Способ получения продукта, содержащего иммуноглобулины g, a, m (варианты)

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения комплекса иммуноглобулинов классов G, A, M. В качестве исходного сырья используют осадки Б(III), А(II+III) фракции Кона или их смесь в любом соотношении, которые гомогенизируют в 0,3-0,7% растворе хлорида натрия с получением суспензии, которую обрабатывают 1-3% хлороформом при величине рН 4,9-5,6, перемешивают, выдерживают суспензию 30-60 мин, центрифугируют, а затем выделяют целевой продукт удалением избытка жидкости. Другой вариант осуществления способа предусматривает гомогенизацию сырья в 0,3-0,7% растворе хлорида натрия с получением суспензии, которую обрабатывают 1-3% хлороформом при величине рН 4,9-5,6, перемешивают, выдерживают суспензию 30-60 мин, центрифугируют, а затем проводят стадию дополнительного формирования осадка балластных фракций в растворе с ионной силой менее 0,05 при величине рН от 4,5 до 5,6 в течение 12-24 часов с последующим удалением их дополнительным центрифугированием или фильтрацией, а затем выделяют целевой продукт ультрафильтрацией. Способ позволяет расширить сырьевую базу производства, увеличить степень экстракции иммуноглобулинов G, A, M и степень очистки целевого продукта, уменьшить потери целевого продукта, увеличить антибактериальную и антивирусную активность. 2 н. и 10 з.п.ф-лы, 1 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к производству активных субстанций и лекарственных продуктов, содержащих комплекс иммуноглобулинов G, A, M из плазмы крови человека.

Плазма крови человека содержит иммуноглобулины пяти различных классов. Наибольшее значение имеют иммуноглобулины классов G, A, M, которые являются антителами и защищают организм от различных вирусов, бактерий и простейших (например, хламидий).

Продукт, содержащий иммуноглобулины, может производиться в готовой лекарственной форме и применяться как лекарственное средство (препарат), или в виде субстанции (комплекса) и применяться в качестве компонента лекарственных средств, включающих и другие компоненты.

Известны различные способы выделения фракции, содержащей иммуноглобулины G, A, M. Общим подходом к процессу получения препаратов для лечения бактериальных и вирусных инфекций является использование так называемых осадков III, или «Б», образующихся в процессе фракционирования плазмы крови человека этанолом по методу Кона /Алешкин В.А. и др., 2003/.

Осадок фракции «Б» представляет собой пастообразную массу, содержащую комплекс иммуноглобулинов, денатурированные белки, неактивные примеси, липопротеиды и липиды (холестерин, триглицериды и др.), небольшое количество этанола. Кроме того, в данной фракции могут присутствовать вирусы, вызывающие гепатиты, СПИД и др. вирусные инфекции.

Осадок фракции «Б» гомогенизируют в растворе хлорида натрия, затем обрабатывают органическим растворителем (обычно хлороформом), отделяют белки от неактивных примесей и липопротеидов, а затем выделяют целевой продукт осаждением полиэтиленгликолем или концентрированием.

Данная схема выделения комплекса иммуноглобулинов имеет ряд недостатков, связанных с наличием в целевом продукте примесей полиэтиленгликоля, фибриногена, липопротеидов, что затрудняет стерилизующую фильтрацию, снижает активность иммуноглобулинов, увеличивает потери целевого продукта и снижает его активность, а также требует немедленной сушки /RU №2199343/.

Особое значение принадлежит липидам, точнее холестерину. Холестерин (производное жирных кислот) является компонентом мембран клеток и источником многих гормонов. Холестерин синтезируется печенью, потупает в общий кровоток и переносится в различные органы и ткани. В связи с тем, что холестерин не растворяется в водных растворах, в том числе и в плазме крови человека, холестрин соединяется с белками, образуя хорошо растворимые комплексы - липопротеиды. Различают липопротеиды высокой плотности и липопротеиды низкой плотности. В результате действия на плазму крови фракционирующих агентов и механического воздействия липопротеиды и триглицериды повреждаются, теряют растворимость и могут выпадать в осадок, препятствуя фильтрации белковых растворов через мембраны.

Для устранения этих недостатков (удаления денатурированных белков, липидов, липопротеидов) предложены различные способы.

