Способ получения конъюгата фрагмента альфа-фетопротеина человека с ципрофлоксацином


 


Владельцы патента RU 2431639:

Автономная некоммерческая организация "Институт Молекулярной Диагностики" (АНО "ИнМоДи") (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения конъюгата целевого белка с ципрофлоксацином, специфически проникающих в клетки, несущие рецептор альфа-фетопротеина. Способ заключается в проведении реакции конъюгирования путем смешивания в течение 5 мин при комнатной температуре ципрофлоксацина с карбодиимидом в соотношении карбодиимид: ципрофлоксацин 1:1, введении полученной в результате реакции конъюгирования реакционной смеси в раствор фрагмента альфа-фетопротеина человека путем добавления к раствору фрагмента альфа-фетопротеина человека реакционной смеси с последующей инкубацией полученного раствора в течение 20-30 мин при перемешивании и контроле показаний рН. Затем побочные продукты, полученные в результате введения реакционной смеси в раствор фрагмента альфа-фетопротеина человека, удаляют диализом против фосфатно-солевого буфера, рН 8.0. Изобретение позволяет расширить области применения способов получения конъюгатов альфа-фетопротеина человека с ципрофлоксацином. 1 ил.

 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для получения конъюгатов целевого белка с ципрофлоксацином, специфически проникающих в клетки, несущие рецептор альфа-фетопротеина (АФП).

Одним из основных направлений современной фармакологии является направленный транспорт лекарственных препаратов к специфическим локусам организма человека. Преимуществом данного подхода является возможность снижения эффективной дозы лекарственного препарата, так как вместо пассивной диффузии лекарственный препарат направленно доставляется к клеткам-мишеням. Принципиальным для данного подхода является создание химически или биологически сконструированных макромолекул, состоящих из векторной части и неспецифической части, являющейся лекарственным препаратом.

Известны технические решения, в которых описаны конъюгаты, например конъюгат пептидного препарата и цитотоксического агента, способный целенаправленно проникать в опухолевую клетку, представляющий собой препарат, ковалентно связанный с цитотоксическим агентом в молярном соотношении от 1:1 до 1:10, при этом в качестве цитотоксического агента содержит вещество, выбранное из группы паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин, дауномицин, карминомицин, винкристин, винбластин, мелфалан, метотрексат, цитарабин [RU 2285537 С1, А61К 38/12, 20.10.2006].

Недостатком этого решения является относительно узкая область использования, поскольку при его реализации не реализуется возможность получения конъюгатов целевого белка с ципрофлоксацином, специфически проникающих в клетки, несущие рецептор альфа-фетопротеина.

Наиболее близким по своей сущности к предлагаемому является способ получения конъюгата, основанный на том, что осуществляют реакцию связывания между концевой альдегидной группой или карбоксильной группой, образующейся за счет селективного окисления концевой альдегидной группы, или активированной карбоксильной группой, полученной превращением указанной карбоксильной группы молекулы гидроксиалкилкрахмала и функциональной группой низкомолекулярного вещества, выбранной из группы, состоящей из аминогруппы, карбоксильной группы, тиоловой группы и гидроксильной группы, которая является реакционноспособной по отношению к этой альдегидной группе или карбоксильной группе или происходящей от нее активированной карбоксильной группе молекулы гидроксиалкилкрахмала, и при этом связь, образующуюся непосредственно при реакции связывания, в случае необходимости модифицируют за счет дальнейшей реакции [RU 2327702 С1, С08В 31/12, 27.06.2008].

Недостатком известного способа является относительно узкая область применения, поскольку способ может быть использован в основном для конъюгата гидроксиалкилкрахмала и низкомолекулярного вещества и не может быть использован для получения востребованного конъюгата фрагмента альфа-фетопротеина (АФП) человека с ципрофлоксанином.

Требуемый результат заключается в расширении области применения за счет обеспечения получения конъюгата фрагмента альфа-фетопротеина (АФП) человека с ципрофлоксанином, относящегося к конъюгату целевого белка с ципрофлоксацином, специфически проникающим в клетки, несущие рецептор альфа-фетопротеина.

Требуемый результат достигается тем, что в способе, основанном на проведении реакции конъюгирования, полученную в результате реакции конъюгирования реакционную смесь вводят в раствор фрагмента альфа-фетопротеина (АФП) человека, а полученные при этом побочные продукты удаляют диализом, при этом реакцию конъюгирования проводят путем активации карбоксильной группы ципрофлоксацина с использованием карбодиимида.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что реакцию конъюгирования проводят путем смешивания в течение 5 мин при комнатной температуре ципрофлоксацина с карбодиимидом в соотношении карбодиимид: ципрофлоксацин 1:1.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что введение реакционной смеси в раствор фрагмента АФП человека осуществляют путем добавления к раствору фрагмента АФП человека реакционной смеси с последующей инкубацией полученного раствора в течение 20-30 мин при перемешивании и контроле показаний рН.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что побочные продукты, полученные в результате введения реакционной смеси в раствор фрагмента АФП человека, удаляют диализом против фосфатно-солевого буфера, рН 8.0.

На чертеже представлены зависимости, характеризующие эффективность цитотоксического действия конъюгата ципрофлоксацина с фрагментом АФП человека на клетки аденокарциномы яичника.

Осуществляется предложенный способ получения конъюгата фрагмента АФП человека с ципрофлоксацином следующим образом.

Ципрофлоксацин является антибактериальным препаратом широкого спектра действия. Он относится к фторхинолонам второго поколения и разрешен для клинического применения с начала 80-х годов. Механизм его действия включает ингибирование двух жизненно важных ферментов - ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, что приводит к нарушению синтеза ДНК.

