Способ прогнозирования клинической формы хронического лимфолейкоза


 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2490642:

Федеральное бюджетное учреждение науки "УФИМСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНЫ ТРУДА И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА" (RU)

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования агрессивной формы хронического лимфолейкоза. Из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК с последующими амплификацией и рестрикцией. Проводят генотипирование полиморфного локуса 309T>G гена MDM2. При выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития агрессивной формы хронического лимфолейкоза. Использование изобретения повышает точность прогнозирования агрессивной формы у больных хроническим лимфолейкозом на самых ранних стадиях развития заболевания. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, может быть использовано для прогнозирования риска развития хронического лимфолейкоза.

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) - моноклональное заболевание крови, относящееся к гемобластозам и характеризующееся накоплением атипичных В-лимфоцитов, преимущественно, в крови, костном мозге, лимфатических узлах, печени и селезенке.

При исследовании механизмов такого сложного многостадийного процесса, как опухоль, мутациям генов отводится большая роль. Хотя изменение отдельного онкогена может вызывать предрасположенность к раку, для того чтобы опухоль развилась, необходимы последующие мутации, затрагивающие другие онкогены, в частности, гены-суппрессоры опухолей или гены, контролирующие программируемую клеточную смерть. Каждый из генов, принадлежащих к этим трем категориям, выполняет свою роль по разным механизмам. Вопрос о том, как они взаимодействуют в многоступенчатом процессе, приводящем в конечном счете к возникновению раковой клетки, и какова их роль в нормальных процессах жизнедеятельности, до конца не раскрыт.

Белок р53 - это транскрипционный фактор, который регулирует клеточный цикл и является супрессором образования злокачественной трансформации клеток (р53, OMIM 191170. В нормальных условиях, наряду с белком р53, в клетке экспрессируется главный регулятор супрессора опухолей р53 - белок MDM2 (OMIM 164785). N-концевой домен белка MDM2 связывается с N-концевым трансактивирующим доменом белка р53, что ведет к снижению активности последнего. Показано, что повышенная экспрессия белка MDM2 является важным фактором прогрессии опухолей. Ген белка MDM2 локализован на длинном плече 12 хромосомы в локусе 12q14.3-12q15.

Существует много предложений по прогнозированию различных форм ХЛЛ на основе данных биохимического, иммунохимического, цитологического и молекулярно-генетического обследования. Так, Т.П.Загоскиной, В.И.Шардаковым, Е.Л.Назаровой, М.М.Куликовой, И.М.Земцовой предложен способ дифференциальной диагностики доброкачественной и прогрессирующей формы хронического лимфолейкоза на основе определение β2-микроглобулина в сыворотке крови с помощью радиоиммунологического метода с I125 в дебюте заболевания, на ранних стадиях опухолевого процесса, отличающийся тем, что доброкачественную форму ХЛЛ определяют уровнем β2-микроглобулина <5 мг/л; а прогрессирующую >5 мг/л (RU 2242004, 2003 г.). Однако данный метод остается достаточно трудоемким и дорогостоящим. Также его недостатком, на который указывают авторы, является прогнозирование формы заболевание лишь в его дебюте.

Известен способ дифференциальной диагностики развернутой и терминальной стадии ХЛЛ (Цепова Е.Л., Литвинов А.В.). В крови больного определяют способность эритроцитов сорбировать витальные красители. При значении сорбционной способности эритроцитов менее 44,5% судят о развернутой стадии, при ее значении более 44,5% - о терминальной стадии ХЛЛ [патент RU 2138808, 1999 г.]. Существенным недостатком этого способа является отсутствие ранней диагностики ХЛЛ.

Известен способ диагностики форм ХЛЛ (Дудко Е.Т., Тищенко Л.М.). В лимфоцитах периферической крови больного определяют количество ядрышковых организаторов на клетку путем импрегнации серебром и при значении их 1,0-1,39 диагностируют прогрессирующий вариант ХЛЛ, а при значении - 1,4-1,7 диагностируют опухолевую форму заболевания [патент RU 2068995, 1996 г.]. Способ позволяет упростить диагностику форм ХЛЛ и повысить ее точность. Недостатками данного метода является, невозможность диагностики ХЛЛ до начала заболевания и в ранних периодах заболевания.

