Обогащенная питательная среда для выращивания легионелл

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для жизнедеятельности легионелл. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота с содержанием 0,10-0,14% аминного азота, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, активированный уголь, железо сернокислое закисное 7-водное, L-цистеина гидрохлорид, агар микробиологический и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки выращивания легионелл. 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, именно к получению питательных сред для выращивания легионелл.

Известна питательная среда для выращивания легионелл, основой которой является мясная вода до 1000,0 мл; пептон ферментативный 10,0 г; натрия хлорид 5,0 г; кровь 10,0 г; агар-агар 15,0-20,0 г, рН 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°C (М.С.Поляк; В.И.Сухаревич; М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 64-65; С. 269).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда, содержащая, г/л: ферментативный гидролизат легкого свиньи 260,0; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2; активированный уголь 2,0; L-цистеина гидрохлорид 0,4; эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов 2,5; агар микробиологический 8,5; дистиллированная вода до 1 л (Патент РФ №2412240. Опубл. 20.02.2011. Бюл. №5).

Недостатком данной среды является относительно высокая себестоимость.

Целью настоящего изобретения является конструирование качественной питательной среды животного происхождения, которая обеспечивает ростовые свойства легионелл.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота; 0,01 М калий фосфатный буфер (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный), а также активированный уголь; L-цистеин гидрохлорид; дистиллированную воду; агар микробиологический, с добавлением в среду в качестве стимулирующей добавки - железа сернокислого закисного 7-водного при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат эритромассы крупного
рогатого скота (0,10-0,14% аминного азота)	170,0-210,0
Калий фосфорнокислый 1-замещенный	0,63-1,03
Калий фосфорнокислый 2-замещенный
3-водный	0,96-1,36
Железо сернокислое закисное 7-водное	0,18-0,22
Активированный уголь	1,0-3,0
L-цистеин гидрохлорид	0,2-0,6
Агар микробиологический	8,0-12,0
Дистиллированная вода	до 1 л

Биологическая ценность эритромассы крупного рогатого скота состоит в наличии в среднем 95% протеина и макроэлементов, мг/кг: калия 0,12%, магния 0,04%; серы 0,02%; хлора 0,15%; фтора 0,8; железо находится в крови в виде органического соединения в молекуле гемоглобина, содержание его в крови равно 50-60 мг%, содержание витаминов, мг/кг: каротина 2,0; витамина B₁ 1,6; витамина В₂ 8,0; пантотеновой кислоты 55; витамина В₅ 3,0; содержание аминокислот, г/кг: аргинина 8,0; гистидина 3,0; лейцина 11,0; изолейцина 9,0; фенилаланина 7,0; треонина 6,0; валина 10,0; микроэлементов, мг/кг: цинка 14,0; марганца 0,8; меди 0,8; кобальта 0,07 (И.В.Петрухин. Корма и кормовые добавки. М.: Росагропромиздат, 1989. С. 39-44; 48).

Железо сернокислое закисное 7-водное ГОСТ 4148-78. Железо (II) сульфат. Показатели качества: хч, чда, ч. Массовая доля основного вещества ≥99,0% (Химические реактивы и высокочистые вещества. Каталог. / О.А.Гольдина, Ю.С.Кузнецова, Т.Г.Иванова и др. - 3-е изд., перераб. и доп. М.: Химия, 1990. С. 212). В ходе многочисленных экспериментов первых исследователей по культивированию легионелл было обнаружено, что важнейшими факторами роста легионелл являются как аминокислоты, так и ионы железа (Легионеллезная инфекция / Н.Д.Темежникова, И.С.Тартаковский. М.: Медицина, 2007. - С.42; 120).

Включение в состав среды 0,01 М калий фосфатного буфера (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1 замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный) обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они малотоксичны. Кроме того, HPO₄ компонент нуклеиновых кислот, фосфолипидов, нуклеотидов (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. - М., 1989).

Ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота является основой питательной среды ввиду присутствия в нем 95% протеина, а это значит содержание большого количества витаминов, макро- и микроэлементов, железа, а также аминокислот, которые играют огромную роль в жизнедеятельности любых микроорганизмов.

При приготовлении питательной среды используют только дистиллированную воду, без применения растворов, содержащих ионы натрия, в виду их губительного действия на легионеллы.

Сочетанное применение указанных компонентов обеспечивает получение чистых культур сплошного роста через 24 ч при посеве 100 м.к.

В отличие от прототипа предлагаемая среда обеспечивает оптимальные условия для размножения легионелл за 24 ч, а получение гидролизата осуществляется за 4,5 ч.

Приготовление ферментативного гидролизата эритроцитарной массы крупного рогатого скота.

