Способ очистки полисахаридов streptococcus pneumoniae 3 типа (варианты)



Способ очистки полисахаридов streptococcus pneumoniae 3 типа (варианты)
Способ очистки полисахаридов streptococcus pneumoniae 3 типа (варианты)
Способ очистки полисахаридов streptococcus pneumoniae 3 типа (варианты)
Способ очистки полисахаридов streptococcus pneumoniae 3 типа (варианты)
Способ очистки полисахаридов streptococcus pneumoniae 3 типа (варианты)
Способ очистки полисахаридов streptococcus pneumoniae 3 типа (варианты)
Способ очистки полисахаридов streptococcus pneumoniae 3 типа (варианты)
Способ очистки полисахаридов streptococcus pneumoniae 3 типа (варианты)

 


Владельцы патента RU 2460539:

ВАЙЕТ (US)

Группа изобретений относится к биотехнологии и биохимии. Проводят очистку полисахаридов Streptococcus pneumoniae серотипа 3 от белковых примесей. По первому варианту способа нагревают лизат клеток Streptococcus pneumoniae до 60°С в течение 30 мин для агрегации и осаждения белков. Отделяют осажденные вещества фильтрацией через мембранный и объемный фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и центрифугируют с получением очищенного лизата. По второму варианту способа повышают рН лизата или центрифугата от 8,0 до 8,4 и фильтруют. По третьему варианту способа нагревают лизат клеток Streptococcus pneumoniae до 60-70°С в течение 30-50 мин. Проводят центрифугирование лизата с последующим повышением рН до 8,0-8,4 и фильтрацию. По четвертому варианту способа снижают рН лизата до 3,0-5,0 и нагревают до 60-70°С в течение 30-50 мин. Проводят центрифугирование, повышают рН лизата или центрифугата до 8,4 и фильтруют. Группа изобретений обеспечивает получение лизатов и концентратов, содержащих очищенный полисахарид серотипа 3. 4 н. и 27 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр., 8 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к улучшенным способам уменьшения количества или удаления белковых примесей из многокомпонентного лизата или центрифугата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащего полисахариды серотипа 3, включающим этапы нагревания или корректировки рН.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

При приготовлении мультивалентной конъюгатной пневмококковой вакцины, предназначенной для профилактики инфекционных заболеваний, вызываемых микроорганизмом Streptococcus pneumoniae (также известным как пневмококк), отобранные серотипы Streptococcus pneumoniae выращивают для получения полисахаридов, необходимых для производства вакцины. Клетки выращивают в больших ферментерах и в конце ферментации лизируют путем добавления дезоксихолата натрия (ДОХ) или другого лизирующего агента. Затем жидкую питательную среду с лизатом собирают для последующей очистки и восстановления капсульных полисахаридов, окружающих бактериальные клетки. После конъюгации с белком-переносчиком полисахарид включают в конечный продукт вакцины, и в таком виде он обеспечивает иммунитет к выбранным серотипам Streptococcus pneumoniae в целевой популяции вакцины.

Хотя лизат клеток, получаемый в ходе этого процесса, содержит целевой полисахарид, он также содержит большие количества компонентов клетки, включая ДНК, РНК, белки и промежуточные компоненты. Традиционная обработка включает в себя минимальное снижение рН лизата до 6,6 путем добавления уксусной кислоты, что способствует осаждению лизирующего агента и некоторых примесей. Этот материал подвергают центрифугированию, затем фильтрации, что обеспечивает удаление большинства твердых веществ с номинальным размером до 0,45 мкм. Однако было показано, что такие традиционные способы обработки минимально сокращают количество примесей и создают дополнительные трудности при удалении растворимых белков для обеспечения соответствия спецификациям очищенных полисахаридов.

Высокое содержание загрязняющего растворимого белка является особенно затруднительным при работе с определенными серотипами. Некоторые серотипы, в частности Streptococcus pneumoniae 3 типа, вырабатывают крупные и вязкие цепи полисахаридов (напр., для типа 3, цепи из глюкозы/глюкуроновой кислоты массой 2-3 миллиона Дальтон), которые попадают в питательную среду при лизисе клеток. Их вязкость затрудняет фильтрацию после центрифугирования, и, в таких случаях, процесс очистки не обеспечивает достаточного удаления белка, что приводило к неполадкам в работе.

