Нанокомпозит с активным лигандом, способ его приготовления и способ адресной инактивации вируса гриппа внутри клетки



Нанокомпозит с активным лигандом, способ его приготовления и способ адресной инактивации вируса гриппа внутри клетки
Нанокомпозит с активным лигандом, способ его приготовления и способ адресной инактивации вируса гриппа внутри клетки
Нанокомпозит с активным лигандом, способ его приготовления и способ адресной инактивации вируса гриппа внутри клетки

 


Владельцы патента RU 2496878:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт катализа им. Г.К. Борескова Сибирского отделения Российской академии наук (ИК СО РАН) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (НГУ) (RU)
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биоорганической химии и медицины. Заявляемые нанокомпозиты предназначены для направленного воздействия на генетический материал внутри клетки и подавления его дальнейшего функционирования. Нанокомпозиты, состоящие из наночастиц диоксида титана в аморфной или кристаллической (анатаз, брукит) форме, иммобилизованных полилизиновых производных олигонуклеотидов (PL-oligo) и фотоактивируемых арилазидных групп, введенных по аминогруппам полилизина. Все компоненты нанокомпозита выполняют определенную функцию: ТiO2-наночастицы способствуют трансфекции клеток; полилизин способствует иммобилизации олигонуклеотида на поверхность наночастиц и вносит функциональные группы (NH2), позволяющие вводить дополнительные реакционноснособные группы; олигонуклеотиды определенной последовательности направляют композит к целевым участкам вирусной РНК; фогоактивируемая перфторарилазидная группа после облучения светом способна разрушать нуклеиновые кислоты. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 15 пр.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биоорганической химии и медицины. Нанокомпозиты состоят из наночастиц диоксида титана, иммобилизованных полилизиновых производных олигонуклеотидов (PL-oligo) и фотоактивируемых групп и предназначены для направленного воздействия на внутриклеточный генетический материал и подавления его дальнейшего функционирования.

Одним из наиболее значимых направлений развития современной молекулярной биологии и фундаментальной медицины является разработка способов селективного воздействия на внутриклеточные нуклеиновые кислоты - носители генетической информации. Впервые данное направление было сформулировано еще в 1967 г. в работе /Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Tetrahedron Lett., 1967, p.3557-3562/, в которой авторы предложили использовать так называемые адресованные реагенты-олигонуклеотиды, несущие реакционноспособные группы - для воздействия на комплементарные нуклеиновые кислоты. Впоследствии такая стратегия была названа антисенс подходом, а олигонуклеотиды - антисенс олигонуклеотидами. В настоящее время с этой целью используются олигонуклеотиды и их различные аналоги, а также малые интерферирующие РНК (siRNA) и РНК- и ДНК-зимы /например, Crooke S.T., Ann. Rev. Med., 2004, v.55, p.61-95; Giuseppina M. et al., Nucleic Acids Res. 2004, v.32, p.4358-4367/.

Олигонуклеотиды, несущие химически активные группы, сохраняют способность к комплементарным взаимодействиям с НК, что обеспечивает направленную модификацию НК-мишеней. Олигонуклеотид при этом играет роль «адреса», который обеспечивает комплементарное связывание с фрагментом нуклеиновой кислоты-мишени, после чего реакционноспособная группировка модифицирует ген-мишень и выводит его из строя /Knorre D.G., et al., Design and Target Reactions of Oligonucleotide Derivatives. CRC Press: Boca Raton-Ann Arbor-Tokyo, 1994, p.366; Ros D.T., et al., Current Medicinal Chemistry, 2005, v.l2, p.71-88/.

