Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений



Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений
Улучшенные аминокислотные последовательности против il-6r и содержащие их полипептиды для лечения связанных с il-6r заболеваний и нарушений

 


Владельцы патента RU 2539798:

АБЛИНКС НВ (BE)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к одиночному вариабельному домену, направленному против IL-6R, к полипептиду и конструкции, направленным против IL-6R, содержащим указанный одиночный вариабельный домен, а также к способам их получения. Раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие вышеуказанный одиночный вариабельный домен, полипептид и конструкцию, а также генетические конструкции, содержащие вышеуказанные нуклеиновые кислоты. Описаны клетки-хозяева и организмы хозяева, содержащие вышеуказанные нуклеиновые кислоты. Изобретение также охватывает композицию для блокирования взаимодействия IL-6/IL-6R, содержащую эффективное количество описанного одиночного вариабельного домена, полипептида, конструкции, нуклеиновой кислоты или генетической конструкции. Также раскрыт способ профилактики и/или лечения по меньшей мере одного из заболеваний или расстройств, связанных с IL-6, IL-6R, комплексом IL-6/IL-6R и/или сигнальными путями, в которые вовлечен IL-6, IL-6R или комплекс IL-6/IL-6R и/или биологическими функциями и реакциями, в которых участвует IL-6, IL-6R или комплекс IL-6/IL-6R с использованием описанного одиночного вариабельного домена, полипептида, конструкции или композиции. Изобретение позволяет эффективно с увеличенной афинностью и биологической активностью блокировать взаимодействие IL-6/IL-6R. 14 н. и 11 з.п. ф-лы, 70 ил., 56 табл., 61 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к аминокислотным последовательностям, направленным против и/или способным специфически связываться (как определено здесь) с рецептором интерлейкина-6 (IL-6R), а также к соединениям или конструкциям, в частности белкам и полипептидам, содержащим или в основном состоящим из одной или нескольких таких аминокислотных последовательностей (которые также именуются как "аминокислотные последовательности изобретения", "соединения изобретения", "конструкции изобретения" и "полипептиды изобретения", соответственно).

Изобретение также имеет отношение к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие аминокислотные последовательности и полипептиды (которые также именуются как "нуклеиновые кислоты изобретения" или "нуклеотидные последовательности изобретения"); способам получения таких аминокислотных последовательностей и полипептидов; клеткам-хозяевам, экспрессирующим или способным экспрессировать такие аминокислотные последовательности или полипептиды; композициям, в частности фармацевтическим композициям, содержащим такие аминокислотные последовательности, полипептиды, нуклеиновые кислоты и/или клетки-хозяева; а также к применению таких аминокислотных последовательностей или полипептидов, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев и/или композиций, в частности, для профилактики, терапевтических или диагностических целей, как-то профилактики, терапевтических или диагностических целей, указанных в настоящем изобретении.

Другие аспекты, воплощения, преимущества и применения изобретения станут ясными из дальнейшего описания.

Уровень техники

Взаимодействие IL-6-белка, первоначально идентифицированного как фактор дифференцировки В-клеток (Hirano et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5490-4; EP 0257406), с рецептором IL-6R (Yamasaki et al., 1988, Science, 241: 825-8; EP 0325474) приводит к образованию комплекса IL-6/IL-6R. Этот комплекс связывается с gp130 (Taga et al., 1989, Cell, 58; 573-81; EP 0411946), мембранным белком на клетке мишени, который передает различные физиологические действия IL-6. В настоящее время известно, что IL-6 участвует, среди прочего, в регуляции иммунного ответа, гемопоэза, острой фазы ответа, метаболизма костей, ангиогенеза и воспаления. Дерегулирование продукции IL-6 влечет за собой патологические процессы некоторых аутоиммунных и хронических воспалительных пролиферативных заболеваний (Ishihara and Hirano, 2002, Biochim. Biophys. Acta, 1592: 281-96). Вследствие этого ингибиторы индуцируемого IL-6 сигнализирования в прошлом привлекали большое внимание (Hirano et al., 1990, Immunol. Today, 11: 443-9). Полипептиды, специфически связывающиеся с IL-6 (Klein et al., 1991, Blood, 78: 1198-204; EP 0312996), IL-6R (EP 0409607) или gp130 (Saito et al., 1993, J. Immunol. Methods, 163: 217-223; EP 0572118), как оказалось, проявляют существенный ингибиторный эффект на функционирование IL-6.

Суперпродукция IL-6 и сигнализирование (в частности, так называемое транссигнализирование) вовлечены в различные заболевания и нарушения, такие как сепсис (Stames et al., 1999, J. Immunol., 148: 1968), различные формы рака, как-то множественная миелома (ММ), почечно-клеточная карцинома (RCC), плазмоцитарная лейкемия (Klein et al., 1991), лимфома, В-лимфопролиферативные нарушения (BLPD) и рак простаты. Неограничительные примеры других заболеваний, вызванных избыточной продукцией IL-6 или сигнализированием, включают резорбцию костей (остеопороз) (Roodman et al., 1992, J. Bone Miner. Res., 7: 475-8; Jilka et al„ 1992, Science, 257: 88-91), кахексию (Strassman et al., 1992, J. Clin. Invest. 89: 1681-1684), псориаз, мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, саркому Капоши, связанную со СПИДом лимфому (Emilie et al., 1994, Int. J. Immunopharmacol. 16: 391-6), воспалительные заболевания и нарушения, такие как ревматоидный артрит, системный юношеский идиопатический артрит, гипергаммаглобулинемия (Grau et al., 1990, J. Exp. Med. 172: 1505-8); болезнь Крона, язвенный колит, системная красная волчанка (SLE), рассеянный склероз, болезнь Кэстлмана, IgM-гаммопатия, миксома сердца, астма (в частности аллергическая астма) и аутоиммунный инсулинозависимый сахарный диабет (Campbell et al., 1991, J. Clin. Invest. 87: 739-742). Другие связанные с IL-6 заболевания должны быть известны специалистам в этой области.

Как можно видеть, к примеру, из вышеприведенных работ, на предшествующем уровне техники описаны антитела и фрагменты антител против IL-6 человека, против IL-6R человека и против белка gp130 человека для профилактики и лечения связанных с IL-6 заболеваний. Их примерами являются Tocilizumab (см. Woo et al., 2005, Arthritis Res. Ther. 7: 1281-8; Nishimoto et al., 2005, Blood 106: 2627-32; Ito et al., 2004, Gastroenterology, 126: 989-96; Choy et al., 2002, Arthritis Rheum. 46: 3143-50), BE8 (см. Bataille et al., 1995, Blood 86: 685-91; Emilie et al., 1994, Blood 84: 2472-9; Beck et al., 1994, N. Engl. J. Med. 330: 602-5; Wendling et al., 1993, J. Rheumatol. 20: 259-62) и CNTO-328 фирмы Centocor (см. Journal of Clinical Oncology, 2004, 22/14S: 2560; Journal of Clinical Oncology, 2004, 22/14S: 2608; Int. J. Cancer, 2004, 111:592-5). Другим активным элементом, известным в этой области для профилактики и лечения связанных с IL-6 заболеваний, является продукт слияния Fc и растворимого gp130 (см. Becker et al. 2004, Immunity, 21: 491-501; Doganci et al., 2005, J. Clin. Invest. 115: 313-25; Nowell et al., 2003, J. Immunol. 171: 3202-9; Atreya et al., 2000, Nat. Med. 6: 583-8). Аминокислотные последовательности и нанотела, направленные против IL-6R, и содержащие их полипептиды описаны в WO 08/020079.

Сущность изобретения

Конкретной, но не ограничительной целью настоящего изобретения является обеспечение аминокислотных последовательностей, полипептидов и терапевтических соединений и композиций, обладающих улучшенными терапевтическими и/или фармакологическими свойствами, наряду с другими полезными свойствами (такими, к примеру, как большая легкость получения и/или снижение стоимости товаров), по сравнению с аминокислотными последовательностями, антителами и нанотелами предшествующего уровня техники. Эти улучшенные и полезные свойства станут понятными из дальнейшего описания. Не налагая каких-либо ограничений, аминокислотные последовательности, полипептиды и терапевтические соединения и композиции, предусмотренные изобретением, могут обладать лучшим связыванием и/или сродством, лучшей авидностью, лучшей эффективностью и/или активностью, большей избирательностью и/или они могут быть способны частично или предпочтительно полностью блокировать взаимодействие IL-6/IL-6R и/или ингибировать сигнализирование через IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R.

В общем, целью изобретения является обеспечение фармакологически активных средств, а также содержащих их композиций, которые могут применяться при диагностике, профилактике и/или лечении одного или нескольких связанных с IL-6 заболеваний (как определено здесь); и обеспечение способов диагностики, профилактики и/или лечения таких заболеваний и/или нарушений, которые включают введение и/или применение таких средств и композиций.

Настоящее изобретение касается аминокислотных последовательностей (также именуемых "аминокислотные последовательности изобретения"), направленных против и/или способных специфически связываться (как определено здесь) с рецептором интерлейкина-6 (IL-6R) с лучшим сродством и/или авидностью и/или обладающих лучшей эффективностью и/или активностью и способных (частично или предпочтительно полностью) блокировать взаимодействие IL-6/IL-6R и/или ингибировать проведение сигнала через IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R. Более конкретно, настоящим изобретением предусмотрены аминокислотные последовательности, которые содержат один или несколько участков аминокислотных остатков, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

и/или

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса;

и/или

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Для связывания со своим эпитопом на IL-6R аминокислотная последовательность обычно должна содержать в пределах своей аминокислотной последовательности один или несколько аминокислотных остатков либо один или несколько участков аминокислотных остатков (определенных в нем далее; при этом каждый "участок" содержит один или несколько аминокислотных остатков, расположенных рядом друг с другом или в близком соседстве друг с другом, т.е. в первичной или третичной структуре аминокислотной последовательности), через которые аминокислотная последовательность изобретения может связываться с эпитопом на IL-6R. Эти аминокислотные остатки или участки аминокислотных остатков тем самым образуют "сайт" для связывания с эпитопом на IL-6R (который также именуется здесь как "антигенсвязывающий сайт", как определено далее).

Настоящим изобретением предусмотрен целый ряд участков аминокислотных остатков (определенных в нем), которые особенно подходят для связывания с определенньм эпитопом на IL-6R. Эти участки аминокислотных остатков могут находиться в и/или могут быть включены в аминокислотную последовательность изобретения, в частности таким образом, что они образуют (входят в состав) антигенсвязывающий сайт аминокислотной последовательности изобретения. Полученные при этом аминокислотные последовательности связываются с определенным эпитопом на IL-6R, который лежит в, образует часть или совпадает с (т.е. в первичной или третичной структуре) или находится в близком соседстве с (т.е. в первичной или третичной структуре) сайтом связывания IL-6 на IL-6R (к примеру, конкурентно с IL-6); и при этом полученные аминокислотные последовательности способны частично или предпочтительно полностью блокировать взаимодействие IL-6/IL-6R и/или ингибировать прохождение сигнала через IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R. В этом плане аминокислотные последовательности и полипептиды изобретения предпочтительно таковы, что они могут конкурировать с IL-6 за связывание с рецептором IL-6. Аминокислотные последовательности и полипептиды изобретения предпочтительно таковы, что они могут конкурировать за связывание с рецептором IL-6 с коммерчески доступным перестроенным химерным моноклональным антителом человека-мыши против IL-6R Tocilizumab (MRA) (Chugai/Roche) или его антиген-связывающим фрагментом (к примеру, см. WO 92/19759 и соответствующий Европейский патент ЕР 0628639, а также Shinkura et al., 1998, Anticancer Research 18, 1217-1222), например, в методе, описанном в Примере 11; и/или таковы, что они могут связываться с тем же самым эпитопом или сайтом связывания на IL-6R, что и Tocilizumab, либо с эпитопом, находящимся рядом с данным сайтом связывания и/или перекрывающимся с данным сайтом связывания.

Также аминокислотные последовательности изобретения предпочтительно таковы, что они могут конкурировать за связывание с рецептором IL-6 с контрольным IgG, приведенным в SEQ ID NO's:1 и 2, и/или с контрольным Fab, приведенным в SEQ ID NO's:3 и 4 (см. Пример 1); и/или таковы, что они могут связываться с тем же эпитопом или сайтом связывания на IL-6R, что и контрольный IgG или контрольный Fab, либо с эпитопом, расположенным рядом с данным сайтом связывания и/или перекрывающимся с данным сайтом связывания. Насчет получения и последовательности контрольного IgG и контрольного Fab следует обратиться к нижеприведенному Примеру 1, а также к SEQ ID NO's:1-4.

Следует отметить, что изобретение в самом широком смысле не ограничивается специфической структурной ролью или функцией, которые эти участки аминокислотных остатков могут иметь в аминокислотной последовательности изобретения, если только эти участки аминокислотных остатков позволяют аминокислотной последовательности изобретения связываться со специфическим эпитопом на IL-6R с определенным сродством и/или силой (как определено далее). Таким образом, в целом изобретение в самом широком смысле включает любые аминокислотные последовательности, которые способны связываться со специфическим эпитопом на IL-6R и которые содержат один или несколько участков аминокислотных остатков, описанных в нем (в частности, и подходящие комбинации из двух или нескольких участков аминокислотных остатков), которые соответствующим образом соединяются друг с другом через одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей таким образом, что вся аминокислотная последовательность образует домен связывания и/или единицу связывания, способную связываться со специфическим эпитопом на IL-6R. Однако следует также отметить, что присутствие только одного из таких участков аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности изобретения само по себе уже может быть достаточным для получения аминокислотной последовательности изобретения, способной связываться со специфическим эпитопом на IL-6R (к примеру, опять же можно обратиться к так называемым "expedite-фрагментам", описанным в WO 03/050531).

Аминокислотные последовательности, содержащие один или несколько из этих специфических участков аминокислотных остатков, проявляют улучшенные свойства, такие, к примеру, как лучшее связывание и/или сродство, лучшую авидность, лучшую эффективность и силу и/или большую избирательность вдобавок к их способности частично или полностью блокировать взаимодействие IL-6/IL-6R и/или ингибировать прохождение сигнала через IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R.

Более конкретно, аминокислотные последовательности изобретения, содержащие один или несколько из этих специфических участков аминокислотных остатков, могут связываться с IL-6R со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения Ко (действительного или кажущегося), значения Кд (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или koff или же в виде значения IC50, как описано далее), предпочтительно таким, что они:

- связываются с hIL-6 с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с hIL-6 с константой скорости kon от 104 М-1s-1 до 107 M-1s-1, предпочтительно от 105 М-1s-1 до 107 М-1s-1, более предпочтительно около 106 M-1s-1 или больше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости kon от 104 M-1s-1 до 107 М-1s-1, предпочтительно от 105 M-1s-1 до 107 M-1s-1, более предпочтительно около 106 M-1s-1 или больше;

и/или таким, что они:

- связываются с hIL-6 с константой скорости koff от 10-3 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости koff от 10-3 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше.

Некоторые предпочтительные значения IC50 для связывания аминокислотных последовательностей изобретения с IL-6R станут ясными из дальнейшего описания и приведенных в нем примеров.

Например, при определении методом TF-1, описанным Kitamura et al. (1989, J. Cell PhysioL, 140: 323), аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50 (при 100 ME IL-6/мл) между 10 нМ и 50 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 50 пМ, более предпочтительно между 1 нМ и 50 пМ или меньше, как-то около 750 или 500 пМ или меньше. При определении этим методом TF-1 аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50 (при 5000 ME IL-6/мл) между 50 нМ и 1 нМ, предпочтительно между 25 нМ и 1 нМ, более предпочтительно между 10 нМ и 1 нМ или меньше, как-то около 8 нМ или меньше. При определении этим методом TF-1 аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4 (см. Пример 1). При определении этим методом TF-1 аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для Tocilizumab (MRA).

При определении методом активности в плазме при значениях ЕСзо для IL-6 (напр., в присутствии 27,29 нг IL-6/мл, как описано в Примере 45) аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50 между 500 пМ и 50 пМ, предпочтительно между 250 пМ и 50 пМ, более предпочтительно между 200 пМ и 50 пМ или меньше, как-то 150 пМ или меньше. При определении методом активности в плазме при значениях ЕС95 для IL-6 (напр., в присутствии 885 нг IL-6/мл, как описано в Примере 45) аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50 между 1000 пМ и 100 пМ, предпочтительно между 750 пМ и ЮОпМ, более предпочтительно между 500 пМ и 100 пМ или меньше, как-то 400 пМ или меньше. При определении этим методом активности в плазме аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4 (см. Пример 1). При определении этим методом активности в плазме аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для Tocilizumab (MRA).

