Диагностикум для определения донор-специфических антител к главному комплексу гистосовместимости и способ его получения

Группа изобретений относится к медицине и касается диагностикума, содержащего лимфоциты человека для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости в посттрансплантационном периоде, характеризующегося тем, что диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора; способа получения диагностикума; способа прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включающего реакцию на определение донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости, характеризующегося тем, что используют указанный диагностикум. Изобретение обеспечивает получение высококачественного диагностикума, содержащего Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа, для диагностики гуморального отторжения и оценки эффективности иммуносупрессивной терапии. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, трансплантологии и хирургии, и может быть использовано для проведения мониторинга донор-специфических антител к системе HLA после аллотрансплантации органа в течение пяти лет и более.

Трансплантация органов, тканей и клеток - это замена больному путем хирургической операции пораженного, изношенного органа, части его или ткани, полностью утративших способность выполнять свои функции. Согласно Закону РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» (в редакции от 20.06.2000 №91-ФЗ, от 16.10.2006 №160-ФЗ) является средством спасения жизни и восстановления здоровья граждан. Одной из главных причин потери трансплантата является реакция отторжения донорского органа. Различают сверхострую, острую и хроническую реакции отторжения. Сверхострая реакция отторжения протекает бурно с первых минут или часов после пересадки органа. Острая реакция отторжения развивается в период с 4 до 90 дня после операции. Хроническая реакция отторжения диагностируется через несколько недель, месяцев и лет после операции, может несколько раз рецидивировать после подавления ее иммуносупрессивной терапией. Реакция отторжения трансплантата обусловлена клеточными и/или гуморальными иммунными механизмами. В ответ на чужеродные человеческие лейкоцитарные антигены (HLA) в организме реципиента вырабатываются донор-специфические антитела (ДСА).

Для диагностики реакции отторжения производят биопсию трансплантата [Cornell LD, Smith RN, Colvin RB. Kidney transplantation: mechanisms of rejection and acceptance. Annu Rev Pathol 2008; 3:189-220; Tomasoni S, Remuzzi G, Benigni A. Allograft rejection: acute and chronic studies. Contrib Nephrol 2008; 159:122-34], по результатам которой может отмечаться смешанная гистологическая картина. Для интерпретации результатов биопсии используются универсальные, регулярно обновляемые критерии Банфф (Banff) [Solez K, Colvin RB, Racusen LC; Banff '05 Meeting Report: differential diagnosis of chronic allograft injury and elimination of chronic allograft nephropathy ('CAN') Am J Transplant 2007; 7(3):518-26;. Solez K, Colvin RB, Racusen LC; Banff 07 classification of renal allograft pathology: updates and future directions. Am J Transplant 2008; 8(4):753-60], на основании которых делается заключение о прогнозе и назначается лечение [Mengel M, Sis В, Halloran PF. SWOT analysis of Banff: strengths, weaknesses, opportunities and threatsof the international Banff consensus process and classification system for renal allograft pathology. Am J Transplant 2007; 7(10):2221-6]. В настоящее время маркером хронической посттрансплантационной нефропатии, опосредованной антителами, считают обнаружение методом иммунофлуоресцентной микроскопии C4d-фрагмента на поверхности эндотелия перитубулярных капилляров. Выявлена корреляция между отложением C4d и наличием в сыворотке реципиента донор-специфических антител.

Для исследования специфических антител используется ДИАГНОСТИКУМ - стандартный препарат, используемый в качестве антигена при серологических исследованиях. В настоящее время определение донор-специфических антител (ДСА) в посттрансплантационном периоде является важным диагностическим критерием реакции отторжения трансплантата. ДСА de novo могут образовываться как в ранние сроки на 3-21 сутки после трансплантации, так и через несколько лет после пересадки органа. Мониторинг донор-специфических антител у реципиента можно осуществлять в течение длительного времени после трансплантации только в том случае, если донор живой, то есть при родственной трансплантации. Исследование образования de novo донор-специфических антител у реципиента в послеоперационном периоде при трансплантации трупного органа не представляется возможным ввиду отсутствия донорских лимфоцитов. Особая трудность отмечается при мультиорганном заборе, когда от одного донора трансплантируют органы нескольким реципиентам и требуется большое количество донорских клеток. Таким образом, для проведения определения донор-специфических антител требуется большое количество стандартизованного антигенного материала донора. С этой целью используют два вида клеток: лимфоциты периферической крови и лимфоциты селезенки донора.

