Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза



Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза

 


Владельцы патента RU 2491551:

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике туберкулеза, и может быть использовано для определения видовой идентификации микобактерий у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза. Способ осуществляют путем определения в гепаринизированной венозной крови маркера, инкубируя кровь с антигенным материалом микобактерий (опытная проба) и физиологическим раствором (контрольная проба), затем в крови определяют уровень лимфоцитов с рецепторами CD45+ маркеров, меченых флюороизотианатом, и по снижению уровня флюоресценции меченых CD45+ лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной заключают, что организм инфицирован тем видом микобактерий, чей антигенный материал использовался для инкубации с кровью в опытной пробирке. Способ позволяет подтвердить факт инфицированности микобактериями, установить видовую принадлежность инфекционного агента, определить эффективность вакцинации и выполняется в короткие сроки в течение нескольких часов. Данный способ может применяться в диагностических лабораториях, в противотуберкулезных учреждениях, в общей лечебной сети для видовой идентификации микобактерий туберкулеза человеческого типа и микобактерий бычьего типа вакцинного штамма. 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике туберкулеза, и может быть использовано для определения видовой идентификации микобактерий у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза.

Известен способ определения инфицирования микобактериями туберкулеза по внутрикожной пробе Манту 2ТЕ, суть которого заключается в том, что положительная проба Манту является фактом наличия в организме микобактерий туберкулеза (1).

Недостатком данного способа является сложность интерпретации положительного результата и невозможность идентифицировать микобактерий человеческого типа и микобактерий бычьего типа вакцинного штамма.

Известен способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза с помощью внутрикожной пробы Диаскинтест. Проба Диаскинтест положительная только в случае активно размножающихся микобактерий человеческого типа (2).

Недостаток этого способа в том, что он идентифицирует микобактерий человеческого вида в фазе активного размножения и может быть сомнительным или отрицательным при доказанных случаях туберкулеза с бактериовыделением, при внелегочном туберкулезе.

Известен способ идентификации микобактерий туберкулеза с помощью бактериологического метода, посева на твердые питательные среды (3).

Недостатками данного способа является обязательное наличие микобактерий туберкулеза в исследуемом материале в большом количестве, длительность метода, ожидание результата до трех месяцев, низкая чувствительность метода, сложная последующая дифференцировка с дополнительными исследованиями.

Известен способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза с помощью ниацинового теста (4).

Недостатками данного способа является обязательное наличие микобактерий туберкулеза при культуральном исследовании, длительные и трудоемкие биохимические исследования. Методика позволяет идентифицировать микобактерий туберкулеза от нетуберкулезных микобактерий, но не позволяет дифференцировать микобактерий внутри комплекса.

Известен способ идентификации микобактерий туберкулеза с помощью полимеразной цепной реакции (5). Недостатками данного способа является обязательное наличие микобактерий туберкулеза в исследуемом материале, дорогостоящее оборудование, постоянная потребность в дорогостоящих расходных материалах.

Известен способ QuantiFERON-ТВ Gold in Tube, который является тестом для диагностики in vitro, содержащим коктейль пептидов ESAT-6, CFP-10, ТВ7.7(р4) и стимулирующих клетки в гепаринизированной цельной крови. Для определения in vitro реакции на антигены к этим пептидам, образующейся при инфицировании микобактериями туберкулеза служит определение γ-интерферона с помощью метода иммуноферментного анализа ELISA. Основой заявляемого способа является определение и последующее количественное определение γ-интерферона, пептидные антигены стимулируют образование γ-интерферона в Т-клетках пациентов, инфицированных микобактериями туберкулеза и не вызывают никакой реакции у неинфицированных людей. Значительный выброс интерферона-γ, регистрируемый после инкубации периферической крови с видовым антигеном микобактерий туберкулеза, является показателем присутствия в организме обследуемого пациента лимфоцитов, сенсибилизированных к микобактериям туберкулеза человеческого вида и указывает на факт инфицирования этим видом микобактерий (6).

Недостатком данного способа является высокая стоимость, невозможность с его помощью оценить микобактерий бычьего типа вакцинного штамма и эффективность вакцинации. Данный метод и выбран как прототип.

Целью изобретения является создание способа видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в крови определяют уровень лимфоцитов с рецепторами CD45+ маркеров, меченых флюороизотианатом и по снижению уровня флюоресценции меченых CD45+ лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы более чем на 20% судят о видовой идентификации микобактерий туберкулеза.

CD45+ - общий лейкоцитарный антиген - трансмембранный гликопротеин, выполняет важную функцию в передаче сигнала внутрь клетки с Т-клеточного рецептора и представлен на поверхности Т-клеток разными изоформами, относится к антигенраспознающим клеткам системы иммунитета, которые за счет морфо-функциональных особенностей молекулы CD45+ и кооперации CD45+ с мембранными антигенно-рецепторными комплексами лимфоцитов осуществляют процессы распознавания, инициации и регуляции развития ответных иммунологических реакций на антигены (7).