При определении методом связывания с мембранным IL-6R на клетках СНО аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50 между 10 нМ и 100 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 100 пМ, более предпочтительно между 2 нМ и 10 пМ или меньше, как-то 2 нМ или меньше.

В предпочтительном аспекте аминокислотные последовательности изобретения могут содержать два или больше участков аминокислотных остатков, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и/или

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и/или

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

с тем, что (i) когда первый участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно а) или b), то второй участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно с), d), е) или f); (И) когда первый участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно с) или d), то второй участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно а), b), е) или f); либо (iii) когда первый участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно е) или f), то второй участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно а), b), с) или d);

Еще более предпочтительно аминокислотные последовательности изобретения содержат три или больше участков аминокислотных остатков, при этом первый участок аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

второй участок аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из:

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса; и

третий участок аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из:

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

Следует отметить, что изобретение не ограничивается ни происхождением аминокислотной последовательности изобретения (или нуклеотидной последовательности изобретения, используемой для ее экспрессии), ни тем, как (была) создана или получена аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность изобретения. Таким образом, аминокислотные последовательности изобретения могут представлять собой природные аминокислотные последовательности (из любого подходящего вида) либо синтетические или полусинтетические аминокислотные последовательности.

В одном специфическом, но не ограничительном аспекте аминокислотная последовательность изобретения может представлять собой такую аминокислотную последовательность, которая содержит иммуноглобулиновую складку, или такую аминокислотную последовательность, которая при определенных условиях (как-то физиологических условиях) способна образовывать иммуноглобулиновую складку (напр., путем укладки). Можно обратиться, среди прочего, к обзору Halaby et al. (1999, J. Protein Eng. 12: 563-71). Предпочтительно при правильной укладке с образованием иммуноглобулиновой складки участки аминокислотных остатков могут надлежащим образом сформировать антиген-связывающий сайт для связывания специфического эпитопа на IL-6R или же более предпочтительно способны связываться со своим эпитопом на IL-6R со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения Ко (действительного или кажущегося), значения KA (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено в настоящем изобретении.

В другом специфическом, но не ограничительном аспекте аминокислотные последовательности изобретения представляют собой имммуноглобулиновые последовательности. В частности, но без ограничения, аминокислотные последовательности изобретения могут представлять собой аминокислотные последовательности, которые в основном состоят из 4 каркасных участков (от FR1 до FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность участков (от CDR1 до CDR3, соответственно); или любые подходящие фрагменты таких аминокислотных последовательностей, которые все еще связывают специфический эпитоп на IL-6R.

В такой аминокислотной последовательности изобретения каркасные последовательности могут представлять собой любые каркасные последовательности, а примеры подходящих каркасных последовательностей должны быть известны специалистам, к примеру, из стандартных справочников и дальнейшего изложения и приведенных в нем работ предшествующего уровня техники.

Каркасные последовательности предпочтительно представляют собой каркасные последовательности (подходящие их комбинации) иммуноглобулинов или каркасные последовательности, полученные из каркасных последовательностей иммуноглобулинов (к примеру, путем оптимизации последовательности типа гуманизации или камелизации). Например, каркасные последовательности могут представлять собой каркасные последовательности, происходящие из вариабельного домена легкой цепи (напр., последовательности VL) и/или из вариабельного домена тяжелой цепи (напр., последовательности VH). В том случае, когда аминокислотная последовательность изобретения является последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи, она может представлять собой последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, происходящую из обычного четырехцепочечного антитела (типа последовательности VH, происходящей из антител человека), или так называемую последовательность vHH (как определено далее), происходящую из так называемых "антител из тяжелой цепи" (как определено далее). В одном особенно предпочтительном аспекте каркасные последовательности представляют собой либо каркасные последовательности, которые были получены из последовательности vhh (в которой данные каркасные последовательности необязательно могли быть частично или полностью гуманизированы), либо обычные последовательности VH, которые были подвергнуты камелизации (как определено далее).

За общим описанием антител из тяжелой цепи и их вариабельных доменов следует обратиться, среди прочего, к приведенным здесь работам предшествующего уровня техники, а также к работам предшествующего уровня техники, приведенным на стр. 59 WO 08/020079, и к библиографии, приведенной на стр. 41-43 Международной заявки WO 06/040153, причем работы и ссылки предшествующего уровня техники включены в настоящее изобретение путем ссылки.

Аминокислотная последовательность изобретения, в частности, может представлять собой доменное антитела (или аминокислотную последовательность, подходящую для использования в качестве доменного антитела), однодоменные антитела (или аминокислотную последовательность, подходящую для использования в качестве однодоменного антитела), "dAb" (или аминокислотную последовательность, подходящую для использования в качестве "dAb") или нанотело (как определено здесь, в том числе, но не ограничиваясь этим последовательность VHH); Другие одиночные вариабельные домены или любые подходящие фрагменты любых из них.

В частности, аминокислотная последовательность изобретения может представлять собой нанотело (Nanobody®) (как определено здесь) или любой подходящий его фрагмент. [Примечание: Nanobody® (напотело), Nanobodies® (напотела) и Nanoclone® (наноклон) -это зарегистрированные торговые марки Ablynx N.V.] Такие нанотела, направленные против IL-6R, также будут именоваться здесь как "нанотела изобретения".

В общем, нанотело может быть определено как аминокислотная последовательность (общей) структуры:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,

где FR1-FR4 означают каркасные участки от 1 до 4, соответственно, а CDR1-CDR3 означают участки комплементарности от 1 до 3, соответственно, причем один или несколько остатков Hallmark определены в WO 08/020079 (таблицы от А-3 до А-8).

В общем, нанотела (в частности последовательности VHH и частично гуманизированные нанотела), в частности, могут характеризоваться присутствием одного или нескольких "остатков Hallmark' в одной или нескольких каркасных последовательностях (напр., как это описано в WO 08/020079, от с.61, строка 24, до с.98, строка 3).

В этом отношении аминокислотные последовательности изобретения могут в основном состоять из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно), и 3 участков, определяющих комплементарность (CDR1-CDR3, соответственно), причем:

- CDR1 выбран из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и/или

- CDR2 выбран из группы, состоящей из:

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и/или

- CDR3 выбран из группы, состоящей из:

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Эти предпочтительные участки комплементарности (CDR1-CDR3, соответственно) также обозначаются как "CDR(s) изобретения".

Предпочтительно, аминокислотные последовательности изобретения в основном состоят из 4 каркасных участков (FR1-FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность участков (участки (CDR1-CDR3, соответственно), причем:

- CDR1 выбран из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и

- CDR2 выбран из группы, состоящей из:

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и

- CDR3 выбран из группы, состоящей из:

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

Такие нанотела могут быть получены любым подходящим способом и из любого подходящего источника и могут представлять собой, к примеру, природные последовательности VHH (то есть из любого подходящего вида Camelid) либо синтетические или полусинтетические аминокислотные последовательности.

В одном специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80 либо участок аминокислотных остатков, имеющий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:80, при условии, что аминокислотная последовательность или нанотело, содержащее такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью или нанотелом, содержащим данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

В другом специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO's:84, 89 или 91, либо участок аминокислотных остатков, имеющий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80, 89 или 91, при условии, что аминокислотная последовательность или нанотело, содержащее такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью или нанотелом, содержащим данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:84 либо участок аминокислотных остатков, имеющий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:84, при условии, что аминокислотная последовательность или нанотело, содержащее такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью или нанотелом, содержащим данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO's:93-94, либо участок аминокислотных остатков, имеющий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-94, при условии, что аминокислотная последовательность или нанотело, содержащее такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью или нанотелом, содержащим данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:93 либо участок аминокислотных остатков, имеющий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:93, при условии, что аминокислотная последовательность или нанотело, содержащее такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью или нанотелом, содержащим данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80 и SEQ ID NO:84.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80 и SEQ ID NO:93.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:84 и SEQ ID NO:93.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:84 и SEQ ID NO:93.

Другие предпочтительные комбинации последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 также представлены в табл.А-1.

Предпочтительные аминокислотные последовательности изобретения могут быть выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO's:60-69; последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или во всех участках CDR от одной из SEQ ID NO's:60-69, при условии, что аминокислотная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием в одном, двух или во всех участках CDR связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:60-69, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:60-69, при условии, что аминокислотная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием от одной из SEQ ID NO's:60-69 связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:60-69, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Такие аминокислотные последовательности изобретения предпочтительно должны быть способны специфически связываться со специфическим эпитопом на IL-6R, и еще более предпочтительно способны связываться со специфическим эпитопом на IL-6R со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения KA (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено в настоящем изобретении. Такие аминокислотные последовательности изобретения предпочтительно также должны обладать клеточной активностью и активностью в плазме, как определено в настоящем изобретении.

Аминокислотные последовательности и нанотела, предусмотренные изобретением, предпочтительно находятся в существенно выделенном виде (как определено здесь) либо составляют часть белка или полипептида изобретения (которые также именуются как "полипептиды изобретения" или "белки изобретения"), которые могут содержать или в основном состоять из одной или нескольких аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения и необязательно дополнительно содержать одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей или нанотел (все они необязательно соединены через один или несколько подходящих линкеров).

Соответственно, в другом аспекте изобретение касается соединений или конструкций, в частности белков или полипептидов (которые также именуются как "соединения изобретения" или "полипептиды изобретения", соответственно), которые содержат или в основном состоят из одной или нескольких аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения (либо их подходящих фрагментов) и необязательно также содержат одну или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания. Как станет ясно из дальнейшего изложения, такие дополнительные группы, остатки, молекулы, единицы связывания или аминокислотные последовательности также могут обеспечивать дополнительную функциональность аминокислотной последовательности изобретения (и/или соединения, конструкции или полипептида, в которых они присутствуют) или же могут модифицировать свойства аминокислотной последовательности или нанотела изобретения.

Например, такие дополнительные группы, остатки, молекулы или единицы связывания могут представлять собой одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей с тем, что соединение, конструкция или полипептид является (слитым) белком или (слитым) полипептидом. В предпочтительном, но не ограничительном аспекте такие одна или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания являются последовательностями иммуноглобулинов. Еще более предпочтительно эти одна или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания выбираются из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, подходящих для использования в качестве доменных антител, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, подходящих для использования в качестве однодоменных антител, "dAb", аминокислотных последовательностей, подходящих для использования в качестве dAb, или нанотел.

С другой стороны, такие группы, остатки, молекулы или единицы связывания могут представлять собой, к примеру, химические группы, остатки, молекулы, которые сами по себе могут и не быть биологически и/или фармакологически активными. К примеру, и без ограничения, такие группы могут быть связаны с одной или несколькими аминокислотными последовательностями или нанотелами изобретения таким образом, чтобы обеспечить "производное" аминокислотной последовательности или полипептида изобретения, как описано далее.

В рамки настоящего изобретения также входят соединения, конструкции или полипептиды, содержащие или состоящие в основном из одного или нескольких производных, как описано здесь, и необязательно также содержащие одну или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывании, необязательно соединенных через один или несколько линкеров. Предпочтительно данные одна или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания представляют собой аминокислотные последовательности.

В соединениях, конструкциях или полипептидах, описанных выше, одна или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения и одна или несколько групп, остатков, молекул или единиц связывания могут непосредственно соединяться друг с другом и/или через один или несколько подходящих линкеров или спейсеров. Например, когда одна или несколько групп, остатков, молекул или единиц связывания являются аминокислотными последовательностям, линкеры также могут быть аминокислотными последовательностям, так что получившееся соединение, конструкция или полипептид является слитым белком или слитым полипептидом.

Процесс конструирования/отбора и/или получения соединения или полипептида изобретения, исходя из аминокислотной последовательности или нанотела изобретения, также именуется здесь "форматированием" данной аминокислотной последовательности или нанотела изобретения; а аминокислотная последовательность или нанотело изобретения, которые составляют часть соединения или полипептида изобретения, считаются '^форматированными" или входящими "в формат" данного соединения или полипептида изобретения. Примеры способов, которыми аминокислотная последовательность или нанотело изобретения могут быть сформатированы, и примеры таких форматов станут ясными специалистам из дальнейшего изложения; причем такие сформатированные аминокислотные последовательности или нанотела составляют дальнейший аспект изобретения.

К примеру, и без ограничения, одна или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения могут использоваться в качестве единиц связывания в таком белке или полипептиде, которые могут необязательно содержать одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, служащих в качестве единиц связывания (т.е. против другого эпитопа на IL-6R и/или против одного или нескольких других антигенов, белков или мишеней, отличных от IL-6R) с тем, чтобы получить моновалентный, мультивалентный, мультипаратопический или мультиспецифичный полипептид изобретения, соответственно, которые все описаны здесь. Таким образом, настоящее изобретение также касается соединений, конструкций или полипептидов, представляющих собой моновалентные конструкции, содержащие или состоящие в основном из аминокислотной последовательности или нанотела изобретения. Настоящее изобретение, таким образом, также касается соединений, конструкций или полипептидов, представляющих собой мультивалентные конструкции, такие, напр., как двухвалентные или трехвалентные конструкции. Настоящее изобретение также касается соединений, конструкций или полипептидов, представляющих собой мультиспецифичные конструкции или полипептиды, такие, напр., как биспецифичные или триспецифичные конструкции. Настоящее изобретение также касается соединений, конструкций или полипептидов, представляющих собой мультипаратопические конструкции, такие, напр., как бипаратопические или трипаратопические конструкции.

В одном специфическом аспекте изобретения соединения или полипептиды изобретения могут иметь большее время полужизни по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью или нанотелом изобретения. Некоторые предпочтительные, но не ограничительном примеры таких соединений и полипептидов станут ясными специалистам из дальнейшего изложения, и они, к примеру, включают аминокислотные последовательности, нанотела или полипептиды изобретения, которые были химически модифицированы для увеличения их времени полужизни (например, посредством ПЭГилирования); аминокислотные последовательности или напотела изобретения, содержащие по меньшей мере один дополнительный сайт связывания с белком сыворотки (типа сывороточного альбумина); или полипептиды изобретения, содержащие по меньшей мере одну аминокислотную последовательность или нанотело изобретения, соединенные по меньшей мере с одной молекулой (в частности, с по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью), увеличивающей время полужизни аминокислотной последовательности или нанотела изобретения. Примеры полипептидов, аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения, содержащих такие повышающие время полужизни молекулы, станут ясными специалистам из дальнейшего изложения; к примеру, они включают, без ограничения, полипептиды, в которых одна или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения соответствующим образом соединяются с одним или несколькими сывороточными белками или их фрагментами (типа сывороточного альбумина (человека) или его подходящих фрагментов) либо с одной или несколькими единицами связывания (такими, к примеру, как доменные антитела, аминокислотные последовательности, подходящие для использования в качестве доменных антител, однодоменные антитела, аминокислотные последовательности, подходящие для использования в качестве однодоменных антител, "dAb", аминокислотные последовательности, подходящие для использования в качестве dAb, или нанотела), способными связываться с сывороточными белками, такими как сывороточный альбумин (типа сывороточного альбумина человека), сывороточными иммуноглобулинами типа IgG или трансферрином; сошлемся на дальнейшее описание и приведенные в нем ссылки); полипептиды, у которых аминокислотная последовательность или нанотело изобретения соединяется с Fc-фрагментом (типа Fc человека) либо его подходящей частью или фрагментом; или полипептиды, у которых одна или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения подходящим образом соединяются с одним или несколькими небольшими белками или пептидами, способными связываться с белками сыворотки (в том числе белки и пептиды, описанные в WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489).

В общем, соединения или полипептиды изобретения с увеличенным временем полужизни предпочтительно имеют время полужизни, которое по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, как-то по меньшей мере в 5 раз, к примеру, по меньшей мере в 10 раз или больше чем в 20 раз больше, чем время полужизни соответствующей аминокислотной последовательности или нанотела изобретения самих по себе.

В предпочтительном, но не ограничительном аспекте такие соединения или полипептиды изобретения имеют время полужизни в сыворотке, которое увеличено более чем на 1 час, предпочтительно более чем на 2 часа, более предпочтительно более чем на б часов, как-то более чем на 12 часов или даже более чем на 24, 48 или 72 часа по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью или нанотелом изобретения самими по себе.