В настоящее время существуют несколько методов определения донор-специфических антител в сыворотке реципиента.

Серологический метод. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови, реже селезенки клетки или лимфоузла. В основе метода лежит комплементзависимый микролимфоцитотоксический тест (cross-match реакция) [Оценка биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации почки // В.Ю. Абрамов / Пособие для врачей. - М. - 2006. С.29-35]. Этот тест базируется на способности антител к главному комплексу гистосовместимости в присутствии комплемента разрушать лимфоциты, несущие соответствующие антигенные детерминанты.

Цитометрический метод. Использование этого метода позволяет выявить очень низкие концентрации антител к антигенам HLA в сыворотке реципиента. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови. Сывороточные антитела реципиента связываются с антигенами HLA на поверхности лимфоцитов донора. После этого добавляются антитела к иммуноглобулинам человека, меченные флуоресцентной меткой. Дополнительное добавление моноклональных антител к CD3 и CD19 позволяют дифференцировать антитела к I классу (на CD3 + лимфоцитах, Т-клетки) и ко II классу (на CD19 + лимфоцитах, В-клетки) HLA [Robson A., Martin S.Т and В cell. crossmatching using three-colour flow cytometry // Transplant Immunology. - 1996. - V. 4. - 3. - P. 203-208]. Чувствительность проточной цитофлюориметрии примерно в 100 раз превышает чувствительность серологических методов. Однако, помимо антител к антигенам HLA, выявляется множество других антител сыворотки реципиента, реагирующих с лимфоцитами донора, например аутоантитела. Обусловленная этими факторами низкая специфичность метода приводит к получению ложноположительных результатов.

Метод на основе хМАР-технологии. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови крови. Определение донор-специфических антител проводят по технологии хМАР на платформе Luminex с помощью наборов LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) фирмы Invitrogen (США) [Detection of donor-specific antibodies using HLA-coated microspheres: another tool for kidney transplant risk stratification / E.M.Gibney, L.R.Cagle, B.Freed, S.E.Wamell, L.Chan, A.C.Wiseman // Nephrology Dialysis Transplantation. - 2006. - V. 21. - Is. 9. - P.2625-2629]. Набор содержит смесь Luminex частиц. Одни частицы в смеси коньюгированы с моноклональными AT к I классу HLA, другие - к II классу HLA. Донорские лимфоциты лизируют, затем лизат смешивают с этими двумя категориями частиц. При инкубировании частицы связываются с растворенными донорскими молекулами HLA, образуя человеческие лейкоцитарные антигены, специфические для донора. Смесь частиц содержит также контрольные частицы, определяющие уровень фонового сигнала, для подтверждения нормальной работы тест-системы. Таким образом, способ определения донор-специфических антител с помощью хМАР-технологии обладает высокой чувствительностью, что позволяет выявить низкие уровни антител, и высокой специфичностью, что минимизирует количество ложноположительных результатов.