Для воздействия на НК широко используются производные олигонуклеотидов, несущие фотоактивируемые, группировки. Такие группы стабильны в физиологических условиях, они инертны в темноте и вступают в реакцию только при облучении светом; так что возможно инициировать реакцию в любой определенный момент времени и легко контролировать процесс модификации. Эти группы обладают большей реакционной способностью по сравнению с другими модифицирующими группами. В качестве фотореагентов используются различные фотоактивируемые группы: эллиптицин /Favire G., С.R. Seances Soc. Biol. Fil. 1992, v.186(1-2), p.73-87/, порфирины /Szentmary N. et al., Ophthalmologe. 2012, v.109(2), p.165-170/, фталоцианины /Kuznetsova A.A., et al., Bioorg. Khim. 2008, v.34(5), p.683-695; Kuznetsova A.A., et al., J.Biomol. Struct. Dyn. 2008, v.26(3), p.307-320/, производные псоралена /Pacifico A, Leone G., Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 2011, v.5, p.261-277; Corash L., Expert Rev. Hematol. 2011, v.5, p.509-525; Stafforst T, Hilvert D,. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2011, v.50, p.9483-9486/, различные ароматические азиды /Shanmugavelan P., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, v.21, p.7273-72761; Kolpashchikov D.M., et al., Bioorg. Khim. 1999, v.25, p.129-136/, производные диазирина /Chiara D.C., et al., Biochemistry 2012, v.51, p.836-847/, акридина /Asanuma K., et al., Anticancer Res. 2011, v.31, p.4163-4168/ и др. Фотореагенты, основанные на ароматических азидах и их фторированных аналогах, представляют большой интерес. Известно, что тетрафторарилазиды, присоединенные к олигонуклеотиду, способны эффективно и сайт-специфически модифицировать РНК и ДНК /Levina A.S., et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 1996, v.6, p.119-126; 127-132; Levina A.S., et al., 1993, Biochimie v.75, p.25-27/. Основная идея этого подхода состоит в том, что на первом этапе реагент, не вступая в химическую реакцию, "находит" свою мишень и лишь затем под воздействием света действует на нее.

Исследования на самых различных модельных системах подтвердили эффективность использования антисенс-олигонуклеотидов, несущих различные, в том числе фотоактивируемые, группы для модификации нуклеиновых кислот, однако применение этой стратегии на организме пока не нашло окончательного решения. Основным препятствием является трудность доставки олигонуклеотидов и их производных к гену-мишени внутри клетки. Одним из путей решения данной проблемы может оказаться использование наночастиц в качестве средств доставки лекарственных средств /Mario Ferrari, Nature Reviews Cancer, 2005, v.5, p.161-171/, a также олигонуклеотидов и их производных к гену-мишени /Paunesku Т., et al.. Nature materials, 2003, v.2, p.343-346; Endres P.J., et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, v.129, p.15760-15761/.

Сущность данного изобретения заключается в создании полифункциональных нанокомпозитов, содержащих наночастицы диоксида титана, олигонуклеотидный конъюгат с полилизином и фотоактивный лиганд. Каждый компонент нанокомпозита выполняет определенную функцию (доставка в клетки, доставка к целевой нуклеиновой кислоте и модификация этой НК).

Наиболее близким к данному изобретению является патент РФ №244571, 12N15/11, B82B 3/00, A61K 48/00, 10.03.2012, в котором описан способ получения нанокомпозитов, состоящих из наночастиц диоксида титана, на которые иммобилизуются полиаминовые производные олигонуклеотидов (PA-oligo), в частности полилизин-содержащие олигонуклеотиды (PL-oligo). Показана способность полученных нанокомпозитов TiO2-PL-oligo проникать в клетки и ингибировать размножение вируса гриппа A Недостатком является отсутствие необратимой инактивации вирусного генома, поскольку используемые нанокомпозиты способны только блокировать мишенную РНК, но не расщеплять ее. Недостатком является также невысокая противовирусная активность, которая проявляется спонтанно и неспецифично.

Изобретение решает задачу адресной (специфичной) инактивации вирусного генома внутри клетки за счет использования в составе нанокомпозита олигонуклеотидного фрагмента, комплементарного участкам вирусных НК, и повышения функциональных возможностей нанокомпозитов за счет введения в них дополнительных фотоактивируемых групп, способных необратимо воздействовать на генетический материал клеток. Поскольку фотоактивируемые группы вступают в реакцию только при облучении светом, то возможно инициировать реакцию в любой определенный момент времени и легко контролировать процесс воздействия на вирусный геном.