В другом предпочтительном, но не ограничительном аспекте такие соединения или полипептиды изобретения проявляют время полужизни в сыворотке человека по меньшей мере в 12 часов, предпочтительно по меньшей мере в 24 часа, более предпочтительно по меньшей мере в 48 часов, еще более предпочтительно по меньшей мере в 72 часа или больше. Например, соединения или полипептиды изобретения могут иметь время полужизни по меньшей мере в 5 дней (как-то от 5 до 10 дней), предпочтительно по меньшей мере 9 дней (как-то от 9 до 14 дней), более предпочтительно по меньшей мере 10 дней (как-то от 10 до 15 дней) или по меньшей мере 11 дней (как-то от 11 до 16 дней), более предпочтительно по меньшей мере 12 дней (как-то от 12 до 18 дней или больше) или более 14 дней (как-то от 14 до 19 дней).

Такие белки, полипептиды, соединения или конструкции также могут находиться в существенно выделенном виде (как определено здесь).

Некоторые предпочтительные соединения, конструкции или полипептиды изобретения включают следующие полипептидные последовательности:

a) SEQ ID NO's:70-72;

b) полипептидные последовательности, имеющие не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех участках CDR изобретения от одной из SEQ ID NO's:70-72, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием в одном, двух или всех участках CDR изобретения связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:70-72, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

c) полипептидные последовательности, имеющие не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:70-72, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием от одной из SEQ ID NO's:70-72 связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:70-72, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

Полипептиды с этими последовательностями проявляют преимущественные свойства для применения в качестве фармакологически активных средств, такие, напр., как хорошие характеристики связывания (высокое сродство и/или авидность), высокая эффективность и/или активность, наряду со способностью (частично или полностью) блокировать взаимодействие IL-6/IL-6R и/или ингибировать проведение сигнала через IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R.

Более предпочтительно эти полипептиды и соединения изобретения могут связываться с IL-6R со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения KA (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или koff или же в виде значения IC50, как описано далее), предпочтительно таким, что они:

- связываются с hIL-6R с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с hIL-6R с константой скорости kon от 104 M-1s-1 до 107 M-1s-1, предпочтительно от 105 M-1s-1 до 107 M-1s-1, более предпочтительно около 106 М-1s-1 или больше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости kon от 104 M-1s-1 до 107 M-1s-1, предпочтительно от 105 M-1s-1 до 107 M-1s-1, более предпочтительно около 106 M-1s-1 или больше;

и/или таким, что они:

- связываются с hIL-6R с константой скорости koff от 10-3 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости koff от 10-3 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше.

Некоторые предпочтительные значения IC50 для связывания полипептидов и соединений изобретения с IL-6R станут ясными из дальнейшего описания и приведенных в нем примеров.

Например, при определении методом TF-1, описанным Kitamura et al. (1989, J. Cell PhysioL, 140: 323), полипептиды и соединения изобретения могут иметь значения IC50 (при 100 ME IL-6/мл) между 10 нМ и 50 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 50 пМ, более предпочтительно между 1 нМ и 50 пМ или меньше, как-то около 750 или 500 пМ или меньше. При определении этим методом TF-1 полипептиды и соединения изобретения могут иметь значения IC50 (при 5000 ME IL-6/мл) между 50 нМ и 1 нМ, предпочтительно между 25 нМ и 1 нМ, более предпочтительно между 10 нМ и 1 нМ или меньше, как-то около 8 нМ или меньше. При определении этим методом TF-1 полипептиды и соединения изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4 (см. Пример 1). При определении этим методом TF-1 аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50» полученным для Tocilizwnab (MRA).

При определении методом активности в плазме при значениях ЕС50 для IL-6 (напр., в присутствии 27,29 нг IL-6/мл, как описано в Примере 45) полипептиды и соединения изобретения могут иметь значения IC50 между 500 пМ и 50 пМ, предпочтительно между 250 пМ и 50 пМ, более предпочтительно между 200 пМ и 50 пМ или меньше, как-то 150 пМ или меньше. При определении методом активности в плазме при значениях ЕС95 для IL-6 (напр., в присутствии 885 нг IL-6/мл, как описано в Примере 45) полипептиды и соединения изобретения могут иметь значения IC50 между 1000 пМ и 100 пМ, предпочтительно между 750 пМ и 100 пМ, более предпочтительно между 500 пМ и 100 пМ или меньше, как-то 400 пМ или меньше. При определении этим методом активности в плазме полипептиды и соединения изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4 (см. Пример 1). При определении этим методом активности в плазме полипептиды и соединения изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для Tocilizumab (MRA).

При определении методом связывания с мембранным IL-6R на клетках СНО полипептиды и соединения изобретения могут иметь значения IC50 между 10 нМ и 100 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 100 пМ, более предпочтительно между 2 нМ и 10 пМ или меньше, как-то 2 нМ или меньше.

В одном специфическом аспекте полипептиды, соединения или конструкции изобретения в основном состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:70.

В другом специфическом аспекте полипептиды, соединения или конструкции изобретения в основном состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:71.

Соединения или полипептиды изобретения в общем могут быть получены способом, который включает по крайней мере стадию присоединения соответствующим образом к одной или нескольким аминокислотным последовательностям, нанотелам или моновалентным конструкциям изобретения одной или нескольких других групп, остатков, молекул или единиц связывания, необязательно через один или несколько подходящих линкеров, получая при этом соединение или полипептид изобретения. Полипептиды изобретения также могут быть получены способом, который обычно включает по меньшей мере стадии получения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид изобретения, экспрессирования данной нуклеиновой кислоты соответствующим образом и выделения экспрессированного полипептида изобретения. Такие способы могут осуществляться известным самим по себе образом, что должно быть ясно специалистам, к примеру, на основе способов и методов, описанных далее.

Соответственно, настоящее изобретение также касается применения аминокислотных последовательностей, нанотел или моновалентных конструкций изобретения при получении мультивалентных соединений, конструкций или полипептидов. Способ получения мультивалентных соединений, конструкций или полипептидов включает присоединение к аминокислотной последовательности, нанотелу или моновалентной конструкции изобретения по меньшей мере одной другой группы, остатка, молекулы или единицы связывания, необязательно через один или несколько линкеров.

В общем, когда аминокислотная последовательность или нанотело изобретения (либо содержащее их соединение, конструкция или полипептид) предназначается для введения субъекту (к примеру, для терапевтических и/или диагностических целей, как описано здесь), то предпочтительно либо аминокислотная последовательность, либо нанотело не встречается естественным образом у данного субъекта; а если же они встречаются у данного субъекта естественным образом, то в существенно выделенном виде (как определено здесь).

Аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды и соединения изобретения направлены против IL-6R человека. Тем не менее, они предпочтительно должны обладать перекрестной реактивностью к IL-6R длиннохвостой макаки (cynomolgus monkey, Macaca fascicularis), что означает, что эти аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды и соединения также "направлены против" (как определено здесь) и/или способны специфически связываться с (как определено здесь) с IL-6R длиннохвостой макаки (Масаса fascicularis). Такая перекрестная реактивность может иметь преимущества с точки зрения разработки лекарственных препаратов, так как она дает возможность тестировать аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды и соединения против IL-6R человека на модели заболевания у длиннохвостой макаки.

Аминокислотная последовательность или нанотело изобретения (а также содержащие их соединения, конструкции или полипептиды) обладает перекрестной реактивностью к IL-6R человека и длиннохвостой макаки означает то, что аминокислотная последовательность или нанотело изобретения (а также содержащие их соединения, конструкции или полипептиды) связывается с IL-6R длиннохвостой макаки со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения Кд (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое будет таким же или составит по меньшей мере 70% (предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 90%, еще более предпочтительно не менее 95%) от сродства, с которым данная аминокислотная последовательность или нанотело изобретения (а также содержащие их соединения, конструкции или полипептиды) связывается с IL-6R человека. Насчет последовательности IL-6R и соответствующей последовательности кДНК длиннохвостой макаки можно также обратиться к WO 09/010539, поданной Ablynx N.V. 16 июля 2008 г., озаглавленной "Receptor for interleukin-6 (IL-6) from Масаса fascicularis"; см. SEQ ID NO:3 и фиг.1В насчет последовательности кДНК и SEQ ID NO:4 и фиг.3В насчет аминокислотной последовательности.

Также в объем настоящего изобретения входит использование частей, фрагментов, аналогов, мутантов, вариантов, аллелей и/или производных аминокислотных последовательностей или полипептидов по изобретению, и/или использование белков или полипептидов содержащих или состоящих по существу из одной или более таких частей, фрагментов, аналогов, мутантов, вариантов, аллелей и/или производных, до тех пор, пока они могут быть применены, как предусмотрено в настоящем документе. Такие части, фрагменты, аналоги, мутанты, варианты, аллели и/или производные обычно содержат (по меньшей мере часть) функционального антигенсвязывающего сайта для связывания со специфическим эпитопом на IL-6R, и более предпочтительно они способны специфически связывать специфический эпитоп на IL-6R, еще более предпочтительно они способны связывать специфический эпитоп на IL-6R со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения KA (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено в настоящем изобретении. Такие части, фрагменты, аналоги, мутанты, варианты, аллели и/или производные предпочтительно также должны обладать клеточной активностью и активностью в плазме, как определено в настоящем изобретении. Некоторые не ограничивающие примеры таких частей, фрагментов, аналогов, мутантов, вариантов, аллелей, производных белков или полипептидов станут ясными для специалиста из дальнейшего изложения. Дополнительные фрагменты или полипептиды по изобретению могут быть получены с помощь подходящего комбинирования (например, с помощью генетического слияния) одной или более (меньших) частей или фрагментов описанных здесь.

В другом аспекте изобретение также относится к нуклеиновым кислотам или последовательностям нуклеотидов, кодирующим такие аминокислотные последовательности по изобретению, нанотела по изобретению, полипептиды по изобретению (или соответствующие фрагменты). Такие нуклеиновые кислоты также именуются как "нуклеиновые кислоты изобретения" и могут находиться в виде генетической конструкции, как далее раскрыто в настоящем документе. Соответственно, настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам или последовательностям нуклеотидов находящимся в виде генетической конструкции.

Нуклеиновые кислоты изобретения могут быть природного происхождения, синтетическими или полусинтетическими, и могут, например, быть последовательностями которые выделены с помощью ПЦР с матрицы из подходящего природного источника (например, ДНК или РНК выделенной из клетки), нуклеотидными последовательностями, выделенными из библиотеки (в частности из экспрессионной библиотеки), нуклеотидными последовательностями, полученными с помощью введения мутаций в природную последовательность (с помощью любой известной подходящей технологии, такой как ПЦР с ошибками), нуклеотидными последовательностями которые были получены с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами, или последовательностями которые были получены с помощью известных per se технологий синтеза ДНК.

В другом аспекте изобретение также относится к хозяину или клетке-хозяину которые экспрессируют (или способны эксперессировать в подходящих условиях) аминокислотную последовательность по изобретению и/или нанотело по изобретению и/или полипептид по изобретению; и/или которые содержат нуклеиновую кислоту по изобретению. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры, таких хозяев или клеток-хозяев станут ясными из дальнейшего описания.

Далее изобретение также относится к продукту или композиции содержащей или включающей, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность по изобретению (или ее фрагмент), по меньшей мере одно нанотело по изобретению, по меньшей мере один полипептид по изобретению, по меньшей мере одно соединение или конструкцию по изобретению, по меньшей мере одну моновалентную конструкцию по изобретению и/или по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту по изобретению и, необязательно, один или более дополнительных компонентов подобных композиций известных per se, т.е. подбираемых в зависимости от назначения данной композиции. Такой продукт или композиция может быть фармацевтической композицией (как описано здесь), ветеринарной композицией, продуктом или композицией для диагностического использования (также описанными здесь). Некоторые предпочтительные варианты таких продуктов или композиций станут ясны из дальнейшего описания.

Настоящее изобретение также относится к способам получения аминокислотных последовательностей, нанотел, полипептидов, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций описанных здесь. Способ получения аминокислотных последовательностей, нанотел, полипептидов и/или моновалентных конструкций изобретения может включать следующие стадии:

a) экспрессирование в подходящих клетках-хозяевах или организме-хозяине либо в другой подходящей системе экспрессии нуклеиновой кислоты по изобретению или генетической конструкции по изобретению, после чего необязательно следует:

b) выделение и/или очистка полученной при этом аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида или моновалентной конструкции по изобретению.

Способ получения аминокислотных последовательностей, нанотел, полипептидов или моновалентных конструкций изобретения может включать следующие стадии:

- культивирование и/или содержание хозяина или клетки-хозяина по изобретению в таких условиях, что данный хозяин или клетка-хозяин по изобретению экспрессирует и/или продуцирует по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, нанотело, полипептид или моновалентную конструкцию по изобретению; после чего необязательно следует:

- выделение и очистка полученной при этом аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида или моновалентной конструкции по изобретению.

Далее изобретение относится к применению и использованию аминокислотных последовательностей, полипептидов, соединений, конструкций, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций описанных здесь, а также к методам предотвращения и/или лечения расстройств или заболеваний связанных с IL-6R. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры применения или использования станут ясными из дальнейшего описания.

Аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, соединения, конструкции и композиции настоящего изобретения, в общем, могут быть использованы для модулирования, в частности ингибирования, и/или предотвращения связывания IL-6R с IL-6, и последующего связывания комплекса IL-6/IL-6R с gp130, что таким образом модулирует, и в частности ингибирует и/или предотвращает сигналирование, вызванное IL-6, IL-6R, комплексом IL-6/IL-6R и/или gp130, что модулирует биологические пути в которые вовлечены IL-6, IL-6R, комплекс IL-6/IL-6R и/или gp130, и/или модулирует биологические механизмы, реакции и/или эффекты сигналирования в этих путях.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, конструкции или соединения которые являются и/или которые могут быть использованы как антагонисты IL-6R, антагонисты сигналирования опосредованного IL-6R и/или механизмов биологических путей, реакций и/или эффектов в которые вовлечен IL-6R и/или сигналирование опосредованное IL-6R.

В этом отношении аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, соединения конструкции или композиции настоящего изобретения таковы, что они (а) специфически связываются (как определено в настоящем документе) с рецептором IL-6; и (Ь) способны к понижающему регулированию рецептора IL-6 и/или к ингибированию, снижению или понижающему регулированию сигналирования рецептора IL-6 и/или путей, механизма(ов), или сигналирования в которые вовлечены IL-6 или IL-6R. Как это ясно специалисту, такая аминокислотная последовательность, напотело, полипептид, конструкция или соединение могут, в общем, быть использованы в качестве антагонистов IL-6, рецептора IL-6 и/или биологических путей, механизмов, и/или эффектов в которые вовлечено сигналирование, опосредованное IL-6, IL-6R и/или комплексом IL-6/IL-6R. Любое такое снижение или понижающая регуляция (которая может представлять собой снижение релевантного параметра на по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере на 10%, или более чем на 10%, или вплоть до 50% или 100% от значения этого же параметра при условиях, когда аминокислотная последовательность, нанотело, полипептид, конструкции или соединение не связано с рецептором IL-6), может быть измерено любым подходящим методом известным per se, например это может быть один из методов описанных ниже и/или в экспериментальной части и/или упомянутых здесь.

Более конкретно в дополнении к вышеуказанным свойствам (а) и (b), такая антагонистическая аминокислотная последовательность, нанотело, полипептид, соединение или конструкция связываются с IL-6 таким образом, что (с) блокируется, ингибируется или уменьшается связывание IL-6 с IL-6R, по сравнению с тем, как связывается IL-6 со своим рецептором в отсутствии аминокислотной последовательности, нанотела или полипептида по изобретению.

Без ограничения подобные антагонистические аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, конструкции или соединения могут связываться со специфическим эпитопом на IL-6R, находящимся поблизости от сайта связывания IL-6 с IL-6R.

Также в дополнение к вышеуказанным (а) (b) и (с) подобные антагонистические аминокислотные последовательности или полипептиды изобретения могут связываться с IL-6R (например, таким, который присутствует в комплексе IL-6/IL-6R) так, что это (d) ингибирует или предотвращает (напр., полностью или частично нарушает) образование комплекса IL-6/IL-6R, таким образом, что уменьшается связывание комплекса с, т.е. его сродство к, gp130 (или наоборот, уменьшается связывание gp130 с комплексом, напр., его сродство к нему), так, что модулируется (напр., уменьшается) сигналирование, индуцированное/вызванное связыванием комплекса с gp130, по сравнению с образованием комплекса и его связыванием с gp130 в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или конструкции изобретения.

Аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, конструкции, соединения или композиции изобретения также предпочтительно (но без ограничения) могут снизить (т.е., по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 75% или более) или полностью ингибировать индукцию С-реактивного белка (CRP) у млекопитающих (например, у человека или у подходящей животной модели воспаления, такой как длиннохвостые макаки) когда его вводят данному млекопитающему в соответствующем терапевтическом количестве по сравнению с млекопитающим, которому не вводили аминокислотную последовательность, нанотело, полипептид, соединение, конструкцию или композицию изобретения.

Аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, конструкции, соединения или композиции изобретения также предпочтительно (но без ограничения) такие, что они снижают (т.е. по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 75% или более) или полностью ингибируют индукцию увеличения числа тромбоцитов у млекопитающих (например у человека или у подходящей животной модели воспаления, такой как длиннохвостые макаки) когда его вводят данному млекопитающему в соответствующем терапевтическом количестве по сравнению с млекопитающим, которому не вводили аминокислотную последовательность, нанотело, полипептид, соединение, конструкцию или композицию изобретения.

Аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, соединения, конструкции или композиции изобретения также предпочтительно (но без ограничения) такие, что они снижают (т.е. по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно мо меньшей мере на 75% или более) или полностью ингибируют индукцию фибриногена у млекопитающих (например у человека или у подходящей животной модели воспаления, такой как длиннохвостые макаки) когда его вводят данному млекопитающему в соответствующем терапевтическом количестве по сравнению с млекопитающим, которому не вводили аминокислотную последовательность, нанотело, полипептид, соединение, конструкцию или композицию изобретения.

Соответственно аминокислотные последовательности, полипептиды, соединения, конструкции или композиции изобретения могут использоваться для профилактики и/или лечения заболевания и/или нарушения связанного с IL-6, с IL-6R, с комплексом IL-6/IL-6R (и необязательно с его дальнейшим комплексом с gp130), и/или с сигнальным путем (путями), и/или с биологической функцией или реакциями в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R (и необязательно с его дальнейшим комплексом с gp130), в частности для профилактики и/или лечения заболевания и/или нарушения связанного с IL-6, с IL-6R, с комплексом IL-6/IL-6R (и необязательно с его дальнейшим комплексом с gp130), и/или с сигнальным путем (путями), и/или с их биологической функцией или реакциями в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R (и необязательно с его дальнейшим комплексом с gp130), которые характеризуются избыточным или нежелательным сигналированием опосредованным IL-6R или путем (путями), в который он вовлечен. Примеры таких заболеваний и/или нарушений связанных с IL-6, с IL-6R, с комплексом IL-6/IL-6R, и/или с сигнальным путем (путями), и/или с биологической функцией и реакциями в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R, будут ясны специалисту в данной области на основе сведений из данного описания, и например, включают следующие нарушения или расстройства: сепсис (Stames et al., 1999, J. ImmunoL, 148: 1968), различные формы рака, как-то множественная миелома (ММ), почечно-клеточная карцинома (RCC), плазмоцитарная лейкемия (Klein et al., 1991), лимфома, В-лимфопролиферативные нарушения (BLPD) и рак простаты. Неограничительные примеры других заболеваний, вызванных избыточной продукцией IL-6 или сигнализированием, включают резорбцию костей (остеопороз) (Roodman et al., 1992, J. Bone Miner. Res., 7: 475-8; Jilka et al., 1992, Science, 257: 88-91), кахексию (Strassman et al., 1992, J. Clin. Invest. 89: 1681-1684), псориаз, мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, саркому Капоши, связанную со СПИДом лимфому (Emilie et al., 1994, Int. J. Immunopharmacol. 16: 391-6), воспалительные заболевания и нарушения, такие как ревматоидный артрит, системный юношеский идиопатический артрит, гипергаммаглобулинемия (Grau et al., 1990, J. Exp. Med. 172: 1505-8); болезнь Крона, язвенный колит, системная красная волчанка (SLE), рассеянный склероз, болезнь Кэстлмана, IgM-гаммопатия, миксома сердца, астма (в частности аллергическая астма) и аутоиммунный инсулинозависимый сахарный диабет (Campbell et al., 1991, J. Clin. Invest. 87: 739-742). Другие связанные с IL-6 заболевания должны быть известны специалисту в этой области. Подобные заболевания и расстройства обозначаются в настоящем описании как «заболевания и расстройства связанные с IL-6R».

Таким образом, и без ограничения, аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, конструкции, соединения или композиции изобретения могут, например, быть использованы для профилактики и/или лечения всех заболеваний и нарушений которые в настоящий момент предотвращаются или лечатся активными действующими веществами, которые модулируют сигналирование опосредованное IL-6R, например, это могут быть те заболевания, которые упомянуты выше. Также предусматривается, что аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, конструкции, соединения или композиции изобретения могу быть использованы для профилактики и/или лечения всех заболеваний и нарушений, для которых лечение с использованием подобных активных действующих веществ в настоящий момент разрабатывается, предложено к применению или будет предложено или разработано в будущем. Дополнительно предусматривается, что благодаря проявляемым ими активным свойствам, которые описаны далее, аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, конструкции, соединения или композиции изобретения могут быть использованы для профилактики и/или лечения других заболеваний или нарушений, в лечении которых используются такие активные действующие вещества, или их использование предполагается или находится в стадии разработки, и/или что аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, конструкции, соединения или композиции изобретения могут обеспечить новые способы и схемы лечения заболеваний или нарушений, описанных здесь.

Соответственно настоящие изобретения также относится к способу профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания или расстройства, развитие которого может быть предотвращено или которое лечится введением нуждающемуся в этом субъекту аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, или моновалентной конструкции изобретения, указанный метод включает введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтически активного количества по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения, (моновалентной) конструкции или композиции изобретения.

Изобретение также относится к применению аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или (моновалентной) конструкции изобретения при получении фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения, по меньшей мере, одного заболевания и нарушения связанного с IL-6, с IL-6R, с комплексом IL-6/IL-6R, и/или с сигнальными путями, и/или с биологической функцией или реакциями в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R, и/или для применения в одном или нескольких методах описанных здесь.

Изобретение также относится к аминокислотной последовательности, нанотелу, полипептиду, соединению или (моновалентной) конструкции по изобретению для применения при лечении и/или профилактики, по меньшей мере, одного из заболеваний или нарушений, связанных с IL-6, IL-6R, комплексом IL-6/IL-6R и/или сигнальными путями и/или биологическими функциями и реакциями, в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R; и/или для применения в одном или нескольких способах описанных здесь.

В частности настоящее изобретение предоставляет аминокислотные последовательности, нанотела, белки, полипептиды, соединения и/или конструкции которые подходят для профилактического, лечебного или диагностического применения у теплокровных животных, в особенности у млекопитающих, предпочтительно у человека.

Более конкретно настоящее изобретение обеспечивает такие аминокислотные последовательности, нанотела, белки, полипептиды, соединения и/или конструкции, которые могут использоваться для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов и/или диагностики одного или нескольких расстройств, связанных с IL-6 (как определено здесь) у теплокровного животного, в особенности у млекопитающего, предпочтительно у человека.

Прочие области применения и использования аминокислотных последовательностей, нанотел, полипептидов и соединений изобретения станут очевидными для специалиста из дальнейшего описания.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Анализ иммунного ответа у лам 81 и 82 методом ELISA, как описано в Примере 2.

Фиг.2. Анализ иммунного ответа у лам 81 и 82 методом FACS, как описано в Примере 2. Обозначения: L181 pre: преиммунная сыворотка из ламы 81; L181 PBL1: сыворотка, взятая через 28 дней у ламы 81; L182 pre: преиммунная сыворотка из ламы 82; L182 PBL2: сыворотка, взятая через 43 дня у ламы 82.

Фиг.3. Схема определения методом Alphascreen для идентификации нанотел против IL-6-связывающего сайта на IL-6R.

Фиг.4. Аминокислотные последовательности нанотел против IL-6R.

Фиг.5. SDS-PAGE очищенных нанотел, полученных как описано в Примере 6.

Фиг.6. Ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R отдельными нанотелами при измерении методом Alphascreen. В качестве контроля использовали MAb BR-6 и контрольный Fab-фрагмент (описанный в Примере 1).

Фиг.7. Связывание нанотел против IL-6R с клетками U266 при анализе методом FACS.

Фиг.8. Связывание нанотел против IL-6R с клетками U266 в отсутствие (наверху) и в присутствии (внизу) плазмы человека.

Фиг.9. Индивидуальные профили наблюдаемой (значки) и предсказанной на модели (сплошная линия) концентрации IL6R304 в плазме от времени у длиннохвостых обезьян после в/в введения 1 мг/кг (о), 5 мг/кг (Δ), 10 мг/кг (+), 25 мг/кг (×) и 100 мг/кг (0).

Фиг.10. Связывание нанотел с IL-6R мыши и человека. В каждой группе из 3 столбиков левый означает IL-6R человека, средний - IL-6R мыши, а правый - холостую пробу.

Фиг.11. SDS-PAGE очищенных биспецифичных нанотел.

Фиг.12. Ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R биспецифичными нанотелами при измерении методом Alphascreen.

Фиг.13. Анализ связывания двухвалентных нанотел с клетками U266 методом FACS.

Фиг.14. Анализ связывания трехвалентных нанотел с клетками U266 методом FACS.

Фиг.15. Сопоставление последовательностей IL6R03, IL6R04 и IL6R13 с 5 наиболее гомологичными гаметными последовательностями человека. Дополнительные объяснения см. в Примере 23.

Фиг.16А и В. Аминокислотные последовательности оптимизированных по последовательности вариантов IL6R03, IL6R04 и IL6R13. Дополнительные объяснения см. в Примере 23.

Фиг.17. Ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R оптимизированными по последовательности вариантами IL6R03.

Фиг.18. Ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R оптимизированными по последовательности вариантами IL6R04.

Фиг.19. Ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R оптимизированными по последовательности вариантами IL6R13.

Фиг.20. Ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R оптимизированными по последовательности вариантами IL6R13.

Фиг.21. Ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R нанотелами дикого типа и оптимизированными по последовательности нанотелами против IL-6R.

Фиг.22. Клеточная активность оптимизированных по последовательности нанотел в сравнении с нанотелами дикого типа.

Фиг.23. Активность в плазме методом ELISA оптимизированных по последовательности нанотел в плазме человека (А) и макаки (В).

Фиг.24. Активность в плазме методом ELISA оптимизированных по последовательности нанотел при значениях ЕСбо (слева) и ЕС95 (справа) для IL-6.

Фиг.25. Картирование эпитопов нанотел к IL-6, как описано в Примере 29: анализ по конкуренции на покрытой IL-6R (А-С) или покрытой IL-6 матрице.

Фиг.26. Аминокислотные последовательности созревших по аффинности вариантов IL6R65.

Фиг.27. Кривые связывания нанотела IL6R65 (именуемого исходным нанотелом) и его созревших по аффинности вариантов.

Фиг.28. Исследование IL6R65 и 5 созревших по аффинности вариантов методом определения активности в плазме человека и макаки.

Фиг.29. Ингибирование IL-6-зависимой пролиферации клеток TF-1 созревшими по аффинности нанотелами. Клетки культивировали в присутствии 2 нг/мл IL-6 человека при различных концентрациях напотел. Пролиферацию измеряли по включению 3H-тимидина.

Фиг.30. Конкуренция между IL-6 и двумя созревшими по аффинности нанотелами (В-С) в сравнении с конкуренцией между IL-6 и IL6R65 (А) при измерении на приборе Biacore.

Фиг.31. Последовательности связывающих IL-6R нанотел после 2-го цикла созревания аффинности (комбинаторные библиотеки CDR1/2+CDR3).

Фиг.32. Ингибирование IL-6-зависимой пролиферации клеток TF-1. Клетки культивировали в присутствии 2 нг/мл IL-6 человека при различных концентрациях нанотел. Пролиферацию измеряли по включению 3H-тимидина.

Фиг.33. Исследование IL6R65 и созревших по аффинности вариантов 2-го цикла методом определения активности в плазме человека и макаки. Исходное = IL6R65.

Фиг.34. Связывание IL6R65 и РМР20А11 с PBMCs человека в цельной крови.

Фиг.35. Ингибирование активности мембранного IL-6R форматированными нанотелами и контрольным IgG. Клетки TF-1 проинкубировали с серийными разведениями IL6R304 (■), IL6R305 (▲), IL6R306 (▼) или контрольного IgG (●), после чего индуцировали пролиферацию с помощью 100 ME IL-6/мл. После инкубации в течение 72 ч оценивали пролиферацию клеток по включению 3H-тимидина. Представлены средние значения ±S.E. из трех измерений.

Фиг.36. Ингибирование мембранного IL-6R форматированными нанотелами и контрольным IgG при высоком уровне IL-6. Клетки TF-1 проинкубировали с серийными разведениями 20А11 (♦), IL6R304 (■), IL6R305 (▲), IL6R306 (▼) или контрольного IgG (●), после чего индуцировали пролиферацию с помощью 5000 ME IL-6/мл. После инкубации в течение 72 ч оценивали пролиферацию клеток по включению 3H-тимидина. Представлены средние значения ±S.E. из трех измерений.

Фиг.37. Эффект IL6R304 и IL6R305 на пролиферацию клеток TF-1. Клетки TF-1 высеивали при плотности 12500 клеток на лунку и инкубировали с или без 50 нМ IL6R304 или IL6R305. Пролиферацию индуцировали с помощью 100 ME IL-6/мл либо клетки инкубировали в отсутствие факторов роста. После инкубации в течение 72 ч оценивали пролиферацию клеток по включению Н-тимидина. Каждая экспериментальная точка измерялась 30 раз. Представлены средние значения ±S.E.

Фиг.38. Активность в плазме методом ELISA в плазме человека. Подавление связывания IL-6 человека с sIL-6R в плазме контрольным IgG (●), IL6R20A11 (♦), IL6R304 (■), IL6R305 (▲), IL6R306 (▼) или посторонним NB (×). Представлены средние значения ±S.E. из двух измерений. А, В: конкуренция при 25 нг/мл IL-6 (ЕС50). C,D: конкуренция при 885 нг/мл IL-6 (ЕС95).

Фиг.39. Связывание IL6R20A11 и форматированных вариантов с клетками СНО. Экспрессирующие IL-6R клетки СНО (А) или отрицательные клетки СНО (В) инкубировали с IL6R20A11 (♦), IL6R304 (■), IL6R305 (▲), IL6R306 (▼). Связавшиеся нанотела детектировали с помощью МАЬ с1.5.3.1 и антител против мыши с РЕ.

Фиг.40. Связывание нанотел к IL-6R с PBL человека в цельной крови. Слева: лимфоциты (L, черные), моноциты (М, темно-серые) и гранулоциты (G, светло-серые) засекали по характеристикам FSC/SSC. Посредине: фоновая флуоресценция РЕ у трех прошедших через канал популяций. Справа: флуоресценция РЕ после инкубации с 1 мкМ IL6R305.

Фиг.41. Связывание нанотел к IL-6R с PBL человека. Обработанную ЭДТА кровь из 2 доноров инкубировали с IL6R20A11 (♦), IL6R304 (■), IL6R305 (▲), IL6R306 (▼). Связавшиеся нанотела детектировали с помощью MAb c1.5.3.1 и антител против мыши с РЕ. А: лимфоциты; В: моноциты; С: гранулоциты.

Фиг.42. Кривые связывания форматированных созревших по аффинности нанотел с альбумином человека и макаки.

Фиг.43. Кривые связывания форматированных созревших по аффинности нанотел с IL-6R человека и макаки.

Фиг.44. Активность в плазме методом ELISA в плазме макаки. Подавление связывания IL-6 человека с sIL-6R в плазме макаки контрольным IgG (●), IL6R20A11 (♦), IL6R304 (■), IL6R305 (▲), IL6R306 (▼) или посторонним NB (×).

Фиг.45. Перекрестная реактивность IL6R20A11 к sIL-6R из других видов. Слева:

связывание IL6R20A11 с sIL-6R человека на планшете после преинкубации с рекомбинантным sIL-6R человека (●), макаки (■) или мыши (▲). Справа: связывание IL6R20A11 с sIL-6R человека после преинкубации с плазмой человека (●), макаки (■), мыши (▲) или морской свинки (▼).

Фиг.46. Конкуренция за связывание методом ELISA. IL6R20A11 (0,05 нМ) проинкубировали при различных концентрациях IL-6R (●), LIF-R (■), CNTF-R (▲), OSM-R (▼) или IL-11R/Fc (♦). Свободные IL6R20A11 захватывали на sIL-6R и детектировали через анти-His.

Фиг.47. Схема экспериментов по анализу ФК/ФД IL6R304 и IL6R305 in vivo.