В основу способа положена дифференциация нативных CD45+ - лимфоцитов периферической крови от сенсибилизированных с использованием меченых флюороизотианатом методом лазерной проточной цитофлюориметрии по динамике уровня флюоресценции опытной и контрольных проб.

После инкубации периферической крови в трех пробирках, одна из которых является контрольной и содержит физиологический раствор, а две пробирки диагностические, при этом одна пробирка содержит 200 мкл раствора Диаскинтест, представляющая антигены ESAT-6, CFP-10, ТВ7.7р4, позволяющая диагностировать заражение микобактериями человеческого вида, а другая пробирка содержит раствор вакцинного штамма, позволяющая диагностировать наличие микобактерий бычьего типа. Идентификация вида микобактерий устанавливается по снижению интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом CD45+ - лимфоцитов более чем на 20% относительно контрольной пробирки. Снижение интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом CD45+ - лимфоцитов менее чем на 20% относительно контрольной пробирки является возможной естественной флуктуацией в процессе постановки реакции.

В основе заявляемого способа находится положение о том, что снижение CD45+ - лимфоцитов после инкубации периферической крови с антигенами микобактерий человеческого вида или микобактерий бычьего типа вакцинного штамма являются показателем присутствия в организме обследованного пациента лимфоцитов, сенсибилизированных к указанным антигенам микобактерий. Если в опытной пробирке регистрируется снижение CD45+ лимфоцитов более чем на 20% относительно контрольной пробы, то можно заключить, что организм инфицирован тем видом микобактерий, чей антигенный материал использовался для инкубации с периферической кровью в опытной пробирке.

Методика обследования: У пациента в положении сидя берется 3 мл периферической венозной крови и разливается по 1 мл с антикоагулянтом гепарином в приготовленные пробирки №1, №2, №3

Пробирка №1, контрольная - содержит 200 мкл физиологического раствора + 1 мл гепаринизированной венозной крови.

Пробирка опытная №2 - содержит 200 мкл диаскинтест, представляющий антигены микобактерий человеческого вида + 1 мл гепаринизированной венозной крови.

Пробирка опытная №3 - содержит 200 мкл раствора вакцины, представляющая антигены микобактерий бычьего типа вакцинного штамма + 1 мл гепаринизированной венозной крови.

Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают, пробирки инкубируют в термостате при 37С° в течение 24 часов. После инкубации в каждой пробирке определяется показатель средней интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом моноклональных антител к CD45+.

Определение уровня интенсивности флюоресценции CD45+ лимфоцитов в контрольных и опытных пробах проводят путем добавления к 100 мкл из каждой пробирки меченных флюороизотианатом моноклональных антител к CD45+. Далее все пробы инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации все пробы обрабатывают гемолизирующей смесью, в результате чего получают взвесь лейкоцитов и лимфоцитов, меченных комплексом флюороизотианатом моноклональных антител. Каждую полученную лейковзвесь анализируют с помощью лазерного проточного цитофлюориметра в режиме лимфогейта и определяют уровень интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом CD45+ лимфоцитов. Динамику интенсивности флюоресценции CD45+ лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы оценивают по формуле:

Снижение интенсивности флюоресценции CD45+ лимфоцитов в опытной пробе с антигенами микобактерий относительно контрольной пробы более 20% рассматривают в качестве показателя инфицирования исследованным агентом. Заявляемый способ иллюстрируется примером.

Пациент П., 6 лет, направлен после очередной ежегодной пробы Манту для проведения дифференциальной диагностики послевакцинной и инфекционной туберкулиновой аллергии. Из анамнеза вакцинирован BCG в роддоме, поствакцинальный рубчик 8 мм. При оценке пробы Манту по годам: размер папулы по годам 10, 8, 7, 11, 11 мм, отмечается монотонный характер пробы. Решить инфицирован ребенок микобактериями туберкулеза или это поствакцинальная аллергия по пробе Манту не представляется возможным.

Целью лабораторного обследования является видовая идентификация микобактерий туберкулеза человеческого типа и микобактерий бычьего типа вакцинного штамма.

В соответствии с прилагаемой методикой у пациента взято 3 мл периферической венозной крови и разлили по 1 мл в 3 пробирки с антикоагулянтом (гепарином) в соответствие с изложенной методикой.

- Пробирка №1 контрольная - содержала 200 мкл физ. раствора.

- Пробирка опытная №2 - содержала 200 мкл диаскинтест.