Прототип. Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является постановка cross-match реакции (перекрестная проба) перед трансплантацией органа, для определения предсуществующих донор-специфических антител у реципиента [Оценка биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации почки // В.Ю. Абрамов / Пособие для врачей. - М. - 2006. С.29-35]. Основным биологическим материалом для проведения реакции является периферическая венозная кровь реципиента и донора. Кровь донора используется для получения лимфоцитов, поэтому она должна быть жидкой. Для предотвращения свертывания, как правило, используют динатриевую соль этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТАNa₂). Следует учитывать, что ЭДТА связывает ионы Са²⁺, что влияет на активность комплемента и тем самым может затруднить серологическое исследование. Выделяют лимфоциты из крови с помощью центрифугирования на градиенте плотности. При трансплантации трупного органа альтернативным источником лимфоцитов служит селезенка донора. В этом случае в чашку Петри помещают фрагмент селезенки донора (1-2 см³). Добавляют в чашку изотонический раствор и тщательно, до состояния кашицы измельчают фрагмент селезенки ножницами. Добавляют еще 5-7 мл изотонического раствора и хорошо размешивают измельченную ткань селезенки. Отбирают пипеткой жидкую часть клеточной взвеси и далее выделяют лимфоциты на градиенте плотности. После выделения клеток проводят оценку их жизнеспособности. Для оценки жизнеспособности лимфоцитов используют метод прижизненной окраски трипановым синим. Минимальный допустимый уровень жизнеспособности лимфоцитов при серологических исследованиях составляет 80%. Далее проводят комплемент-зависимую цитотоксическую реакцию (лимфоцитотоксический тест). Для этого в сыворотку реципиента вносят лимфоциты донора и инкубируют в течение 30 минут при +37°С. Затем добавляют кроличий комплемент и инкубируют еще 60 минут при +37°С. Вносят краску (5% водный раствор эозина) и после инкубации в течение 5 минут добавляют 20% раствор формалина. Через 15-20 минут оценивают результат реакции под микроскопом (по количеству живых и мертвых лимфоцитов). Результат исследования выражали в баллах в зависимости от относительного содержания погибших клеток. Так, при 0-20% погибших клеток результат считают отрицательным, 20-30% - слабоположительным (сомнительным), 31-41% - положительным, 41-80 - выраженно положительным, 81-100% - сильно выраженным положительным.

Самым существенным недостатком метода является невозможность исследования образования de novo донор-специфических антител у реципиента органов в послеоперационном периоде при трансплантации трупного органа ввиду отсутствия лимфоцитов донора, необходимых для постановки реакции. Наиболее доступным для исследования видом ткани донора служит периферическая кровь. В то же время в периферической крови преобладают Т-лимфоциты (60-70%), несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса. Содержание В-лимфоцитов, главный источник человеческих лейкоцитарных антигенов II класса, малочисленно (10-15%). Так как при оценке результатов лимфоцитотоксического теста гибель 0-20% клеток рассматривается как отрицательный результат, низкое содержание В-лимфоцитов может стать причиной неправильной трактовки результатов. Также существенно затрудняет чтение реакции «фоновая» гибель клеток более 10%.

Таким образом, существует необходимость разработки высококачественного диагностикума для определения у реципиента образования de novo донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде. Обоснованным является использование лимфоцитов селезенки длительных сроков хранения. С этой целью предложено вместе с трансплантируемыми органами у донора осуществить забор селезенки или ее фрагмента, получить суспензию Т- и В-лимфоцитов селезенки, оценить популяционный состав и жизнеспособность лимфоцитов, затем после добавления криопротекторов сохранить жизнеспособные клетки в условиях сверхнизких температур. Диагностикум позволит в течение длительного времени (год и более) контролировать наличие донор-специфических антител у реципиента после аллотрансплантации.

Достигаемым техническим результатом является получение высококачественного диагностикума, содержащего Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа, для диагностики гуморального отторжения и оценки эффективности иммуносупрессивной терапии.

