Способ получения холерогена-анатоксина

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и касается способа получения холерогена-анатоксина. Способ включает выделение холерогена-анатоксина методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 300 кДа, концентрирование методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 30 кДа с последующей очисткой диафильтрацией трехкратным объемом стерильной очищенной водой методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 30 кДа. Изобретение обеспечивает увеличение выхода холерогена-анатоксина, сокращение времени и количества технологических стадий его получения. 1 ил., 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов, в частности к технологии получения холерогена-анатоксина, и может быть использовано в практике производства вакцины оральной холерной бивалентной химической таблетированной.

Холероген-анатоксин используется для получения вакцины холерной бивалентной химической, таблетированной (одним из компонентов которой он является), включенной в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям в соответствии с Приказом Минздрава России №229 от 27.06.2001 г. Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, представляет собой смесь холерогена-анатоксина и O-антигенов, полученных из инактивированных формалином бульонных культур холерных вибрионов O1 серогруппы - Vibrio cholerae 569 В классического биовара серовара Инаба и V. cholerae M-41 классического биовара серовара Огава.

Известен способ получения очищенного холерного экзотоксина (В.В. Строганов и др. Применение метода ультрафильтрации на отечественных полупроницаемых мембранах марки УАМ для отделения соматического O-антигена от экзотоксина холерного вибриона - Пробл. особо опасных инф., 1978, вып.4, с.52-55), сущность которого заключается в том, что из нативной культуры, содержащей O-антиген и холерный экзотоксин, удаляют ультрафильтрацией O-антиген. Полученный холерный экзотоксин используется только для получения антихолерогенной сыворотки, а не как компонент вакцины.

Известен способ производства химической вакцины, состоящей из холерогена-анатоксина вместе с O-антигеном серовара Инаба, описанный в патенте России №2076734, A61K 39/00, согласно которому холерный вибрион выращивают в условиях глубинного культивирования на питательной среде, состоящей из ферментативного перевара казеина или мяса. В начале стационарной фазы роста выращивание прекращают добавлением 0,6% формалина. Убитые формалином микробные тела через 12 ч отделяют в центрифуге при 15000 об/мин, а надосадочную жидкость выдерживают 25-30 дней при концентрации формалина 0,2%, pH 6,7, температуре 10-12°C для образования устойчивого анатоксина и снижения токсичности O-антигена. После этого приступают к выделению, очистке и концентрации иммуногенов (холерогена-анатоксина и O-антигена). Поэтапное осаждение антигенов холерного вибриона состоит в выполнении следующих операциях. На первом этапе добавляют сульфат аммония до 0,37 насыщения (281±7,6 г соли на 1 л), перемешивают, оставляют на 18-20 ч и центрифугируют при 8000 об/мин. Полученный на роторе осадок «O-антигенсодержащая фракция» используют в дальнейшем для получения O-антигена. На втором этапе из центрифугата выделяют фракцию, содержащую термолабильные белки, условно названную «холероген-анатоксин», путем последующего осаждения до 0,80 насыщения (327±38 г соли на 1 л исходного раствора). После центрифугирования осадок диализуют, разводят дистиллированной водой до 10 мг белка в 1 мл и проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры. Полученную жидкую фракцию «холероген-анатоксин» лиофильно высушивают и используют для конструирования таблеток вакцины.

Недостатками способа являются существенные потери холерогена-анатоксина и O-антигена и применение значительного (608±45,7 г на 1 дм3 безмикробного центрифугата) количества сульфата аммония, затрачиваемого на осаждение.