По патенту SU 1815820 после очистки фракции «Б» хлороформом и декстрансульфатом рекомендовано целевой продукт выделять в присутствии 12% полиэтиленгликоля.

Патент RU 2060034 для лучшей очистки предполагает экстрагирование спиртового осадка «Б» (Ш фракции Кона) в сорока-шестидясяти кратном объеме раствора хлористого натрия с последующим удалением фракции липопротеидов хлороформом.

С целью увеличения содержания иммуноглобулина А в целевом продукте предложено экстракт фракции «Б» сначала осадить 10-15% полиэтиленгликолем, затем осадок растворить в дистиллированной воде и удалить нерастворившиеся примеси центрифугированием, а надосадочную жидкость использовать в качестве целевого продукта.

Патент RU 2084229 предусматривает суспензирование осадка «Б» в 10-кратном объеме дистиллированной воды, обработку раствора хлороформом и 0,9% хлоридом натрия с последующим выделением целевого продукта 12% полиэтиленгликолем.

Для выделения IgM-содержащего концентрата предложено осадок последовательно обрабатывать аэросилом и натрием каприловокислым с промежуточными центрифугированиями для удаления балластных белков, а затем концентрировать /Патент RU 2158136/.

Патентом RU 2189833 предусмотрена последовательная обработка экстракта осадка «Б» хлороформом в концентрации от 0,1 до 3%, сульфатом меди в концентрации от 0,1 до 2% при величине рН 6-8, а выделение целевого продукта осуществляется методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующего соединения. В этом случае содержание общих липидов в целевом продукте уменьшается в 5 раз, до 0,308-0,117 г/л.

Патент RU 2199343 предусматривает разведение осадка «Б» плазмы крови в солевом растворе с ионной силой 0,01-0,15, осаждение 13-17% этиловым спиртом, суспензирование осадка и его обработку 13-15% хлороформом, двукратное удаление балластных белков, дополнительную очистку 4-6% этиловым спиртом и выделение целевого продукта осаждением этанолом.

Патент RU 2252780 предусматривает выделение комплекса иммуноглобулинов этиловым спиртом и 10% хлороформом, фильтрацией центрифугата с выделением целевого продукта 50% полиэтиленгликолем, растворением и стерилизующей фильтрацией.

Патент RU 2261112 предусматривает экстракцию осадка «Б» 12-кратным объемом дистиллированной воды, введение натрия хлорида до 0,9% концентрации, установление рН от 4,0 до 5,0, обработку 3% хлороформом в течение 14 часов, удаление осадка, осветляющую фильтрацию, выделение целевого продукта 12% полиэтиленгликолем или 26% спиртом с последующей стерилизующей фильтрацией, вирусинактивацией и лиофильным высушиванием.

Стерилизация целевого продукта может быть выполнена методом гамма-облучения с мощностью поглощенной дозы 3-6 кГр/ч, суммарной дозой 12-30 кГр до или после расфасовки.

Несмотря на многочисленные предложения по оптимизации схемы выделения комплекса иммуноглобулинов, воспроизведение заявленных методов в условиях промышленного производства не обеспечивает требуемое качество целевого продукта.

Серьезным недостатком являются сложность технологического процесса, высокая себестоимость, повреждающее воздействие фракционирующих агентов, в частности, 10% хлороформа на молекулы иммуноглобулинов, воздействие паров хлороформа на персонал, снижение активности целевого продукта в процессе хранения.

Из-за высокого содержания примесей фибриногена и фибрина, соосаждающегося с иммуноглобулинами, целевой продукт нестабилен и плохо фильтруется.

Кроме того, на большинстве предприятий по переработке плазмы и станциях переливания крови в настоящее время готовят только альбумин, а фракция иммуноглобулинов, так называемый осадок II+III, или «А», из которого в процессе дальнейшего фракционирования получают осадок III, или «Б», уничтожают. В результате исходное сырье для приготовления комплекса иммуноглобулинов - осадок III («Б») является весьма дефицитным продуктом.

Наиболее близким техническим решением является способ получения иммуноглобулинового препарата /Патент RU 2261112, прототип/.