Прототипом изобретения является способ прогнозирования течения и развития хронического лимфолейкоза, предложенный Б.А.Бакировым, А.Б.Бакировым, Т.В.Викторой, О.В.Гринчук [патент RU 2248574, 2003], включающий генотипирование полиморфных локусов генов TNFA и TNFB, на основе которого делается прогноз о течении и риске развития ХЛЛ. Недостатком данного способы является то, что прогнозирование основано на двух генных полиморфизмах, точность прогнозирования ниже.

Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования агрессивной и доброкачественной формы ХЛЛ на самых ранних стадиях развития заболевания.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования агрессивной формы хронического лимфолейкоза, включающем исследование лимфоцитов периферической венозной крови, выделение ДНК с последующими амплификацией и рестрикцией, согласно изобретению проводят генотипирование полиморфного локуса 309T>G гена главного регулятора супрессора опухолей р53 (MDM2) и при выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития агрессивной формы хронического лимфолейкоза.

Предлагаемый способ прогнозирования клинической формы хронического лимфолейкоза осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической венозной крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press; - 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трисHCl (pH 7,6).

2. Смесь центрифугируется 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, pH 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°C.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трисHCl до pH 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной H2O; раствор хранят при -20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательность олигонуклеотидных праймеров для полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 F: 5'-CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG-3' R: 5'-CTGAGTCAACCTGCCCACTG-3'. Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 тМ MgCl2, 16,6 mM (NH4)2SO4, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°C, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°C - 45 секунд, 55°C - 45 секунд, 72°C - 45 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°C в течение 7 минут.

Нуклеотидную замену T→G в положении 309 гена MDM2 выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Msp A1I, смесь выдерживают при 37°C в течение 10-12 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl pH=7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с pH=8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Генотипы полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 157 пар нуклеотидов (пн) идентифируется аллель Т и гомозиготный генотип ТТ, при наличии двух фрагментов размером 157 и 109 пн идентифицируется гетерозиготный генотип TG, при наличии фрагмента размером 109 пн идентифицируется гомозиготный по редкому аллелю генотип GG. При генотипировании полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 генетическим маркерами злокачественной формы ХЛЛ является генотип GG полиморфного локуса 309T>G гена MDM2.

Обследовано 133 больных ХЛЛ, находившихся на стационарном лечении в гематологическом отделении Республиканской клинической больнице. Средний возраст обследованных пациентов, отобранных случайным образом, составил 49,57±1,42 лет. Половое соотношение мужчин к женщинам - 56,4% (75) к 43,6%(58). Клиническое обследование больных проводилось врачами больницы и включало в себя обязательные и дополнительные методы исследования.

В группу с агрессивной формой ХЛЛ вошли больные с прогрессирующим развитием заболевания (быстрое нарастание лимфоузлов и селезенки, диффузный или диффузно-интерстициальный рост опухоли в костном мозге), опухолевой трансформацией клеток (наличие больших плотных конгломератов лимфоузлов, диффузный рост опухоли в костном мозге) и абдоминальной формой (отличающейся наличием конгломератов лимфоузлов в брюшной полости и диффузной пролиферацией в трепанате), плохим ответом на проводимую терапию, небольшим сроком выживаемости. Так же включена опухолевая, спленомегалическая и костномозговая форма классификации А.И. Воробьева. В группу с доброкачественным течением вошли все остальные пациенты.

Больные наблюдались в амбулаторных условиях. Длительность наблюдения с момента установления заболевания более двух лет.

С целью выявления клинико-генетических особенностей течения ХЛЛ проведено исследование полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 между группой с агрессивной и доброкачественной формой хронического лимфолейкоза (таблица).

Проведя статистический анализ связи полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 с течением ХЛЛ было показано, что генотип GG связан со злокачественным течением заболевания (χ2=4,87; p=0,028; OR=3,27; 95% CI 1,22-8,72), также показано, что генотип TG ассоциирован с доброкачественным течением ХЛЛ (χ2=6,50; p=0,012; OR=0,36; 95% CI 0,18-0,76).

На основании полученных результатов можно сделать вывод об ассоциации генотипа GG полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 с агрессивной формой ХЛЛ.

Для иллюстрации приведем клинический пример. Больной К., 1975 года рождения, город Ишимбай, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в марте 2008 года, подтвержден стернальной пункцией, костный мозг богат клеточными элементами, представлен зрелыми лимфоцитами 79%. Химиотерапию не получал. В настоящее время диагноз ХЛЛ, стадия по K. Rai II. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 выявило у больного генотип GG, что позволило, соответственно, прогнозировать агрессивную форму ХЛЛ. Прогноз был подтвержден в результате наблюдения за пациентом, у которого наблюдалось быстрое нарастание лимфоузлов и селезенки, диффузный рост опухоли в костном мозге, плохой ответом на проводимую терапию, срок жизни после постановки диагноза 6 месяцев.