Фиг.48. Эффект контрольного IgG, IL6R304 и IL6R305 на повышение уровня CRP под действием hIL-6 у индивидуальных длиннохвостых макак. (А) Животные 27, 28 и 29 служили отрицательным контролем и получали только hIL-6. Контрольный IgG (В, черные значки), различные дозы IL6R304 (С, синие значки) и различные дозы IL6R305 (D, красные значки) вводили в/в, после чего вводили п/к hIL-6 в дозе 5 мкг/кг раз в день на протяжении 7 дней.

Фиг.49. Средний уровень CRP для всех групп, полученный при исследовании ФК/ФД IL6R304 и IL6R305 in vivo.

Фиг.50. Эффект контрольного IgG, IL6R304 и IL6R305 на повышение уровня фибриногена под действием hIL-6 у индивидуальных длиннохвостых макак. (А) Животные 27, 28 и 29 служили отрицательным контролем и получали только hIL-6. Контрольный IgG (В, черные значки), различные дозы IL6R304 (С, синие значки) и различные дозы IL6R305 (D, красные значки) вводили в/в, после чего вводили п/к hIL-6 в дозе 5 мкг/кг раз в день на протяжении 7 дней. Результаты нормализировали по базальным уровням.

Фиг.51. Средний уровень фибриногена для всех групп, полученный при исследовании ФК/ФД IL6R304 и IL6R305 in vivo.

Фиг.52. Эффект контрольного IgG, IL6R304 и IL6R305 на повышение числа тромбоцитов под действием hIL-6 у индивидуальных длиннохвостых макак. (А) Животные 27, 28 и 29 служили отрицательным контролем и получали только hIL-6. Контрольный IgG (В, черные значки), различные дозы IL6R304 (С, синие значки) и различные дозы IL6R305 (D, красные значки) вводили в/в, после чего вводили п/к hIL-6 в дозе 5 мкг/кг раз в день на протяжении 7 дней. Результаты нормализировали по базальным уровням.

Фиг.53. Среднее число тромбоцитов для всех групп, полученное при исследовании ФК/ФД IL6R304 и IL6R305 in vivo.

Фиг.54. Индивидуальные графики наблюдаемой концентрации в плазме от времени после в/в введения болюсом IL6R304 (0,4-2-10 мг/кг) у длиннохвостых макак. 11m, 12m и 13f означают три графика с левой стороны, 17m, 18f и 14m - средние графики, а 15m и 16f - графики с правой стороны.

Фиг.55. Индивидуальные графики наблюдаемой концентрации в плазме от времени после в/в введения болюсом IL6R305 (0,4-2-10 мг/кг) у длиннохвостых макак. 19m, 20f и 21f означают три графика с левой стороны, 25m, 26f и 22m - средние графики, а 23m и 24f - графики с правой стороны.

Фиг.56. Графики средней наблюдаемой концентрации в плазме от времени после в/в введения болюсом IL6R304 (0,4-2-10 мг/кг) и IL6R202 (2 мг/кг, дозу приводили к 0,4-10 мг/кг) у длиннохвостых макак.

Фиг.57. Иммунодетекция антител против IL6R304 до введения и через различное количество дней после в/в введения IL6R304. Планшеты для ELISA были покрыты IL6R304. Подписи под каждой из фигур соответствуют группам на гистограммах слева направо.

Фиг.58. Иммунодетекция антител против IL6R304 до введения и через различное количество дней после в/в введения IL6R304. Планшеты для ELISA были покрыты IL6R300. Подписи под каждой из фигур соответствуют группам на гистограммах слева направо.

Фиг.59. Иммунодетекция антител против IL6R304 до введения и через различное количество дней после в/в введения IL6R304. Планшеты для ELISA были покрыты ALB8. Подписи под каждой из фигур соответствуют группам на гистограммах слева направо.

Фиг.60. Иммунодетекция антител против IL6R305 до введения и через различное количество дней после в/в введения IL6R305. Планшеты для ELISA были покрыты IL6R305. Подписи под каждой из фигур соответствуют группам на гистограммах слева направо.

Фиг.61. Иммунодетекция антител против IL6R305 до введения и через различное количество дней после в/в введения IL6R305. Планшеты для ELISA были покрыты IL6R300. Подписи под каждой из фигур соответствуют группам на гистограммах слева направо.

Фиг.62. Иммунодетекция антител против IL6R305 до введения и через различное количество дней после в/в введения IL6R305. Планшеты для ELISA были покрыты ALB8. Подписи под каждой из фигур соответствуют группам на гистограммах слева направо.

Фиг.63. Уровень sIL-6R в плазме длиннохвостых макак после однократного в/в введения болюсом нанотел к IL6R. А: 2 животных получали контр. IgG в дозе 5 мг/кг (■) или носитель (▲); В: 3 животных получали IL6R304 в дозе 0,04 мг/кг; С: 3 животных получали IL6R305 в дозе 0,04 мг/кг.

Фиг.64. Общий уровень sIL-6R в плазме длиннохвостых макак после однократного в/в введения болюсом нанотел к IL6R. А: животные получали IL6R304 (▲, ■, ●), контр. IgG (▼) или носитель (◊); В: животные получали IL6R305 (▲, ■, ●), контр. IgG (▼) или носитель (◊). Представлены средние значения ±S.E. для каждой группы.

Фиг.65. Общий уровень IL-6 в плазме длиннохвостых макак после однократного в/в введения болюсом нанотел к IL6R. Общую концентрацию IL-6 в плазме, как эндогенного IL-6 макаки, так и введенного IL-6 человека, измеряли на платформе Gyrolab. Образцы, которые были ниже предела обнаружения, приведены как 9,6 пг/мл. A: IL6R304;

В: IL6R305; С: положительный (контр. IgG) и отрицательный (буфер) контроль. Представлены средние значения ±S.E. для каждой обработки (п=3 для 0,4 и 2 мг/кг; п=2 для 10 мг/кг). D: концентрация эндогенного IL-6 макаки в плазме индивидуальных животных после в/в введения болюсом 10 мг/кг IL6R304 (■,●), IL6R305 (▲,▼) или посторонних нанотел (◊,●). Представлены средние значения ±S.E. из 2 измерений.

Фиг.66. Общий уровень (А) и уровень свободного (В) sIL6R в плазме длиннохвостых макак после однократного в/в введения различных доз IL6R304. Представлены средние концентрации каждого биомаркера в плазме ±SD для каждой группы. Носитель или IL6R304 в указанных дозах вводили в момент времени 0. См. подписи на Фиг.66В.

Фиг.67. Общий уровень и уровень свободного sIL6R в плазме и концентрация IL6R304 у длиннохвостых макак после однократного в/в введения 25 мг/кг IL6R304. Представлены средние концентрации ±SD для определенной группы. На графике приведены общий sIL6R (сплошная линия, квадратики), свободный sIL6R (сплошная линия, кружочки) и концентрация IL6R304 (пунктир, дельта) в зависимости от времени (дни).

Фиг.68. Индивидуальные графики наблюдаемой (значки) и предсказанной на модели (сплошная линия) общей концентрации sIL6R от времени после в/в введения 1 мг/кг (о), 5 мг/кг (Δ), 10 мг/кг (+), 25 мг/кг (×) и 100 мг/кг (◊) IL6R304.

Фиг.69. Профили средней концентрации IL6R304 в плазме от времени у длиннохвостых макак после в/в введения болюсом 1,5,10,25 или 100 мг/кг IL6R304.

Фиг.70. Открытая фармакокинетическая модель с тремя компартментами при линейном и нелинейном клиренсе из центрального компартмента. CLNON-IL6R - линейный клиренс, не опосредованный IL6R; Vc - объем центрального компартмента; Vd - объем глубокого периферического компартмента; CLd - поток между центральным и глубоким компартментом; Vs - объем мелкого периферического компартмента; CLd - поток между центральным и мелким компартментом; a CLIL6R - нелинейный клиренс, опосредованный IL6R (при этом Vmax - максимальная скорость метаболизма и Km - концентрация IL6R304, соответствующая 50% от Vmax).

Раскрытие сущности изобретения

В настоящем описании, примерах и формуле:

a) Если не указано или не определено иначе, все используемые термины имеют свое обычное в данной области значение, которое должно быть известно специалистам. К примеру, сошлемся на стандартные учебники, такие как Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd ed.), vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds., "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd ed„ University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6th ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., "Roitt's Essential Immunology", 10th ed, Blackwell Publishing, UK (2001); и Janeway et al., "Immunobiology" (6th ed.). Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), а также на приведенные выше работы предшествующего уровня техники.

b) Если не указано иначе, термин "иммуноглобулиновая последовательность" - относится ли он к антителу из тяжелых цепей или к обычному 4-цепочечному антителу - применяется как общий термин, охватывающий и полные антитела, и их отдельные цепи, а также все их части, домены или фрагменты (в том числе антигенсвязывающие домены или фрагменты, такие как домены VHH или домены VH/VL, соответственно). Кроме того, термин "последовательность" в настоящем изобретении (например, в терминах типа "последовательность иммуноглобулина", "последовательность антитела", "последовательность вариабельного домена", "последовательность VHH" или "последовательность белка") в общем следует понимать как включающий и соответствующую аминокислотную последовательность, и кодирующие ее нуклеиновые кислоты или последовательности нуклеотидов, если только контекст не требует более конкретной интерпретации. Также и термин "нуклеотидная последовательность" в настоящем изобретении охватывает и молекулу нуклеиновой кислоты с данной последовательностью нуклеотидов, так что термины "нуклеотидная последовательность" и "нуклеиновая кислота" следует считать эквивалентными, причем они применяются взаимозаменяемым образом.

c) Если не указано иначе, все способы, стадии, методики и процедуры, которые не описаны конкретно в деталях, могут выполняться и выполнялись способом, известным per se, как должно быть понятно специалистам. Опять же сошлемся, к примеру, на стандартные учебники, приведенные выше работы предшествующего уровня техники и приведенные в них другие ссылки; а также, к примеру, на следующие обзоры: Presta, 2006, Adv. Drug Deliv. Rev., 58(5-6): 640-56; Levin and Weiss, 2006, Mol. Biosyst., 2(1): 49-57; Irving et al., 2001, J. Immunol. Methods, 248(1-2): 31-45; Schmitz et al., 2000, Placenta, 21 Suppl. A, S106-12; Gonzales et al., 2005, Tumour BioL, 26(1); 31-43, в которых описаны такие методы инженерии белков, как созревание аффинности и другие методики для улучшения специфичности и других желательных свойств таких белков, как иммуноглобулины.

d) Аминокислотные остатки будут обозначаться по стандартной трехбуквенной или однобуквенной кодировке аминокислот, как указано в табл.А-2.

Таблица А-2.
Однобуквенная и трехбуквенная кодировка аминокислот
Неполярные, незаряженные (при рН 6,0-7,0)(3) Аланин А1а A
Валин Val V
Лейцин Leu L
Изолейцин Не I
Фенилаланин Phe F
Метионин(1) Met M
Триптофан Trp W
Пролин Pro P
Полярные, незаряженные (при рН 6,0-7,0) Глицин(2) Gly G
Серии Ser S
Треонин Thr Т
Цистеин Cys с
Аспарагин Asn N
Глутамин Gln Q
Тирозин Tyr Y
Полярные, заряженные (при рН 6,0-7,0) Лизин Lys К
Аргинин Arg R
Гистидин(4) His H
Аспартат Asp D
Глутамат Glu E
Примечания:
(1) Иногда тоже считается полярной незаряженной аминокислотой.
(2) Иногда тоже считается неполярной незаряженной аминокислотой.
(3) Как должно быть известно специалистам, тот факт, что аминокислотный остаток приведен в данной таблице как заряженный или незаряженный при рН 6,0-7,0, никоим образом не отражает заряда данного аминокислотного остатка при рН ниже 6,0 и/или при рН выше 7,0; приведенные в таблице аминокислотные остатки могут быть как заряженными, так и незаряженными при более высоких или более низких рН, что должно быть ясно специалистам.
(4) Как известно, заряд остатка His сильно зависит даже от небольших сдвигов рН, однако остаток His в общем считается практически незаряженным при рН около 6,5.

е) В целях сравнения двух или нескольких нуклеотидных последовательностей можно рассчитать степень "идентичности последовательностей" между первой нуклеотидной последовательностью и второй нуклеотидной последовательностью путем деления [числа нуклеотидов в первой нуклеотидной последовательности, которые идентичны нуклеотидам в соответствующих положениях во второй нуклеотидной последовательности] на [общее число нуклеотидов в первой нуклеотидной последовательности] и умножения на 100%, при этом каждая делеция, вставка, замена или добавление нуклеотида во второй нуклеотидной последовательности - по сравнению с первой нуклеотидной последовательностью - считается отличием по одному нуклеотиду (положению).

С другой стороны, степень идентичности последовательностей между двумя или несколькими последовательностями нуклеотидов можно рассчитать с помощью известного компьютерного алгоритма для сопоставления последовательностей типа NCBI Blast v2.0, используя стандартные настройки.

Некоторые другие методы, компьютерные алгоритмы и настройки для определения степени идентичности последовательностей, к примеру, описаны в WO 04/037999, ЕР 0967284, ЕР 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 и GB 2357768-A.

Обычно в целях определения степени "идентичности последовательностей" между двумя последовательностями нуклеотидов в соответствии с методом расчета, изложенным выше, в качестве "первой" нуклеотидной последовательности берется нуклеотидная последовательность с наибольшим числом нуклеотидов, а в качестве "второй" нуклеотидной последовательности берется другая нуклеотидная последовательность.

f) В целях сравнения двух или нескольких аминокислотных последовательностей можно рассчитать степень "идентичности последовательностей" между первой аминокислотной последовательностью и второй аминокислотной последовательностью (также именуется как "аминокислотная идентичность") путем деления [числа аминокислотных остатков в первой аминокислотной последовательности, идентичных аминокислотным остаткам в соответствующих положениях во второй аминокислотной последовательности] на [общее число аминокислотных остатков в первой аминокислотной последовательности] и умножения на [100%], при этом каждая делеция, вставка, замена или добавление аминокислотного остатка во второй аминокислотной последовательности - по сравнению с первой аминокислотной последовательностью - считается отличием по одному аминокислотному остатку (положению), то есть "аминокислотным отличием", как определено здесь.

С другой стороны, степень идентичности последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями можно рассчитать с помощью известного компьютерного алгоритма типа тех, что описаны выше для определения степени идентичности нуклеотидных последовательностей, опять же используя стандартные настройки. Обычно в целях определения процента "идентичности последовательностей" между двумя аминокислотными остатками в соответствии с методом расчета, изложенным выше, в качестве "первой" аминокислотной последовательности берется аминокислотная последовательность с наибольшим числом аминокислот, а в качестве "второй" аминокислотной последовательности берется другая аминокислотная последовательность.

Также при определении степени идентичности последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями специалисты могут учитывать и так называемые "консервативные" аминокислотные замены, которые в общем могут быть описаны как аминокислотные замены, при которых один аминокислотный остаток заменяется на другой аминокислотный остаток со сходной химической структурой и которые почти или практически совсем не влияют на функцию, активность или другие биологические свойства полипептида. Такие аминокислотные замены хорошо известны в данной области, например, из WO 04/037999, GB 335 768-А, WO 98/49185, WO 00/46383 и WO 01/09300; a (предпочтительные) типы и/или комбинации таких замен могут быть выбраны на основе соответствующих положений из WO 04/037999, а также WO 98/49185 и приведенных в них других работ.

Такие консервативные замены предпочтительно представляют собой замены, при которых одна аминокислота внутри следующих групп (а)-(е) заменяется на остаток другой аминокислоты в пределах одной и той же группы: (а) небольшие алифатические, неполярные или слегка полярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (b) полярные, отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; (с) полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (d) большие алифатические, неполярные остатки: Met, Leu, He, Val и Cys; и (е) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp.

Особенно предпочтительны следующие консервативные замены: Ala на Gly или на Ser; Arg на Lys; Asn на Gin или на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или на Pro; His на Asn или на Gln; He на Leu или на Val; Leu на Не или на Val; Lys на Arg, на Gln или на Glu; Met на Leu, на Туг или на Ile; Phe на Met, на Leu или на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp; и/или Phe на Val, на Не или на Leu.