Данный известный способ характеризуется тем, что спиртовый осадок «Б» (III фракция Кона) экстрагируют двенадцатикратным объемом дистиллированной воды, добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 0,9%, устанавливают рН от 4,0 до 5,0, вводят хлороформ до 3%, выдерживают смесь в течение 14 часов при 0-3°С, центрифугируют, осадок удаляют, проводят осветляющую фильтрацию, к фильтрату добавляют 50% раствор полиэтиленгликоля до 12% или этанол 26%, осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 0,3 М глицине с последующей стерилизующей фильтрацией, вирусинактивацией и лиофильным высушиванием.

Апробация данного способа получения иммуноглобулинового препарата в условиях промышленного производства показала, что при указанных условиях гомогенизации осадка (величина рН от 4,0 до 5,0, хлорид натрия 0,9%, хлороформ - 3%) формирование балластных примесей (липидов и липопротеидов) происходит не полностью, и денатурированные белки осаждаются 12% полиэтиленгликолем или 26% этанолом и попадают в целевой продукт, который очень плохо фильтруется через мембраны при осветляющей и стерилизующей фильтрации, до 10-15% целевого продукта безвозвратно теряется. В результате продукт не обладает достаточной антибактериальной и антивирусной, в частности антихламидийной, активностью, и стабильностью при хранении.

Направление создания препарата и способа его получения было выбрано с учетом результатов изучения причин недостатков прототипа - плохой экстракции комплекса иммуноглобулинов из исходного сырья, неполного формирования осадков денатурированных белков и липидов (холестерина), обуславливающих потери целевого продукта и снижение его активности в процессе хранения.

Технической задачей данной группы изобретений, объединенных единым техническим замыслом, является создание вариантов универсального эффективного способа выделения комплекса иммуноглобулинов из осадков Б(III) или А(II+III), получение препарата для лечения бактериальных и вирусных инфекций и расширение арсенала указанных способов и препаратов.

Технический результат, обеспечивающий решение поставленной задачи данной группы изобретений состоит:

в расширении сырьевой базы благодаря неограниченному использованию различных видов сырья - осадков Б(III) или А(II+III);

в увеличении степени экстракции иммуноглобулинов G, A, M из сырья и повышении, тем самым, выхода целевого продукта;

в уменьшении потерь целевого продукта и сырья;

в увеличении степени очистки целевого продукта за счет снижениия содержания примесей денатурированных белков, липидов и липопротеидов, чем обусловлено увеличение антибактериальной и антивирусной, в частности антихламидийной, активности в 2-4 раза;

в сохранении антибактериальной и антивирусной активности на протяжении 1,5 лет при выпуске в форме комплекса иммуноглобулинов и сохранении данной активности на протяжении трех лет при выпуске в форме лекарственного препарата иммуноглобулинов;

в обеспечении безопасности технологического процесса за счет уменьшения токсического действия хлороформа на персонал.

Сущность изобретения в части способа получения комплекса иммуноглобулинов классов G, A, M состоит в том, что в качестве исходного сырья используют осадки Б(III), А (II+III) фракции Кона или их смесь в любом соотношении, которые гомогенизируют в 0,3-0,7% растворе хлорида натрия с получением суспензии, которую обрабатывают 1-3% хлороформом при величине рН 4,9-5,6, перемешивают, выдерживают суспензию 30-60 мин, центрифугируют, а затем выделяют целевой продукт удалением избытка жидкости.

Предпочтительно величину рН 4,9-5,6 устанавливают добавлением к суспензии раствора NaOH или раствора HCL, а перемешивание осуществляют при скорости вращения мешалки 500-1500 об/мин, в течение не менее 20 мин, при гомогенизации исходного сырья в указанный раствор хлорида натрия вводят натрия ацетат в концентрации 0,01-0,1 М, выделение целевого продукта осуществляют центрифугированием при добавлении с помощью дозирующих устройств полиэтиленгликоля до концентрации последнего 12% в смеси или выделение целевого продукта осуществляют ультрафильтрацией. Кроме того, перед выделением целевого продукта в раствор вводят стабилизатор активности иммуноглобулинов, в частности, в качестве стабилизатора в раствор вводят поливинилпирролидон в концентрации 1-5%.