Таблица
Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 в группах со злокачественной формой и доброкачественной формой ХЛЛ
Злокачественная форма ХЛЛ (N=55) Доброкачественная форма (N=68) χ2 P OR CI - 95%
Абс. % Абс. %
TT 18 32,73 17 25,00 0,55 0,458 1,46 0,67-3,21
TG 22 40,00 44 64,71 6,50 0,012 0,36 0,18-0,76
GG 15 27,27 7 10,29 4,87 0,028 3,27 1,22-8,72
T 58 52,73 78 57,35 0,36 0,551 0,83 0,50-1,38
G 52 47,27 58 42,65 0,36 0,551 1,21 0,73-2,00

Способ прогнозирования агрессивной формы хронического лимфолейкоза, включающий исследование лимфоцитов периферической венозной крови, выделение ДНК с последующими амплификацией и рестрикцией, отличающийся тем, что проводят генотипирование полиморфного локуса 309T>G гена главного регулятора супрессора опухолей p53 (MDM2) и при выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития агрессивной формы хронического лимфолейкоза.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины. .
Изобретение относится к области медицины. .

Изобретение относится к области медицины. .

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и может найти применение для прогнозирования периода безрецидивной выживаемости при раке шейки матки (РШМ).

Изобретение относится к биохимии, в частности к определению активности пируватдегидрогеназного комплекса (PDH комплекса) путем 13C-МР обнаружения (магнитно-резонансного обнаружения на основе изотопа 13C).

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу скрининговой диагностики инсулинорезистентности. Способ основан на определении биохимических показателей сыворотки венозной крови, в которой ферментативным методом определяют показатели липидного спектра и глюкозы. Согласно заявленному способу проводили однократный забор крови у пациента из локтевой вены натощак после 12 часового голода, затем в сыворотке венозной крови определяли показатели холестерина липопротеидов высокой плотности прямым ферментативным колориметрическим методом (direct HDL-Cholesterol), уровня триглицеридов ферментативным колориметрическим методом реакцией GPO-PAP и концентрацию глюкозы гексокиназным методом, затем рассчитывали показатель инсулинорезистентности (МИ) по формуле. При значении показателя МИ≥7,0 диагностировали инсулинорезистентность. Использование заявленного способа позволяет дать качественную и количественную оценку состояния инсулинорезистентности и подтверждает высокую информативность при скрининговых обследованиях, является высокоинформативным при скрининговых обследованиях. 2 табл., 2 ил.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования отслойки хориона и плаценты на ранних сроках беременности. Осуществляют выделение ДНК с последующей амплификацией полиморфизма -675 5G>4G гена ингибитора активатора плазминогена I типа (PAI-1) при помощи метода ПЦР. Вероятность развития отслойки хориона и плаценты у женщин с высоким риском самопроизвольных репродуктивных потерь при генотипе 4G/4G прогнозируют как 50,0%, при генотипе 4G/5G - как 35,3%. Изобретение позволяет с довольно высокой точностью прогнозировать вероятность отслойки хориона и плаценты на ранних сроках, что способствует более рациональному ведению беременности и улучшению ее исходов. 3 табл., 1 пр.