Описанные недостатки устранены в способе по патенту RU 2451522, в соответствии с которым осуществляют предварительное концентрирование нативных холерогена-анатоксина и О-антигена путем проточной фильтрации через мембранные модули с номинальной отсечкой по молекулярной массе 50 кДа под давлением 0,23-0,25 МПа со средней удельной скоростью освобождения нативных холерогена-анатоксина и O-антигена от балластных примесей - 60-70 дм32/ч, с последующим осаждением балластной (O-антигенсодержащей) фракции путем добавления 281±7,6 г сульфата аммония на 1 дм3 безмикробного центрифугата с последующим удалением этой фракции центрифугированием; осаждением холерогена-анатоксина и O-антигена из полученного центрифугата путем добавления 327±38 г сульфата аммония на 1 дм3 безмикробного центрифугата и концентрированием центрифугированием. После концентрирования центрифугированием полученный продукт диализуют, разводят дистиллированной водой до 10 мг белка в 1 мл и проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры, лиофильно высушивают и используют для конструирования таблеток вакцины. Балластную (O-антигенсодержащую) фракцию используют в дальнейшем для получения O-антигена. O-антиген, полученный с использованием двух вышеописанных способов, обладает стандартностью и используется в дальнейшем для конструирования таблеток вакцины холерной бивалентной химической, таблетированной.

Недостатком описанных способов являются потери холерогена-анатоксина, возникающие за счет того, что его концентрирование проводят центрифугированием. Кроме того, технологический процесс получения холерогена-анатоксина длительный и многостадийный.

Технический результат заключается в увеличении выхода холерогена-анатоксина, с сохранением показателей качества препарата при сокращении времени и количества технологических стадий его получения.

Одним из перспективных направлений, применяемых в технологиях производства химических вакцин, является внедрение метода тангенциальной ультрафильтрации. Фильтрация в проточном (тангенциальном) потоке является разделительным методом, в котором поток жидкости направляется вдоль мембраны, омывая ее поверхность. Применение мембранных модулей с разным размером пор (номинальной отсечкой по молекулярной массе) позволяет использовать данный метод для разделения и концентрирования антигенов с различной молекулярной массой.

Технический результат достигается тем, что в способе получения холерогена-анатоксина, включающем выращивание холерного вибриона штамма 569 В Инаба в условиях глубинного культивирования, отделение убитых формалином микробных тел в проточной центрифуге, согласно изобретению холероген-анатоксин выделяют методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 300 кДа, концентрируют методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 30 кДа, очищают диафильтрацией трехкратным объемом стерильной очищенной водой методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 30 кДа с последующей стерилизующей фильтрацией.

Возможность практического использования заявляемого изобретения подтверждается примером.

Пример. Холерный вибрион V. cholerae 569 В классического биовара серовара Инаба выращивают в условиях глубинного культивирования в реакторе с 200 л бульона из ферментативного перевара казеина, с аэрацией и автоматической подкормкой глюкозой и аммиаком. В первые четыре часа роста поддерживают температуру 37°C, а затем в течение 5-7 ч снижают до 34-35°C для сохранения в культуральной жидкости термолабильного токсина. В начале стационарной фазы роста (10-11 ч выращивания), когда концентрация микробных тел, достигнув 70-100 млрд в 1 мл, остается постоянной 2-3 ч, выращивание прекращают добавлением 0,6% формалина.

Убитые формалином микробные тела через 12 ч отделяют в проточной центрифуге при 15000 об/мин, а надосадочную жидкость выдерживают 20-30 дней при концентрации формалина 0,2%, pH 6,7, температуре 10-12°C для образования устойчивого холерогена-анатоксина и снижения токсичности O-антигена. После этого приступают к выделению, очистке и концентрации иммуногенов.

Технологические операции тангенциальной ультрафильтрации проводили с использованием ультра- и микрофильтрационной установки на базе фильтродержателя АСФ-020, которая дает возможность:

проводить технологический процесс в асептических условиях;

осуществлять стерилизацию оборудования химическим и термическим способами и их сочетанием, что соответствует требованиям GMP (ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств»);

быстро заменять фильтрующие элементы в случае их выхода из строя во время проведения технологического процесса, благодаря модульной системе фильтров установки на базе фильтродержателя АСФ-020.