Соответственно, необходимы улучшенные способы удаления примесей белков из сложных лизатов клеток Streptococcus pneumoniae, в частности лизатов, содержащих полисахариды Streptococcus pneumoniae 3 типа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предложены улучшенные способы уменьшения или удаления примесей белков из многокомпонентного лизата или центрифугата клеток Streptococcus pneumoniae, включающих полисахариды серотипа 3. Согласно одному способу, лизат клеток Streptococcus pneumoniae, содержащий полисахариды серотипа 3, нагревают в течение такого количества времени и при такой температуре, которые достаточны для денатурации содержащихся в лизате белков и для того, чтобы вызывать их агрегацию и осаждение. Соответственно, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, способ включает следующие этапы: 1) нагревание лизата до по меньшей мере 60°С в течение по меньшей мере 30 минут, что вызывает агрегацию и осаждение белков; и 2) отделение осажденных веществ от лизата; при этом получают по существу очищенный лизат, содержащий полисахариды серотипа 3. Согласно одному конкретному варианту реализации, лизат нагревают до примерно 60-70°С в течение приблизительно 30-50 минут. Согласно другому конкретному варианту реализации, лизат нагревают до приблизительно 65°С в течение приблизительно 40 минут. Согласно другому варианту реализации, этап выделения (отделения) включает фильтрацию лизата с удалением осажденных веществ с использованием мембранного фильтра, в частности мембранного фильтра с диаметром пор 45 мкм. Согласно другому варианту реализации, этап выделения включает фильтрацию лизата для удаления осажденных веществ с применением объемного фильтра. Согласно другому конкретному варианту реализации, этап выделения осажденных веществ из лизата включает центрифугирование лизата для удаления осажденных веществ.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения, предложен способ для уменьшения количества или удаления примесей из лизата или центрифугата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащих полисахариды серотипа 3, который включает этап корректировки рН лизата или центрифугата. Согласно данному варианту реализации, этап корректировки рН улучшает фильтруемость. Согласно одному конкретному варианту реализации, рН лизата или центрифугата повышают до по меньшей мере 8,0 перед фильтрацией, в частности до значения в диапазоне от 8,0 до 8,4, а более конкретно до приблизительно 8,2. Согласно другому варианту реализации, этап фильтрации включает фильтрацию лизата или центрифугата с использованием мембранного фильтра, в частности мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм. Согласно другому варианту реализации, этап фильтрации включает фильтрацию лизата или центрифугата с использованием объемного фильтра.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения, предложен способ уменьшения количества или удаления примесей из лизата или центрифугата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащих полисахариды серотипа 3, который включает нагревание лизата в сочетании с этапом корректировки рН лизата или центрифугата, полученного путем центрифугирования лизата. Согласно данному варианту реализации этап корректировки рН улучшает фильтруемость. Соответственно, согласно одному варианту реализации, данный способ включает следующие этапы: 1) нагревание лизата до по меньшей мере 60°С в течение по меньшей мере 30 минут, что вызывает агрегацию и осаждение белков; 2) центрифугирование лизата и отделение осажденных белков от лизата с получением центрифугата; 3) повышение рН центрифугата до по меньшей мере 8,0; и 4) фильтрация центрифугата; при этом получают очищенный центрифугат, содержащий полисахариды серотипа 3. Согласно определенному варианту реализации, лизат нагревают до приблизительно 60-70°С в течение приблизительно 30-50 минут перед центрифугированием, а конкретнее до приблизительно 60°С в течение 40 минут. Согласно другому варианту реализации, перед фильтрацией рН центрифугата повышают до значения в диапазоне приблизительно от 8,0 до 8,4, более конкретно до приблизительно 8,2. Согласно дополнительному варианту реализации, этап фильтрации включает фильтрацию лизата с удалением осажденных веществ с использованием мембранного фильтра, более конкретно, мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм. Согласно другому варианту реализации, этап фильтрации включает фильтрацию лизата с удалением осажденных веществ с использованием объемного фильтра.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения, предложен способ уменьшения количества или удаления белковых примесей из лизата или центрифугата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащих полисахариды серотипа 3, который включает этап корректировки рН лизата или центрифугата, вызывающий агрегацию и осаждение белков. Согласно данному варианту реализации, способ включает следующие этапы: 1) снижение рН указанного лизата до приблизительно 3,0-5,0, что вызывает агрегацию и осаждение белков; 2) центрифугирование лизата и отделение осажденных белков от лизата с получением центрифугата; 3) повышение рН центрифугата до по меньшей мере 8,0; и 4) фильтрацию центрифугата; в результате получают по существу очищенный центрифугат, содержащий полисахариды серотипа 3. Согласно конкретному варианту реализации, рН лизата перед центрифугированием снижают до приблизительно 3,0. Согласно другому варианту реализации, рН центрифугата перед фильтрацией повышают до значений в диапазоне от приблизительно 8,0 до приблизительно 8,4, более конкретно до приблизительно 8,2. Согласно дополнительному варианту реализации, этап корректировки рН для агрегации и осаждения белков включает дополнительно нагревание лизата до по меньшей мере 60°С в течение по меньшей мере 30 минут, более конкретно до приблизительно 60-70°С в течение 30-50 минут, и еще более конкретно до приблизительно 60°С в течение 40 минут. Согласно одному дополнительному варианту реализации, этап фильтрации включает фильтрование лизата с удалением осажденных веществ с использованием мембранного фильтра, более конкретно мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм. Согласно другому варианту реализации, этап фильтрации включает фильтрацию лизата с удалением осажденных веществ с использованием объемного фильтра.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На Фигуре 1 показан выход полисахаридов в лабораторных исследованиях различных условий нагревания и времени выдержки для лизатов серотипа 3. Данные показаны как процентная доля значений, полученных для образцов в эксперименте без нагревания, чтобы продемонстрировать относительный процент потери (т.е. уменьшения количества) белка в обработанных образцах (100% эквивалентно отсутствию потерь).

На Фигуре 2 показан выход белков в лабораторных исследованиях различных условий нагревания и времени выдержки для лизатов серотипа 3. Данные показаны как процентная доля значений, полученных для образцов в эксперименте без нагревания, чтобы продемонстрировать относительный процент потери белка в обработанных образцах (100% эквивалентно отсутствию потерь).

На Фигуре 3 показан скорректированный график ответа влияния времени (слева) и температуры (справа) на концентрацию белков (вверху) и полисахаридов (ПС, внизу) в лизатах серотипа 3. Значения «% коррекции ПС» и «% коррекции белка» представляют собой процент концентраций полисахаридов и белков, соответственно, при различных значениях времени и температуры по сравнению с моментом времени = 0 минут и комнатной температурой (которые составляют 100% значения концентраций белков и полисахаридов).

На Фигуре 4 показан контурный график суммарного процента белка из лизатов, построенный в виде зависимости от условий температуры и времени. Процент оставшегося растворимого белка показан на криволинейных гистограммах. Диапазон 60-70°С в течение 30-50 минут выделен рамкой.

На Фигуре 5 показаны ДДС-Na-ПААГ гели, демонстрирующие удаление растворимых белков из лизата клеток, подвергнутого нагреванию. Дорожки с лизатами, не подвергнутыми нагреванию, показаны слева (IPPPN3-007), а дорожки с лизатами, подвергнутыми нагреванию, показаны справа (IPPPN3-011).

На Фигуре 6 показана фотография, на которой сравниваются лизаты серотипа 3, подвергнутые нагреванию (справа) и не подвергнутые нагреванию (слева), после осаждения в течение одинакового времени.

