Способ производства мультиферментного препарата

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению мультиферментных препаратов, и может быть использовано на предприятиях пищевой промышленности в качестве получения препаратов, направленных на снижение токсического действия алкоголя и продуктов его метаболизма. Способ предусматривает культивирование дрожжей в биореакторе на мелассной среде с добавлением молочной сыворотки в количестве 50% от общего объема питательной среды. Клетки дрожжей отделяют от культуральной жидкости центрифугированием и подвергают трансформации на шаровой мельнице при температуре 25±2°С при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,3 ч. Трансформированные клетки дрожжей экстрагируют 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С с последующим центрифугированием с получением супернатанта. Полученный супернатант подвергают двукратной обработке охлажденным раствором ацетона с получением осадка. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде и подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 3 ч при температурем +4±2°С и центрифугируют с получением супернатанта. Полученный супернатант подвергают микрофильтрации на мембранах с размерами пор 0,22 мкм и удаляют балластные белки с помощью ионообменной хроматографии на колонке с КМ- и ДЭАЭ-целлюлозой. Изобретение позволяет получить этанол-окисляющий мультиферментный препарат с высокой степенью чистоты и высокой каталитической активностью и повысить выход биомассы дрожжей.

 

Изобретение относится к области получения мультиферментных препаратов, в частности получению этанол-окисляющего мультиферментного препарата, и может быть использовано на предприятиях биотехнологической промышленности в качестве получения препаратов, направленных на снижение токсического действия алкоголя и продуктов его метаболизма.

Известен способ получения ферментного препарата алгкогольдегидрогеназы, культивирование дрожжей при аэрации в периодическом режиме на синтетической питательной среде, содержащие источники азота, фосфора, минеральные соли и 2% метилового спирта в качестве источника углерода, а также выделение фермента (Metra, R.J. Pyridine Nucleotide-Linked Oxidation of methanol in methanol-assimilating yeasts.- Bacteriology. - 1975. - V.3. - P.1165-1167). Однако данный способ не позволяет получить из дрожжей ферментный препарат, специфичный к алкоголю и ацетальдегиду высокой каталитической активности. Кроме того, он не может быть использован в пищевой промышленности, в связи с тем, что не отвечает требованиям по микробиологической чистоте ГосФармакопеи.

Известен также другой способ получения ферментного препарата из дрожжей, предусматривающий культивирование дрожжей в проточных условиях, где в качестве источника углерода используют этиловый спирт, после чего дрожжи подвергают растиранию на стеклянных бусах и центрифугированию с последующей очисткой хроматографическим методом на ДЕАЭ-целлюлозе (авторское свидетельство SU 763464, 15.09.1980). Это техническое решение является наиболее близким к заявленному по совокупности существенных признаков (прототип). Недостатками является то, что данный способ позволяет выделить из дрожжей один фермент с низкой каталитической активностью к субстрату, кроме того, полученный препарат загрязнен микрофлорой и балластными белками.

Технической задачей изобретения является выделение алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы с высокой каталитической активностью в одном препарате, повышение их каталитической активности, предназначенной для применения в биотехнологической промышленности.

Технический результат достигается за счет культивирования дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae в биореакторе на питательной среде, состоящей из мелассы и молочной сыворотки (соотношение 1:1) при температуре процесса 30±2°С, продолжительностью 18 ч, при скорости аэрации воздуха 30±0,2 л/ч и скорости перемешивания 500±5 об/мин. При меньшем содержании молочной сыворотки наблюдается увеличения выхода биомассы дрожжей и снижается каталитическая активность ферментного комплекса состоящего из АДГ и АЛДГ. При массовой доле молочной сыворотки в питательной среде более 50% не наблюдается увеличение выхода биомассы дрожжей и целевого продукта. По окончании процесса культивирования дрожжи отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 15±1 мин при 15000±100 об/мин и промывают дистиллированной водой. При этом каталитическая активность ферментного комплекса составляет для АДГ 20±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,3±0,02 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей сыворотку.

Для более полного извлечения дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 80 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.

Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последущим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 15000 об/мин в течение 40 мин и проводят ультрафильтрацию супернатантана при температуре 25±2°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм при температуре плюс 19±2°С, давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.

Очистку фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 10 см3/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 25,4 и 4,3% соответственно.

Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого ферментный комплекс, состоящего из АДГ и АЛДГ, наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет 90,3%.

С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящего из АДГ и АЛДГ и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. С этой целью ферментный комплекс, содержащий АДГ и АЛДГ, коферменты НАД и НАДН добавляют в 9% водный раствор агарозы и оставляют при температуре 2±2°С на 1 час, после застывания продукта его подвергают гомогенизации.

В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 1290 Е/мг белка и АЛДГ 39,0 Е/мг белка.

Пример 1. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивируют на питательной среде, содержащей 50% мелассы и 50% молочной сыворотки в периодическом ферментере с рабочим объемом 5,0 л. Для предотвращения спенивания в среду добавляют силиконовое масло в количестве 0,01%. Аэрацию воздуха ведут со скоростью 30±0,2 л/ч, скорость перемешивания питательной среды и биомассы составляет 500±5 об/мин. Процесс культивирования ведут при температуре 30±2°С в течение 18 ч.

По окончании процесса культивирования дрожжи отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 20±1 мин при 12000±100 об/мин и промывают дистиллированной водой. При этом каталитическая активность ферментного комплекса составляет для АДГ 20±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,2±0,01 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей молочную сыворотку.

Для более полного извлечения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 80 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.

Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин и проводят ультрафильтрацию супернатанта при температуре 25°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм при температуре плюс 19±2°С, давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.

Очистку ферментной фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 15 см3/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 18,2 и 3,2% соответственно.

Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого этанол-окисляющую систему наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой.

Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет 90,5%.

С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают комплекс полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. Полимеризацию ведут при температуре плюс 2±2°С в течение 1 ч, после чего продукт подвергают гомогенизации.

В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 1290 Е/мг белка и АЛДГ 39,0 Е/мг белка.

Пример 2. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивируют согласно примеру 1. По окончании процесса культивирования дрожжи отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 30±1 мин при 10000±100 об/мин и промывают дистиллированной водой. При этом каталитическая активность ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет для АДГ 16±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,15±0,01 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей молочную сыворотку.

Для более полного извлечения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 100 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.

Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 12000 об/мин в течение 60 мин и проводят ультрафильтрацию супернатанта при температуре 26±2°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,40 мкм при температуре плюс 19±2°С давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.

Очистку ферментной фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 10 см3/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 20,7 и 3,8% соответственно.

Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки этанол-окисляющей системы составляет 83,5%.

С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают комплекс полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. Полимеризацию ведут при температуре плюс 2±2°С в течение 1 ч, после чего продукт подвергают гомогенизации.

В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 780,0 Е/мг белка и АЛДГ 28,0 Е/мг белка.

Пример 3. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивируют согласно примеру 1. При этом каталитическая активность ферментного комплекса для АДГ 18,0±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,2±0,01 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей молочную сыворотку.

Дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 60 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.

Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 12000 об/мин в течение 60 мин и проводят ультрафильтрацию супернатанта при температуре 24±2°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм при температуре плюс 19±2°С, давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.

Очистку ферментной фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 15 см3/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 18,2 и 3,2% соответственно.

Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого этанол-окисляющую систему наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет 83,5%.

С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают комплекс полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. Полимеризацию ведут при температуре плюс 2±2°С в течение 1 ч, после чего продукт подвергают гомогенизации.

В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 830,0 Е/мг белка и АЛДГ 25,0 Е/мг белка.

Предлагаемый способ позволяет получить этанол-окисляющий мультиферментный препарат с высокой степенью чистоты и высокой каталитической активностью по алкогольдегидрогеназе (в 4,0 раза выше чем в прототипе) и альдегиддегидрогеназе. Также разработанная технология позволяет повысить выход биомассы дрожжей и использовать этанол-окисляющий мультиферментный препарат в пищевой промышленности.

