Средство, индуцирующее дифференцировку стволовых кроветворных клеток в тромбоциты

Изобретение относится к области медицины. Заявлено средство, индуцирующее дифференцировку стволовых кроветворных клеток в тромбоциты, представляющее собой рекомбинантный циклофилин А человека (рчЦфА). Изобретение обеспечивает расширение ассортимента средств указанного назначения. 2 ил.

 

Изобретение относится к области медицины.

Применение химиотерапии у онкологических больных приводит к повреждению и гибели кроветворных клеток костного мозга со снижением количества тромбоцитов в периферической крови. Тромбоцитопения является серьезной проблемой в лечении онкологических больных (Lorusso D, Ferrandina G, Greggi S, Gadducci A, Pignata S, Tateo S, Biamonte R, Manzione L, Di Vagno G, Ferrau' F, Scambia G. // Phase III multicenter randomized trial of amifostine as cytoprotectant in first-line chemotherapy in ovarian cancer patients. Ann. Oncology. 2003 Jul; 14(7): 1086-93).

Известно ограниченное количество средств, способствующих дифференцировке тромбоцитов. Наиболее близким к заявляемому средству является тромбопоэтин (прототип). Тромбопоэтин - гормон, индуцирующий дифференцировку мегакариоцитарного ростка из стволовых клеток костного мозга и влияющий на пролиферацию, созревание и дифференцировку мегакариоцитов и образование тромбоцитов (Nagahisa H, Nagata Y, Ohnuki T, Osada M, Nagasawa Т, Abe T, Todokoro K. // Bone marrow stromal cells produce thrombopoietin and stimulate megakaryocyte growth and maturation but suppress proplatelet formation. Blood. 1996 Feb 15; 87(4):1309-16).

Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, индуцирующих дифференцировку тромбоцитов. Задача решается тем, что предлагается новое средство, индуцирующее дифференцировку тромбоцитов, представляющее собой рекомбинантный циклофилин А человека (рчЦфА).

РчЦфА известен как белок с молекулярной массой 18 кД, присутствующий в различных тканях, усиливает миграцию стволовых клеток, предшественников дендритных клеток, гранулоцитов и лимфоцитов из костного мозга на периферию, способствует дифференцировке дендритных клеток и гранулоцитов (Khromykh L.M., Kulikova N.L., Anfalova T.V. et al. // Cyclophilin A produced by thymocytes regulates the migration of murine bone marrow cells. Cell Immunol. - 2007. - vol. 249(1). - p.46-53; Bharadwaj U, Zhang R, Yang H, Li M, Doan LX, Chen C, Yao Q. // Effects of cyclophilin A on myeloblastic cell line KG-1 derived dendritic like cells (DLC) through p38 MAP kinase activation. J Surg Res. 2005 Jul 1; 127(1):29-38; Патент РФ №2370277).

РчЦфА усиливает адгезивные свойства тромбоцитов (Патент РФ №2435607). Для выполнения поставленной задачи оценивали влияние рчЦфА на дифференцировку стволовых клеток лейкаферезного концентрата и костного мозга онкологических больных после химио-лучевой терапии и здоровых доноров. Дифференцировку клеток тромбоцитарного ростка оценивали по экспрессии маркера CD61, который присутствует на всех этапах становления тромбоцитов от стволовых до зрелых клеток.

Для получения рчЦфА использовали клетки Escherichia coli BL21, трансформированные плазмидой pCyPAwt/pGEX-2TK (M.Bukrinsky Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University, США). Качество полученного рчЦфА оценивали с помощью SDS-PAAG по Лэммли (U.K.Laemmli. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature, 1970; V.227, P.680-685). Концентрацию рчЦфА определяли по методу Бредфорда (Bradford, M.M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72:248-254). Идентификацию рчЦфА проводили с помощью Wetstern-blott анализа (Gershoni JM, Palade GE. Electroblotting of proteins from polyacrylamide gels. Methods Mol Biol. 2004; 244:345-352) с использованием кроличьих антител к рчЦфА (е-Biosciences). Чистота полученного рчЦфА составила более 98%.

Для исследования использовали лейкаферезный концентрат, представляющий собой фракцию клеток периферической крови с преобладанием мононуклеаров. Лейкаферезный концентрат получали у пяти онкологических больных после химио-лучевой терапии путем сепарации клеток периферической крови.

В качестве образцов использовали костный мозг трех онкологических больных и трех здоровых доноров.

С целью мобилизации стволовых кроветворных клеток пациентам предварительно проводили стимуляцию кроветворения гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ) в стандартной дозе 5 мкг/кг в течение 3-14 дней. Количество CD34+ стволовых клеток в аликвотах образцов ленкаферезного концентрата варьировало от 0,25% до 1,3%, в аликвотах образцов костного мозга от 2,1% до 5,8%.