Размороженную эритроцитарную массу крупного рогатого скота в количестве 250,0 мл вливают в 3-литровый стеклянный баллон, заливают питьевой водой 1,750 л, подщелачивают 20% раствором гидроокиси калия до рН 8,2 в количестве 13 мл по фенолфталеину, затем добавляют коммерческий фермент панкреатин в количестве 12,0 г активностью 45 ед. В качестве консерванта добавляют хлороформ в количестве 1% к объему жидкости. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 50±2°C. Содержимое баллона в течение первых суток перемешивают через 20±1 мин по 5 мин, в последующие 4,5 ч через 1,5-2,0 ч по 5 мин. В течение первого часа через каждые 15 мин измеряют рН, при изменении рН в кислую сторону обязательно корректируют рН 40% раствором гидроокиси калия до значения 8,0-8,2. После первого часа значение рН не измеряют. Через 4 ч ведут забор пробы в количестве 10 мл на определение аминного азота и по достижении аминного азота до 260±40 мг% гидролиз прекращают. В результате гидролиз идет в течение 4,5 ч с момента загрузки панкреатина. Ввиду резкого падения рН до 5 ед - добавляют 30 мл 20% гидроокиси калия до рН 8,2 по фенолфталеину. После этого гидролиз останавливают и отстаивают в течение 2х суток. Отстоявшийся верхний слой гидролизата декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр. Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 3 л, для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему содержимого баллона, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2 до +8°C.

Питательную среду на ферментативной основе эритромассы крупного рогатого скота для выращивания легионелл готовят следующим способом. Берут ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 190,0 мл, другие ингредиенты в соотношении, г/л: калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,83; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1,16; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,2; активированный уголь - 2,0; агар микробиологический - 10,0; дистиллированную воду - до 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин, рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) в количестве 1,0 мл до рН 6,9±0,5. Приготовленную питательную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. В расплавленный на водяной бане и остуженный до 56°C агар добавляют L-цистеина гидрохлорида 0,4 г, простерилизованного автоклавированием при 112°C в течение 30 мин, затем разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в течение 30 минут и используют для посева.

Соляную кислоту ГОСТ-3118-77 (чда, хч) используют для установления рН. Массовая доля основного вещества, % 35-38.

Эффективность полученной питательной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», (Москва, 2007), с использованием в качестве тест-культур легионелл Legionella pneumophilla АТСС 33155 Bloomington, Legionella pneumophilla ATCC 33152 Philadelphia.

Испытуемые культуры выращивали на пластинках плотного агара контрольной среды СЭЛ рН 6,8 при температуре 36°C 24 ч. Из суточных культур готовили в стерильном 0,01 М калий фосфатном буфере 1 млрд. взвесь м.т. тест-штаммов, равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85П (рН 6,8) ГИСК им. Л.А.Тарасовича, затем серийными десятикратными разведениями в калий фосфатном буфере в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000 (10^-6). Из данных разведений взвесей культур высевали по 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого подсушенного испытуемого агара, и на контрольные среды СЭЛ и агар Хоттингера (отрицательный контроль - на нем нет роста в любые сроки наблюдения). Посевы инкубировали при 36±1°C в течение 5 суток. Через 24-120 ч учитывали результаты путем подсчета выросших колоний.

Контрольная среда СЭЛ (Питательная среда для культивирования и выделения возбудителя легионеллеза элективная) - состав, г/л: питательная основа животного происхождения - ферментолизат селезенки жидкий крупного рогатого скота в расчете на сухое вещество - 7,0; активированный уголь ОУ-А 4,0; агар микробиологический 17,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,6; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,4; рН среды 7,1 (Производитель ФГУЗ Рост НИПЧИ Роспотребнадзора. 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117).

Контрольный агар Хоттингера. Промышленный регламент №1707-05 на производство питательного агара для культивирования микроорганизмов, готового к применению (агара Хоттингера). Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05571 от 20 августа 2009 г. Срок действия не ограничен.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,10% - 170,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,63; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 0,96; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,18; активированный уголь - 1,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,2; агар микробиологический - 8,0; дистиллированная вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов вырастало 100 плосковыпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,0 мм через 48 ч для обеих штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве менее 50% колоний диаметром 1,0 мм, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 190,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,83; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1.16; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,2; активированный уголь - 2,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,4; агар микробиологический - 10,0; дистиллированная вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов наблюдался сплошной рост в виде голубовато-серого налета через 24 ч для обеих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве 100 колоний диаметром 1,2 мм соответственно, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,14% - 210,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 1,03; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1,36; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,22; активированный уголь - 3,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,6; агар микробиологический - 12,0; дистиллированная вода до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов вырастало 92 плосковыпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,0 мм через 48 ч для обеих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве менее 50% колоний, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной среды на основе ферментативного гидролизата эритромассы крупного рогатого скота (пример 2).

Обогащенная питательная среда для выращивания легионелл, включающая питательную основу, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, активированный уголь, L-цистеин гидрохлорид, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат эритромасы крупного рогатого скота, а в качестве стимулирующей добавки - железо сернокислое закисное 7-водное, при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат
эритромассы крупного рогатого скота
(с содержанием 0,10-0,14% аминного азота)	170,0-210,0
Калий фосфорнокислый 1-замещенный	0,63-1,03
Калий фосфорнокислый 2-замещенный
3-водный	0,96-1,36
Железо сернокислое закисное 7-водное	0,18-0,22
Активированный уголь	1,0-3,0
L-цистеин гидрохлорид	0,2-0,6
Агар микробиологический	8,0-12,0
Дистиллированная вода	До 1 л