Наличие реакционноспособной фотоактивной группы в нанокомпозите обеспечивает ему дополнительную, уникальную способность необратимо модифицировать те НК, которые будут содержать участки, комплементарные иммобилизованному на TiO2 олигонуклеотиду. Создание нанокомпозитов, обладающих тремя функциями (доставка в клетки, доставка к целевой нуклеиновой кислоте и модификация этой НК) и исследование их свойств позволит приблизиться к разработке нового класса полифункциональных нанокомпозитов, которые могут рассматриваться как перспективные лекарственные препараты для лечения вирусных, наследственных и других заболеваний.

Задача достигается за счет использования нанокомпозитов, состоящих из наночастиц диоксида титана в аморфной или кристаллической (анатаз, брукит) форме, иммобилизованных полилизиновых производных олигонуклеотидов (PL-oligo) и фотоактивируемых перфторарилазидных групп, введенных по аминогруппам полилизина. Все компоненты нанокомпозита выполняют определенную функцию: TiO2-наночастицы способствуют трансфекции клеток; полилизин способствует иммобилизации олигонуклеотида на поверхность наночастиц и вносит дополнительные функциональные группы (NH2), позволяющие вводить дополнительные реакционноспособные группы; олигонуклеотиды определенной последовательности направляют композит к целевым участкам вирусной РНК; фотоактивируемая перфторарилазидная группа после облучения светом способна разрушать нуклеиновые кислоты.

Задача решается способом приготовления нанокомпозиитов вида TiO2-PL(ArN3)-oligo, который включает синтез наночастиц диоксида титана (аморфные, анатаз, брукит), синтез конъюгатов олигонуклеотида с соответствующим линкером, с емкостью по олигонуклеотиду 10-40 нмол/мг, иммобилизацию конъюгатов на наночастицы диоксида титана, и введение фотоактивируемой n-азидо-тетрафторбензоильной (ArN3) группы по аминогруппам полилизина в составе нанокомпозита TiO2-PL-oligo (1-5 мг/мл) путем его обработки с помощью 100-кратного избытка сукцинимидного эфира n-азидотетрафторбензойной кислоты в смеси диметилформамид-вода или диметилсульфоксид-вода в присутствии основного буфера, преимущественно, 0.1 М Na2CO3 или 0.1 М HEPES, pH 9.0, в течение ~3 ч с последующей отмывкой нанокомпозита с помощью 0.1 М NaCl.

Доставку нанокомпозитов TiO2-PL(ArN3)-oligo в клетки осуществляют путем обычного эндоцитоза.

Задача решается способом адресной инактивации вируса гриппа внутри клетки, включающим обработку клеток MDCK нанокомпозитами диоксида титана TiO2-PL(ArN3)-oligo с последующим их заражением вирусом гриппа A (H3N2) и УФ-облучением с расстояния 1.5 см в течение 16 мин (расчетная удельная мощность светового потока 4 мВт/см2), при этом адресная противовирусная активность проявляется благодаря тому, что олигонуклеотиды определенной последовательности ( 5 ' G C A A A A G C A G G G T A G A T A A T C p ) направляют нанокомпозит к целевым участкам вирусной РНК, а фотоактивируемая перфторарилазидная группа после облучения светом разрушает нуклеиновые кислоты.

Сущность изобретения иллюстрируется примерами 1-11 и рисунками Фиг.1-3.

Пример 1 иллюстрирует способ приготовления нанокомпозита TiO2-PL-oligo по прототипу.

Примеры 2-10 иллюстрируют способ приготовления нанокомпозитов TiO2-PL(ArN3)-oligo.

Пример 11 иллюстрирует способ приготовления нанокомпозита TiO2-PL(ArN3)-oligo(Flu).

Пример 12 иллюстрирует проникновение нанокомпозитов в клетки.

Примеры 13, 14 иллюстрируют противовирусную активность предлагаемых нанокомпозитов.