Выделение холерогена-анатоксина осуществляют методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе 300 кДа под давлением 0,24-0,26 МПа. Образующийся фильтрат, содержащий холероген-анатоксин, концентрируют методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе 30 кДа под давлением 0,24-0,26 МПа. Далее осуществляют очистку концентрированного холерогена-анатоксина диафильтрацией трехкратным объемом стерильной очищенной водой методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе 30 кДа под давлением 0,24-0,26 МПа. Очищенную диафильтрацией фракцию «холероген-анатоксин» подвергают стерилизующей фильтрации, лиофильно высушивают и используют для конструирования таблеток вакцины холерной бивалентной химической, таблетированной.

Количество безмикробного центрифугата штамма V. cholerae O1 569 В классического биовара серовара Инаба для получения холерогена-анатоксина по существующему способу (патент RU 2451522) и заявляемому способу составляло по 100 дм3. Контроль качества лиофилизированных препаратов «холероген-анатоксин» (таблица 1) показал на соответствие их требованиям нормативной документации, при этом количество препарата холерогена-анатоксина, полученного по заявляемому способу, на 25% больше.

Проверка препаратов методом гель-хроматографии (чертеж) выявила, что профили элюции представляли собой подобные пики, оба препарата (I - полученный по заявляемому способу; II - полученный по существующему способу (патент RU 2451522)) выходили с колонки практически с одинаковой задержкой во времени, что говорит об их одинаковом качественном составе.

Характеристики проведения процесса получения холерогена-анатоксина по существующему и заявленному способам технологии представлены в таблице 2. Как видно из данных, представленных в таблице 2, использование предложенного способа сокращает время получения холерогена-анатоксина из культуральной жидкости и всего технологического процесса в целом на 100 ч по сравнению с существующим способом технологии, при этом количество стадий производственного процесса сокращается.

Таблица 1
Способ получения холерогена-анатоксина
Наименование показателя Требования нормативной документации Значение показателя качества препарата холерогена-анатоксина
полученного по существующему способу (патент RU 2451522) полученного по заявляемому способу
Специфическая безвредность безвреден безвредны
Специфическая активность холерогена-анатоксина, единиц связывания анатоксина от 2000 до 12000 в 1 мг препарата 7000 7000
Содержание O-антигена, обратный показатель титра в реакции непрямой агллютинации с O1 сывороткой отсутствует 156 156
Количество продукта, г отсутствует 23 29

Способ получения холерогена-анатоксина, включающий глубинное культивирование холерного вибриона штамма 569 В Инаба, отделение убитых формалином микробных тел в проточной центрифуге, выделение холерогена-анатоксина, отличающийся тем, что холероген-анатоксин выделяют методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 300 кДа, концентрируют методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 30 кДа, очищают диафильтрацией трехкратным объемом стерильной очищенной водой методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 30 кДа с последующей стерилизующей фильтрацией.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения средства, обладающего антимикробной активностью. Способ получения средства, обладающего антимикробной активностью, где надземную часть свежесобранного лука медвежьего (Allium ursinum L.) или лука победного (Allium victoriale L.) измельчают до кашицеобразного состояния, заливают спиртом этиловым, настаивают трехкратно, при определенных условиях, после каждой экстракции извлечения сливают, полученные извлечения объединяют.

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности к аспектам, относящимся к антимикробным композициям, и описывает антимикробные композиции, антимикробный силиконовый гель на основе указанной антимикробной композиции, повязки на раны и способы их изготовления.
Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для оздоровления хозяйств от некробактериоза крупного рогатого скота. Способ включает внутримышечное введение лекарственного препарата.

Группа изобретений относится к области ветеринарии и предназначено для лечения коров с субклиническим маститом. Заявлены препарат и способ его применения.
Заявленная группа изобретений относится к области ветеринарии и предназначена для лечения животных, больных бактериозами и дрожжевыми микозами. Заявленный препарат содержит окситетрациклина гидрохлорид, сульфадимезин, ампициллина натриевую соль, нистатин, растворитель и проводник активных веществ диметилсульфоксид, анестетик быстрого действия - лидокаин при следующем соотношении компонентов, масс.%: ампициллина натриевая соль 4,0-8,0, окситрациклина гидрохлорид 2,0-4,0, нистатин 1,0-2,0, сульфадимезин 2,0-4,0, новокаин 0,25-0,5, лидокаин 0,25-0,5, диметилсульфоксид 10,0-20,0, 1,2-пропиленгликоль - остальное.

Изобретение относится к способу получения полимерного конъюгата индолокарбазольного соединения формулы (I), где R1, R2, R3, W1 и W2 представляют собой водород, Х представляет собой метокси-полиэтиленгликоль.

Изобретение относится к медицине, а именно к антибактериальным препаратам широкого спектра действия. Предложено средство, представляющее собой дигидроксоцистинодиа-минодиаргенат натрия, обладающее антибактериальной активностью.
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для профилактики и лечения инфекционных процессов при хирургических стоматологических вмешательствах.

Группа изобретений относится к области фармацевтической промышленности, в частности к производству лекарственных средств из фторхинолонов, используемых для местного лечения воспалительных заболеваний глаз микробного генеза и бактериальных инфекций у людей или животных.

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированной бактерии Salmonella enterica, которые содержат, по меньшей мере, один оперон pgl из Campylobacter jejuni или его функциональное производное и относится к презентации, по меньшей мере, одного N-гликана из Campylobacter jejuni или производного этого N-гликана на их клеточной поверхности.
Изобретение относится к вакцине, включающей в комбинации неживые антигены Lawsonia intracellularis, Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней и фармацевтически приемлемый носитель.
Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов, в частности к способам концентрирования холерогена-анатоксина и О-антигена Vibrio cholerae О1 классического биовара штамма 569 В серовара Инаба, и может быть использовано в практике производства вакцины оральной холерной бивалентной химической таблетированной.
Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и касается способа концентрирования нативного O-антигена Vibrio cholerae. .
Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для производства химических вакцин против возбудителя холеры и получения очищенного препарата O1 антигена Огава для приготовления диагностической сыворотки.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению авирулентного штамма холерного вибриона биовара эльтор серовара Инаба, характеризующегося высокой продукцией основного протективного O1 антигена Инаба, предназначенного для производства химических вакцин против возбудителя холеры и получения очищенного препарата O1 антигена Инаба для приготовления диагностической сыворотки.

Изобретение относится к области медицины, в частности к вакцинологии. .
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике особо опасных инфекций. .

Изобретение относится к области медицины, микробиологии и иммунологии. .

Изобретение относится к технологии иммунобиологических лекарственных препаратов, в частности к производству химической холерной вакцины. Изобретение раскрывает способ получения таблетированной формы холерной бивалентной химической вакцины, который включает подготовку и смешивание лиофилизированных антигенов - холерогена-анатоксина, О-антигенов серовара Инаба и серовара Огава с лактозы моногидратом, целлюлозой микрокристаллической, гранулирование таблеточной смеси методом псевдоожиженного слоя с распылением 10% водного раствора поливинилпирролидона сверху с последующим таблетированием и нанесением 20% водного раствора кишечнорастворимого покрытия. Способ обеспечивает увеличение выхода таблеток вакцины холерной химической и повышение безопасности процесса производства вакцины для операторов, ведущих технологический процесс. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и касается способа получения холерогена-анатоксина. Способ включает выделение холерогена-анатоксина методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 300 кДа, концентрирование методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 30 кДа с последующей очисткой диафильтрацией трехкратным объемом стерильной очищенной водой методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 30 кДа. Изобретение обеспечивает увеличение выхода холерогена-анатоксина, сокращение времени и количества технологических стадий его получения. 1 ил., 2 табл., 1 пр.

Наверх