Способ количественного определения клеток-предшественников (cd34+) в кроветворной ткани

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани. Для этого проводят окраску клеточного субстрата одновременно моноклональными антителами к антигену CD34 и нуклеотропным (ядерным) красителем Syto16, при этом подсчет клеток-предшественников (CD34+) осуществляют в пределах Syto16+ клеток. Использование данного способа позволяет количественно учесть всю популяцию CD34+CD45 клеток в пределах ядросодержащих Syto16+ без предварительного ограничения области анализа на основании экспрессии антигена CD45 и избежать занижения процента CD34+ клеток-предшественников. 1 пр., 2 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и онкологии, и касается способа количественного определения клеточного состава кроветворной ткани.

В комплексном лечении злокачественных заболеваний и ряда наследственных, генетических болезней используется трансплантация кроветворных клеток. Успех трансплантации кроветворной ткани определяется количеством клеток-предшественников в донорской ткани. Поддержание и восстановление кроветворения обеспечивается пулом клеток-предшественников (CD34+). Количественный подсчет клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани стал возможным с момента открытия антигена, выявляемого на мембране стволовых клеток, молекулы CD34. [Civin C.I., Strauss L.S. J. Immunol. Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell sutface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1 a cell. 1984, 133:157-164].

Содержание клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани представляет малую клеточную популяцию. Даже в условиях предварительной стимуляции кроветворения их содержание не превышает от 1,0 до 3,0%, поэтому их подсчет в каждой пробе предполагает анализ не менее 100000-150000 клеток.

Существует несколько способов количественного определения клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани.

Известен способ количественного определения клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани с использованием одинарной окраски. Способ основан на экспрессии на мембране клеток-предшественников антигена CD34 и заключается в том, что клетки инкубируют с моноклональными антителами к антигену CD34. Подсчет количества клеток-предшественников (CD34+) осуществляют с помощью проточной цитофлуориметрии. Область исследования, включающая клетки-предшественники (CD34+), ограничивается мононуклеарными клетками и выбирается на основании характеристик светорассеяния (SSC/FSC - боковое светорассеяние, отражающее гранулярность клеток, против прямого светорассеяния, отражающего размер клетки) [Civin С.I., Strauss L.S.; J. Immunol., Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell sutface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1a cell, 1984, 133:157-164, Krause D.S., Fackler M.J., Civin C.I., CD34: structure, biology and clinical utility. Blood, 1996, 87:1-13; Андреева Л.Ю. Автореф. дисс. канд. мед. наук, Москва, 1999].

Недостатки способа: сложность в пересчете абсолютного количества клеток- предшественников (CD34+), контаминация клеточными обломками и эритроцитами, что приводит к занижению количества CD34+ клеток.

Известен способ количественного определения клеток-предшественников (CD34+) с использованием двойной окраски, при котором клеточный субстрат окрашивается одновременно моноклональными антителами (МКА) к антигену CD34 и к антигену CD45, который определяется на мембране всех клеток крови за исключением эритроцитов Область исследования ограничена только CD45+ клетками, в пределах этой популяции подсчитывают содержание клеток-предшественников (CD34+). Способ позволяет рассчитать относительное количество клеток-предшественников (CD34+) от количества лейкоцитов [Gratama J.W., Kraan J., Keeney M, and al. Validation of the single-platform ISHAGE method for CD34+ hematopoietic stem and progenitor cell enumeration in an international multicenter study. Cytotherapy. 2003, 5 (1) 55-65; Allan D.S., Keeney M., Howson-Jan K. Number of viable CD34+cells reinfused predict engraftment in autologous hematopoietic stem cell transplantation. Bone marrow Transplant. 2002, 29: 967-972]. Данный способ является прототипом заявляемого способа.

Недостатки способа: часть клеток-предшественников (CD34+) может не экспрессировать антиген CD45 или экспрессирует его с очень низкой плотностью, поэтому при подсчете возможны значительные потери количества клеток-предшественников (CD34+).