На Фиг.1 представлены фотографии образцов клеток линий MDCK и КСТ до и после инкубации с нанокомпозитом TiO2-PL(ArN3)-oligo(Flu), демонстрирующие проникновение нанокомпозитов в клетки. На Фиг.2 приведена противовирусная активность нанокомпозитов TiO2-PL(ArN3)-oligo1, содержащих комплементарный олигонуклеотидный фрагмент и фотоактивируемую группу, в сравнении с аналогичными нанокомпозитами без фотоактивируемой группы и с композитом без олигонуклеотида, до (светлые столбики) и после (темные столбики) УФ-облучения. На Фиг.3 приведена противовирусная активность нанокомпозитов TiO2-PL(ArN3)-oligo2, содержащих некомплементарный олигонуклеотидный фрагмент, в сравнении с аналогичными нанокомпозитами без фотоактивируемой группы, до (светлые столбики) и после (темные столбики) УФ-облучения.

Пример 1 (по прототипу).

Получение нанокомпозита TiO2-PL-oligo, состоящего из наночастиц диоксида титана в кристаллической форме (анатаз, An; брукит, Br; или аморфный, Am) проводят, добавляя 10 мкл 10-5 М раствора полилизин-содержащего олигонуклеотида (1 нмол) к 0.5 мл суспензии наночастиц (2 мг/мл). Смесь выдерживают при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего центрифугируют и отделяют супернатант. К осадку нанокомпозита добавляют 0.5 мл 0.1 М KH2PO4 (pH 7), выдерживают 5-10 мин при встряхивании и снова центрифугируют. Процедуру повторяют, используя в качестве раствора 0.1 М NaCl. Осадок суспендируют в 0.5 мл 0.1 М NaCl. Количество конъюгата PA-oligo, присоединившегося к наночастицам диоксида титана, определяют по разности оптического поглощения раствора конъюгата перед добавлением к частицам и промывных растворов после иммобилизации. Концентрация частиц в суспензии нанокомпозита - 2 мг/мл, соотношение PL-oligo/TiO2=~0.9 нмол/мг.

Пример 2.

В качестве исходного нанокомпозита используют TiO2-PL-oligo с емкостью по олигонуклеотиду 10 нмол/мг, полученный известным способом (прототип). В качестве основы для нанокомпозитов используют наночастицы в аморфной форме. В качестве олигонуклеотидного фрагмента нанокомпозита используют последовательность 5 ' G C A A A A G C A G G G T A G A T A A T C p   ( o l i g o l ) .

Синтез нанокомпозита Am-PL(ArN3)-oligo1, содержащего фотоактивируемую арилазидную группу, осуществляют следующим образом. Суспензию нанокомпозита Am-PL-oligo1 в 0.5 мл 0.1 М NaCl (1 мг/мл) с емкостью по олигонуклеотиду 10 нмол/мг центрифугируют, отделяют супернатант, к частицам добавляют 100 мкл 0.1 М Na2CO3, 100 мкл диметилформамида (DMF) и 3 раза с интервалом 30 мин - по 100 мкл раствора 0.3 М N-оксисукцинимидного эфира n-азидотетрафторбензойной кислоты в DMF. Через 2 ч после последнего добавления реагента нанокомпозит, содержащий присоединившиеся арилазидные (ArN3) группы, отмывают от непрореагировавших компонентов с помощью DMF (3×500 мкл), затем 0.1 М NaCl (3×500 мкл) и суспендируют в 0.5 мл 0.1 М NaCl. Концентрация частиц в суспензии нанокомпозита - 1 мг/мл.

Полноту реакции проверяют по реакции с хлоридом N-(2-оксиэтил)феназиния (Phn) следующим образом. Полученный нанокомпозит Am-PL(ArN3)-oligo (0.1 мг в 200 мкл 0.1 М NaCl) центрифугируют, отделяют супернатант, к частицам добавляют раствор Phn (0.5 мг в 20 мкл 0.2 М Na2CO3) и смесь выдерживают при встряхивании в течение 10 мин при комнатной температуре и затем отмывают тем же раствором соды (3×100 мкл). Исходный нанокомпозит Am-PL-oligo (контроль) обрабатывают аналогичным образом. Сравнивают окрашивание контрольного и опытного образцов. Отсутствие окрашивания (или очень слабое окрашивание) опытного образца по сравнению с контрольным образцом) свидетельствует о полноте реакции аминогрупп полилизина в составе нанокомпозита с эфиром арилазида.

