Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи


 


Владельцы патента RU 2502999:

Общество с ограниченной ответственностью Научно-Производственное Объединение "Тюменькриобанк" (RU)

Изобретение относится к области фармацевтики и биологии и представляет собой способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, включающий забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9% водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°C, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C. Изобретение обеспечивает разделение клеток кожи с сохранением их жизнедеятельности. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для получения и исследования жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи.

Наиболее близким к предлагаемому является способ разделения пулов 26S- и 20S-протеасом из цитоплазматической фракции клеток [Патент РФ №2427623, кл. C12N 1/00, С07K 14/00, C12Q 1/68, 2011], включающий гомогенизацию ткани в буфере, центрифугирование гомогената при 105000 g в течение 60-90 мин при 0-4°С с получением цитоплазматической фракции, инкубацию цитоплазматической фракции с 10 мМ фосфокреатина и 10 мкг/мл фосфокреатинкиназы в течение 25-45 мин при 35°C и разделение белков цитоплазматической фракции.

Известной причиной, препятствующей достижению технического результата, обеспечиваемого предлагаемым изобретением, является невозможность разделения клеток кожи с сохранением их жизнедеятельности.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является получение жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи.

При осуществлении изобретения поставленная задача решается за счет достижения технического результата, который заключается в разделении клеток кожи с сохранением их жизнедеятельности.

Указанный технический результат достигается способом получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, включающим в себя забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9% водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°C, извлечение гомогената вначале отсасыванием стерильным шприцем, а затем трижды вымыванием рабочей камеры гомогенизатора 0,9% водным раствором хлорида натрия, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C.

Забор биоптата кожи проводят на глубину 2 мм, для того чтобы практически не захватывать подкожно жировой слой, но забирать эпидермис и дерму. Это позволяет проводить исследование без проведения ферментной обработки, что снижает опасность действия фермента и благоприятно сказывается на жизнеспособности клеток кожи и исключает их возможную активацию.

Гомогенизацию ткани проводят в 0,9% водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°C. 0,9% водный раствор хлорида натрия является наиболее близкой средой к условиям жизнедеятельности клетки кожи в живом организме. При использовании других веществ возможно их поступление через мембрану внутрь клетки и последующее ее разрушение или наоборот, диффузия раствора из клетки наружу с последующей ее гибелью. Температура +23…+25°C является оптимальной для данного способа.

Для того чтобы полностью извлечь все клетки кожи из рабочей камеры гомогенизатора проводят вначале отсасывание гомогената стерильным шприцем, а затем трижды вымывают 0,9% водным раствором хлорида натрия.

Фильтрование гомогената проводят через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, чтобы отделить строму и пропустить все клетки кожи в раствор. Если диаметр пор будет меньше 20 мкм, то в фильтре задержатся некоторые крупные клетки кожи, например фибробласты или макрофаги. Если диаметр пор будет больше 20 мкм, то не отфильтруется строма, что негативно повлияет на результаты дальнейших исследований. В качестве инертного материала фильтровальной перегородки может использоваться, например, нейлон.

Центрифугирование гомогената проводят при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C. При данных условиях центрифугирования осаждаются все нужные клетки кожи и удаляется надосад очная жидкость.

Пример осуществления предлагаемого способа приведен ниже.

Забор биоптата кожи размером 2×2×2 мм проводили с ягодичной области человека с помощью дракара DERMO-PUNCH (2 мм) (STERYLAB, Италия). Далее биоптат кожи и 1 мл 0,9% водного раствора хлорида натрия помещали в рабочую камеру автоматической системы для механической гомогенизации ткани Medimachine (Becton Dickinson, США). Гомогенизацию ткани проводили в течение 30 секунд при температуре +23…+25°C. Затем извлекали гомогенат стерильным шприцем и трижды вымывали рабочую камеру гомогенизатора 0,9% водным раствором хлорида натрия по 1 мл.

После чего фильтровали гомогенат через фильтр для клеток Falcon (Becton Dickinson, США) с нейлоновой сетчатой структурой и диаметром пор 20 мкм. Далее центрифугировали гомогенат для удаления надосадочной жидкости при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C.