Задача заявляемого изобретения состоит в создании нового, более точного способа количественного определения клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани. Поставленная задача решается тем, что для количественного определения клеток-предшественников (CD34+) используют моноклональные антитела к антигену CD34 и нуклеотропный (ядерный) краситель Syto16, при этом подсчет CD34+ клеток осуществляют в пределах Syto16+ клеток.

Изобретение иллюстрировано фигурами 1 (А-Г) и 2 (А-Д).

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Кроветворные клетки (костный мозг, пуповинная кровь, стимулированная периферическая кровь, цитаферезный продукт) больных и доноров в количестве 100 микролитров (мкл) помещали в пробирку и вносили 10 мкл моноклональных антител к антигену CD34, которые были конъюгированы с флуорохромными частицами фикоэритрина-РЕ, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее добавляли 0,5 мл лизирующего раствора, не содержащего фиксирующих компонентов, и инкубировали в течение 5-7 минут в темноте при комнатной температуре. Клеточную суспензию доводили фосфатным буфером до объема от 4,5 до 10 мл, далее клетки осаждали центрифугированием при оборотах 500g в течение 5 минут, освобождались от надосадочной жидкости, добавляли 2 мкл рабочего раствора Syto16 в разведении 1:1000 и ресуспендировали. Подсчитывали количество клеток-предшественников (CD34+) на проточном цитофлуориметре без ограничения гейтов на всю клеточную популяцию, при этом в каждой пробе анализировали 100000-150000 клеток.

Syto16+ клетки определяли в диапазоне канала FL-1 проточного цитофлуориметра. Подсчет количества клеток-предшественников (CD34+) осуществляли непосредственно после окончания реакции, не позднее 24 часов с момента ее постановки. Пробирки с клеточной суспензией хранили в холодильнике при температуре 4°С.

Проведена сравнительная оценка количественного определения клеток-предшественников (CD34+) по заявляемому способу и прототипа на 25 образцах кроветворной ткани (лейкаферезный продукт) с использованием моноклональных антител к антигену CD34 и общелейкоцитарному антигену CD45 и нуклеотропного (ядерного) красителя Syto16.

Кроветворные клетки каждого образца были инкубированы одновременно с моноклональными антителами к антигенам CD34 и CD45, и по окончанию инкубации к клеткам добавлен нуклеотропный (ядерный) краситель Syto16.

Количественное определение клеток-предшественников (CD34+) проводили с помощью проточной цитофлуориметрии, производили подсчет количества клеток-предшественников CD34+CD45+ и CD34+Syto16+ (фиг.1 (А-Г) и фиг.2 (А-Д).

На фиг.1 (А-Г) представлена экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45 клетками-предшественниками (CD34+).

На фиг.1А представлены все клетки образца, количество клеток-предшественников (CD34+) составило 0,33% (область R1): по оси абсцисс - экспрессия антигена CD34, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.

На фиг.1Б представлена экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45 (область R2 - CD45+ клетки): по оси абсцисс - экспрессия антигена CD45, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.

На фиг.1В представлены только клетки-предшественники CD34+ (область R1 фиг.1А), из которых СD45-негативные клетки составили более 80% (нижний левый квадрант).

На фиг.1Г представлены CD45+ клетки (область R2 фиг.1Б), из которых содержание клеток-предшественников (CD34+) составило 0,05% (область R1): по оси абсцисс - CD34+ клетки, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.

На фиг.2 (А-Д) представлено сопоставление количественного определения клеток-предшественников (CD34+) по заявляемому способу и прототипу.

На фиг.2А представлено количество ядросодержащих Syto16+ клеток в образце (область R2): по оси абсцисс - ядросодержащие Syto16+ клетки, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.

На фиг.2Б представлена экспрессия антигена CD34 в пределах ядросодержащих Syto16+ клеток (область R2 фиг.2А), при этом количество Syto16+CD34+клеток составило 0,47% (область R3): пo оси абсцисс - CD34+ клетки, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.

На фиг.2В представлено количество CD45+ клеток образца, составляющее 78,7% (область R1): по оси абсцисс - экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45, моноклональные антитела конъюгированы с фикоэритрином Су5 (РЕ-Су5), по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.