Пример 3

Способ аналогичен примеру 2, отличается тем, что в качестве исходного используют нанокомпозит Am-PL-oligo в концентрации 5 мг/мл.

Пример 4

Способ аналогичен примеру 2, отличается тем, что в качестве исходного используют нанокомпозит с емкостью по олигонуклеотиду 40 нмол/мг.

Пример 5

Способ аналогичен примеру 2, отличается тем, что в качестве растворителя вместо диметилформамида используют диметилсульфоксид (DMSO).

Пример 6

Способ аналогичен примеру 2, отличается тем, что в качестве основы для исходного нанокомпозита An-PL-oligo1 используют TiO2-наночастицы в форме анатаз.

Пример 7

Способ аналогичен примеру 2, отличается тем, что в качестве основы для исходного нанокомпозита Br-PL-oligo1 используют TiO2-наночастицы в форме брукит.

Пример 8

Способ аналогичен примеру 2, отличается тем, что в качестве олигонуклеотидной части нанокомпозита используют последовательность 5 ' G A T C A A C T C C A T A T G C C A T G T p   ( o l i g o 2 ) .

Пример 9

Способ аналогичен примеру 8, отличается тем, что в качестве основы для исходного нанокомпозита используют наночастицы в форме брукит.

Пример 10

Способ аналогичен примеру 2, отличается тем, что вместо раствора Na2CO3 используют буфер 0.1 М HEPES, pH 9.0.

Пример 11

Способ аналогичен примеру 2, отличается тем, что в качестве исходного используют полученный известным способом (прототип) нанокомпозит Am-PL-oligo1(Flu), несущий на 5'-конце олигонуклеотида флуоресцентную метку (остаток флуоресцеина).

Пример 12

Для проведения экспериментов по проникновению в клетки нанокомпозитов, приготовленных по примеру 11, используют клетки линий КСТ и MDCK. Клетки получают из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (п. Кольцово, Новосибирская обл.).

Для приготовления образцов для конфокальной микроскопии клетки КСТ, HeLa и MDCK культивируют в полной среде DMEM в присутствии 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (КРС) с добавлением пенициллина (100 МЕ/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл) в 8-ми луночных камерах до достижения 70% монослоя. После этого полную среду заменяют на среду без сыворотки, стрептомицина и пенициллина (160 мкл). Затем добавляют исследуемые образцы нанокомпозитов, содержащих флуоресцентно-меченный олигонуклеотид (40 мкл) до конечной концентрации 0.1 мг/мл по TiO2 и 2 нмол/мл по DNA-фрагменту. После 24 ч инкубации клетки отмывают 1×PBS, фиксируют смесью 0.4% формалина и 0.1% Triton Х-100 (10 мин), обрабатывают 0.5% Triton X-100 (10 мин) и дофиксируют 2% формалином (10 мин). Все растворы готовят в буфере PBS, pH 7.2. Затем клетки обрабатывают красителями (DAPI для ядер, голубой цвет и Cell Mask Plasma Membrane Stain для клеточных мембран, красный цвет) в течение 10 мин. Препараты анализируют с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 UV Meta Microscope (Carl Zeiss, Inc., Германия). Используют три лазерные линии с длиной волны 405 нм (для обнаружения ядер клеток), 543 нм (для клеточных мембран) и 488 (для нанокомпозитов, меченных флуоресцеином). Флуоресцеин-меченные нанокомпозиты (зеленый цвет) в черно-белом варианте проявляются как белые точки (рис.8).

На Фиг.1 приведена фотография образцов клеток линий MDCK и КСТ до и после инкубации с нанокомпозитом Am-PL(ArN3)-oligo1(Flu), полученном по примеру 10. Рисунок демонстрирует проникновение нанокомпозитов в клетки.