После этого определяли жизнеспособность клеток с помощью витального красителя 7-amino-actinomycin D RUO (7AAD) (Beckman Coulter, США), анализируя на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Идентификацию клеток выполняли путем регистрации двух параметров: объема и светорассеяния в боковом направлении (SSLin) и регистрацией флуорисценции (7-AAD).

На чертеже представлена гистограмма количества жизнеспособных клеток в образце в результате предлагаемого способа.

Известно, что популяция клеток кожи считается жизнеспособной, если в ней содержится не менее 85% живых клеток. На гистограмме слева от вертикальной линии (у значения 10°) зарегистрированы живые клетки кожи, а справа мертвые. Также наблюдается гетерогенность популяции, т.к. клетки имеют разный объем, причем размеры клеток не превышают 20 мкм. Полученные данные показали, что в результате применения предлагаемого способа количество жизнеспособных клеток кожи в рассмотренном образце составило 90,0%.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить жизнеспособную гетерогенную популяцию клеток кожи для дальнейших исследований по подбору и испытанию лекарственных препаратов при лечении кожных заболеваний in vitro, выделения и культивирования отдельных популяций клеток и разработки лекарственных препаратов нового поколения.

1. Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, включающий забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9%-ном водном растворе хлорида натрия при температуре 23-25°C, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 мин при температуре 23-25°C.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что извлечение гомогената проводят вначале отсасыванием стерильным шприцем, а затем трижды вымывают рабочую камеру гомогенизатора 0,9%-ным водным раствором хлорида натрия.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области иммунологии, лабораторной диагностике и предназначено для выявления повышенной активированности Т-лимфоцитов. Сущность способа: у обследуемых лиц производится забор крови из вены и выделение из нее лимфоцитов.
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии. У пациента с острым инфарктом миокарда (ОИМ) при госпитализации снимают ЭКГ, делают клинический и биохимический анализы крови, анализируют анамнез.
Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии. Для прогнозирования неблагоприятного годового исхода у пациентов с острым коронарным синдромом с подъемом сегмента ST, подвергшихся чрескожному коронарному вмешательству, проводят анализ результатов клинических и лабораторных методов исследования.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ оценки морфофункционального состояния индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) больных паркинсонизмом путем проведения их дифференцировки в дофаминергические нейроны, для чего воздействуют на ИПСК факторами, индуцирующими их дифференцировку в дофаминергические нейроны, а затем высаживают их на мультиэлектродную матрицу, обработанную опорным субстратом матригель/фибронектин, после чего, начиная с 3-5 дня вплоть до 8-10 дня, проводят динамическую регистрацию сетевой спонтанной биоэлектрической активности и при наличие к 3-5 дню сетевой спонтанной биоэлектрической активности в виде одиночных спайков, а к 8-10 дню упорядоченной пачечной спайковой активности на сформированном на микроэлектродах монослое оценивают морфофункциональное состояние как нейрональную направленность дифференцировки ИПСК в дофаминергические нейроны.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования невынашивания беременности в ранние сроки. Сущность изобретения состоит в том, что у беременных женщин с выявленной урогенитальной инфекцией в 1 триместре проводят определение в слизи цервикального канала уровня MIP-1α.
Изобретение относится к области биохимии и микробиологии и может быть использовано для определения липолитической активности в субклеточных фракциях бактерий. Сущность способа состоит в том, что среда, содержит агарозу или агар (500 мг), неионный детергент (50 мкл), хлористый кальций (12,5 мг), 0,05 М Трис-HCl буфер pH 8,3 (до 100 мл), причем после застывания среды в ней делают лунки, в которые вносят исследуемый образец в объеме 10-50 мкл на одну лунку, затем среду с исследуемым образцом инкубируют при 37°C в течение 12 часов и визуально определяют наличие или отсутствие липолитической активности в исследуемом образце.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для диагностики гипоксии плода в родах. Для этого за 30 минут до родов проводят кардиотокографию.