Клетки крови и костного мозга человека культивировали при концентрации 1×106/мл в питательной среде альфа-МЕМ (для клеток крови, Gibco) и IMDM (для клеток костного мозга, Gibco) с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2-меркаптоэтанола 5×10-5 M, L-глютамина 2 мМ и цифрана 100 мкг/мл. Культивирование клеток проводили при температуре 37°C в присутствии 5% CO2 в пластиковых 24-луночных планшетах (Corning) в течение 5 дней. Концентрация рчЦфА составила 10,0 мкг/мл.

Анализ клеточных маркеров проводили при помощи проточного цитофлюориметра Faxcanto II (Beckton Dickenson) с использованием флюоресцентномеченных антител анти-CD61Fitc (E-Bioscience). Контрольные маркеры были установлены в соответствии с изотипическим контролем: анти-IgG Fitc. Для исключения неспецифического окрашивания до окраски с флюоресцентными антителами клетки человека инкубировали с донорской сывороткой крови (IV группа) в разведении 1:10. Погибшие клетки исключали путем гейтирования в параметрах прямого и бокового рассеивания (FSC/SSC), а также включения 7-амино-актиномицина D (Calbiochem, CA). Данные анализировали при помощи программ BD FACSDiva (версия 6.1.2, Beckton Dickinson) и WinMDI 2.8 (J.Trotter, http://facs.scripps.edu/).

Изобретение иллюстрировано фиг.1 и 2.

На фиг.1(А-Г) представлено влияние рчЦфА на дифференцировку тромбоцитов в лейкаферезном концентрате.

На фиг.1 (А и Б) по оси абсцисс обозначен уровень экспрессии маркера CD34, по оси ординат (SSC) - уровень клеточной гранулярности. На фиг.1А представлена идентификация стволовых клеток, несущих маркер CD34+, в контроле, и на фиг.1Б - в присутствии рчЦфА (очерченный регион).

На фиг.1(В и Г) по оси абсцисс показан уровень экспрессии маркера CD61, по оси ординат - уровень экспрессии маркера CD34. На фиг.1В представлено количество стволовых клеток, несущих маркер CD61 в контроле (24,69%), и на фиг.1Г - под влиянием рчЦфА (65,81%).

На фиг.2 (А-Г) показано влияние рчЦфА на дифференцировку тромбоцитов в костном мозге.

На фиг.2 (А и Б) по оси абсцисс обозначен уровень экспрессии маркера CD34, по оси ординат - уровень клеточной гранулярности (SSC).

На фиг.2А представлена идентификация стволовых клеток костного мозга в контроле и на фиг.2Б - в присутствии рчЦфА (очерченный регион).

На фиг.2 (В и Г) по оси абсцисс показан уровень экспрессии маркера CD61, по оси ординат - уровень экспрессии маркера CD34.

На фиг.2 В представлено количество стволовых клеток, несущих маркер CD61 в контроле (1,11%) и на фиг.2Г - под влиянием рчЦфА (3,83%).

Таким образом, показано, что под влиянием рчЦфа наблюдается увеличение количества стволовых клеток, экспрессирующих маркер CD61, в лейкаферезном концентрате и костном мозге - в 3 раза относительно контрольных значений.

Технический результат изобретения

Средство, индуцирующее дифференцировку тромбоцитов, представляет собой рекомбинантный циклофилин А человека.

Средство, индуцирующее дифференцировку стволовых кроветворных клеток в тромбоциты, представляющее собой рекомбинантный циклофилин А человека.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и представляет собой обладающую активностью стимулятора гемопоэза комбинацию бис-( -L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевой соли и координационных соединений, образованных палладием, медью и ( -L-глутамил)-L-цистеинил-глицином, где мольное соотношение бис-( -L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевая соль: палладий: медь находится в диапазоне 100-10000:1-10:1-10.
Изобретение относится к медицине, а именно к реаниматологии и интенсивной терапии, и может быть использовано при лечении геморрагического шока I, II и III степени тяжести.

Изобретение относится к замещенным оксазолидинонам формулы в которой R1 означает метил, этил, н-пропил, метокси, метоксиметил или этоксиметил, R 2 означает водород или метил и R3 означает группу формул или где * означает место присоединения к кольцу оксопиридина, n означает число 1, 2, 3 или 4, m означает число 1 или 2, R4 означает водород, метил, этил, циклопропил, циклобутил, 2-гидроксиэт-1-ил, 3-гидроксипроп-1-ил или 4-гидроксициклогекс-1-ил, R5 означает водород, метил или этил, или R4 и R5 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют кольцо морфолин-4-ила, кольцо 4-метил-пиперазин-1-ила или 4-гидрокси-пиперидин-1-ила, R6 означает водород, циклопропил, циклобутил, 2-гидроксиэт-1-ил, 3-гидроксипроп-1-ил, 2-метоксиэт-1-ил, 3-метоксипроп-1-ил, 4-гидроксициклогекс-1-ил, тетрагидрофуран-2-илметил или 1,4-диоксан-2-илметил, R7 означает водород, метил или этил, или R6 и R 7 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют кольцо пирролидин-1-ила, кольцо 2-метоксиметил-пирролидин-1-ила, кольцо 1,1-диоксо-тиоморфолин-4-ила, кольцо 1,4-оксазепан-4-ила, кольцо 4-метил-пиперазин-1-ила или 4-гидрокси-пиперидин-1-ила, или к их физиологически приемлемым солям.