На фиг.2Г представлено количество клеток-предшественников (CD34+) относительно пропорции CD45+ клеток образца: по оси абсцисс - клетки-предшественники CD34+, моноклональные антитела конъюгированы с фикоэритрином (РЕ), по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC. Относительное число клеток-предшественников (CD34+) от количества лейкоцитов составило 0,47% (0,37%:(78,7%:100)=0,47%).

На фиг.2Д представлено количество клеток-предшественников (CD34+) относительно Syto16+ клеток (на фиг.2Д только клетки, попавшие в область R3 фиг.2Б): по оси абсцисс - Syto16+ клетки, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC. Все клетки-предшественники (CD34+) являются Syto16+.

Таким образом, показано, что количество клеток-предшественников (CD34+) относительно всей клеточной популяции составило 0,37% (фиг.2Г), а в пределах только ядросодержащих Syto16+ клеток их количество составило 0,47% (фиг 2Б), что соответствовало числу CD34+CD45+клеток (фиг 2В, Г). Все клетки-предшественники (CD34+) образца находились в области Syto16+ клеток (фиг.2Д).

Полученные данные позволяют оценивать количество клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани по заявляемому способу.

Способ количественного определения клеток-предшественников (CD34+) осуществляли на 585 образцах кроветворной ткани (костный мозг, пуповинная кровь, стимулированная периферическая кровь, цитаферезный продукт) больных и доноров.

Технический результат. Заявляемый способ количественного определения клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани является точным и позволяет избежать искусственного занижения или завышения их содержания.

Способ количественного определения клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани, включающий использование окраски клеточного субстрата одновременно моноклональными антителами к антигену CD34 и нуклеотропным (ядерным) красителем Syto16, при этом подсчет клеток-предшественников (CD34+) осуществляют в пределах Syto16+ клеток.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа количественного определения фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253». Способ предусматривает обеззараживание и выделение РНК из вируссодержащего материала, постановку реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме «реального времени» с использованием специфичных праймеров RV5-5'-GTTGGGCACTGAAACTGCTA-3', RV6-5'-GAATCTCCGGGTTCAAGAGT-3' и зонда RV7-5'-ROX-AATCCTCCTTGAACTCCATGCGACAGA-BHQ2.
Изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использовано для определения протеолитической модификации клеточных рецепторов на модели выделенных лимфоцитов периферической крови.

Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для прогнозирования туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью у впервые выявленных больных туберкулезом легких (ТБ).
Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано у больных гемобластозами для прогноза развития рецидива заболевания после проведения аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток (АТСКК).

Изобретение относится к медицине, а именно к детской гастроэнтерологии, и может быть использовано для прогноза эффективности интерферонотерапии гепатита С. .
Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, иммунологии, и может быть использовано для оценки эффективности антибактериальной терапии С. .

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к областям диагностической медицинской микробиологии, медицинской биохимии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем, касается разработки нового способа для высокочувствительного определения белка летального фактора сибирской язвы (LF) в инфицированных образцах биологического происхождения и окружающей среде.
Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для диагностики гнойно-септических заболеваний у новорожденных детей. .
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для прогнозирования замедленной консолидации костной ткани при внеочаговом остеосинтезе.