На Фигуре 7 показан график зависимости концентрации полисахаридов (ПС), концентрации белков и относительной фильтруемости центрифугатов серотипа 3 от рН центрифугата. Показаны пять групп гистограмм, соответствующие пяти экспериментальным циклам. Значения концентраций полисахаридов (мг/10 л) и концентраций белков (г/моль) показаны по левой оси ординат. Значения относительной фильтруемости показаны на правой оси ординат, которая соответствует относительной силе, необходимой для того, чтобы протолкнуть приблизительно 3 мл центрифугата серотипа 3 через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,45 мкм по шкале от 1 до 5 (1=легко, 5=тяжело).

На Фигуре 8 показан график, демонстрирующий изменение скорости потока образцов центрифугата серотипа 3 через объемные фильтры со временем в зависимости от рН центрифугата. Скорость потока (ось ординат) измеряли путем расчета отношения для каждой минуты фильтрации, при этом время в минутах делили на общую массу центрифугата, прошедшего через фильтр за эту минуту (чем меньше такое отношение, тем выше скорость потока), в граммах. рН образцов центрифугата доводили до разных значений (5,0-8,5), и продавливали образцы через фильтры при разных постоянных значениях давления (5-20 фунтов на квадратный дюйм (psi)).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены улучшенные способы уменьшения количества или удаления белковых примесей из многокомпонентного лизата или центрифугата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащего полисахариды серотипа 3, включающие этапы нагревания или корректировки рН. В некоторых способах лизат нагревают в течение времени и до температуры, которые достаточны для денатурирования белков, присутствующих в лизате, и вызывают агрегацию и осаждение белков. Согласно другим способам, доводят рН лизата или центрифугата, полученного путем центрифугирования лизата, для улучшения фильтруемости или для того, чтобы вызвать агрегацию и осаждение белков. Согласно другим способам, этапы нагревания и корректировки рН комбинируют, что вызывает агрегацию и осаждение белков, улучшает фильтруемость лизата или центрифугата. Такие способы позволяют получать по существу очищенные лизаты или центрифугаты, содержащие полисахариды серотипа 3.

В настоящей заявке термин «по существу очищенные лизаты, содержащие полисахариды серотипа 3» или «по существу очищенные центрифугаты, содержащие полисахариды серотипа 3» обозначает лизат или центрифугат клеток Streptococcus pneumonia серотипа 3, из которого белки были удалены таким образом, что относительная концентрация белка в лизате или центрифугате составляет менее приблизительно 40%, приблизительно 35%, приблизительно 30%, приблизительно 25%, приблизительно 20%, приблизительно 15%, приблизительно 10%, приблизительно 5% или приблизительно 1% белка по сравнению с концентрацией белка в лизате или центрифугате до удаления белка. Методы количественного определения концентрации белка в лизате или центрифугате клеток хорошо известны из уровня техники и включают, например, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДДС-Na ПААГ), хроматографию и электрофорез (см., например, Deutscher, M.Р. (ed.), Guide to Protein Purification, San Diego: Academic Press, Inc. (1990)).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, предложен способ, включающий этап нагревания, обеспечивающий уменьшение количества или удаление белковых примесей из лизата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащего полисахариды серотипа 3. Воздействие высоких температур позволяет разрушить нативную структуру белков и денатурировать их, не оказывая воздействия на полисахариды. В результате происходит агрегация и осаждение белков, что облегчает отделение лизата и позволяет легко удалить твердые вещества путем центрифугирования или фильтрации. Такой этап нагревания потенциально эффективен при выделении или очищении любого устойчивого к нагреванию полисахарида из биологической смеси, содержащей значительные количества примесей растворимых белков, и, следовательно, его можно применять в любой жидкой фазе, где уровень белков представляет собой проблему (например, биологические смеси, содержащие ДНК, РНК, полисахариды, олигосахариды, сахариды, жирные кислоты и липиды).

Так, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, предложен способ уменьшения количества или удаления белковых примесей из лизата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащего полисахариды серотипа 3, включающий следующие этапы: 1) нагревание лизата до по меньшей мере 50°С, до по меньшей мере 55°С или до по меньшей мере 60°С в течение по меньшей мере 15 минут или по меньшей мере 30 минут с агрегацией и осаждением белков; и 2) отделение осадка от лизата с получением по существу очищенного лизата, содержащего полисахариды серотипа 3. Согласно конкретному варианту реализации лизат нагревают до приблизительно 50-80°С в течение приблизительно 15-60 минут. Согласно другому конкретному варианту реализации лизат нагревают до приблизительно 60-70°С в течение приблизительно 30-50 минут. Согласно другому конкретному варианту реализации лизат нагревают до приблизительно 65°С в течение приблизительно 40 минут. Согласно более подробному описанию ниже в разделе Эксперименты, при нагревании стабильных полисахаридов серотипа 3 при 65°С в течение 40 минут удавалось удалить более 80% белков с минимальной потерей полисахарида. Согласно другому варианту реализации этап отделения включает центрифугирование или фильтрацию с удалением или уменьшения количества белка в лизате. В частности, согласно одному варианту реализации этап отделения включает фильтрацию лизата с удалением осажденных веществ с использованием мембранного фильтра, в частности мембранного фильтра с размером пор 0,45 мкм. Согласно другому варианту реализации этап отделения включает фильтрацию лизата с удалением осажденных веществ с использованием объемного фильтра.

Фильтры, обычно используемые при фильтрации больших объемов, например при очистке полисахаридов серотипа 3, включают мембранные (поверхностные) фильтры и объемные фильтры. Мембранные фильтры действуют в основном благодаря разделению частиц по размеру, при котором все примеси фильтруемого раствора, размер которых превышает размер пор мембранного фильтра, остаются на поверхности фильтра. В отличие от мембранных, объемные фильтры содержат волокнистый или гранулярный материал со случайной пористой структурой, через который пропускают фильтруемый раствор; действие такого фильтра основано, в основном, на случайной абсорбции и механическом улавливании примесей в глубинном слое материала. В рамках способов согласно настоящему изобретению мембранные и объемные фильтры можно применять в комбинации, при этом объемный фильтр будет отбирать более крупные примеси, а поверхностный фильтр будет захватывать более мелкие примеси.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения также предложен способ уменьшения количества или удаления белковых примесей из лизата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащего полисахариды серотипа 3, или центрифугата, полученного при центрифугировании такого лизата, включающий этап корректировки рН лизата или центрифугата. Согласно данному варианту реализации этап корректировки рН улучшает фильтруемость. В настоящей заявке термин «фильтруемость» лизата или центрифугата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащего полисахариды серотипа 3, обозначает способность лизата или центрифугата проходить через фильтр, например через мембранный или объемный фильтр. Следовательно, улучшение фильтруемости лизата или центрифугата связано, например, с увеличением скорости потока лизата или центрифугата через фильтр, снижением закупоривания фильтров лизатом или центрифугатом или со снижением давления, которое нужно приложить для пропускания данного объема лизата или центрифугата через фильтр.