Способ производства мультиферментного препарата, предусматривающий культивирование дрожжей в биореакторе на мелассной среде с добавлением молочной сыворотки в количестве 50% от общего объема питательной среды, отделение клеток дрожжей центрифугированием, трансформацию дрожжей на шаровой мельнице при температуре 25±2°С при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч, экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С с последующим центрифугированием с получением супернатанта, двукратную обработку полученного супернатанта охлажденным раствором ацетона с получением осадка, растворение осадка в дистиллированной воде, диализ против дистиллированной воды в течение 3 ч при температуре плюс 4±2°С, центрифугирование с получением супернатанта с последующей микрофильтрацией на мембранах с размерами пор 0,22 мкм и удалением балластных белков с помощью ионообменной хроматографии на колонке с КМ- и ДЭАЭ-целлюлозой.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности. .

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, и может быть использовано в бактериотерапии и бактериопрофилактике инфекций разнообразной этиологии и локализаций.

Изобретение относится к медицине и касается цитозольной изоцитратдегидрогеназы, ее гена и их использования в лечении ожирения, гиперлипидемии и жировой инфильтрации печени.

Изобретение относится к области биохимии и генной инженерии и может быть использовано в производстве амидированных форм гормонов и других пептидов, применяемых в медицине и сельском хозяйстве.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно микробиологическому получению 1,2-кортикостероидов. .
Изобретение относится к биотехнологии, может найти применение в биохимии, при определении активностей в биологических жидкостях. .
Изобретение относится к биотехнологии и медицине (а именно, к онкологии) и может быть использовано для создания современной технологии получения противоопухолевого средства и для химиотерапии злокачественных новообразований

Изобретение относится к ферментному электроду, включающему частицы углерода, несущие глюкозодегидрогеназу (GDH) с флавинадениндинуклеотидом (FAD) в качестве кофермента; и электродный слой, контактирующий с указанными частицами углерода, причем частицы углерода и электродный слой состоят из частиц углерода с диаметром частицы не более 100 нм и удельной поверхностью по меньшей мере 200 м2 /г

Изобретение относится к области биохимии

Изобретение относится к биотехнологии. Представлены ферменты: гидрогеназа и дегидрогеназа, выделенные из Thermococcus onnurineus NA1 и имеющие последовательности, приведенные в описании, а также кодирующие их гены. Описан вектор, содержащий указанные гены, объединенные в кластер FDH2-MFH2-MNH2. Описана клетка-хозяин, содержащая указанный вектор. Предложены способы получения водорода, включающие следующие стадии: приготовления среды в сосуде для культивирования; подачи формиата в газовую фазу, присутствующую в сосуде для культивирования; культивирования рекомбинантной клетки-хозяина или штамма T. onnurineus в сосуде для культивирования; извлечения водорода из сосуда для культивирования. Изобретение позволяет наиболее эффективно получать водород микробиологическим способом в среде, содержащей формиат в газовой фазе. 8 н. и 5 з.п. ф-лы, 14 ил., 7 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области химии. Предложено применение ферментного препарата, который катализирует разложение формальдегида, для уменьшения содержания формальдегида в смоле, содержащей формальдегид, причем смола представляет собой сшивающий агент, подходящий для обработки текстильных материалов, причем ферментный препарат представляет собой формальдегиддисмутазу, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, в которой изолейцин в положении 301 замещен лейцином, и фенилаланин в положении 93 замещен аланином. Изобретение может быть использовано в текстильной и деревообрабатывающей промышленности. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 ил., 15 табл., 16 пр.