Любые аминокислотные замены в приложении к описанным здесь полипептидам также могут основываться на анализе частоты изменчивости аминокислот между гомологичными белками разных видов, разработанном Schuiz et al. (1978, "Principles of Protein Structure", Springer-Verlag), на анализе структурообразующих потенциалов, разработанном Chou and Fasman (1974, Biochemistry 13: 211, и 1978, Adv. Enzymol., 47: 45-149), и на анализе профилей гидрофобности белков, разработанном Eisenberg et al. (1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140-144), Kyte и Doolittle (1981, J. Mol. Biol. 157: 105-132) и Goldman et al. (1986, Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353), которые все включены во всей полноте путем ссылки. Информация о первичной, вторичной и третичной структуре нанотел приводится в настоящем описании и в приведенных выше работах предшествующего уровня техники. Кроме того, для этой цели кристаллическая структура домена vhh ламы, к примеру, приведена в Desmyter et al. (1996, Nature Structural Biology, 3(9): 803), Spinelli et al. (1996, Natural Structural Biology, 3: 752-757) и Decanniere et al. (1999, Structure, 7(4): 361). Дополнительную информацию о некоторых аминокислотных остатках, которые в обычных доменах VH образуют область контакта VH/VL и возможных камелизирующих заменах в этих положениях можно найти в приведенных выше предшествующих работах.

g) Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот считаются "точно такими же", если они обладают 100% идентичностью последовательностей (как определено здесь) по всей своей длине.

h) При сравнении двух аминокислотных последовательностей термин "аминокислотное отличие" относится к вставке, делеции или замене одного аминокислотного остатка в одном положении первой последовательности по сравнению со второй последовательностью; предусматривается, что две аминокислотные последовательности могут содержать одно, два или несколько таких аминокислотных отличий.

i) Когда говорится, что нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность "содержит" другую нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно, или "в основном состоит из" другой нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности, то это может означать, что последняя нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность была включена в названную первой нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно, но чаще всего это значит, что названная первой нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность содержит внутри своей последовательности участок нуклеотидов или аминокислотных остатков, соответственно, который имеет такую же нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно, что и последняя последовательность, независимо от того, как на самом деле была сделана или получена названная первой последовательность (что могло быть, к примеру, любым подходящим способом, описанным здесь). В качестве неограничительного примера: когда говорится, что аминокислотная последовательность изобретения содержит некий участок аминокислотных остатков, это может означать, что данный участок аминокислотных остатков был введен в аминокислотную последовательность изобретения, но чаще всего это значит, что аминокислотная последовательность изобретения содержит внутри своей последовательности участок аминокислотных остатков, независимо от того, как была сделана или получена данная аминокислотная последовательность изобретения. Когда говорится, что нанотело изобретения содержит последовательность CDR, это может означать, что данная последовательность CDR была введена в нанотело изобретения, но чаще всего это значит, что нанотело изобретения содержит внутри своей последовательности участок аминокислотных остатков с такой же аминокислотной последовательностью, что и данная последовательность CDR, независимо от того, как было сделано или получено данное нанотело изобретения. Следует также отметить, что если последняя аминокислотная последовательность имеет определенную биологическую или структурную функцию, то она предпочтительно имеет такую же, сходную или эквивалентную биологическую или структурную функцию в названной первой аминокислотной последовательности (иными словами, названная первой аминокислотная последовательность предпочтительно такова, что последняя последовательность способна выполнять практически такую же, сходную или эквивалентную биологическую или структурную функцию). Например, когда говорится, что нанотело изобретения содержит последовательность CDR или каркасную последовательность, соответственно, то последовательность CDR и каркасная последовательность предпочтительно способны функционировать в данном нанотеле в качестве последовательности CDR или каркасной последовательности, соответственно. Также когда говорится, что нуклеотидная последовательность содержит другую нуклеотидную последовательность, то названная первой нуклеотидная последовательность предпочтительно такова, что при ее экспрессировании в продукт экспрессии (т.е. полипептид) аминокислотная последовательность, кодируемая последней нуклеотидной последовательностью, составляет часть данного продукта экспрессии (иными словами, последняя нуклеотидная последовательность находится в той же самой рамке считывания, что и названная первой, большая нуклеотидная последовательность).

j) Нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность считается "в практически выделенном виде" - к примеру, по сравнению с ее естественным природным источником и/или реакционной средой или культуральной средой, из которой она была получена - если она была отделена от по меньшей мере одного другого компонента, с которым она обычно связана в данном источнике или среде, как-то другой нуклеиновой кислоты, другого белка/полипептида, другого биологического компонента или макромолекулы либо по меньшей мере одного загрязняющего вещества, примеси или второстепенного компонента. В частности, последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность считается "практически выделенной", если она была очищена по крайней мере в 2 раза, предпочтительно по крайней мере в 10 раз, более предпочтительно по крайней мере в 100 раз и вплоть до 1000 раз или больше. Последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, которая находится "в практически выделенном виде", предпочтительно практически гомогенна, что определяется соответствующим методом, как-то соответствующим хроматографическим методом или электрофорезом в полиакриламидном геле.

k) Термин "домен" в настоящем изобретении обычно обозначает глобулярный участок аминокислотной последовательности (как-то цепи антитела, в частности, глобулярный участок тяжелой цепи антитела) или полипептид, состоящий в основном из такого глобулярного участка. Обычно такой домен содержит пептидные петли (например, 3 или 4 пептидные петли), стабилизированные, к примеру, в виде листа или дисульфидными связями. Термин "домен связывания' обозначает такой домен, который направлен против антигенной детерминанты (как определено здесь).

l) Термин "антигенная детерминанта" обозначает эпитоп на антигене, распознаваемый антигенсвязывающей молекулой (как-то аминокислотной последовательностью, нанотелом или полипептидом изобретения), в частности, антиген-связывающим сайтом такой молекулы. Термины "антигенная детерминанта" и "эпитоп" также могут применяться взаимозаменяемым образом.

m) Аминокислотная последовательность (как-то нанотело, антитело, полипептид изобретения или антигенсвязывающий белок или полипептид вообще либо его фрагмент), которая способна (специфически) связываться с, обладает сродством и/или обладает специфичностью к определенной антигенной детерминанте, эпитопу, антигену или белку (либо по меньшей мере к одной его части, фрагменту или эпитопу), считается "направленной против" или просто "против" данной антигенной детерминанты, эпитопа, антигена или белка.

n) Термин "специфичность" относится к ряду различных типов антигенов или антигенных детерминант, с которыми может связываться определенная антигенсвязывающая молекула или антигенсвязывающий белок (как-то аминокислотная последовательность, нанотело или полипептид изобретения). Специфичность антигенсвязывающего белка может быть определена на основе сродства и/или авидности. Сродство, представленное константой равновесия для диссоциации антигена из антигенсвязывающего белка (KD), является мерой прочности связывания между антигенной детерминантой и антигенсвязывающим сайтом на антигенсвязывающем белке: чем меньшее значение KD, тем большая прочность связывания между антигенной детерминантой и антигенсвязывающей молекулой (с другой стороны, сродство может быть выражено в виде константы аффинности (KA), которая равна 1/KD). Как должно быть известно специалистам (к примеру, из дальнейшего изложения), аффинность можно определить известным способом per se, в зависимости от данного конкретного антигена. Авидность является мерой прочности связывания между антигенсвязывающей молекулой (как-то аминокислотной последовательностью, нанотелом или полипептидом изобретения) и соответствующим антигеном. Авидность связана как с аффинностью между антигенной детерминантой и ее антигенсвязывающим сайтом на антигенсвязывающей молекуле, так и числом соответствующих сайтов связывания, находящихся на антигенсвязывающей молекуле. Как правило, антигенсвязывающие белки связываются со своим антигеном с константой диссоциации (Ко) от 10-5 до 10-12 литр/моль или меньше, предпочтительно от 10-7 до 10-12 литр/моль или меньше и более предпочтительно от 10-8 до 10-12 литр/моль (т.е. с константой ассоциации (KA) от 105 до 1012 литр/моль или больше, предпочтительно от 107 до 1012 литр/моль или больше и более предпочтительно от 108 до 1012 литр/моль). Обычно считается, что любое значение KD больше, чем 104 литр/моль (или любое значение KA меньше, чем 104 М-1) указывает на неспецифическое связывание. Предпочтительно моновалентная иммуноглобулиновая последовательность изобретения будет связываться с требуемым антигеном со сродством менее 500 нМ, предпочтительно менее 200 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, как-то менее 500 пМ. Специфическое связывание антигенсвязывающего белка с антигеном или антигенной детерминантой можно определить любым подходящим способом, известным per se, включая, к примеру, анализ по Скетчерду и/или методы конкурентного связывания, такие как радиоиммуноанализ (RIA), ферментный иммуноанализ (EIA) и конкурентные методы "сэндвича" и различные их варианты, известные per se в данной области; а также и другие методы, указанные здесь.

Константа диссоциации может быть действительной или кажущейся константой диссоциации, как должно быть известно специалистам. Способы определения константы диссоциации должны быть известны специалистам, к примеру, они включают методы, указанные здесь. В этом отношении также должно быть ясно, что невозможно измерить константы диссоциации больше чем в 10-4 литр/моль или 10-3 литр/моль (напр., 10-2 литр/моль). Необязательно, что также должно быть известно специалистам, (действительная или кажущаяся) константа диссоциации может быть рассчитана на основании (действительной или кажущейся) константы ассоциации (KD) по соотношению [KD=1/Кд]. Аффинность означает прочность или стабильность молекулярного взаимодействия. Аффинность обычно приводится в виде Ко или константы диссоциации в единицах литр/моль (или М-1). Аффинность также может выражаться в виде константы ассоциации, KA, которая равна I/KD в единицах (литр/моль)-1 (или М-1). В настоящем описании стабильность взаимодействия между двумя молекулами (как-то аминокислотной последовательностью, нанотелом или полипептидом изобретения и искомой мишенью) в основном выражается в терминах значения KD для их взаимодействия; специалистам должно быть ясно, что в свете отношения KA=i/KD определение прочности молекулярного взаимодействия его значением KD может применяться также и для расчета соответствующего значения KD. Значение KD характеризует прочность молекулярного взаимодействия и в термодинамическом смысле, так как оно связано со свободной энергией (DG) связывания хорошо известным соотношением DG=RTln(KD) (что эквивалентно DG=RTln(KD), где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура и ln означает натуральный логарифм.

Значения KD для биологических взаимодействий, которые считается значимыми (напр., специфическими), обычно находятся в пределах от 10-10 М (0,1 нМ) до 10-5 М (10000 нМ). Чем сильнее взаимодействие, тем меньше его KD.

KD также может выражаться в виде отношения констант скорости диссоциации комплекса, обозначаемой как koff, к скорости его ассоциации, обозначаемой как kon (при этом KD=koff/kon и KA=kon/koff). Константа скорости koff выражается в единицах s-1 (где s - обозначение секунды в системе SI). Константа скорости kon выражается в единицах M-1s-1. Константа kon может варьировать от 102 M-1s-1 до примерно 107 M-1s-1, приближаясь к ограниченной диффузией константе скорости ассоциации для бимолекулярного взаимодействия. Константа koff связана со временем полужизни данного молекулярного взаимодействия через отношение t½=ln(2)/koff. Константа koff может варьировать между 10-6 s-1 (почти необратимый комплекс с t½, в несколько дней) до 1 s-1 (t½=0,69 сек). Аффинность молекулярного взаимодействия между двумя молекулами можно измерить различными методами, известными per se, такими как хорошо известный биосенсорный метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (см., к примеру, Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001), в котором одна молекула фиксируется на биосенсорном чипе, а другая молекула пропускается через иммобилизованную молекулу в проточных условиях, давая измерения значений kon, koff и следовательно KD (или KA). Это может осуществляться, к примеру, с помощью хорошо известных приборов BIACORE. Специалистам также должно быть ясно, что измеренное значение KD может соответствовать кажущемуся KD, если на процесс измерения каким-либо образом влияет внутреннее сродство связывания предполагаемой молекулы, к примеру, из-за артефактов, связанных с наслоением на биосенсоре одной из молекул. Кажущееся значение KD также может быть измерено, если одна молекула содержит более одного сайта узнавания для другой молекулы. В такой ситуации на измеряемое сродство может повлиять авидность взаимодействия двух молекул.

Другой подход, который может применяться для оценки сродства - это 2-ступенчатый метод ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ) по методике Friguet et al. (1985, J. Immunol. Methods, 77: 305-19). В этом методе проводится измерение равновесного связывания в растворе и устраняются возможные артефакты, связанные с адсорбцией одной из молекул на такой подложке, как пластик. Однако точное измерение KD может быть весьма трудоемким, поэтому часто определяются кажущиеся значения KD для оценки прочности связывания двух молекул. Следует отметить, что если все измерения проводятся последовательным образом (т.е. условия измерения поддерживаются неизменными), то измерения кажущейся константы KD можно использовать в качестве аппроксимации действительных значений KD, поэтому в настоящем документе значениям KD и кажущейся KD придается равное значение.

Наконец, следует отметить, что во многих ситуациях опытный ученый может посчитать удобным определение сродства связывания относительно некой стандартной молекулы. Например, для оценки прочности связывания между молекулами А и В можно использовать, напр., стандартную молекулу С, для которой известно, что она связывается с В и соответствующим образом помечена флуорофорной или хромофорной группой или другой химической молекулой, такой как биотин, для легкости детектирования методом ELISA или FACS (активируемая флуоресценцией сортировка клеток) или в другом формате (флуорофор для детекции флуоресценции, хромофор для детекции поглощения света, биотин для опосредованной стрептавидином детекции методом ELISA). Как правило, молекула стандарта С содержится в фиксированной концентрации, а концентрация А варьируется при данной концентрации или количестве В. В результате получается значение IC50, соответствующее той концентрации А, при которой сигнал, измеренный для С в отсутствие А, уменьшается наполовину. Если известно KD ref, т.е. KD молекулы стандарта, а также общая концентрация cref молекулы стандарта, то кажущееся KD для взаимодействия А-В можно получить по следующей формуле: KD=IC50/(1+cref/KD ref). Отметим, что если cref<<KDref, то KD≈IC50. Если измерение IC50 проводится последовательным образом (напр., поддерживается фиксированное значение Cref) при сравнении связывающихся веществ, то прочность или стабильность молекулярного взаимодействия можно оценить по IC50, и это измерение считается эквивалентным KD или кажущемуся KD по всему настоящему тексту.

о) Время полужизни аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения в общем можно определить как время, необходимое для того, чтобы концентрация аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида в сыворотке уменьшилась на 50% in vivo, к примеру, вследствие деградации последовательности или соединения и/или клиренса или депонирования последовательности или соединения естественными механизмами. Время полужизни аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения in vivo можно определить любым способом, известным per se, как-то фармакокинетическим анализом. Подходящие способы должны быть известны специалистам и в общем могут включать, к примеру, стадии соответствующего введения теплокровным животньм (т.е. человеку или другим подходящим млекопитающим, таким как мыши, кролики, крысы, свиньи, собаки или приматы, к примеру, обезьяны из рода Масаса, в частности длиннохвостые макаки (cynomolgus monkeys. Macaco, fascicularis) и/или макаки резус (Масаса mulatto), и павианы (Papio ursinus)~), соответствующей дозы аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения; отбора образцов крови или других образцов из данного животного; определения уровня или концентрации аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения в этом образце крови; расчета из графика полученных при этом данных того времени, когда уровень или концентрация аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения уменьшится на 50% по сравнению с первоначальным уровнем после дозировки. Сошлемся, к примеру, на "Экспериментальную часть", которая следует ниже, а также на стандартные учебники, такие как Kenneth A. et al. (Chemical Stability ofPharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists) и Peters et al. (1996, Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach). Сошлемся также на Gibaldi M. and Perron D. (1982, "Pharmacokinetics", published by Marcel Dekker, 2nd rev. ed.).

Специалистам также должно быть известно (см., к примеру, страницы 6 и 7 в WO 04/003019 и приведенные там другие ссылки), что время полужизни может быть выражено при помощи таких параметров, как t½-альфа, t½-бета и площадь под кривой (AUC). В настоящем описании "увеличение времени полужизни" означает увеличение любого из этих параметров, как-то любых двух из этих параметров или практически всех трех этих параметров. В настоящем изобретении "увеличение времени полужизни" или "увеличенное время полужизни", в частности, означает увеличение t½-бета, как вместе с увеличением t½-альфа и/или AUC или обоих, так и без него.

р) В контексте настоящего изобретения "модулирование" или "модулировать" в общем означает либо снижение или ингибирование активности, либо наоборот, повышение активности мишени или антигена, что измеряется соответствующими методами in vitro, на клетках или in vivo. В частности, "модулирование" или "модулировать" может означать либо снижение или ингибирование активности, либо наоборот, повышение (соответствующей или предполагаемой) биологической активности мишени или антигена при измерении соответствующим методом in vitro, на клетках или in vivo (что обычно зависит от конкретной мишени или антигена) по меньшей мере на 1%, предпочтительно по меньшей мере на 5%, как-то на 10% или на 25%, к примеру, по меньшей мере на 50%, на 60%, на 70%, на 80% или 90% или больше по сравнению с активностью мишени или антигена при определении тем же самым методом в таких же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или конструкции изобретения.