Традиционные методы удаления примесей из лизатов или центрифугатов клеток Streptococcus pneumoniae, содержащих полисахариды серотипа 3, включали минимальное понижение рН лизата до 6,6 путем добавления уксусной кислоты, после которого проводили длительное центрифугирование и фильтрацию через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Такой способ обработки демонстрирует минимальное уменьшение количества примесей и возникающие вследствие этого затруднения в отношении возможности удаления растворимых белков при помощи мембранных или объемных фильтров перед отправкой продукта на очистку. Однако способы согласно настоящему изобретению, относятся к обнаружению того факта, что фильтруемость этого высокомолекулярного полисахарида можно изменять как прямую функцию рН и что повышение рН лизата или центрифугата улучшает фильтруемость без значительной потери молекулярного веса или функциональности полисахаридов серотипа 3.

Так, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ уменьшения или удаления белковых примесей из лизата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащего полисахариды серотипа 3, или центрифугата, полученного путем центрифугирования этого лизата, который включает этап повышения рН центрифугата или лизата до по меньшей мере 8,0 перед фильтрацией. Согласно другому варианту реализации рН центрифугата или лизата перед фильтрацией повышают до приблизительно 8,0-8,4, более конкретно до приблизительно 8,2. Фильтрация, производимая после корректировки рН лизата или центрифугата, может включать фильтрацию лизата или центрифугата с использованием мембранного фильтра, в частности мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм. Согласно другому варианту реализации фильтрация лизата или центрифугата может включать использование объемного фильтра.

Согласно еще одному варианту реализации предложен способ уменьшения количества или удаления белковых примесей из лизата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащего полисахариды серотипа 3, который включает этап нагревания лизата в сочетании с этапом корректировки рН лизата. Согласно одному варианту реализации данный способ включает в себя следующие этапы: 1) нагревание лизата до по меньшей мере 50°С, до по меньшей мере 55°С или до по меньшей мере 60°С, в течение по меньшей мере 15 или по меньшей мере 30 минут, что вызывает агрегацию и осаждение белков; 2) центрифугирование лизата и отделение осажденных белков от лизата с получением центрифугата; 3) повышение рН центрифугата до по меньшей мере 8.0; и 4) фильтрацию центрифугата с получением по существу очищенного лизата, содержащего полисахариды серотипа 3. Согласно конкретному варианту реализации лизат перед центрифугированием нагревают до приблизительно 50-80°С в течение приблизительно 15-60 минут. Согласно другому конкретному варианту реализации лизат перед центрифугированием нагревают до приблизительно 60-70°С в течение приблизительно 30-50 минут. Согласно еще одному варианту реализации лизат перед центрифугированием нагревают до приблизительно 65°С в течение приблизительно 40 минут. Согласно другому конкретному варианту реализации перед фильтрацией рН центрифугата повышают до приблизительно 8,0-8,4, более конкретно до приблизительно 8,2. Согласно дополнительному варианту реализации этап фильтрации включает фильтрацию центрифугата с использованием мембранного фильтра, в частности мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм. Согласно другому варианту реализации этап фильтрации включает фильтрацию лизата с удалением осажденных веществ с использованием объемного фильтра.

Согласно еще одному варианту реализации предложен способ уменьшения количества или удаления белковых примесей из лизата или центрифугата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащего полисахариды серотипа 3, включающий этап корректировки рН, который вызывает агрегацию и осаждение белков. Согласно одному варианту реализации данный способ включает в себя следующие этапы: 1) снижение рН указанного лизата до значений менее приблизительно 5,0, 4,5, 4,0, 3,5 или 3,0, или до приблизительно 3,0-5,0, что вызывает агрегацию и осаждение белков; 2) центрифугирование лизата и отделение осажденных белков от лизата для получения центрифугата; 3) повышение рН центрифугата до по меньшей мере 8,0; и 4) фильтрацию центрифугата с получением по существу очищенного центрифугата, содержащего полисахариды серотипа 3. Согласно определенному варианту реализации перед центрифугированием рН лизата понижают до приблизительно 3,0. Согласно другому варианту реализации рН центрифугата повышают до приблизительно 8,0-8,4, более конкретно до приблизительно 8,2. Согласно определенному варианту реализации этап фильтрации включает фильтрацию лизата с удалением осажденных веществ с использованием мембранного фильтра, более конкретно мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм. Согласно другому варианту реализации этап фильтрации включает фильтрацию лизата с удалением осажденных веществ с использованием объемного фильтра.

Согласно еще одному варианту реализации предложен способ уменьшения количества или удаления белковых примесей из лизата или центрифугата клеток Streptococcus pneumoniae, содержащего полисахариды серотипа 3, который включает этап корректировки рН, вызывающий агрегацию и осаждение белков, а также включает нагревание лизата до по меньшей мере 50°С до по меньшей мере 55°С или до по меньшей мере 60°С в течение по меньшей мере 15 минут или по меньшей мере 30 минут, вызывающее агрегацию и осаждение белков. Согласно конкретному варианту реализации лизат перед центрифугированием нагревают до приблизительно 50°С-80°С в течение приблизительно 15-60 минут. Согласно другому конкретному варианту реализации лизат перед центрифугированием нагревают до приблизительно 60°С-70°С в течение приблизительно 30-50 минут. Согласно дополнительному варианту реализации лизат перед центрифугированием нагревают до приблизительно 65°С в течение приблизительно 40 минут.