Пример 13

В экспериментах используют вирус гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) с исходным титром 108,5 ТЦД50/мл. В качестве нанокомпозитов используют Am-PL(ArN3)-oligo1 и Br-PL(ArN3)-oligo1 с фотоактивируемой арилазидной группой, полученные по примерам 2 и 7, Am-PL-oligo1 и Br-PL-oligo1 без фотоактивируемой группы, полученные известным способом (прототип), в которых адресующей частью выступает олигонуклеотид oligo1, комплементарный 3'-концу 5 сегмента вирусной (-)РНК и имеющий выраженные противовирусные свойства по отношению к вирусу гриппа A H3N2. В качестве TiO2-частиц используют наночастицы в аморфной и кристаллической (брукит) форме. В качестве контрольных образцов используют Am-PL(ArN3) (композит, не содержащий олигонуклеотид) и oligo1(ArN3)+липофектин (композит, в котором липофектин выполняет роль трансфектанта вместо TiO2-наночастиц).

Противовирусные свойства нанокомпозитов исследуют на культуре клеток MDCK. Клетки культивируют, как описано в примере 11. Препараты нанокомпозитов, разводят средой RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина, и вносят в трех повторах на монослой отмытых от сыворотки клеток MDCK в объеме 50 мкл на лунку 96-луночного планшета из расчета 100 мкг/мл по отношению к наночастицам или 1 мкМ по отношению к олигонуклеотиду в конечной реакционной смеси. Второй планшет готовят аналогичным образом с теми же препаратами. Реакционные смеси инкубируют при 37°C и 100% влажности в CO2-инкубаторе в течение 1 ч. Затем вносят вирус A/Aichi/2/68 (H3N2) в разведениях на среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина, от -1 до -8 с десятикратным шагом в объеме 50 мкл/лунку. Через 2,5 ч инкубации реакционные смеси одного из планшетов подвергают УФ-облучению с расстояния 1.5 см в течение 16 мин (расчетная удельная мощность светового потока 4 мВт/см2). Все реакционные смеси затем инкубируют в течение 2 суток в CO2-термостате при 37°C и 100% влажности. Наличие вируса определяют визуально под микроскопом с использованием гемагглютинации по ЦПД и в РГА с 1% эритроцитами петуха.

В качестве дополнительных контролей используют: контроль клеток MDCK (вносят по 100 мкл/лунку питательной среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина) и контроль вируса A/Aichi/2/68 (H3N2) (вносят 50 мкл/лунку среды и через 1 ч инкубации вносят вирус по 50 мкл/лунку в разведениях на среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина, от -1 до -8 с десятикратным шагом). Дальнейшая обработка - как в основном опыте.

Противовирусную активность выражают с помощью индекса нейтрализации, определенного как разность логарифмов титра вируса в клетках в отсутствие нанокомпозитов (контроль) и титра вируса в клетках, обработанных нанокомпозитами (lg ТЦД50/млконтроль - lg ТЦД50/млобразец).

Результаты приведены на Фиг.2, из которой следует, что нанокомпозиты Am-PL-oligo1 и Br-PL-oligo1, не содержащие фотоактивируемой группы, проявляют практически одинаковую противовирусную активность до и после облучения. Такую же активность проявляют нанокомпозиты Am-PL(ArN3)-oligo1 и Br-PL(ArN3)-oligo1 с фотоактивируемой арилазидной группой без облучения. Однако если эти же нанокомпозиты используют в опытах с облучением, их активность значительно увеличивается (в 5-10 раз в зависимости от использованной формы наночастиц диоксида титана). Воздействие контрольных образцов Am-PL(ArN3) и oligo1(ArN3)+липофектин также в 10 раз увеличивается при облучении, благодаря наличию в их составе фотоактивируемой группы.

Пример 14

Способ аналогичен примеру 13, отличается тем, что в качестве нанокомпозитов используют нанокомпозиты, приготовленные по примеру 6, т.е. на основе наночастиц в форме анатаз, а также тем, что концентрация нанокомпозитов в конечной реакционной смеси в опытах по подавлению репродукции вируса составляет 5 мкг/мл по отношению к наночастицам или 0.05 мкМ по отношению к олигонуклеотиду. Как и в предыдущем примере, противовирусная активность нанокомпозита An-PL-oligo1, не содержащего фотоактивируемую группу, не зависит от облучения. В тот же время, нанокомпозит An-PL(ArN3)-oligo1 с фотоактивируемой арилазидной группой проявляет в ~10 раз большую активность после облучения.