I. Получение лимфоцитов селезенки

1. Заготовка ткани селезенки осуществляется на основании приказа Минздравсоцразвития России и РАМН от 25.05.2007 №357/40 «Об утверждении Перечня органов и (или) тканей человека - объектов трансплантации, Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих трансплантацию органов и (или) тканей человека, и Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих забор и заготовку органов и (или) тканей человека». Хирург, после заготовки трансплантируемых органов, через выполненный ранее доступ в брюшную полость, с сохранением стерильности операционного поля, мануально выделяет селезенку. С целью предотвращения кровотечения на сосудистую ножку органа накладывается лигатура. Режущим хирургическим инструментарием отсекается один из полюсов селезенки. Отсеченный фрагмент помещается в стерильный транспортный контейнер, содержащий 200 мл охлажденного до +4°С раствора 0,9% раствором NaCl. Контейнер герметично закрывают. Транспортировка биоматериала осуществляется в условиях, поддерживающих температуру ткани +4°С. В случае невозможности заготовки ткани селезенки, без повреждения донорского органа при операции забора, биоматериал заготавливается при последующей обработке органа. Хирургом, подготавливающим орган к имплантации, в соответствии с интраоперационной ситуацией, острым методом выделяется фрагмент селезенки объемом не менее ¼ органа. Упаковка и транспортировка ткани селезенки выполняются по описанной ранее методике. Передача биоматериала в медицинское учреждение оформляется стандартным актом, в котором указывается: дата, ФИО донора, № истории болезни, тип тканей, учреждения передавшее и принявшее биоматериал, лица передавшее и принявшие биоматериал. Операция заготовки ткани селезенки занимает 15-20 минут, однако в зависимости от объема операции органного донорства длительность нахождения лимфоцитов в условиях гипоксии на этапах заготовки ткани селезенки и ее транспортировки в лабораторию может составлять от 6 до 12 часов.

2. Выделение популяций лимфоцитов. При поступлении в лабораторию в асептических условиях в стерильном лотке хирургическими ножницами селезенку нарезают фрагментами объемом до 0,5 см³. 3-4 фрагмента селезенки помещают в стерильную пробирку и измельчают в гомогенизаторе вместе с раствором Хенкса, получают взвесь лимфоцитов. В пробирки, содержащие 1 мл раствора «Лимфолит» плотностью 1,077, наслаивают по 2 мл суспензии лимфоцитов и центрифугируют 20 минут при 1000-1500 rpm. Интерфазу, кольцо лимфоцитов на градиенте плотности, аккуратно отбирают пипеткой. Полученную клеточную суспензию дважды отмывают раствором Хенкса путем центрифугирования в течение 5 минут при 1000-1500 rpm. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки в 1 мл раствора Хенкса. 100 мкл клеточной суспензии отбирают для оценки количества, фенотипа и жизнеспособности лимфоцитов.

3. Оценка качества лимфоцитов. Оценку качества лимфоцитов селезенки проводят с помощью проточной цитометрии. В цитометрические пробирки к 100 мкл суспензии лимфоцитов добавляют 20 мкл моноклональных антител CD3-FITC/CD19-PE и 20 мкл витального красителя 7 амино-актиномицина D (7AAD) и инкубируют в течение 20 минут. После чего в пробирки вносят 1 мл фосфатного буфера (PBS) и анализируют на проточном цитометре. В норме в селезенке преобладают CD 19 позитивные клетки (В-лимфоциты), содержание которых составляет 40-50%, концентрация CD3 + клеток (Т-лимфоциты) варьирует от 25 до 35% [Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.].

Обследовано 15 взвесей лимфоцитов селезенки доноров органов, подготовленных к криохранению. Выявленное содержание Т-лимфоцитов (CD3 + клетки) варьировало от 27,2% до 33,5%, концентрация В-лимфоцитов (CD19 + клетки) - от 41,2% до 53,3%. Содержание жизнеспособных клеток, не включающих 7AAD, составляло 91,2-97,8%.