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, конкретно к областям диагностической медицинской микробиологии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем для иммунофлуоресцентного определения протективного антигена (ПА) возбудителя сибирской язвы в образцах биологического происхождения.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения длительно незаживающей раны и/или раневой полости. Для этого проводят многократное нанесение на поверхность раны и/или раневой полости пациента композиции, включающей культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток человека, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток, содержащую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов и цитокинов, используемую для культивирования in vitro мезенхимальных стволовых клеток человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и медицины. Предложено применение композиции для культивирования клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описаны способы генерации HLA-гомозиготных партеногенетических линий стволовых клеток человека (hpSC-Hhom) как от HLA-гомозиготных, так и от HLA-гетерозиготных доноров.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Предложен способ выделения происходящих из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, с культивированием в сосуде, содержащем фибронектин, и последующим получением стволовых клеток из культуры, а также среда для культивирования стволовых клеток, способ культивирования стволовых клеток, клеточное терапевтическое средство, и способ увеличения «стволовости» стволовых клеток, который характеризуется наличием сферической культуры или трехмерной культуры стволовых клеток.
Изобретение относится к области медицины, тканевых технологий и биотехнологии. Предложен предшественник искусственной почки, содержащий не относящийся к человеку метанефрос млекопитающего, выделенный из живого организма, при этом метанефрос подвергался операциям замораживания и размораживания вне живого организма, и он содержит мезенхимные стволовые клетки млекопитающего, перенесенные из живого организма (за исключением мезенхимных стволовых клеток из человеческого эмбриона), и также предложен способ его получения.
Изобретение относится к области медицины и клеточных технологий. Предложен клеточный продукт, содержащий популяцию протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, характеризующихся фенотипом CD49f+/EpCAM+ и после обработки вальпроевой кислотой в концентрации 0,1-40 мМ и культивирования в коллагеновом геле меняющих профиль экспрессии на 1AAT+/PEPCK+/G6P+/TDO+/CYP Р4503А13+, а также приобретающих способность синтезировать мочевину и альбумин.
Изобретение относится к области клеточной биологии и медицины. Предложен способ получения клеток для заместительной клеточной терапии печени, заключающийся в выделении из подчелюстной слюнной железы популяции стволовых клеток, экспрессирующей маркеры CD49f и EpCAM, инкубировании ее с вальпроевой кислотой и последующей трансдифференцировке в гепатоцитарном направлении в процессе культивирования.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения непрерывных клеточных линий живых клеток и их применений. Представленный способ включает облучение указанных живых клеток дозой УФ-света от около 20 мДж/см2 до около 300 мДж/см2 при длине волны между около 100 нм и около 400 нм в течение от около 30 сек до 5 мин и отбор клеток, способных к пролиферации после по меньшей мере 20 пассажей.
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложен способ in vitro генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток рака яичника.

Изобретение относится к медицине и клеточной биотехнологии. Для получения биологически активной субстанции после электростимуляции куриных голов в режиме 100-120 В, силой тока 3-5 А в течение 3-5 секунд осуществляют забор и инкубацию крови.
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к генной инженерии, и касается выделения жизнеспособных клеток из такого биологического материала, как стенка тонкого кишечника мыши. Получают жизнеспособные лимфоциты из стенок тонкого кишечника (lamina propria) мыши линии СВА при использовании биологического материала трех мышей. Исходный биологический материал - участок кишечника промывают фосфатно-буферным раствором и удаляют пейеровые бляшки. Измельчают его в присутствии фосфатно-солевого раствора, содержащего дитиотреитол при перемешивании при комнатной температуре. Промывают буферным раствором через нейлоновую сетку. Инкубируют материал в буферном растворе, содержащем бычий сывороточной альбумин при перемешивании в заданных условиях. Удаляют надосадочную жидкость. Промывают осадок фосфатно-солевым буфером. Инкубируют осадок биологического материала в клеточной среде RPMI-1640, содержащей эмбриональную телячью сыворотку, HEPES и коллагеназу при перемешивании в заданных условиях, и фильтруют полученную суспензию. Отмывают суспензию от остатков коллагеназы и осаждают клетки лимфоцитов в клеточной среде RPMI-1640, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и HEPES с использованием центрифугирования в заданных условиях с последующим определением выхода жизнеспособных клеток с помощью камеры Горяева. Изобретение позволяет повысить выход жизнеспособных клеток из тонкого кишечника мыши. 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани. Для этого проводят окраску клеточного субстрата одновременно моноклональными антителами к антигену CD34 и нуклеотропным красителем Syto16, при этом подсчет клеток-предшественников осуществляют в пределах Syto16+ клеток. Использование данного способа позволяет количественно учесть всю популяцию CD34+CD45 клеток в пределах ядросодержащих Syto16+ без предварительного ограничения области анализа на основании экспрессии антигена CD45 и избежать занижения процента CD34+ клеток-предшественников. 1 пр., 2 ил.

Наверх