Пример 15

Способ аналогичен примеру 13, отличается тем, что в качестве нанокомпозитов используют нанокомпозиты Am-PL(ArN3)-oligo2 и Br-PL(ArN3)-oligo2, полученные по примерам 8 и 9, и Am-PL-oligo2 и Br-PL-oligo2, полученные известным способом (прототип), в которых адресующей частью выступает олигонуклеотид oligo2, имеющий случайную последовательность той же длины, что и oligo1. В качестве контрольного образца использовали oligo2(ArN3)+липофектин (композит, в котором липофектин выполняет роль трансфектанта вместо TiO2-наночастиц).

Результаты приведены на Фиг.3, из которой следует, что нанокомпозиты, содержащие олигонуклеотид, некомплементарный вирусной РНК, без облучения проявляет слабую противовирусную активность (на ~1.5 порядка меньшую по сравнению с нанокомпозитами, содержащими комплементарный олигонуклеотид). Противовирусная активность таких нанокомпозитов после облучения практически отсутствует вовсе. Вероятно, это связано с тем, что некомплементарный олигонуклеотид, не находя своей мишени, подвергается воздействию облучения в составе нанокомпозита, т.е. саморазрушается. Таким образом, разница в действии нанокомпозитов, несущих комплементарный и некомплементарный олигонуклеотид достигает 3 порядков, т.е. увеличивается специфичность противовирусного действия нанокомпозитов. Контрольный образец oligo2(ArN3)+липофектин также проявляет низкую противовирусную активность, одинаковую до и после облучения Вероятно, липофектин защищает олигонуклеотид от саморазрушения при воздействии облучения.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить функциональные возможности нанокомпозитов. получаемых известным способом (прототип), за счет введения в них дополнительной фотоактивируемой группировки. Нанокомпозиты проявляют сайт-специфическое действие, которое обусловлено последовательностью олигонуклеотида в его составе: контрольный нанокомпозит, содержащий специфичный к вирусу гриппа A олигонуклеотид (oligo1) ингибирует размножение вируса с эффективностью, на ~1.5 порядка превосходящей действие нанокомпозита, содержащего олигонуклеотид со случайной последовательностью (oligo2). Получаемые заявляемым способом нанокомпозиты обладают более высокой противовирусной активностью по отношению к вирусу гриппа A при УФ-облучении.

1. Нанокомпозит с активным лигандом для адресной инактивации вируса гриппа внутри клеток, содержащий наночастицы диоксида титана, на которые иммобилизованы конъюгаты олигонуклеотидов с линкером, отличающийся тем, что он содержит дополнительно активный лиганд, представляющий собой фотоактивируемую арилазидную группу, а в качестве олигонуклеотидного компонента он содержит олигонуклеотид, комплементарный 3'-концу 5 сегмента вирусной (-)РНК и имеющий выраженные противовирусные свойства по отношению к вирусу гриппа А.

2. Нанокомпозит по п.1, отличающийся тем, что наночастицы диоксида титана имеют размер 3-10 нм, преимущественно 3-5 им, и находятся в аморфном состоянии или в кристаллической модификации анатаз и/или брукит.

3. Нанокомпозит по п.1, отличающийся тем, что в качестве линкера он содержит поли-L-лизин, а в качестве фотоактивируемой арилазидной группы перфторарилазид.

4. Способ приготовления нанокомпозита с активным лигандом для инактивации вируса гриппа внутри клеток, включающий синтез наночастиц диоксида титана, синтез конъюгатов олигонуклеотида с соответствующим линкером, иммобилизацию конъюгатов на наночастицы диоксида титана, отличающийся тем, что после иммобилизации конъюгатов к препаратам присоединяют фотоактивируемую арилазидную группу, а в качестве олигонуклеотидного компонента используют олигонуклеотид, комплементарный 3'-концу 5 сегмента вирусной (-)РНК и имеющий выраженные противовирусные свойства по отношению к вирусу гриппа А.