Как должно быть известно специалистам, "модулирование" также может включать реализацию изменения (как в сторону повышения, так и уменьшения) аффинности, авидности, специфичности и/или избирательности мишени или антигена к одному или нескольким лигандам, партнерам по связыванию, партнерам по ассоциации в гомомультимерную или гетеромультимерную форму или субстратам; и/или реализацию изменения (как в сторону повышения, так и уменьшения) чувствительности мишени или антигена к одному или нескольким условиям в среде или окружении, в котором находится мишень или антиген (как-то рН, ионная сила, наличие кофакторов и др.), по сравнению с такими же условиями, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или конструкции изобретения. Как должно быть известно специалистам, это опять же можно определить любым подходящим способом и/или любым подходящим методом, известным per se, в зависимости от конкретной мишени или антигена.

"Модулирование" также может означать реализацию изменения (т.е. действие в качестве агониста, антагониста или обратного агониста, соответственно, в зависимости от мишени или антигена и требуемого биологического или физиологического эффекта) в отношении одного или нескольких биологических или физиологических механизмов, эффектов, реакций, функций, путей или активностей, в которых участвует эта мишень или антиген (или в которых участвуют их субстраты, лиганды или пути), как-то сигнальные пути или метаболические пути и связанные с ними биологические или физиологические эффекты). Опять же, как должно быть известно специалистам, такое действие в качестве агониста или антагониста можно определить любым подходящим способом и/или любым подходящим методом (in vitro, на клетках или in vivo), известным per se, в зависимости от конкретной мишени или антигена. В частности, действие в качестве агониста или антагониста может быть таково, что искомая биологическая или физиологическая активность повышается или уменьшается, соответственно, по меньшей мере на 1%, предпочтительно по меньшей мере на 5%, как-то на 10% или на 25%, к примеру, по меньшей мере на 50%, на 60%, на 70%, на 80% или 90% или больше по сравнению с активностью мишени или антигена при определении тем же самым методом в таких же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или конструкции изобретения.

Модулирование может, к примеру, включать аллостерическую модуляцию мишени или антигена; и/или уменьшение или ингибирование связывания мишени или антигена с одним из его субстратов или лигандов и/или конкуренцию с природным лигандом, субстратом за связывание с мишенью или антигеном.

Модулирование также может включать активацию мишени или антигена или механизма или пути, в которых оно участвует. Модулирование может, к примеру, также включать реализацию изменения в отношении укладки или конформации мишени или антигена либо в отношении способности мишени или антигена к укладке, изменению своей конформации (например, при связывании с лигандом), ассоциации с другими субъединицами или диссоциации. Модулирование может, к примеру, также включать реализацию изменения способности мишени или антигена к транспортировке других соединений или служить каналом для других соединений (как-то ионов).

Модулирование может быть обратимым или необратимым, но для фармацевтических и фармакологических целей оно обычно является обратимым.

В контексте настоящего изобретения "модулирование" или "модулировать" может означать реализацию агонистического или антагонистического эффекта, соответственно, в отношении IL-6, IL-6R и/или биологических путей, реакций, сигналирования, механизмов или эффектов, в которых участвует IL-6 и/или IL-6R. В частности, "модулирование" или "модулировать" может означать агонистическое либо антагонистическое действие (т.е. в качестве полного или частичного агониста или антагониста, соответственно) при измерении подходящим методом in vitro, на клетках или in vivo (типа тех, что приведены здесь), которое ведет к изменению соответствующего параметра по меньшей мере на 1%, предпочтительно по меньшей мере на 5%, как-то по меньшей мере на 10% или на 25%, к примеру, по меньшей мере на 50%, на 60%, на 70%, на 80% или 90% или больше по сравнению с тем же параметром при определении тем же самым методом в таких же условиях, но в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или конструкции изобретения.

В контексте настоящего изобретения "модулирование, ингибирование и/или предотвращение связывания комплекса IL-6/IL-6R с gp130" означает, что аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, соединения или конструкции настоящего изобретения связываются со специфическим эпитопом на IL-6R (т.е. на нем самом или в комплексе IL-6R/IL-6R) таким образом, что образование комплекса IL-6/IL-6R ослабляется, ингибируется и/или предотвращается (напр., полностью или частично нарушается) таким образом, что уменьшается, ингибируется и/или предотвращается связывание комплекса с gp130, напр., его сродство к gp130 (или наоборот, уменьшается, ингибируется и/или предотвращается связывание gp130 с комплексом, напр., его сродство к нему), так что модулируется (напр., уменьшается, ингибируется и/или предотвращается) сигналирование, индуцированное/вызванное связыванием комплекса с gp130, по сравнению с образованием комплекса и его связыванием с gp130 в отсутствие аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или конструкции изобретения.

q) По отношению к мишени или антигену термин "сайт взаимодействия" на мишени или антигене означает сайт, эпитоп, антигенную детерминанту, часть, домен или участок аминокислотных остатков на мишени или антигене, который является сайтом для связывания с лигандом, рецептором или другим партнером по связыванию, каталитическим сайтом, сайтом расщепления, сайтом аллостерического взаимодействия, сайтом, участвующим в мультимеризации (как-то гомомеризации или гетеромеризации) мишени или антигена; или любой другой сайт, эпитоп, антигенную детерминанту, часть, домен или участок аминокислотных остатков на мишени или антигене, который участвует в биологическое действии или механизме мишени или антигена. В более общем смысле "сайтом взаимодействия" может быть любой сайт, эпитоп, антигенная детерминанта, часть, домен или участок аминокислотных остатков на мишени или антигене, с которым может связываться аминокислотная последовательность, нанотело, полипептид, соединение или конструкция изобретения таким образом, что происходит модулирование (как определено здесь) мишени или антигена (и/или любого пути, взаимодействия, проведение сигнала, биологического механизма или биологического действия, в котором участвует мишень или антиген).

г) "Участок аминокислотных остатков" означает два или несколько аминокислотных остатков, прилегающих друг к другу или находящихся в близком соседстве друг с другом, т.е. в первичной или третичной структуре аминокислотной последовательности. В контексте настоящего изобретения "участок аминокислотных остатков" отвечает (по крайней мере частично) за связывание аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или конструкции изобретения со своим специфическим эпитопом на IL-6R.

s) Считается, что аминокислотная последовательность, нанотело, полипептид, соединение или конструкция изобретения является "специфичной к" первой мишени или антигену по сравнению со второй мишенью или антигеном, если она связывается с первым антигеном со сродством (как описано выше, и соответствующим образом выраженным в виде значения KD, KA, скорости Koff и/или скорости Kon), которое по меньшей мере в 10 раз, как-то в 100 раз и предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз и вплоть до 10000 и больше раз лучше, чем сродство, с которым данная аминокислотная последовательность, нанотело, полипептид, соединение или конструкция связывается со второй мишенью или полипептидом. Например, первая аминокислотная последовательность, нанотело, полипептид, соединение или конструкция может связываться с мишенью или антигеном со значением KD, которое по меньшей мере в 10 раз меньше, в 100 раз меньше и предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз меньше и вплоть до 10000 и даже больше раз меньше, чем значение KD, с которым данная аминокислотная последовательность, нанотело, полипептид, соединение или конструкция связывается со второй мишенью или полипептидом. Предпочтительно, если аминокислотная последовательность, нанотело, полипептид, соединение или конструкция "специфична к" первой мишени или антигену по сравнению со второй мишенью или антигеном, она направлена против (как определено здесь) данной первой мишени или антигена, но не направлена против данной второй мишени или антигена.

t) Если аминокислотная последовательность или нанотело изобретения (а также содержащие их соединения, конструкции и полипептиды) "перекрестие реагирует" с IL-6R из двух различных видов (т.е. из первого вида и второго вида), то это означает, что аминокислотная последовательность или нанотело изобретения (а также содержащие их соединения, конструкции и полипептиды) связывается с IL-6R из второго вида со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения KD (действительного или кажущегося), скорости Koff и/или скорости Kon либо значения IC50, как в дальнейшем описано здесь), которое одинаково или составляет по меньшей мере 70% (предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%) от сродства, с которым данная аминокислотная последовательность или нанотело изобретения (а также содержащие их соединения, конструкции и полипептиды) связывается с IL-6R из первого вида.

u) Как будет подробно описано дальше, общее число аминокислотных остатков у нан отела может составлять порядка 110-120, предпочтительно 112-115, и наиболее предпочтительно 113. Однако следует отметить, что части, фрагменты, аналоги или производные (как будет подробно описано далее) нанотел не имеют особых ограничений по длине и/или размерам, если только такие части, фрагменты, аналоги или производные отвечают дополнительным требованиям, изложенным здесь, а также предпочтительно подходят для описанных здесь целей.

v) Аминокислотные остатки нанотел пронумерованы согласно общей нумерации для доменов vh, приведенной Kabat et al. ("Sequences of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), которая применялась для доменов vhh из Camelids в статье Riechmann and Muyldermans (2000, J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195; к примеру, см. Фиг.2 в этой публикации); она же приведена здесь. Согласно этой нумерации, FR1 нанотел содержит аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 нанотел содержит аминокислотные остатки в положениях 31-35, FR2 нанотел содержит аминокислотные остатки в положениях 36-49, CDR2 нанотел содержит аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 нанотел содержит аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 нанотел содержит аминокислотные остатки в положениях 95-102 и FR4 нанотел содержит аминокислотные остатки в положениях 103-113. [В этом отношении следует отметить, как это хорошо известно насчет доменов VH и доменов VHH, что общее число аминокислотных остатков в каждом из CDR может варьировать и может не соответствовать общему числу аминокислотных остатков, приведенных по нумерации Кабата (то есть одно или несколько положений согласно нумерации Кабата может быть не занято реальной последовательностью либо реальная последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем число, разрешенное нумерацией Кабата). Это означает, что в общем-то нумерация Кабата может как соответствовать так и не соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в реальной последовательности. Однако в целом можно сказать, что согласно нумерации Кабата и независимо от числа аминокислотных остатков в участках CDR положение 1 по нумерации Кабата соответствует старту FR1 и наоборот, положение 36 по нумерации Кабата соответствует старту FR2 и наоборот, положение 66 по нумерации Кабата соответствует старту FR3 и наоборот, и положение 103 по нумерации Кабата соответствует старту FR4 и наоборот].

Альтернативные методы нумерации аминокислотных остатков доменов VH, которые также могут применяться аналогичным образом к доменам VHH из Camelids и к нанотелам, - это метод, описанный Chothia et al. (1989, Nature 342: 877-883), так называемое "определение AbM" и так называемое "контактное определение". Однако в настоящем описании, формуле изобретения и фигурах будет применяться нумерация по Кабату в применении к доменам VHH no Riechmann и Muyldermans, если не указано иначе.

w) Фигуры, Перечень последовательностей и Экспериментальная часть/Примеры приводятся только для дальнейшей иллюстрации изобретения и никоим образом не должны интерпретироваться или восприниматься как ограничивающие объем изобретения и/или прилагаемую формулу изобретения, если прямо не указано иное.

Настоящим изобретением предусмотрены участки аминокислотных остатков (SEQ ID NO's:80-82, SEQ ID NO's:84-91 и SEQ ID NO's:93-95), которые особенно подходят для связывания с IL-6R. Эти участки аминокислотных остатков могут присутствовать и/или могут быть вставлены в аминокислотную последовательность изобретения, в частности, таким образом, чтобы они составляли (часть) антигенсвязывающего сайта аминокислотной последовательности изобретения. Эти участки аминокислотных остатков были созданы как последовательности CDR антител из тяжелой цепи или как последовательности VHH, полученные против IL-6R и подвергнутые дальнейшему созреванию аффиности (см. раздел Примеры) для дальнейшего повышения сродства к связыванию с IL-6R, а также других свойств, таких как эффективность и/или активность и/или избирательность, вдобавок к их способности частично или полностью блокировать взаимодействие IL-6/IL-6R и/или ингибировать сигнализирование через IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R. Эти участки аминокислотных остатков также именуются здесь как "последовательности CDR изобретения" (т.е. "последовательности CDR1 изобретения", "последовательности CDR2 изобретения" и "последовательности CDR3 изобретения", соответственно).

Однако следует отметить, что изобретение в самом широком смысле не ограничивается той специфической структурной ролью или функцией, которой эти участки аминокислотных остатков могут обладать в аминокислотной последовательности изобретения, лишь бы только эти участки аминокислотных остатков позволяли аминокислотной последовательности изобретения связываться с IL-6R. Таким образом, в целом изобретение в самом широком смысле предусматривает аминокислотные последовательности, способные связываться с IL-6R с определенной заданной аффиностью, авидностью, эффективностью и/или прочностью, наряду со способностью частично или полностью блокировать взаимодействие IL-6/IL-6R и/или ингибировать сигнализирование через IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R, и содержащие одну или несколько последовательностей CDR, как описано здесь, в частности, подходящие комбинации из двух или нескольких таких последовательностей CDR, которые соответствующим образом связаны друг с другом через одну или несколько других аминокислотных последовательностей таким образом, что вся эта аминокислотная последовательность образует домен связывания и/или единицу связывания, способную связываться с IL-6R. Однако следует также отметить, что наличие только одной такой последовательности CDR в аминокислотной последовательности изобретения само по себе уже может быть достаточным для придания аминокислотной последовательности изобретения способности связываться с IL-6R; опять же можно сослаться, к примеру, на так называемые "фрагменты Expedite", описанные в WO 03/050531.

Итак, в специфическом, но не ограничительном аспекте аминокислотная последовательность изобретения может содержать по меньшей мере один участок аминокислотных остатков, выбранный из группы, состоящей из:

- последовательностей CDR1:

a) SEQ ID NO's:80-82;

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

и/или

- последовательностей CDR2:

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

и/или

- последовательностей CDR3:

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

В частности, аминокислотная последовательность изобретения может быть аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, причем данный антигенсвязывающий сайт содержит по меньшей мере один участок аминокислотных остатков, выбранный из группы, состоящей из последовательностей CDR1, последовательностей CDR2 и последовательностей CDR3, как описано выше (или любых подходящих их комбинаций). В предпочтительном аспекте, однако, аминокислотная последовательность изобретения содержит более одного, как-то два или несколько участков аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из последовательностей изобретения CDR1, последовательностей изобретения CDR2 и последовательностей изобретения CDR3.

Соответственно, настоящее изобретение также касается аминокислотных последовательностей, содержащих два или несколько участков аминокислотных остатков, выбранных из следующего:

- последовательностей CDR1:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

и/или

- последовательностей CDR2:

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса;

и/или

- последовательностей CDR3:

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

с тем, что: (i) когда первый участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно а) или b), то второй участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно с), d), е) или f); (ii) когда первый участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно с) или d), то второй участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно а), b), е) или f); либо (iii) когда первый участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно е) или f), то второй участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно а), b), с) или d).

В специфическом аспекте настоящее изобретение также касается аминокислотных последовательностей, содержащих три или несколько участков аминокислотных остатков, при этом первый участок аминокислотных остатков выбран из следующих последовательностей CDR1:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более I аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса;

второй участок аминокислотных остатков выбран из следующих последовательностей CDR2:

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и

третий участок аминокислотных остатков выбран из следующих последовательностей CDR3:

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Как описано в настоящем изобретении, оно также охватывает аминокислотные последовательности, содержащие один или несколько участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одного из участков аминокислотных остатков, приведенных в а), с) и/или е), т.е. от одной из приведенных последовательностей CDR1 (т.е. одной из SEQ ID NO's:80-82), от одной из приведенных последовательностей CDR2 (т.е. одной из SEQ ID NO's:84-91) и/или от одной из приведенных последовательностей CDR3 (т.е. одной из SEQ ID NO's:93-95).

Термин "аминокислотное отличие" относится к вставкам, делениям или заменам одного аминокислотного остатка в одном положении участка аминокислотных остатков (или последовательности CDR), приведенного в b), d) или f), по сравнению с участком аминокислотных остатков (или последовательностью CDR) из а), с) или е), соответственно; подразумевается, что участок аминокислотных остатков (или последовательность CDR) из b), d) и f), соответственно, может содержать одно или максимум два таких аминокислотных отличия по сравнению с участком аминокислотных остатков из а), с) или е), соответственно.