Следующие примеры представлены с целью иллюстрации, а не с целью ограничения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Streptococcus pneumoniae типа 3 вырабатывают очень крупный и вязкий полисахарид, который попадает в питательную среду при лизисе клеток. В настоящее время в конце ферментации лизис индуцируют с помощью дезоксихолата (ДОХ) натрия. Считается, что полисахарид 3 типа очень стабилен в широком диапазоне температур и рН; однако его вязкость затрудняет фильтрацию после центрифугирования, что позволяет выделять лишь небольшие количества бесклеточной культуральной жидкости (CFB). В следующих примерах описаны исследования, касающиеся нагревания после лизиса с целью денатурирования и осаждения белков, а также корректировки рН для улучшения фильтруемости лизата.

Пример 1. Этап нагревания

Применение этапа нагревания для получения Streptococcus pneumoniae серотипа 3 обусловлено необходимостью снизить содержание белка перед этапами очистки. Партии очищенного полисахарида имели тенденцию к разрушению из-за того, что уровень остаточного белка в них превышал нормативный уровень 5% в/в белок/полисахарид. Поэтому с целью исследования эффективности и диапазонов применения этапа нагревания при очистке и получении Streptococcus pneumoniae серотипа 3 были проведены следующие лабораторные испытания. Цель внедрения этапа нагревания состояла в том, чтобы снизить уровень белка при сохранении высокого уровня полисахарида.

В лаборатории материал, полученный при ферментации лизата клеток в опытной установке, разливали в равном количестве в пробирки Falcon™ (BD Biosciences, Bedford, MA) и нагревали на водяной бане до различных значений температуры. Исследовали температуры в диапазоне от 50°С до 80°С, а время выдержки составляло от 15 до 240 минут. Контрольные пробы выдерживали при комнатной температуре (около 21°С). Все пробы затем выдерживали в течение ночи в условиях внешней среды, после чего центрифугировали и пропускали через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (Мембранные шприцевые фильтры 25 мм НТ Tuffryn®, low protein binding, Pall Life Sciences, Anne Arbor, Миссисипи, США), в результате чего получали материал для анализа полисахаридов и белков. Экспериментальные данные анализировали с применением программ для статистической обработки данных (Cornerstone™, Applied Systems Technologies, Inc., Dunnellon, Флорида, США) с целью определения влияния температуры и времени нагревания на уровни полисахарида и белков.

Анализ уровня полисахарида и белков

Анализ уровня полисахаридов проводили методом HPLC-SEC (Высокоэффективная жидкостная хроматография - гель-фильтрационная колонка) с применением стандартных методов, хорошо известных в данной области (см, например, Aquilar, M. "HPLC of Peptides and Proteins: Methods and Protocols" Totowa, NJ: Humana Press (2004)). На Фигуре 1 показан выход полисахарида в экспериментах при различном времени нагревания. Данные представлены как процентная доля уровня полисахарида в контрольном опыте и 100% означают отсутствие потерь. Как показано на Фигуре 1, выход полисахарида имел стабильную зависимость от времени нагревания и температуры.

Также были собраны данные в опытном масштабе; они показаны на Фигуре 1 как точки, обозначенные сокращением "IPP". Показанные значения времени обозначают периоды нагревания, поддержания указанной температуры и охлаждения. Эти образцы были отобраны после нагревания в действующем ферементере в отличие от нагревания в лаборатории. В пределах диапазона температур и времени нагревания, исследуемых в опытном масштабе (30-50 минут и 60-70°С), потери полисахарида находились в диапазоне 0-18%, причем большинство определенных в исследовании значений потерь составляли 10% или менее. Эти значения попадали в диапазон приемлемых значений для последующей обработки данного материала.

Анализ уровня белков проводили с помощью стандартных методов ДДС-Na-ПААГ (Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия), хорошо известных в данной области (см., например. Walker, J.M. "The Protein Protocols Handbook" Totowa, NJ: Humana Press (2002)). Анализ гелей проводили с помощью системы визуализации гелей (визуализирующее устройство с УФ-фотометром с программой Labworks™ V.3, UVP Inc., Upland, Калифорния, США) для интерпретации суммарных плотностей полос (дорожек) по сравнению со стандартным белком.

Как показано на Фигуре 2, температуры от 50°С до 80°С исследовали и в лаборатории, и в опытном масштабе (точки, обозначенные сокращением "IPP"). Данные показаны как процентная доля контрольных значений, полученных для не подвергнутых нагреванию проб, чтобы показать относительный процент потери при температуре 60°С (См. Фигуру 2). Хотя при 50°С и 55°С происходило значительное уменьшение количества белка, температура 60°С была определена как минимальная для эксплуатации опытной установки, поскольку при данной температуре происходит более надежное удаление белков.

На Фигуре 3 показан График откорректированного ответа для концентрации белков и полисахаридов, построенный в форме зависимости от времени и температуры. Представленные данные показывают процент концентрации белка и полисахарида при различных значениях времени и температуры по сравнению со временем=0 и комнатной температурой (которые соответствуют 100% значения для белка и полисахарида). Как показано на Фигуре 3, время выдержки оказывало значительное влияние на удаление растворимых белков, тогда как длительность выдержки более 15 минут влияния не оказывала. Что касается выхода полисахарида (ПС), то и время, и температура оказывали ограниченное влияние на потерю ПС (<20% потерь, что приемлемо для последующей обработки полисахарида).

На Фигуре 4 показан контурный график суммарного процента белка из лизатов серотипа 3, построенный в форме зависимости от температуры и времени. Процент оставшегося растворимого белка показан на криволинейных гистограммах. Диапазон 60°С-70°С в течение 30-50 минут выделен рамкой и представляет собой предпочтительный диапазон, выбранный для внедрения этапа нагревания, описанного в настоящей заявке. Однако, как описано выше, был также проведен анализ более широкого диапазона, который показал эффективность данного диапазона.