5. Способ приготовления по п.4, отличающийся тем, что наночастицы диоксида титана имеют размер 3-10 нм, преимущественно 3-5 нм, и находятся в аморфном состоянии или в кристаллической модификации анатаз и/или брукит.

6. Способ приготовления по п.4, отличающийся тем, что в качестве линкера используют полилизин, а в качестве фотоактивируемой арилазидной группы используют перфторарилазид.

7. Способ приготовления по п.4, отличающийся тем, что после стадии иммобилизации препарат центрифугируют, отделяют супернатант, добавляют раствор 0,1 М карбонат натрия Na2CO3, диметилформамид DMF и трижды с интервалом 30 мин 0,3 М раствор N-оксисукцинимидного эфира n-азидотетрафторбензойной кислоты в DMF.

8. Способ адресной инактивации вируса гриппа внутри клетки, включающий обработку клеток нанокомпозитами, содержащими наночастицы диоксида титана, на которые иммобилизованы конъюгаты олигонуклеотидов с линкером, с последующим их заражением вирусом гриппа A (H3N2) и УФ-облучением, отличающийся тем, что инактивацию проводят нанокомпозитами, содержащими олигонуклеотид, комплементарный 3'-концу 5 сегмента вирусной (-РНК) и имеющий выраженные противовирусные свойства к вирусу гриппа A (H3N2) и фотоактивируемую арилазидную группу, способную под действием УФ-облучения разрушать нуклеиновые кислоты.

9. Способ адресной инактивации вируса гриппа внутри клетки по п.8, отличающийся тем, что обработку клеток нанокомпозитами осуществляют при концентрации нанокомпозитов в клеточной среде 5-100 мкг/мл по TiO2-наночастицам или 0,05-1 мкМ по олигонуклеотиду.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области молекулярной биологии, генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения препарата, содержащего вирусные антигены, включающий а) инокуляцию клеток инфекционным вирусом в жидкости, b) репродукцию указанного вируса в указанных клетках, с) сбор указанного репродуцированного вируса, d) инактивацию указанного собранного вируса, и е) обработку указанного инактивированного вируса детергентом, приводящий к получению препарата, содержащего вирусные антигены.

Изобретение относится к области медицины, и молекулярной биологии, и вирусологии. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии и вирусологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, медицины и ветеринарии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, включающую регуляторную последовательность РНК-полимеразы I собаки и содержащую (i) по меньшей мере 250, или по меньшей мере 350, или по меньшей мере 450 соприкасающихся нуклеотидов или всю нуклеотидную последовательность, представленную в виде последовательности SEQ ID NO:26, (ii) полинуклеотид, который по меньшей мере на 80% идентичен указанной выше нуклеотидной последовательности (i) или включает комплементарную или обратно комплементарную (i) или (ii) последовательность.

Изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и медицины. .

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к противовирусным средствам на основе ген-направленных каталитически активных нуклеиновых кислот. .

Промотор // 2491344
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к промоторам, и может быть использовано в продукции гетерологичных белков клетками-хозяевами. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии. .

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии и может быть использовано для детекции нуклеиновых кислот, диагностики и/или лечения заболеваний.
Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано для диагностики болезни Альцгеймера. .

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии для получения представляющих практический интерес белков, являющихся продуктами молчащих генов или генов с низким уровнем экспрессии.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу анализа частоты взаимодействия нуклеотидной последовательности-мишени с одной или несколькими представляющими интерес нуклеотидными последовательностями.

Изобретение относится к области иммунологии. .

Изобретение относится к новому способу получения фуллеренола С84, при котором сухой углеродный шлам (отходы производства сульфоаддукта нанокластеров углерода) загружают в экстрактор типа аппарата Сокслета и экстрагируют фуллеренол в виде водного раствора аммиачной соли фуллеренола раствором аммиака, нагревом его в испарительной части экстрактора.
Наверх