Значительное влияние на качество лимфоцитов оказывает длительность нахождения клеток в условиях гипоксии. Обследованы образцы лимфоцитов селезенки от 5 доноров, хранившиеся в условиях гипоксии при +4°С до 72 часов. Методом проточной цитометрии определяли общее количество лимфоцитов и долю клеток включавших витальный краситель 7AAD. Каждый образец обследовали через 12, 24, 36, 48 и 72 часа хранения. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли с помощью витального ДНК-специфичного красителя 7AAD на проточном цитометре. Выявлено, что содержание жизнеспособных клеток через 12 и 24 часа хранения составляет от 93 до 97%, через 36 часов варьирует от 89 до 94%, через 48 часов - от 85 до 92% и через 72 часа - от 76 до 82%. Таким образом, для получения качественного диагностикума на основе лимфоцитов селезенки человека продолжительность этапов должна быть максимально короткой. Время от момента прекращения перфузии тканей донора до криоконсервирования клеток не должно превышать 48 часов.

II. Криоконсервирование клеток

1. Приготовление раствора криопротектора. В каждую пробирку для криоконсервирования вносят 180 мкл 99% DMSO, 250 мкл раствора Хенкса, 920 мкл фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Пробирки помещают в холодильник на +4°С.

2. Расчет необходимого числа пробирок для хранения. Рассчитывают количество образцов для криоконсервирования по формуле:

Х=n·4+2, где

Х - количество образцов для криоконсервирования, n - количество реципиентов, кому были выполнена операция трансплантации органа/ов от данного донора. Например: у донора С. изъяты печень, легкие, почка и поджелудочная железа. Органы трансплантированы следующим образом: реципиенту №1 поджелудочная железа + почка, реципиенту №2 - печень, реципиенту №3 - легкие. Количество образцов необходимое для криоконсервирования составляет: Х=3·4+2=14. Таким образом, должно быть подготовлено к криохранению 14 пробирок с лимфоцитами селезенки донора.

3. Внесение лимфоцитов в среду для хранения. В охлажденные пробирки для криоконсервирования с подготовленным и охлажденным раствором криопротектора пипеткой вносят по 1,5 млн лимфоцитов в 450 мкл раствора Хенкса. Пробирки для криоконсервирования плотно закрывают крышками и перемешивают содержимое с помощью вихревого смешивателя типа Vortex. Затем пробирки помещают в холодовой штатив и в течение 5-7 минут переносят в программный замораживатель.

4. Помещение на хранение. Пробирки с клеточным материалом, подготовленные для криоконсервирования, помещают в камеру программного замораживателя, предварительно охлажденную до +4°С. Криоконсервирование проходит по следующей программе:

Стартовая температура: +4°С

Этап №1: охлаждение 1°С/мин до -70°С

Этап №2: охлаждение 70°С/мин до -196°С

Затем образцы лимфоцитов донора переносят в отдельно выделенное хранилище криобанка и хранят при температуре -196°С в течение 5 лет и более.

III. Размораживание лимфоцитов донора

При необходимости из хранилища достают одну пробирку с лимфоцитами селезенки донора и помещают в водяную баню при температуре 37°С до полного исчезновения кристалликов льда. Затем пробирки с взвесью лимфоцитов центрифугируют 1000-1500 rpm в течение 5 минут, удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют в 0,5 мл раствора Хенкса. После чего возможно тестирование сыворотки реципинта на наличие донор-специфических антител, которое может проводится двумя способами: серологическим (лимфоцитотоксический тест) или с применением набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex. По истечению общего срока хранения, при отсутствии необходимости дальнейшего хранения биоматериала, невостребованные образцы изымаются из криохранилища и утилизируются.

IV. Контроль качества диагностикума

Обследовано 12 образцов лимфоцитов селезенки доноров органов, после криохранения. Выявлено, содержание Т-лимфоцитов (CD3 + клетки) варьировало от 25,7% до 31,4%, концентрация В-лимфоцитов (CD19 + клетки) - от 41,7% до 52,8%. Содержание жизнеспособных клеток, не включающих 7AAD, составляло 87,9-91,7%. Таким образом, предложенная методика получения и хранения лимфоцитов доноров органов позволяет получить высококачественный диагностикум для определения донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде. В дальнейшем определение антител проводят по любой из существующих методик.