Настоящее изобретение относится к способу прогнозирования клинического течения лимфопролиферативных заболеваний кожи. Заявленный способ включает проведение гистологических исследований биоптатов пораженной кожи, исследование сыворотки периферической крови, определение пола, возраста, социально-профессиональной принадлежности, а также факторов, способствующих заболеванию, оценку прогностических коэффициентов каждого из указанных факторов и суммирование полученных значений. В случае когда указанная сумма прогностических коэффициентов составляет 11,1-17,3, прогнозируют низкую вероятность ухудшения клинического течения заболевания, 17,4-23,6 - среднюю вероятность, а 23,7-29,9 - высокую вероятность ухудшения клинического течения заболевания. Заявленное изобретение обеспечивает повышение точности прогнозирования клинического течения лимфопролиферативных заболеваний кожи для рационального выбора тактики наблюдения, ведения пациентов, выбора вида профилактики неблагоприятного течения заболевания. 9 ил., 2 табл., 3 пр.
Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования ответа на проводимую химиотерапию хронического лимфолейкоза. Проводят генотипирование полиморфного локуса 9360Т гена фактора роста эндотелия сосудов. При выявлении у больного генотипа СС или аллеля С прогнозируют высокую вероятность положительного ответа на проводимую химиотерапию. Способ повышает точность прогнозирования положительного ответа на проводимую химиотерапию у больных хроническим лимфолейкозом на самых ранних стадиях развития заболевания. 2 табл., 2 пр.
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения инфицированности пациента вирусом клещевого энцефалита, основанный на обнаружении РНК вируса методом РТ - ПЦР. Изобретение обеспечивает эффективный способ определения инфицированности пациента вирусом клещевого энцефалита за счет обнаружения РНК вируса клещевого энцефалита в капиллярной крови, забранной в месте присасывания клеща путем прокола кожным скарификатором. 2 пр.

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности к медицинским, химико-токсикологическим исследованиям, и описывает способ подготовки пробы для газохроматографического определения тиодигликолевой кислоты в моче, включающий дериватизацию, извлечение тиодигликолевой кислоты из пробы этилацетатом, где дериватизацию тиодигликолевой кислоты проводят метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты при температуре 80°C в течение 15 минут, а извлечение тиодигликолевой кислоты из пробы проводят этилацетатом путем жидкостно-жидкостной микроэкстракции в течение 5 минут, при этом все операции выполняют в одной емкости. Данный способ позволяет повысить чувствительность и точность, уменьшить продолжительность анализа, упростить пробоподготовку, сэкономить расходы особо чистых веществ. 3 табл., 1 пр., 2 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, может быть использовано для прогнозирования развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза. Сущность способа: проводят генотипирование полиморфного локуса - 248G>A гена Bcl-2 ассоциированного X белка (ВАХ - 248G>A). При выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза. Использование изобретения повышает точность прогнозирования «тлеющей» формы ХЛЛ на самых ранних стадиях развития заболевания. 3 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к инфектологии, и может быть использовано для прогнозирования развития периваскулярных нарушений у больных гриппом. Сущность способа: у больных гриппом определяют возрастную группу, срок наблюдения и значение ристомицин-агрегации тромбоцитов в сыворотке крови в секундах. Полученные данные подставляют в формулу: ПП=11,4+A*0,28-B*0,51-C*0,73, где ПП - прогностический коэффициент риска развития периваскулярных нарушений; 11,4 - константа математических расчетов для прогнозирования развития периваскулярных нарушений; А - возрастная группа пациентов, где 1 - первая группа, если возраст пациентов колеблется от 21 до - 35 лет, 2 - вторая группа - от 36 до 50 лет, 3 - третья группа - от 51 до 65 лет; В - срок наблюдения: 1 - 1-й срок - 1-3 дни болезни, 2 - 2-й срок - 4-5 дни болезни, 3 - 3-й срок - 6-8 дни, 4 - 4-й срок - 9-14 дни от начала заболевания, 5 - 5-й срок - один месяц от начала заболевания; С - значение ристомицин-агрегации тромбоцитов в сыворотке крови в секундах. Использование способа обеспечивает прогнозирование развития и выраженности периваскулярных нарушений в виде повышенной проницаемости сосудов и микрогеморрагий в микроциркуляторном русле у больных и переболевших гриппом. Также предлагаемый способ дает возможность предпринять комплекс мероприятий, направленных на своевременное выявление и предотвращение этих изменений и обоснованно проводить их коррекцию. 1 пр.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ дифференциальной диагностики тяжелой бронхиальной астмы, включающий определение вентиляционной функции легких и исследование мононуклеаров, выделенных из венозной крови больного, с последующим расчетом индекса, характеризующего воспалительный процесс. Моноциты культивируют в дендритные клетки. К половине культур добавляют N-этилкарбоксамидоаденозин (NECA). Полученные дендритные клетки собирают и анализируют на содержание мРНК ИЛ-8 при помощи полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Выполняют расчет вероятности Р отнесения индивида к группе больных тяжелой бронхиальной астмой по системе уравнений. При Р>0,5 диагностируют тяжелую бронхиальную астму. Изобретение позволяет дифференцировать тяжелую бронхиальную астму от бронхиальной астмы других степеней тяжести. 4 ил., 2 табл., 3 пр.
Наверх