Изобретение относится к соединениям общей формулы (I), где n означает 0, 1, 2 или 3, R1 означает хлор, метил, этил, н-пропил, метокси, метоксиметил или этоксиметил, R2 означает водород.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой имплантируемое медицинское устройство, содержащее внутрипросветную имплантируемую конструкцию; первое покрытие, содержащее комбинацию из рапамицина и пробукола в лечебных дозах, заключенных в первом полимерном материале, при этом первое покрытие присоединено к поверхности внутрипросветной имплантируемой конструкции; и второе покрытие, содержащее второй полимерный материал, присоединенное к первому покрытию, для регулирования скорости элюирования рапамицина и пробукола, при этом второй полимерный материал содержит фторполимер.

Изобретение относится к соединениям формулы 1, где X и Т представляют собой N или С, Q представляет собой (3-7)-членный ароматический цикл, который содержит от О до 3 атомов азота в качестве членов цикла, и который необязательно бензоконденсирован, и замещен оксо; C1-С6-алкилом; галоген-С 1-С6-алкилом; гидрокси-С1-С6 -алкилом; C1-С6-алкокси; С6-С 10-арилом; или (3-7)-членным гетероарилом, содержащим от 1 до 3 атомов кислорода, Р представляет собой С1-С 6-алкил, необязательно замещенный галогеном, и R представляет собой группу, выбранную из: (i) - С1-С6 -алкил-R1, (ii) -NR2R3, (iii) -O-R4, (iv) -S-R5, (v) -C (=O)-R6 , (vi) необязательно замещенного (3-7)-членного гетероарила, содержащего от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из атома азота, атома кислорода и атома серы, (vii) необязательно замещенного, насыщенного или частично ненасыщенного, единственного или конденсированного (3-10)-членного гетероцикла, содержащего от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из атома азота, атома кислорода и атома серы, (viii) азидо; где каждый R1, R2, R3 , R4, R5, R6 является таким, как определено в формуле изобретения.

Изобретение относится к области иммунологии и может найти применение в биотехнологии и в иммунотерапии в качестве средства для стимулирования функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается фармацевтических препаратов, содержащих хелат бисглицината железа (2) в ассоциации со смесью подслащивающих веществ с улучшенными вкусовыми качествами.
Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано с целью повышения эффективности лечения больных деструктивными формами туберкулеза легких.

Изобретение относится к области ветеринарии и нормализации активности альфа 2 антиплазмина у новорожденных телят с железодефицитной анемией. .

Изобретение относится к области биохимии, а именно к биологически активным полипептидам, обладающим анальгетическим действием. .

Изобретение относится к блокирующим никотиновые холинорецепторы биологически активным пептидам, которые могут найти применение в области биохимии, биотехнологии и медицины.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармацевтической композиции для назального введения, содержащей гидрофильное биологически активное вещество и пептид, (а) имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1; (b) пептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:1, за исключением того, что одна или несколько аминокислот исключены, замещены и/или добавлены, где пептид обладает проницаемостью через слизистую оболочку носа; (с) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью, обратной (а) или (b), где пептид обладает проницаемостью через слизистую оболочку носа, любое из (а)-(с), при условии, что амидированный на С-конце пептид исключен.
Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для лечения периферических и центральных тапеторетинальных дистрофий. .
Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и касается лечения влажной формы возрастной макулярной дегенерации (ВМД). .

Изобретение относится к медицине и касается пептидов, представляющих фрагменты VIP; а также композиции, содержащей указанный пептид, для лечения фиброза миокарда и/или связанного с ним состояния.

Изобретение относится к применению антисекреторного белка (AF) или гомолога и/или фрагмента, обладающего антисекреторной активностью, и/или его фармацевтически активной соли, где указанный белок (АF) соответствует аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6 и/или где указанный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N:4 для приготовления фармацевтической композиции или лечебного продукта для лечения или профилактики компартмент-синдрома.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к использованию рекомбинантных белков для лечения млекопитающих, страдающих от злокачественных опухолей.

Изобретение относится к медицине и касается применения эпидермального фактора роста (EGF) для получения инъецируемой фармацевтической композиции, где указанную композицию вводят посредством инфильтрации на периферии нервных стволов и/или ганглиев, для морфофункционального восстановления периферических нервов при болезненной сенсомоторной невропатии или ишемическом неврите.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к полипептидам и составу для профилактики или лечения гипертрофии миокарда, применению и способам получения указанных полипептидов

Изобретение относится к области медицины

Наверх