Для оценки эффективности полученных по предлагаемой методике клеток селезенки доноров органов для определения донор-специфических антител у реципиентов проведено исследование 18 образцов дигностикумов, хранившихся от 3 суток до 1 года. Определение антител проводили серологическим методом и с помощью набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex. В таблице 1 представлены результаты определения антител у реципиентов органов, с использованием диагностикумов. При этом методом на платформе Luminex донор-специфические антитела выявлены у 5 реципиентов, течение посттрансплантационного периода которых осложнилось развитием реакции отторжения. Серологическим методом антитела выявлены только у одного реципиента. Таким образом, для определения DSA в посттрансплантационном периоде мы рекомендуем использовать методы, основанные на использовании х-МАР технологии на платформе Luminex.

Таблица 1
Определение донор-специфических антител у реципиентов органов с использованием диагностикумов
Метод исследования	Обследовано образцов клеток	Отсутствие донор-специфических антител	Наличие донор-специфических антител
Серологический (лимфоцитотоксический тест)	18	17	1
Метод по технологии хМАР на платформе Luminex	18	13	5

Разработанный диагностикум для определения донор-специфических антител к HLA использовался в клинической практике у пациентки в течение 6 месяцев после трансплантации легких. Результаты проведенного обследования представлены в таблице 2.

Таблица 2
Мониторинг донор-специфических антител (ДСА) у реципиента М. после трансплантации легкого в течение 6 месяцев
Сутки после трансплантации	ДСА к I классу	ДСА к II классу
7 сутки	отрицательный	отрицательный
9 сутки	отрицательный	положительный
15 сутки	отрицательный	положительный
124 сутки	отрицательный	слабо положительный
165 сутки	отрицательный	отрицательный

Как видно из таблицы, у пациентки на 9 сутки посттрансплантационного периода выявили донор-специфические антитела ко второму классу HLA, которые сохранялись в течение трех месяцев на фоне проведения иммуносупрессивной терапии. Через шесть месяцев донор-специфические антитела в сыворотке пациентки не выявлены.

Таким образом, разработан диагностикум, содержащий выделенные из селезенки донора Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа.

Разработанный диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора, при этом содержание Т-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, составляет от 25 до 35%, В-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса - от 41 до 55%, жизнеспособность клеток - не менее 80%.

Способ получения диагностикума для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости после трансплантации органов у мультиорганного донора, включает следующие приемы. Во время операции по изъятию органов для трансплантации у мультиорганного донора забирают селезенку или ее фрагмент, помещают в стерильный контейнер, содержащий охлажденный до +4° - +6°С 0,9% раствор хлорида натрия, затем селезенку в стерильных условиях нарезают на небольшие фрагменты, помещают их в стерильную пробирку с раствором Хенкса и гомогенезируют, из полученной взвеси клеток на градиенте плотности выделяют лимфоциты и с помощью проточной цитометрии оценивают качество полученных клеток, отбирают образцы с содержанием Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов не менее 41%, жизнеспособностью не менее 80%, вносят в них раствор криопротектора, с конечной концентрацией DMSO 10%, лимфоциты замораживают с помощью двухэтапной программы при стартовой температуре +4°С, с охлаждением на первом этапе в режиме 1°С/мин до -70°С и охлаждением на втором этапе в режиме 70°С/мин до -196°С, с последующим хранением диагностикума в жидком азоте при температуре -196°С, при этом время от момента забора селезенки до помещения диагностикума в жидкий азот не должно превышать 48 часов.

Способ прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включает следующие приемы. Для прогнозирования используют разработанный диагностикум, причем для постановки реакции клетки размораживают на водяной бане при температуре +37°С, далее на проточном цитометре проводят контроль качества диагностикума, при содержании Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов - не менее 41%, жизнеспособности клеток не менее 80% осуществляют реакцию на определение донор-специфических антител, при выявлении которых прогнозируют высокий риск развития реакции отторжения.

Для лучшего понимания сущности предложения приведем примеры.