Сущность изобретения в части способа получения препарата, содержащего иммуноглобулины классов G, A, M, состоит в том, что в качестве исходного сырья используют осадки Б(III), А (II+III) фракции Кона или их смесь в любом соотношении, которые гомогенизируют в 0,3-0,7% растворе хлорида натрия с получением суспензии, которую обрабатывают 1-3% хлороформом при величине рН 4,9-5,6, перемешивают, выдерживают суспензию 30-60 мин, центрифугируют, а затем проводят стадию дополнительного формирования осадка балластных фракций в растворе с ионной силой менее 0,05 при величине рН от 4,5 до 5,6 в течение 12-24 часов с последующим удалением их дополнительным центрифугированием или фильтрацией, а затем выделяют целевой продукт ультрафильтрацией.

Предпочтительно, величину рН 4,9-5,6 устанавливают добавлением к суспензии раствора NaOH или раствора HCL, а перемешивание осуществляют при скорости вращения мешалки 500-1500 об/мин, в течение не менее 20 мин, для лучшей экстракции иммуноглобулинов при гомогенизации исходного сырья в указанный раствор хлорида натрия вводят натрия ацетат в концентрации 0,01-0,1 М, формирование осадка денатурированных белков и неактивных примесей проводят в присутствии солей каприловой кислоты, целевой продукт разливают по флаконам и, как вариант, высушивают из замороженного состояния.

В результате осуществления способа получают комплекс и/или препарат иммуноглобулинов - активную субстанцию, содержащую иммуноглобулины классов G, A, M, с повышенной антихламидийной активностью, стабильную на протяжении более 1 года, а после стерилизующей фильтрации, розлива и, как вариант, лиофилизации, получают препарат для лечения бактериальных и вирусных инфекций с двумя стадиями инактивации вирусов, который не содержит остаточного полиэтиленгликоля, денатурированных белков, а концентрация липидов и липопротеидов (холестерина) составляет менее 0,2 ммоль/л.

Отмеченные показатели качества (количественное содержание липидов и липопротеидов, т.е. холестерина), продукта иммуноглобулинов, приготовленного в соответствии с прототипом и вариантами заявляемого способа, приведены в таблице 1.

Таблица 1
Препарат иммуноглобулина	Холестерин, ммоль/л	Остаточный полиэтиленгликоль
Полученный по прототипу	0,85+0,07	0,35%
Полученный заявляемым способом	0,18+0,02	отсутствует

Продукт, полученный заявляемым способом (вариантами), содержит меньше холестерина, а остаточный полиэтиленгликоль полностью отсутствует.

Оптимальный диапазон рН (от 4,9 до 5,6) на стадии отделения

балластных белков и липопротеидов хлороформом и проведение дополнительной стадии формирования осадка денатурированных белков и неактивных примесей обеспечивают высокое качество целевого продукта, свободного от неактивных примесей, вследствие чего целевой продукт легко фильтруется и потери при осветляющей и стерилизующей фильтрации составляют всего 2-3% против 10-15% у прототипа (см. чертеж).

На чертеже изображена зависимость скорости фильтрации (по вертикали) целевого продукта при осветляющей и стерилизующей фильтрации от величины рН (по горизонтали) на стадии отделения липидов хлороформом.

Из чертежа видно, что наиболее высокая скорость фильтрации целевого продукта лежит в диапазоне рН от 4,9 до 5,6.

Введение в раствор (центрифугат) стабилизатора поливинилпирролидона в оптимальной концентрации перед выделением целевого продукта обеспечивает сохранение титра антител к хламидиям более продолжительное время - в течение более 18 месяцев (1,5 года). Минимальный титр антител в комплексе иммуноглобулинов (активной субстанции), содержащей иммуноглобулины классов G, A, M должен быть не менее 1:100 и сохраняться на протяжении более одного года.

В таблице 2 приведен титр (активность) антител к хламидиям в комплексе иммуноглобулинов - активной субстанции, содержащей иммуноглобулины классов G, A, M, приготовленном по прототипу и по вариантам заявляемого способа

Таблица 2
	При выпуске	Через 3 месяца	Через 6 месяцев	Через 9 месяцев	Через 12 месяцев	Через 15 месяцев	Через 18 месяцев
Прототип	1:100	1:100	1:100	1:100	1:50	1:50	1:25
Варианты заявляемого способа	1:200	1:200	1:200	1:200	1:200	1:100	1:100

Варианты способа производства продуктов, содержащих иммуноглобулины, реализуются следующим образом.