- Пробирка опытная №3 - содержала 200 мкл раствора вакцины BCG, предварительно разведенной в 1 мл дистиллированной воды.

Получили результаты. Пробирка №1 контрольная - 67,0%

Пробирка опытная №2 - 34,6%

Пробирка опытная №3 - 66,8%

1. Расчет для пробирки №2

Д и н а м и к а  ИФ CD45 +   =   67,0 34,6 67,0 × 100 % = 48,4 %

2. Расчет для пробирки №3

Д и н а м и к а  ИФ CD45 +   =   67,0 66,8 67,0 × 100 % = 0,29 %

Регистрируется снижение ИФср CD45+ - клеток крови в пробирке №2 в тест-системе с антигенами микобактерий туберкулеза человеческого типа на 48,4%.

Заключение. Инфицированность микобактериями туберкулеза человеческого типа.

Преимущество заявляемого способа перед известными заключается в том, что он позволяет подтвердить факт инфицированности микобактериями, позволяет установить видовую принадлежность инфекционного агента, позволяет установить эффективность вакцинации, выполняется в короткие сроки в течение нескольких часов и является значительно дешевле прототипа QuantiFERON-ТВ Gold.

Данный способ может применяться в диагностических лабораториях, в противотуберкулезных учреждениях, в общей лечебной сети для видовой идентификации микобактерий туберкулеза человеческого типа и микобактерий бычьего типа вакцинного штамма.

Источники

1. Фтизиатрия: Национальное руководство / под ред. Перельмана М.И. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. - С.184-195.

2. Кожная проба с препаратом «Диаскинтест» - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции / Под ред. Академика РАН и РАМН М.А.Пальцева. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2011. - С.40-96.

3. Приказ от 21 марта 2003 года №109 О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации. - Москва, 2003. - С.47-62.

4. Фтизиатрия: Национальное руководство / под ред. Перельмана М.И. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. - С.165-166.

5. Фтизиатрия: Национальное руководство / под ред. Перельмана М.И. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. - С.177.

6. Desem, N., Jones, S.L. // Development of a human interferon - y enzyme immunoassay and comparison with tuberculin skin testing for detection of Mycobacterium tuberculosis infection / Clin. Diag. Lab. Immunol. 1998. - №5. - Р.5316.

7. Koretzky G.A. // Role of the CD45 tyrosine phosphatase in signal transduction in the immune system / FASEB J. - 1993. - №7. - P.420-426.

Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза, включающий определение в гепаринизированной венозной крови in vitro маркера путем инкубации крови с антигенным материалом микобактерий (опытная проба) и физиологическим раствором (контрольная проба), отличающийся тем, что в крови определяют уровень лимфоцитов с рецепторами CD45+ маркеров, меченных флюороизотианатом, и по снижению уровня флюоресценции меченых CD45+ лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной заключают, что организм инфицирован тем видом микобактерий, чей антигенный материал использовался для инкубации с кровью в опытной пробирке.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области:- медицины, а именно к диагностике нарушений функции гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и мониторингу эффективности проводимой терапии; - иммуно-диагностики, а именно к определению уровня содержания натуральных антител в сыворотке крови; - пептидной химии, а именно к конструированию и модификации синтетических пептидных фрагментов для использования в качестве антигена для определения натуральных антител к природным белкам человеческого организма, в частности для определения натуральных антител к белку S100 человека.

Изобретение относится к медицине, в частности к гистологии, морфометрии, абдоминальной хирургии. .
Изобретение относится к медицине, в частности к пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности и оценки показаний к терапии системными глюкокортикоидами у больных с обострением хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования дискоординации родовой деятельности при доношенной беременности.
Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии и нейрохирургии, а именно к способам оценки функционального состояния спинальных мотонейронов при электростимуляции спинного мозга у больных с осложненной травмой верхне-шейного отдела позвоночника.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу изменения иммуномодулирующих свойств липополисахаридов чумного микроба в условиях in vitro, который включает получение препаратов липополисахаридов (ЛПС) и «мышиного» токсина (МТ) Yersinia pestis с последующим образованием их комплекса ЛПС-МТ.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, и может быть использовано в прогнозировании плацентарной недостаточности у беременных женщин с нарушением становления менструальной функции в пубертатном периоде по содержанию плацентарного фактора роста (P1GF) и его рецептора (VEGFR-1) в сыворотке крови.
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, трансплантологии и хирургии, и может быть использовано для проведения мониторинга донор-специфических антител к системе HLA после аллотрансплантации органа в течение пяти лет и более

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и касается прогнозирования эффективности лечения диабетической полинейропатии у больных сахарным диабетом 2 типа и дислипидемией

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и медицины. Предложено однодоменное антитело (наноантитело), специфически связывающее белок муцин 1 (MUC1) человека и охарактеризованное через полную аминокислотную последовательность. Также рассмотрен способ детекции белка MUC1 в биологических жидкостях человека с использованием наноантитела по изобретению. Изобретение может найти дальнейшее применение в диагностике и терапии рака. 2 н. и 1 з. п. ф-лы, 3 ил., 4 пр.