Пример 1. Больной Г., 47 лет. Диагноз: хронический гломерунефрит, терминальная стадия хронической почечной недостаточности. 21.10.2011 произведена аллотрансплантация почки; miss-match по локусам А, А, В, В, Dr, совместимость по Dr. На момент трансплантации реакция cross-match - отрицательная. Одновременно с изъятием донорской почки заготовлен фрагмент селезенки и по предлагаемой методике подготовлен диагностикум для определения донор-специфических антител. На 4 сутки у реципиента появились клинические признаки острого криза отторжения. Решено провести определение донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения. Проведено исследование сыворотки реципиента с криоконсервированными лимфоцитами селезенки донора (диагностикум). В сыворотке реципиента выявлено наличие донор-специфических антител к I и II классам HLA как серологическим методом, так и на платформе Luminex. Поставлен диагноз: острый гуморальный криз отторжения. Диагноз был подтвержден морфологически.

Пример 2. Больной К. 24 года. Диагноз: хроническая почечная недостаточность. 3.01.2012 года произведена аллотрансплантация почки; miss-match по локусам А, А В, Dr, совместимость по В, Dr. На момент трансплантации реакция cross-match - отрицательная. В посттрансплантационном периоде отмечены: отсроченная функция трансплантата и замедленное восстановление азотовыделительной функции. На 17 сутки решено провести определение донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения. Исследование сыворотки реципиента проведено с подготовленным по предлагаемой методике диагностикумом. В сыворотке реципиента серологическим методом донор-специфических антител не выявлено, с помощью набора LIFECODES на платформе Luminex определены донор-специфические антитела к I классу HLA. Поставлен диагноз гуморальная реакция отторжения. После проведенной иммуносупрессивной терапии восстановилась функция трансплантата. При контрольном исследовании DSA на 30 сутки в сыворотке реципиента донор-специфических антител не выявлено.

1. Диагностикум, содержащий лимфоциты человека для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости в посттрансплантационном периоде, характеризующийся тем, что диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора, при этом содержание Т-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, составляет от 25 до 35%, В-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса, - от 41 до 55%, жизнеспособность клеток - не менее 80%.

2. Способ получения диагностикума для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости после трансплантации органов у мультиорганного донора, включающий получение лимфоцитов донора, характеризующийся тем, что во время операции по изъятию органов для трансплантации у мультиорганного донора забирают селезенку или ее фрагмент, помещают в стерильный контейнер, содержащий охлажденный до +4° - +6°С 0,9%-ный раствор хлорида натрия, затем селезенку в стерильных условиях нарезают на небольшие фрагменты, помещают их в стерильную пробирку с раствором Хенкса и гомогенезируют, из полученной взвеси клеток на градиенте плотности выделяют лимфоциты и с помощью проточной цитометрии оценивают качество полученных клеток, отбирают образцы с содержанием Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов не менее 41%, жизнеспособностью не менее 80%, вносят в них раствор криопротектора, с конечной концентрацией DMSO 10%, лимфоциты замораживают с помощью двухэтапной программы при стартовой температуре +4°С, с охлаждением на первом этапе в режиме 1°С/мин до -70°С и охлаждением на втором этапе в режиме 70°С/мин до -196°С, с последующим хранением диагностикума в жидком азоте при температуре -196°С, при этом время от момента забора селезенки до помещения диагностикума в жидкий азот не должно превышать 48 ч.

3. Способ прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включающий реакцию на определение донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости, характеризующийся тем, что используют диагностикум по п.1, полученный способом по п.2, причем для постановки реакции клетки размораживают на водяной бане при температуре +37°С, далее на проточном цитометре проводят контроль качества диагностикума, при содержании Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов не менее 41%, жизнеспособности клеток не менее 80% осуществляют реакцию на определение донор-специфических антител, при выявлении которых прогнозируют высокий риск развития реакции отторжения.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что определение донор-специфических антител проводят с помощью набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex.