РНКи, относительно молекул киНК, и, как ожидается, будут обладать повышенной стабильностью и активностью in vivo; в этой связи, данное изобретение не следует рассматривать как ограниченное тольк