Настоящее изобретение относится к области молекулярной иммунологии, биотехнологии и медицины. Предложено однодоменное антитело (наноантитело), специфически связывающее карциноэмбриональный антиген (СЕА) человека и охарактеризованное через полную аминокислотную последовательность. Также рассмотрен способ детекции белка СЕА в биологических жидкостях и тканях человека с использованием наноантитела по изобретению. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в диагностике и терапии рака. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии и может быть использовано для прогнозирования развития необратимой дисфункции трансплантата у реципиентов после трансплантации сердца. Сущность изобретения заключается в следующем: оценивают уровень плацентарного фактора роста (P1GF) в плазме крови реципиентов сердца на этапе до трансплантации сердца и в сроки от 24 до 36 месяцев после трансплантации. При увеличении уровня P1GF более чем на 60% от дотрансплантационного, прогнозируют развитие необратимой дисфункции трансплантата. Использование изобретения обеспечивает возможность прогнозирования развития необратимой дисфункции трансплантата в отдаленные сроки у реципиентов после трансплантации сердца. 3 пр.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования гематогенного метастазирования при диффузном типе рака желудка путем иммуногистохимического исследования препаратов первичной опухоли. Для проведения исследования используют антитела Cyclophilin A Antibody (CypA) клон NBP 1-54388 при рабочем разведении 1:1200. При наличии позитивной цитоплазматической экспрессии CypA в клетках первичной опухоли прогнозируют низкий риск развития гематогенных метастазов. Изобретение позволяет прогнозировать низкий риск гематогенного метастазирования при диффузном типе рака желудка и избегать избыточной агрессивной адъювантной терапии. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающий определение наличия антител к антигенам семи серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis. Изобретение значительно упрощает и максимально сокращает диагностику лептоспироза, позволяет осуществлять оперативный контроль за эпизоотическим состоянием животных по лептоспирозу. Способ обладает высокой специфичностью, чувствительностью и стандартностью, а также обеспечивает создание безопасных условий труда для персонала диагностических лабораторий. 4 табл., 4 пр.

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающий определение наличия антител к антигенам семи серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis. Изобретение значительно упрощает и максимально сокращает диагностику лептоспироза, позволяет осуществлять оперативный контроль за эпизоотическим состоянием животных по лептоспирозу. Способ обладает высокой специфичностью, чувствительностью и стандартностью, а также обеспечивает создание безопасных условий труда для персонала диагностических лабораторий. 4 табл., 4 пр.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению эритроцитарного антительного диагностикума для индикации бруцелл в патматериале. Сущность изобретения включает способ получения эритроцитарного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с целью индикации бруцелл в патматериале, посредством изготовления формалинизированных эритроцитов, с последующей сенсибилизацией позитивной бруцеллезной сывороткой, при этом для изготовления эритроцитарного антительного диагностикума позитивную бруцеллезную сыворотку для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов разводят 1:50-1:100, инактивируют при 60°C в течение 30 минут, сенсибилизируют формалинизированные эритроциты, из расчета: осадок от 2 объемов 40%-ной взвеси эритроцитов барана, 1 объем 0,43-0,44% раствора свежеприготовленного амидола, 1,0-1,5 объем позитивной сыворотки, разведенной 1:50-1:100, и выдерживают в течение 28-32 минут при 55-56°C. Изобретение позволяет получить обладающий высокой активностью и специфичностью эритроцитарный бруцеллезный антительный диагностикум. 4 табл.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, патологической анатомии, и может быть использовано для прогнозирования воспалительных осложнений после операций по поводу колоректального рака. Способ состоит в том, что на 3-5 сутки после операции проводят иммуноцитохимическое исследование с целью выявления TLR 2, TLR 3, TLR 4 на лейкоцитах в перитонеальном выпоте, при этом исследование выполняют разведением антител к данным рецепторам - 1/200 и инкубацией в течение 12 часов в холодильной камере при температуре +4 - +8°С, и в случае выявления позитивной реакции на TLR 2 и/или TLR 3 и/или TLR 4 прогнозируют воспалительные осложнения в зоне оперативного вмешательства, а в случае негативной реакции - их отсутствие. Способ позволяет прогнозировать развитие воспалительных осложнений в зоне оперативного вмешательства, обладает простотой, доступностью, информативностью и надежностью. 4 пр.
Наверх