На Фигуре 5 показаны ДДС-Na-ПААГ гели растворимых белков после тестирования этапа нагревания в опытном масштабе. На геле слева показаны результаты, полученные для партии ферментации опытного масштаба (IPPPN3-007) без этапа нагревания, которые показывают, что уровни белка не изменяются на протяжении всего процесса выделения (перед корректировкой рН, после корректировки рН, после центрифугирования и после корректировки рН в резервуаре). «После корректировки рН в резервуаре» означает пробы, взятые из сборника для выдержки центрифугата после корректировки рН до заданного уровня перед фильтрацией. Процесс очистки путем 100 КДа продольной ультрафильтрации (УФ) вдоль потока применяли для удаления растворенных веществ с молекулярной массой менее 100 КДа путем постепенного замещения исходной суспензионной среды на буферный раствор при помощи непрерывной циркуляции и фильтрации и дальнейшего концентрирования раствора. Было показано, что после описанного этапа УФ содержание белков в партии IPPPN3-007 составило 31% белок/полисахарид, выраженного в форме в/в (соотношение по весу компонентов). Конечный уровень белка после полного процесса очистки составил 9,9% (в/в относительно полисахарида), и соответственно данная партия не удовлетворила нормативу Конечной Концентрации в Партии (ККП)<5% белка. Для партии IPPPN3-011 после выдержки лизата и перед выделением целевого продукта включили этап нагревания с выдержкой при 60°С в течение 30 минут. Уровень белка после 100 кДа фильтрации составил 6,7%, а уровень белка ККП составил 2,5%, и соответственно данная партия соответствовала промежуточному нормативу ККП для лекарственных средств. Как показано на изображении геля на Фигуре 5 справа, этап нагревания приводил к значительному снижению уровня белка во время процесса выделения.

Обобщенные данных опытного масштаба, связанные с этапом нагревания, также представлены в Таблице 1. В циклах -001, -004, -005, -007 и -013 не применяли этапа нагревания. Среди этих циклов только циклы -001 и -004 удовлетворили целевому нормативу по уровню белков <5% в/в, что указывает на сохраняющиеся затруднения процесса очистки, направленного на удаление 20-35% содержания белка после этапа УФ. При введении этапа выдержки при повышенной температуре, как показано в Таблице 1 для циклов -011, -012, -014, -015 и -017, содержание белка снижалось до 3,1-6,7% после этапа УФ, и конечный уровень белка в очищенном полисахариде составлял 0,6-2,5%.

Таблица 1
Процентное содержание белка после ультрафильтрации и в конечном концентрате партии (ККП) при различных условиях нагревания и временах выдержки
Процесс Партия % белка УФ % белка ККП
Без нагревания IPPPN3-001 32 4,8
Без нагревания IPPPN3-004 35 3,5
Без нагревания IPPPN3-005 20 7,4
Без нагревания IPPPN3-007 31 9,9
Без нагревания IPPPN3-013 22 6,1
Нагревание 60°С/30 мин IPPPN3-011 6,7 2,5
Нагревание 70°С/50 мин IPPPN3-012 4,3 1,7
Нагревание 65°С/40 мин IPPPN3-014 3,1 0,9
Нагревание 65°С/40 мин IPPPN3-015 3,7 0,6
Нагревание 65°С/40 мин IPPPN3-017 3,4 1,7

Введение этапа нагревания также повышало эффективность разделения за счет повышения агрегации белка, что приводило к более эффективному центрифугированию. Влияние введения этого этапа иллюстрирует Фигура 6, на которой представлена фотография со сравнением лизата клеток, не подвергнутого нагреванию (слева), и лизата клеток, подвергнутого нагреванию (справа), после выдержки в течение ночи в условиях внешней среды без перемешивания. Среды становилась значительно более прозрачными после нагревания, что указывало на более интенсивную агрегацию и осаждение белка.

Как показывают данные, описанные выше, введение этапа нагревания было важным для удаления белковых примесей при производстве полисахарида. Конечный полисахарид удовлетворял промежуточным критериям выпуска лекарственных средств <5% в/в (белок/полисахарид), что указывает на стабильность продукта в отношении тепловой обработки.

Пример 2. Этап корректировки рН и фильтрации

Традиционная фильтрация полисахаридов Streptococcus pneumoniae, входящих в состав вакцины Prevnar®, включала длительное центрифугирование лизатов клеток и дальнейшую фильтрацию через объемные и мембранные фильтры. Как описано выше, Streptococcus pneumoniae 3 типа - это крупный полисахарид, который является вязким в растворе, и его не удается хорошо отфильтровать в условиях обычной обработки. В связи с указанными проблемами, провели работу с целью изменения характеристик фильтрации данного полисахарида. Соответственно, были проведены исследования, направленные на поиск средств, которые могли бы улучшить фильтруемость растворов полисахарида серотипа 3. Применяя рН в качестве переменного параметра, в лаборатории провели начальные исследования по оценке влияния рН на удаление белков и последующую фильтруемость растворов лизата серотипа 3 через шприцевые фильтры диаметром 25 мм с размером пор 0,45 мкм НТ Tuffryn® (Pall Life Sciences, Anne Arbor, Мичиган, США). Перед центрифугированием, рН проб лизата серотипа 3, подвергнутого ферментации, доводили до 6,6 (две серии экспериментов), 5,0 (две серии экспериментов) или 3,0 (одна серия экспериментов) с помощью уксусной кислоты или серной кислоты, чтобы удалить растворимые белки. Лизаты центрифугировали и разливали в пробирки Falcon™ (BD Biosciences, Bedford, Массачусетс, США) в условиях, соответствующих одному из четырех вариантов, в которых рН доводили с помощью 3н NaOH (раствора гидроксида натрия): 1) контроль (без корректировки рН); 2) корректировка рН до 7,0; 3) корректировка рН до 8,0; и 4) корректировка рН до 9,0. Затем центрифугаты продавливали через шприцевые фильтры с диаметром пор 0,45 мкм с относительной силой, необходимой для фильтрации приблизительно 3 мл материала.

Результаты, полученные в пяти сериях экспериментов, описанных выше, представлены на Фигуре 7, в виде графика зависимости концентрации полисахарида (ПС), концентрации белков и относительной фильтруемости центрифугатов серотипа 3 от рН центрифугата.

Значения концентрации полисахарида (мг/мл) и концентрации белков (г/10 л) указаны по оси ординат слева. Значения относительной фильтруемости указаны по оси ординат справа, и они соответствуют относительной силе, которую нужно приложить для продавливания приблизительно 3 мл центрифугата серотипа 3 через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,45 мкм по пятибалльной шкале (1=легко, 5=тяжело). Как показано на Фигуре 7, при более высоком уровне рН во всех экспериментальных циклах, кроме одного, наблюдали повышение фильтруемости. Результаты, приведенные на Фигуре 7, также демонстрировали, что очень низкое значение рН 3,0 обеспечивает успешное удаление белка, но затрудняет фильтрацию.

На основании выявленного влияния рН были проведены контролируемые лабораторные исследования для определения влияния рН на фильтрационную способность. Материал после центрифугирования получали в опытной установке и повторно центрифугировали в лаборатории. Лизат разделяли, и рН доводили до значений в диапазоне 5,0-8,5. Лизат помещали в камеру давления, в которой поддерживали постоянное давление. Лизат разливали по пробиркам через объемный фильтр CUNO 60SP (CUNO Inc., Meriden, Коннектикут, США), и анализировали пропускную способность фильтра. Такую процедуру проводили для каждого тестируемого уровня рН (5,0-8,5) и при разных значениях постоянного давления (5-20 фунтов на квадратный дюйм (psi)). Результаты приведены на Фигуре 8, где показано сравнение зависимостей скорости потока образцов центрифугата через объемные фильтры от времени как функцию рН центрифугата. Скорость потока (ось у) измеряли путем расчета отношения для каждой минуты фильтрации, при этом время в минутах делили на общую массу центрифугата в граммах, прошедшего через фильтр в данную минуту (чем меньше это отношение, тем выше скорость потока). Как показано на Фигуре 8, прохождение при повышенном рН 7,0-8,5 характеризовалось более высокой скоростью потока по сравнению с прохождением при более низких рН 5,0-6,0 при том же значении постоянного давления (10 psi). При рН 8,0, при постоянном давлении 10 psi или 20 psi скорость потока также была более высокой, чем при давлении 5 psi.

Далее проводили опытные запуски, включающие описанный выше этап корректировки рН (опытные запуски ниже в Таблице 2). Флаконы для посева, содержащие инокулят Streptococcus pneumonias 3 типа, выращивали в ферментерах. Клетки подвергали химическому лизису, а лизат либо центрифугировали, либо подвергали нагреванию и затем центрифугировали. После центрифугирования доводили рН (за исключением цикла IPPPN3-015), а лизат фильтровали через объемные фильтры и мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм перед последующим этапом очистки. Число фильтров, необходимых для обработки лизата, полученного из разных экспериментальных циклов, принимали за меру фильтруемости (чем ниже фильтруемость, тем чаще происходит засорение фильтров и тем больше фильтров нужно для обработки лизата). Данные в Таблице 2 указывают на то, что для обработки лизата, полученного в различных циклах с корректировкой рН до разного уровня от 7,5 и выше, с тепловой обработкой или без нее, потребовался только один объемный и один мембранный фильтр. В цикле -015 оценивали влияние рН 6,6 на фильтруемость. Как показывают данные для цикла -015 для обработки всего 37 л потребовалось три комплекта фильтров. Такие результаты получили даже при наличии в цикле -015 этапа нагревания для удаления белков. После корректировки рН оставшегося материала лизата из цикла -015 до значения 8,2 обработка оставшихся 68 л потребовала одного комплекта фильтров.

Таблица 2
Фильтруемость лизатов после корректировки рН в циклах лабораторного масштаба
Цикл рН Объем Объемные фильтры Мембранные фильтры Температура нагрева, °С Время нагревания/охлаждения (мин)
IPPPN3-001 8,0 82 л 1 1 Н/П Н/П
IPPPN3-003 7,5 80 л 1 1 Н/П Н/П
IPPPN3-004 9,0 90 л 1 1 Н/П Н/П
IPPPN3-006 8,5 85 л 1 1 Н/П Н/П
IPPPN3-007 8,5 96 л 1 1 Н/П Н/П
IPPPN3-010 8,0 88 л 1 1 Н/П Н/П
IPPPN3-011* 8,2 85 л 1 1 60 42/30/43
IPPPN3-012* 8,2 86 л 1 1 70 55/50/45
IPPPN3-013 8,1 90 л 1 1 Н/П Н/П
IPPPN3-014* 8,2 103 л 1 1 65 52/40/51
IPPPN3-015* 8,2 37 л 3 3 65 52/40/52
IPPPN3-015* 8,2 68 л 1 1 65 52/40/52
IPPPN3-016* 8,2 87 л 1 1 65 53/40/43
*Лизат подвергали тепловой обработке перед центрифугированием.

На основании лабораторных данных, представленных на Фигуре 7 и Фигуре 8, и возможностей корректировки рН в опытной обстановке для технологической обработки в качестве предпочтительного диапазона рН, улучшающего фильтруемость лизатов серотипа 3, установили рН 8,2±0,2.

В настоящей заявке термины в единственном числе относятся к одному или более (т.е. к по меньшей мере одному) из обозначаемых объектов. Например, «элемент» означает один или более элементов.

Все публикации и заявки на патенты, упоминаемые в подробном описании, указывают на уровень, доступный специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации и заявки на патенты включены в данную заявку посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была бы особо и индивидуально указана посредством ссылки.

Хотя выше настоящее изобретение описано до определенной степени детальности посредством иллюстрации и примеров в целях лучшего понимания, возможны некоторый изменения и модификации в рамках объема прилагающейся формулы изобретения.

1. Способ очистки полисахаридов Streptococcus pneumoniae серотипа 3 от белковых примесей, включающий следующие этапы:
а. нагревание лизата по меньшей мере до 60°С в течение по меньшей мере 30 мин с тем, чтобы вызвать агрегацию и осаждение белков; и
б. отделение осажденных веществ от указанного лизата с получением, по существу, очищенного лизата, содержащего полисахариды серотипа 3.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап а) включает нагревание указанного лизата до 60-70°С.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что этап а) включает нагревание указанного лизата в течение 30-50 мин.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что этап а) включает нагревание указанного лизата до по меньшей мере 65°С в течение 40 мин.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап б) включает фильтрацию указанного лизата с осуществлением удаления осажденных веществ из указанного лизата.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанный лизат фильтруют с использованием по меньшей мере одного фильтра, выбранного из группы, включающей мембранный фильтр и объемный фильтр.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный мембранный фильтр представляет собой мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап б) включает центрифугирование указанного лизата с удалением осажденных веществ из указанного лизата.

9. Способ очистки полисахаридов Streptococcus pneumoniae серотипа 3 от белковых примесей, включающий этапы:
а. повышения рН указанного лизата или центрифугата клеток Streptococcus pneumoniae до по меньшей мере 8,0; и
б. фильтрации указанного лизата или центрифугата с получением, по существу, очищенного лизата, содержащего полисахариды серотипа 3.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что рН указанного лизата или центрифугата перед фильтрацией повышают до значений от 8,0 до 8,4.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что рН указанного лизата или центрифугата перед фильтрацией повышают до значения 8,2.

12. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанный лизат фильтруют с использованием по меньшей мере одного фильтра, выбранного из группы, включающей мембранный фильтр и объемный фильтр.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный мембранный фильтр представляет собой мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

14. Способ очистки полисахаридов Streptococcus pneumoniae серотипа 3 от белковых примесей, включающий этапы:
а. нагревание лизата клеток Streptococcus pneumoniae по меньшей мере до 60°С в течение по меньшей мере 30 мин с тем, чтобы вызвать агрегацию и осаждение белков;
б. центрифугирование указанного лизата и отделение осажденных белков от указанного лизата с получением центрифугата;
в. повышение рН указанного лизата или центрифугата по меньшей мере до 8,0; и
г. фильтрация указанного лизата с получением, по существу, очищенного лизата, содержащего полисахариды серотипа 3.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что этап а) включает нагревание указанного лизата до температуры 60-70°С.

16. Способ по п.14, отличающийся тем, что этап а) включает нагревание указанного лизата в течение примерно 30-50 мин.

17. Способ по п.14, отличающийся тем, что этап а) включает нагревание указанного лизата до 60°С в течение 40 мин.

18. Способ по п.14, отличающийся тем, что этап в) включает повышение рН указанного центрифугата до значений в диапазоне от 8,0 до 8,4.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что этап в) включает повышение рН указанного центрифугата до 8,2.

20. Способ по п.14, отличающийся тем, что этап г) включает фильтрацию указанного центрифугата с использованием по меньшей мере одного фильтра, выбранного из группы, включающей мембранный фильтр и объемный фильтр.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанный мембранный фильтр представляет собой мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

22. Способ очистки полисахаридов Streptococcus pneumoniae серотипа 3 от белковых примесей, включающий этапы:
а. снижение рН указанного лизата клеток Streptococcus pneumoniae до значения в диапазоне от 3,0 до 5,0, с осуществлением агрегации и осаждения белков;
б. центрифугирование указанного лизата и отделение осажденных белков от указанного лизата с получением центрифугата;
в. повышение рН указанного лизата или центрифугата по меньшей мере до 8,0; и
г. фильтрация указанного лизата с получением, по существу, очищенного лизата, содержащего полисахариды серотипа 3.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что этап а) включает понижение рН указанного лизата до 3,0, с осуществлением агрегации и осаждения белков.

24. Способ по п.22, отличающийся тем, что этап в) включает повышение рН указанного центрифугата до значений в диапазоне от 8,0 до 8,4.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что этап в) включает повышение рН указанного центрифугата до 8,2.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанный центрифугат фильтруют с использованием по меньшей мере одного фильтра, выбранного из группы, включающей мембранный фильтр и объемный фильтр.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанный мембранный фильтр представляет мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

28. Способ по п.22, отличающийся тем, что этап а) дополнительно включает нагревание указанного лизата до по меньшей мере 60°С в течение по меньшей мере 30 мин.

29. Способ по п.22, отличающийся тем, что этап а) дополнительно включает нагревание указанного лизата до 60-70°С.

30. Способ по п.22, отличающийся тем, что этап а) дополнительно включает нагревание указанного лизата в течение 30-50 мин.

31. Способ по п.22, отличающийся тем, что этап а) дополнительно включает нагревание указанного лизата 60°С в течение 40 мин.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к набору олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации РНК энтеровирусов.

Изобретение относится к биохимии и касается способа получения коменовой кислоты. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам выделения чистой культуры микроорганизмов из патологического биоматериала, и может быть использовано в ветеринарной медицине и животноводстве.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу диагностики биоматериалов на наличие в них агробактерий. .

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и может быть использовано для получения основного протективного антигена холерного вибриона В-субъединицы холерного токсина, применяемого в дальнейшем для получения антитоксических сывороток, высокоспецифических иммуноглобулинов и диагностических тест-систем, а также в качестве компонента, добавляемого к вакцинным препаратам.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции. .
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов в искусственных питательных средах при бактериологической диагностике дифтерии.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению белков, обладающих нейромодуляторным действием по отношению к никотиновым ацетилхолиновым рецепторам человека, и может быть использовано в медицине.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для получения биоинсектицида для борьбы с большой восковой молью. .
Изобретение относится к области иммунофармакологии и касается способа иммобилизации липополисахарида Shigella flexneri 2a на твердом гидрофобном носителе. .

Изобретение относится к области переработки древесного сырья, в частности его отходов, для последующего получения из них сахаров (полисахаридов и др.), используемых, например, в производстве спиртов.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения биологического средства - пищевых волокон, улучшающих работу пищевого тракта. .
Изобретение относится к биотехнологии. .
Наверх