В качестве исходного сырья используют осадки, полученные при фракционировании плазмы спиртовым методом Кона - осадки Б(III), или А(II+III), или их смесь. Осадок помещают в гомогенизатор и заливают 0,3-0,7% раствором хлорида натрия в соотношении 1:10. Для лучшей экстракции иммуноглобулинов в раствор вводят натрия ацетат в концентрации 0,01-0,1 М и гомогенизируют в течение 10-15 мин. После исчезновения видимых частиц осадка с помощью 1 М раствора NaOH или 1 М раствора HCL устанавливают величину рН получаемой суспензии 4,9-5,6 и вводят трихлорметан до концентрации 1-3%. Осуществляют перемешивание суспензии при скорости вращения мешалки 500 - 1500 об/мин в течение не менее 20 мин. Суспензию выдерживают в течение 30-60 мин для инактивации вирусов под влиянием хлороформа. После этого балластные белки и липопротеиды удаляют центрифугированием. Для более полного удаления липидов, липопротеидов и неактивных примесей проводят дополнительную стадию очистки. Для этого в центрифугате снижают ионную силу до 0,05 М, устанавливают рН 4,4-5,6 и оставляют раствор для формирования осадка на 12-18 часов. Для избирательной денатурации липопротеидов и лучшего формирования осадка в раствор целесообразно вводить натрия каприлат в концентрации 0,1-1,0%. Липопротеиды, потерявшие растворимость в растворе с низкой ионной силой, удаляют центрифугированием или фильтрацией. Центрифугат используют для получения целевого продукта концентрированием ультрафильтрацией взаимодействием иммуноглобулинов с полиэтиленгликолем при добавлении последнего с помощью дозирующих устройств до концентрации 12% в смеси.

С целью повышения активности комплекса иммуноглобулинов перед получением целевого продукта в центрифугат вводят стабилизатор, предпочтительно поливинилпирролидон в концентрации 1-5%.

Получают заявляемый комплекс иммуноглобулинов, содержащий иммуноглобулины классов G, A, M - активную субстанцию, которая обладает повышенной антихламидийной активностью, стабильной на протяжении более 1 года.

Комплекс иммуноглобулинов, содержащий иммуноглобулины классов G, A, M подвергают осветляющей, стерилизующей фильтрации, выстаиванию в течение 21 суток при кислом значении рН (вторая стадия инактивации возможно присутствующих вирусов), разливают по флаконам и, как вариант, лиофилизируют. В результате получают препарат для лечения бактериальных и вирусных инфекций с двумя стадиями инактивации вирусов, который не содержит остаточного полиэтиленгликоля, денатурированных белков, а концентрация липидов и липопротеидов составляет менее 0,2 ммоль/л.

Пример 1.

Осадки фракции Кона А(II+III) и Б(III), взятых в соотношении 2:3, общим количеством 15 кг, порциями по 5 кг помещают в гомогенизатор, заливают 10-кратным объемом 0,3% раствора хлорида натрия, содержащего 0,05 М натрия ацетата (50 л на порцию) и гомогенизируют суспензию до исчезновения видимых частиц осадка. Затем с помощью 1 М раствора NaOH или 1 М раствора HCL устанавливают величину рН 4,9 и вводят 1,7 л трихлорметана (хлороформа) до конечной концентрации 3%. Перемешивают смесь при скорости вращения мешалки 500-1500 об/мин в течение 20 минут. Проводят инактивацию возможно присутствующих вирусов, выдерживая суспензию 60 мин и удаляют возможно присутствующие вирусы, липопротеиды и денатурированные белки центрифугированием. Для получения партии 140 л всю процедуру со второй и третьей порциями осадка повторяют. В результате получают центрифугат в количестве 140 л. К центрифугату добавляют равный объем 0,1% раствора каприлата натрия, устанавливают величину рН 4,8 и ионную силу менее 0,05 и выдерживают раствор для формирования осадка в течение 18 часов. Липопротеиды, потерявшие растворимость, удаляют центрифугированием или фильтрацией. Осветленный центрифугат подвергают концентрированию ультрафильтрацией до содержания белка 5,5-6,5%. Вводят стабилизатор - глицин до конечной концентрации 2%, устанавливают величину рН 4,7 и подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Получают целевой продукт - 19 л раствора комплексного иммуноглобулинового препарата.

После выдерживания продукта в течение 21 суток (вторая стадия инактивации возможно присутствующих вирусов), розлива и лиофильного высушивания из замороженного состояния получают препарат для лечения бактериальных и вирусных инфекций с двумя стадиями инактивации вирусов, который не содержит остаточного полиэтиленгликоля, денатурированных белков, с концентрацией холестерина 0,16 ммоль/л.

Пример 2.

Осадок А(II+III), полученный при фракционировании плазмы спиртовым методом Кона, общим количеством 13,5 кг, порциями по 4,5 кг помещают в гомогенизатор, заливают 10-кратным объемом 0,6% раствора хлорида натрия, (45 л на порцию), вводят натрия ацетат в концентрации 0,01 М и гомогенизируют суспензию до исчезновения видимых частиц осадка. Устанавливают величину рН суспензии 5,6 и добавляют 0,5 л трихлорметана (хлороформа) до концентрации 1%. Осуществляют перемешивание суспензии при скорости вращения мешалки 500-1500 об/мин в течение не менее 20 мин. Суспензию выдерживают в течение 30 мин для инактивации вирусов под влиянием хлороформа. После этого балластные белки и липопротеиды удаляют центрифугированием.

Для получения партии в 155 л всю процедуру суспензирования и обработки осадка хлороформом со второй и третьей порциями осадка повторяют. В результате получают 155 л центрифугата, к которому добавляют стабилизатор - поливинилпирролидон в количестве 1,6 кг (1%). Центрифугат и раствор полиэтиленгликоля подают на центрифугу с помощью дозирующего устройства до концентрации последнего 12% в смеси.

Получают заявляемый комплекс иммуноглобулинов, содержащий иммуноглобулины классов G, A, M - активную субстанцию, которая не содержит остаточного полиэтиленгликоля, денатурированных белков, а концентрация липидов и липопротеидов (холестерина) составляет менее 0,2 ммоль/л, обладает повышенной антихламидийной активностью, стабильной на протяжении 1,5 лет.

В соответствии с заявляемыми способами начато экспериментальное производство лекарственного средства для лечения вирусных и бактериальных инфекций, в качестве лекарственного средства используют препарат иммуноглобулинов, выделенный из плазмы крови человека с торговым названием «Иммуноглобулиновый комплексный препарат», представляющий собой сухую массу во флаконе, содержащую 300 мг иммуноглобулинов G, A, M. Препарат производится по фармакопейной статье предприятия ФСП №42-0194-6953-05.

Кроме того, в соответствии с заявляемыми способами начато экспериментальное производство лекарственного средства для терапии урогенитального хламидиоза у женщин (препарат «Кипферон, суппозитории»), которое выпускается по ФСП 42-0137-0365-00. В качестве активных компонентов (субстанций) оно содержит интерферон и комплекс иммуноглобулинов G, A, M, являющийся в этом случае компонентом лекарственного средства. Субстанция иммуноглобулинов представляет собой пастообразную густую массу, содержащую комплекс иммуноглобулинов G, A, M, выпускаемую по ФСП №42-0194-6954-05.

Таким образом в результате изобретения созданы варианты универсального эффективного способа выделения комплекса иммуноглобулинов из осадков Б(III) или А(II+III), получение препарата для лечения бактериальных и вирусных инфекций и расширение арсенала указанных способов и препаратов.

При этом обеспечены расширение сырьевой базы производства, увеличение степени экстракции иммуноглобулинов G, A, M и степени очистки целевого продукта, уменьшение потерь целевого продукта, увеличение антибактериальной и антивирусной, в частности антихламидийной активности в 2-4 раза, сохранение антибактериальной и антивирусной активности на протяжении 1,5 лет в форме комплекса иммуноглобулинов и сохранении активности на протяжении трех лет в форме сухого препарата иммкноглобулинов, уменьшении токсического действия хлороформа на персонал.

Литература

1. Сапожникова B.C. Разработка и изучение свойств антистафилококкового и противостолбнячного иммуноглобулинов для внутривенного введения.: Автореф. дисс канд.биол. наук. Л., 1990, 20 с.

2. Алешкин В.А., Лютов А.Г, Афанасьев С.С.и др. Место иммуноглобулиновых препаратов в лечении и реабилитации инфекционных больных. // Новые лекарственные препараты. М., 2003, в.4, с.6-32.