Пример получения конъюгата фрагмента АФП человека с ципрофлоксацином.

Активацию карбоксильной группы ципрофлоксацина проводили с использованием карбодиимида в соотношении карбодиимид:ципрофлоксацин 1:1 непосредственно перед реакцией конъюгирования в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем реакционную смесь добавляли к раствору белка и инкубировали в течение 20-30 мин при перемешивании, контролируя показания рН. Побочные продукты реакции удаляли диализом против фосфатно-солевого буфера, рН 8.0.

Анализ количества молекул ципрофлоксацина в молекуле белка проводили, измеряя прирост интенсивности поглощения при 280 нм. Ципрофлоксацин имеет максимум поглощения при данной длине волны.

Определение цитотоксической активности конъюгата фрагмента АФП человека с ципрофлоксацином проводили с использованием клеток аденокарциномы яичника человека линии SKOV3. В качестве контроля были использованы лимфоциты периферической крови.

Клетки за 1 сутки до эксперимента рассевали в 96-луночные планшеты для микротитрования (Corning, США) в среде для культивирования в плотности 5000-7000 клеток в лунку. Раствор ципрофлоксацина и конъюгата стерилизовали фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм (Millipore Corporation, США) и добавляли к клеткам. Инкубировали клетки в стандартных условиях 72 ч, после чего определяли их выживаемость.

Для количественной оценки выживаемости клеток при инкубации в среде, содержащей цитотоксический агент, использовали МТТ-тест согласно методике [Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. // J.Immunol. Meth. - 1983. - №65. - P.55-63]. Выживаемость клеток в контрольной и в обработанной препаратами группах определяли через 72 ч инкубации. Для этого за 2-4 ч до окончания инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора МТТ (метилтиазолилдифенилтетразолий бромид; Sigma, США) в среде для культивирования клеток до конечной концентрации 200 мкг/мл. По прошествии времени инкубации среду над клетками полностью удаляли, и образовавшиеся микрокристаллы формазана растворяли, добавляя в каждую лунку по 0,1 мл диметилсульфоксида. Через 5 мин измеряли поглощение (λ=540 нм) в каждой лунке с помощью многоканального спектрофотометра (Bio-Rad, США). Рассчитывали степень влияния на пролиферацию клеток цитотоксических препаратов в исследованных концентрациях, принимая за 100% поглощение в соответствующих контрольных лунках. ЦТА препарата выражали в единицах IC50 (молярная концентрация препарата, вызывающая гибель 50% клеток).

Статистическую достоверность полученных данных определяли, используя t-критерий Стьюдента с помощью компьютерной программы Origin™ 6.0 (Microcal Software Inc., США). Как статистически значимый рассматривали уровень p<0,05.

Результаты эксперимента показали, что цитотоксическое действие конъюгата ципрофлоксацина с фрагментом АФП человека на клетки аденокарциномы яичника человека линии SKOV3 на несколько порядков превышает цитотоксическое действие несвязанного с белком ципрофлоксацина (см. чертеж).

Таким образом, благодаря модификации известных способов достигается требуемый результат, заключающийся в расширении области применения, поскольку обеспечивается получение конъюгата фрагмента АФП человека с ципрофлоксанином, специфически проникающих в клетки, несущие рецептор альфа-фетопротеина.

Способ получения конъюгата фрагмента альфа-фетопротеина человека с ципрофлоксацином, основанный на проведении реакции конъюгирования, отличающийся тем, что полученную в результате реакции конъюгирования реакционную смесь вводят в раствор фрагмента альфа-фетопротеина человека, а полученные при этом побочные продукты удаляют диализом, при этом реакцию конъюгирования проводят путем смешивания в течение 5 мин при комнатной температуре ципрофлоксацина карбоксильной группы с карбодиимидом в соотношении карбодиимид: ципрофлоксацин 1:1, введение полученной в результате реакции конъюгирования реакционной смеси в раствор фрагмента альфа-фетопротеина человека осуществляют путем добавления к раствору фрагмента альфа-фетопротеина человека реакционной смеси с последующей инкубацией полученного раствора в течение 20-30 мин при перемешивании и контроле показаний рН, а удаление побочных продуктов, полученных в результате введения реакционной смеси в раствор фрагмента альфа-фетопротеина человека, осуществляют диализом против фосфатно-солевого буфера, рН 8.0.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рецепторам, сопряженным с G-белками (GPCR), и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых белков, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к рекомбинантному химерному белку фактора ингибирования нейтрофилов и гиругена (TNHH), кодирующей его полинуклеотидной последовательности, рекомбинантному вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, микроорганизму, трансформированному указанным вектором, и фармацевтической композиции, содержащей указанный рекомбинантный химерный белок фактора ингибирования нейтрофилов и гиругена.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой иммуногенный гибридный полипептид для профилактики или лечения ожирения. .
Изобретение относится к области ветеринарии. .

Изобретение относится к медицине и касается применения антагонистов окситоцина или их фармацевтически приемлемых солей для изготовления лекарственного средства для улучшения рецептивности матки при вспомогательной репродукции.

Изобретение относится к соединениям формулы (I) и их фармацевтически приемлемым солям, которые применяют для изготовления лекарства для лечения или профилактики состояния, при котором полезно ингибирование карбоксипептидазы U.
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к лечению инфекционных болезней, и может быть использовано для лечения бактериальной инфекции. .

Изобретение относится к лизобактинамидам и способам их получения, а также к их применению для приготовления лекарственных средств, предназначенных для лечения и/или профилактики бактериальных инфекционных заболеваний
Наверх