Предложены варианты бактерий Escherichia coli, являющихся продуцентами янтарной кислоты. Бактерия Escherichia coli модифицирована таким образом, что гены асkА, pta, рохВ, ldhA, adhE, ptsG в ней инактивированы, экспрессия генов galP и glk усилена, и бактерия обладающий активностью пируват карбоксилазы. Также предложен вариант бактерии Escherichia coli, обладающий инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, ptsG, iclR, усиленной экспрессией генов galP и glk, и активностью пируват карбоксилазы. Также предложен вариант бактерии Escherichia coli, обладающий инактивированными генами ackA, pta, рохВ, ldhA, adhE, ptsG, усиленной экспрессией генов galP и glk, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируват карбоксилазы. Также предложен вариант бактерии Escherichia coli, обладающий инактивированными генами асkА, pta, рохВ, ldhA, adhE, ptsG, iclR, усиленной экспрессией генов galP и glk, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируват карбоксилазы. Также предложен вариант бактерии Escherichia coli, обладающий инактивированными генами асkА, pta, рохВ, IdhA, adhE, ptsG, pflB, усиленной экспрессией генов galP и glk, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируват карбоксилазы. Также предложен вариант бактерии Escherichia coli, обладающий инактивированными генами асkА, pta, рохВ, ldhA, adhE, ptsG, pflB, iclR, усиленной экспрессией генов galP и glk, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируват карбоксилазы. Предложен способ получения янтарной кислоты с использованием указанных вариантов. Группа изобретений обеспечивает увеличение выхода янтарной кислоты. 7 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения трансформантов дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующих молочную кислоту. Предложен трансформант, несущий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%. Также предложен трансформант, несущий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, в котором инактивирован или делетирован один или несколько генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза этанола. Предложен трансформант, несущий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus, или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, и ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus plantarum или Lactobacillus pentosus. Предложен трансформант, несущий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%, и ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus plantarum или Lactobacillus pentosus, в котором инактивирован или делетирован один или несколько генов, кодирующих ферменты, участвующие в пути биосинтеза этанола. Также предложены варианты способа получения указанных трансформантов и способ микробиологического синтеза молочной кислоты. Группа изобретений обеспечивает эффективную продукцию молочной кислоты при небольшой концентрации побочного продукта. 9 н. и 4 з.п. ф-лы, 10 ил., 8 пр.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к новым полипептидам из Bacillus methanolicus, обладающим активностью алкогольдегидрогеназы, в том числе метанолдегидрогеназы. Указанные полипептиды характеризуются аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 2, 4, 6. Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим эти полипептиды. Нуклеотидные последовательности указанных молекул нуклеиновой кислоты представлены в SEQ ID NO: 1, 3, 5. Изобретение относится к векторам экспрессии, содержащим эти молекулы нуклеиновой кислоты. Изобретение также относится к прокариотическим микроорганизмам-хозяинам для экспрессии указанных полипептидов алкогольдегидрогеназ. Настоящее изобретение позволяет получать новые полипептиды из Bacillus methanolicus с активностью алкогольдегидрогеназы, в том числе метанолдегидрогеназы. 4 н. и 5 з.п. ф-лы,13 ил., 3 табл., 18 пр.

Группа изобретений относится к получению 2,4-дигидроксимасляной кислоты (2,4-ДГМ). Предложен способ получения 2,4-ДГМ, включающий первую стадию превращения малата в 4-фосфомалат с использованием фермента, способного осуществить подобное превращение, вторую стадию превращения 4-фосфомалата в малат-4-полуальдегид с использованием фермента, способного осуществить подобное превращение, и третью стадию превращения малат-4-полуальдегида в 2,4-ДГМ с использованием фермента, способного осуществить подобное превращение. При этом на первой стадии используют фермент, который имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 43 и SEQ ID No. 45. На второй стадии используют фермент, который имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 66 и SEQ ID No. 231. На третьей стадии используют фермент, который имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 74, SEQ ID No. 76, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 225 и SEQ ID No. 227. Предложены также варианты ферментов, используемых в способе, варианты нуклеиновых кислот, кодирующих соответствующие ферменты, варианты химерных генов для трансформации микроорганизма-хозяина и экспрессии в этом микроорганизме соответствующего фермента, варианты вектора экспрессии, варианты микроорганизма-хозяина, экспрессирующего соответствующий фермент. 19 н. и 12 з.п. ф-лы, 5 ил., 16 табл.,12 пр.
Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии
Наверх