3. Русанов В.М., Скобелев Л.И. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови. М., Медицина, 1983, с.75-78.

4. ФСП №42-0194-6953-05.

5. ФСП 42-0504-6737-05.

6. ФСП-42-0381-3757-02.

7. SU 1815820 (Алешкин В.А., Борисова Г.В., Холчев Н.В., Пономарева A.M., Быко-Янко Г.В.)

8. Патент RU 2060034 (Алешкин В.А., Борисова И.В., Быко-Янко Г.В.)

9. Патент RU 2073525, Алешкин В.А., Борисова И.В., Новикова Л.И.).

10. Патент RU 2084229 (Алешкин В.А., Борисова И.В., Быко-Янко Г.В.).

11. Патент RU 2158136.

12. Патент RU 2189833 (Зорик А.В., Алешкин В.А., Лютов А.Г., Борисова И.В.)

13. Патент RU 2199343 (Анастасиев В.В. и др.)

14. Патент RU 2252780 (Аваков А.Э., Анастасиев В.В., Пискарева Ю.К.)

15. Патент RU 2261112 (Антонян Р., Былов К.В.)

16. Патент RU 2255766, Алешкин В.А., Новикова Л.И., Афанасьев С.С., Борисова И.В., Зуева М.М., Зорик А.В.).

17. Патент RU 2261112.

1. Способ получения продукта, содержащего иммуноглобулины G, A, M, при котором в качестве исходного сырья используют осадки Б(III), А(II+III) фракции Кона или их смесь в любом соотношении, которые гомогенизируют в 0,3-0,7%-ном растворе хлорида натрия с получением суспензии, которую обрабатывают 1-3%-ным хлороформом при величине рН 4,9-5,6, перемешивают, выдерживают суспензию 30-60 мин, центрифугируют, а затем выделяют целевой продукт удалением избытка жидкости.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что величину рН 4,9-5,6 устанавливают добавлением к суспензии раствора NaOH или раствора HCL, а перемешивание осуществляют при скорости вращения мешалки 500-1500 об/мин в течение не менее 20 мин.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что при гомогенизации исходного сырья в указанный раствор хлорида натрия вводят натрия ацетат в концентрации 0,01-0,1 М.

4. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что выделение целевого продукта осуществляют центрифугированием при добавлении с помощью дозирующих устройств полиэтиленгликоля до концентрации последнего 12% в смеси.

5. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что выделение целевого продукта осуществляют ультрафильтрацией.

6. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что перед выделением целевого продукта в раствор вводят стабилизатор активности иммуноглобулинов.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора в раствор вводят поливинилпирролидон в концентрации 1-5%.

8. Способ получения продукта, содержащего иммуноглобулины G, A, M, при котором в качестве исходного сырья используют осадки Б(III), А(II+III) фракции Кона или их смесь в любом соотношении, которые гомогенизируют в 0,3-0,7%-ном растворе хлорида натрия с получением суспензии, которую обрабатывают 1-3%-ным хлороформом при величине рН 4,9-5,6, перемешивают, выдерживают суспензию 30-60 мин, центрифугируют, а затем проводят стадию дополнительного формирования осадка балластных фракций в растворе с ионной силой менее 0,05 при величине рН от 4,4 до 5,6 в течение 12-24 ч с последующим удалением их дополнительным центрифугированием или фильтрацией, а затем выделяют целевой продукт ультрафильтрацией.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что величину рН 4,9-5,6 устанавливают добавлением к суспензии раствора NaOH или раствора HCL, а перемешивание осуществляют при скорости вращения мешалки 500-1500 об/мин в течение не менее 20 мин.

10. Способ по любому из пп.8 и 9, отличающийся тем, что для лучшей экстракции иммуноглобулинов при гомогенизации исходного сырья в указанный раствор хлорида натрия вводят натрия ацетат в концентрации 0,01-0,1 М.

11. Способ по любому из пп.8 и 9, отличающийся тем, что формирование осадка денатурированных белков и неактивных примесей проводят в присутствии солей каприловой кислоты.

12. Способ по любому из пп.8 и 9, отличающийся тем, что целевой продукт разливают по флаконам и высушивают из замороженного состояния.