Изобретение относится к биохимическим методам исследования с использованием измерения по селективным ионам, характеризующим маркеры микроорганизмов, для молекулярного микробиологического анализа.
Изобретение относится к медицине, в частности к гастроэнтерологии и иммунологии, и предназначено для прогнозирования неэффективности консервативной терапии тяжелой формы язвенного колита при тотальном поражении толстой кишки.
Изобретение относится к областям биологии и медицины. Для диагностики бесплодия позвоночных животных и человека обоего пола сравнивают концентрации иммунореактивности уротензина 2 в крови, определяемой методом реакции прямой гемагглютинации между бесплодными особями и особями, способными к детородной функции.

Представленная группа изобретений относится к области биотехнологии и касается новых нуклеотидных последовательностей вируса Torque teno (TTV) и векторов, содержащих такие последовательности.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена композиция, применяемая для клеточной терапии.

Изобретение относится к области биотехнологии, биологии и медицины. Предложена клеточная линия huFSHIK - продуцент рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), секретируемого в культуральную жидкость.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению вакцин против рака, и может быть использовано в медицине. Выделенный пептид, обладающий способностью индуцировать цитотоксический Т-лимфоцит (ЦТЛ) в присутствии антигенпрезентирующей клетки, несущей HLA-A*2402, используют для получения антигенпрезентирующих клеток и соответственно ЦТЛ.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Предложен способ получения вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ оценки морфофункционального состояния индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) больных паркинсонизмом путем проведения их дифференцировки в дофаминергические нейроны, для чего воздействуют на ИПСК факторами, индуцирующими их дифференцировку в дофаминергические нейроны, а затем высаживают их на мультиэлектродную матрицу, обработанную опорным субстратом матригель/фибронектин, после чего, начиная с 3-5 дня вплоть до 8-10 дня, проводят динамическую регистрацию сетевой спонтанной биоэлектрической активности и при наличие к 3-5 дню сетевой спонтанной биоэлектрической активности в виде одиночных спайков, а к 8-10 дню упорядоченной пачечной спайковой активности на сформированном на микроэлектродах монослое оценивают морфофункциональное состояние как нейрональную направленность дифференцировки ИПСК в дофаминергические нейроны.

Настоящее изобретение относится к медицине и касается способа культивирования клеток пульпы зуба без нарушения функции, присущей клеткам пульпы зуба в живом организме, и способа транспортировки удаленного зуба для хранения.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены пептиды, представляющие собой Т-клеточные эпитопы эндотелиального маркера опухоли (ТЕМ8), которые способны индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) в присутствии антиген-презентирующих клеток или экзосом, несущих или содержащих HLA-A*0201.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к экспериментальной иммунологии, и может быть использовано в медицине. Способ модификации моноцитов периферической крови включает выделение фракции периферических мононуклеарных клеток (МНК) из венозной крови, которое проводят с использованием двойного градиента плотности перколла: 1,064 г/мл и 1,032 г/мл соответственно, при комнатной температуре +20°C.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ выделения стволовых клеток, включающий центрифугирование гепаринизированного костного мозга с гидроксиэтилкрахмалом в соотношении исходных ингредиентов 1:2 со скоростью 700g в течение 15 мин в замкнутой системе трех гематологических контейнеров, соединенных между собой трубками, с последующим удалением примесей жира и плазмы в контейнер №1, перевод мононуклеарной фракции костного мозга, части супернатанта и эритроцитов, примыкающих к линии разделения двух сред, в контейнер №2, при этом в основном контейнере остаются сладжированные эритроциты и костные фрагменты, центрифугирование полученного образца со скоростью 900g в течение 15 мин в контейнере №2 для получения клеточного материала для внутрисосудистого введения, при этом после упомянутого центрифугирования удаляют часть супернатанта в контейнер №1 без разгерметизации системы.
Изобретение относится к медицине, андрологии, репродуктологии, ветеринарии. Предложены среда и способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных, где сперматозоиды из нативной или размороженной спермы, полученные путем центрифугирования эякулята в градиенте плотности или отобранные в результате флотации, переносятся в среду для иммобилизации с пониженным осмотическим давлением 100-170 мОсм/кг на время от 1 мин до 2 часов при составе газовой среды от 0,1 до 8% углекислого газа и температуре среды от 0 до 39°C. Изобретение может быть использовано для диагностических и лечебных целей для размножения или оплодотворения животных. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл.
Наверх