"Аминокислотное отличие" может представлять собой одну, максимум две замены, делении или вставки либо их комбинации, которые либо улучшают свойства аминокислотной последовательности изобретения, либо по крайней мере не слишком сильно ухудшают (уменьшают) желательные свойства или баланс или сочетание желательных свойств аминокислотной последовательности изобретения. В этом отношении полученная аминокислотная последовательность изобретения по крайней мере должна связываться с IL-6R с таким же, примерно таким же или более высоким сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей один или несколько участков аминокислотных остатков без одной, максимум двух замен, делеций или вставок, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Например, в зависимости от организма хозяина, используемого для экспрессии аминокислотной последовательности изобретения, такие делеций и/или замены могут быть разработаны таким образом, чтобы удалить один или несколько сайтов для посттрансляционной модификации (как-то один или несколько сайтов гликозилирования), что должно быть в компетенции специалистов в этой области.

В предпочтительном аспекте изобретения "аминокислотное отличие" является аминокислотной заменой. Аминокислотная замена может представлять собой одну или максимум две замены, которые либо улучшают свойства аминокислотной последовательности изобретения, либо по крайней мере не слишком сильно ухудшают желательные свойства или баланс или сочетание желательных свойств аминокислотной последовательности изобретения. В этом отношении полученная аминокислотная последовательность изобретения по крайней мере должна связываться с IL-6R с таким же, примерно таким же или более высоким сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей один или несколько участков аминокислотных остатков без одной, максимум двух замен, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Аминокислотные замены в одном или нескольких участках аминокислотных остатков могут быть консервативными аминокислотными заменами. "Консервативные" аминокислотные замены - в общем это такие аминокислотные замены, при которых один аминокислотный остаток заменяется другим аминокислотным остатком со сходной химической структурой и которые почти или практически совсем не влияют на функцию, активность или другие биологические свойства полученной аминокислотной последовательности. Такие консервативные аминокислотные замены хорошо известны в этой области, к примеру, из WO 04/037999, GB 3357768-A, WO 98/49185, WO 00/46383 и WO 01/09300; а (предпочтительные) типы и/или комбинации таких замен могут быть выбраны на основе соответствующих положений из WO 04/037999, а также из WO 98/49185 и приведенных в них других ссылок.

Такие консервативные замены предпочтительно представляют собой такие замены, при которых одна аминокислота в пределах следующих групп (а)-(е) заменяется на остаток другой аминокислоты в пределах той же группы: (а) небольшие алифатические неполярные или слабо полярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (b) полярные, отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; (с) полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (d) большие алифатические, неполярные остатки: Met, Leu, He, Val и Cys; и (е) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp.

Особенно предпочтительными являются следующие консервативные замены: Ala на Gly или Ser; Arg на Lys; Asn на Gln или His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gin на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или Pro; His на Asn или Gln; He на Leu или Val; Leu на Не или Val; Lys на Arg, Gln или Glu; Met на Leu, Tyr или Ile; Phe на Met, Leu или Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp; и/или Phe на Val, Ile или Leu.

В другом аспекте изобретения аминокислотные замены в одном или нескольких участках аминокислотных остатков могут придавать аминокислотной последовательности повышенное сродство к связыванию с IL-6R. Это может быть сделано такими методами, как случайного или сайт-направленного мутагенеза и/или другими методами для созревания аффинности, известными per se, такими, напр., как описанные в WO 09/004065, WO 2009/004066, WO 05/003345, WO 06/023144, EP 527809, EP 397834.

Не будучи ограничительными, правила (частично или полностью соблюдаемые) для замены аминокислотных остатков в CDR могут быть следующими (т.е. замены на аминокислоты со сходной химией боковых цепей):

- K заменяется на R;

- R заменяется на K;

- А заменяется на S или Т;

- S заменяется на А или Т;

- Т заменяется на А или S;

- I заменяется на L или V;

- L заменяется на I или V;

- V заменяется на I или L;

- F заменяется на Y;

- Y заменяется на F;

- N заменяется на D;

- D заменяется на N;

- Q заменяется на Е;

- Е заменяется на Q;

- G заменяется на А;

- М заменяется на L;

- Н, С, W и Р остаются постоянными.

Кроме того, и тоже без ограничений, правила (частично или полностью соблюдаемые) для замены аминокислотных остатков в CDR могут быть изложены альтернативно следующим образом для замены в положениях 27-35 и в положениях 50-58 (по системе нумерации Кабата), при этом:

для положений 27-35:

- исходный аминокислотный остаток в положении 27 (по нумерации Кабата) заменяется на F; G; R; S; 2 из F, G, R, S; 3 из F, G, R, S; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 28 (по нумерации Кабата) заменяется на А; I; S; Т; 2 из А, I, S, Т; 3 из A, I, S, Т; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 29 (по нумерации Кабата) заменяется на F; G; L; S; 2 из F, G, L, S; 3 из F, G, L, S; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 30 (по нумерации Кабата) заменяется на D; G; S; Т; 2 из D, G, S, Т; 3 из D, G, S, Т; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 31 (по нумерации Кабата) заменяется на D; I; N; S; Т; 2 из D, I, N, S, Т; 3 из D, I, N, S, Т; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 32 (по нумерации Кабата) заменяется на D; N;Y; 2 из D, N, Y; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 33 (по нумерации Кабата) заменяется на А; G; Т; V; 2 из А, G, Т, V; 3 из А, G, Т, V; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 34 (по нумерации Кабата) заменяется на I; М; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 35 (по нумерации Кабата) заменяется на А; G; S; 2 из А, G, S; или все из них, предпочтительно все из них;

для положений 50-58, если исходная аминокислотная последовательность имеет аминокислотную последовательность в положении 52а (по нумерации Кабата):

- исходный аминокислотный остаток в положении 50 (по нумерации Кабата) заменяется на А; С; G; S; Т; 2 из А, С, G, S, Т; 3 из А, С, G, S, Т; 4 из А, С, G, S, Т; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 51 (по нумерации Кабата) заменяется на I;

- исходный аминокислотный остаток в положении 52 (по нумерации Кабата) заменяется на N; R; S; Т; 2 из N, R, S, Т; 3 из N, R, S, Т; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 52а (по нумерации Кабата) заменяется на R; S; Т; W; 2 из R, S, Т, W; 3 из R, S, Т, W; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 53 (по нумерации Кабата) заменяется на D; G; N; S; Т; 2 из D, G, N, S, Т; 3 из D, G, N, S, Т; 4 из D, G, N, S, Т; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 54 (по нумерации Кабата) заменяется на D; G; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 55 (по нумерации Кабата) заменяется на D; G; S; 2 из D, G, S; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 56 (по нумерации Кабата) заменяется на I; N; R; S; Т; 2 из I, N, R, S, Т; 3 из I, N, R, S, Т; 4 из I, N, R, S, Т; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 57 (по нумерации Кабата) заменяется на Т;

- исходный аминокислотный остаток в положении 58 (по нумерации Кабата) заменяется на D; H; N; S; Y; 2 из D, H, N, S, Y; 3 из D, H, N, S, Y; 4 из D, H, N, S, Y; или все из них, предпочтительно все из них;

для положений 50-58, если исходная аминокислотная последовательность не имеет аминокислотной последовательности в положении 52а (по нумерации Кабата),

- исходный аминокислотный остаток в положении 50 (по нумерации Кабата) заменяется на А; G; R; S; Т; 2 из А, G, R, S, Т; 3 из А, G, R, S, Т; 4 из A, G, R, S, Т; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 51 (по нумерации Кабата) заменяется на I;

- исходный аминокислотный остаток в положении 52 (по нумерации Кабата) заменяется на N; S; Т; 2 из N, S, Т; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 53 (по нумерации Кабата) заменяется на N; R; S; Т; Y; 2 из N, R, S, Т, Y; 3 из N, R, S, Т, Y; 4 из N, R, S, Т, Y; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 54 (по нумерации Кабата) заменяется на D; G; R; S; 2 из D, G, R, S; 3 из D, G, R, S; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 55 (по нумерации Кабата) заменяется на G;

- исходный аминокислотный остаток в положении 56 (по нумерации Кабата) заменяется на G; N; R; S; Т; 2 из D, N, R, S, Т; 3 из D, N, R, S, Т; 4 из D, N, R, S, Т; или все из них, предпочтительно все из них;

- исходный аминокислотный остаток в положении 57 (по нумерации Кабата) заменяется на Т;

- исходный аминокислотный остаток в положении 58 (по нумерации Кабата) заменяется на D; N; Т; Y; 2 из D, N, Т, Y; 3 из D, N, Т, Y; или все из них, предпочтительно все из них;

после чего в данную последовательность CDR (любым способом, известным per se, как описано далее), может быть введена одна или несколько потенциально полезных замен (или их комбинаций), установленных при этом, и полученную аминокислотную последовательность можно протестировать на сродство к IL-6R и/или на другие желательные свойства, такие как способность (частичная или предпочтительно полная) блокировать взаимодействие IL-6/IL-6R и/или ингибировать прохождение сигнала через IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R. Таким образом, путем ограниченного числа проб и ошибок на основе настоящего изложения специалист может найти другие подходящие замены в CDR (или их подходящие комбинации).

Аминокислотная последовательность изобретения может представлять собой любую аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере один участок аминокислотных остатков, причем данный участок аминокислотных остатков имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности по меньшей мере одной из последовательностей CDR, приведенных здесь. Такая аминокислотная последовательность может и не содержать иммуноглобулиновую складку. Например, и без ограничений, такой аминокислотной последовательностью может быть подходящий фрагмент иммуноглобулиновой последовательности, содержащий по меньшей мере одну такую последовательность CDR (как определено выше), но недостаточно большой для образования (полной) иммуноглобулиновой складки (опять же можно сослаться, к примеру, на "фрагменты Expedite", описанные в WO 03/050531). С другой стороны, такой аминокислотной последовательностью может быть подходящий "белковый каркас", содержащий по меньшей мере один участок аминокислотных остатков, соответствующий последовательности CDR, как определено здесь для аминокислотных последовательностей изобретения (т.е. как часть антигенсвязывающего сайта). Подходящие каркасы для презентации аминокислотных последовательностей должны быть известны специалистам, к примеру, они содержат, без ограничений, связывающие каркасы на основе или происходящие из иммуноглобулинов (т.е. отличные от иммуноглобулиновых последовательностей, уже описанных здесь), белковые каркасы, происходящие из доменов белка А (как-то Affibodies™), тендамистата, фибронектина, липокалина, CTLA-4, Т-клеточных рецепторов, составленных анкириновых повторов, авимеров и доменов PDZ (Binz et al., 2005, Nat. Biotech., 23: 1257), и связывающие молекулы на основе ДНК или РНК, в том числе ДНК- или РНК-аптамеры (Ulrich et al., 2006, Comb. Chem. High Throughput Screen. 9(8): 619-32).

Опять же, любая аминокислотная последовательность изобретения, содержащая одну или несколько последовательностей CDR, как определено здесь для аминокислотных последовательностей изобретения (т.е. " CDR изобретения"), предпочтительно такова, что может специфически связываться (как определено здесь) с IL-6R, более предпочтительно такова, что может связываться с IL-6R с таким сродством связывания (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительное или кажущееся), значения KA (действительное или кажущееся), константы скорости kon и/или скорости koff либо в виде значения IC50, как описано далее), как определено здесь. Любая аминокислотная последовательность изобретения, содержащая одну или несколько последовательностей CDR, как определено здесь для аминокислотных последовательностей изобретения, предпочтительно такова, что она обладает активностью на клетках и активностью в плазме, как определено здесь.

Кроме того, специалистам должно быть известно и то, что можно "пересадить" один или несколько участков CDR, определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения (т.е. "CDR изобретения"), на другие "каркасы", в том числе на каркасы человека или неиммуноглобулиновые каркасы. Подходящие каркасы и методики для такой пересадки CDR должны быть понятны специалистам и хорошо известны в данной области, к примеру, см. US 7,180,370, WO 01/27160, EP 0605522, EP 0460167, US 7.054,297, Nicaise et al. (2004, Protein Science, 13: 1882-1891), Ewert et al. (2004, Methods, 34(2); 184-199), Kettleborough et al. (1991, Protein Eng. 4(7): 773-783), O'Brien and Jones (2003, Methods Mol. Biol. 207: 81-100), Skerra (2000, J. Mol. Recognit. 13: 167-187), и Saerens et al. (2005, J. Mol. Biol. 352(3); 597-607), и приведенные в них другие ссылки. Например, методы, известные per se для пересадки CDR мыши или крысы на каркасные участки и каркасы человека, можно использовать аналогичным образом для получения химерных белков, содержащих одну или несколько последовательностей CDR, определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения, и один или несколько каркасных участков или последовательностей человека.

Итак, в специфическом аспекте изобретение также охватывает химерные аминокислотные последовательности, содержащие по меньшей мере одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR1 изобретения, последовательностей CDR2 изобретения и последовательностей CDR3 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения). Предпочтительно, такие химерные аминокислотные последовательности содержат по меньшей мере одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR1 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), и по меньшей мере одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR2 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения); или по меньшей мере одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR1 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), и по меньшей мере одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR3 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения); или же такой химерный полипептид может содержать по меньшей мере одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR2 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), и еще по меньшей мере одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR3 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения). Например, такой химерный полипептид может содержать одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR3 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR1 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), и одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR2 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения). Комбинации CDR, приведенные здесь как предпочтительные для аминокислотных последовательностей изобретения (см. табл.А-1), должны быть предпочтительны и для этих химерных полипептидов.

В данных химерных полипептидах участки CDR могут быть связаны с другими аминокислотными последовательностями и/или друг с другом через аминокислотные последовательности, в которых данные аминокислотные последовательности предпочтительно являются каркасными последовательностями или действуют как каркасные последовательности либо вместе образуют каркас для презентации CDR.

Согласно одному неограничительному воплощению, химерные аминокислотные последовательности содержат по меньшей мере две последовательности CDR (определенные здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), соединенные через по меньшей мере одну каркасную последовательность, в которой предпочтительно по меньшей мере одна из двух последовательностей CDR является последовательностью CDR3, а другая последовательность CDR является последовательностью CDR1 или CDR2. Согласно предпочтительному, но не ограничительному воплощению, химерные аминокислотные последовательности содержат по меньшей мере три последовательности CDR по изобретению (определенные здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), соединенные по меньшей мере с двумя каркасными последовательностями, в которых предпочтительно по меньшей мере одна из трех последовательностей CDR является последовательностью CDR3, а две другие последовательности CDR являются последовательностями CDR1 или CDR2, предпочтительно это одна последовательность CDR1 и одна последовательность CDR2. Согласно одному специфически предпочтительному, но не ограничительному воплощению, химерные аминокислотные последовательности имеют структуру FR1'-CDR1-FR2'-CDR2-FR3'-CDR3-FR4'. в которой CDR1, CDR2 и CDR3 определены здесь для аминокислотных последовательностей изобретения, a FR1', FR2', FR3' и FR4' - это каркасные последовательности. В частности, FR1', FR2', FR3' и FR4' могут представлять собой последовательности, соответственно, каркасного участка 1, каркасного участка 2, каркасного участка 3 и каркасного участка 4 антител человека (как-то последовательностиУнЗ) и/или частей или фрагментов таких каркасных последовательностей. Также можно использовать части или фрагменты химерных полипептидов со структурой FR1'-CDR1-FR2'-CDR2-FR3'-CDR3-FR4'. Предпочтительно, эти части или фрагменты таковы, что они соответствуют критериям, установленным для аминокислотных последовательностей изобретения.

В такой аминокислотной последовательности изобретения каркасными последовательностями могут быть любые подходящие каркасные последовательности, и примеры подходящих каркасных последовательностей должны быть известны специалистам, к примеру, из стандартных учебников и дальнейшего изложения и приведенных здесь работ предшествующего уровня техники.

Каркасные последовательности предпочтительно представляют собой каркасные последовательности (подходящие их комбинации) иммуноглобулинов или каркасные последовательности, происходящие из каркасных последовательностей иммуноглобулинов (к примеру, при оптимизации последовательностей типа гуманизации или камелизации). Например, каркасные последовательности могут представлять собой каркасные последовательности, происходящие из вариабельного домена легкой цепи (т.е. VL-последовательности) и/или из вариабельного домена тяжелой цепи (т.е. VH-последовательности). В одном особенно предпочтительном аспекте каркасные последовательности могут представлять собой либо каркасные последовательности, происходящие из последовательностей VHH (в которых эти каркасные последовательности могут необязательно быть частично или полностью гуманизированы), либо обычные VH-последовательностями, которые были подвергнуты камелизации (как определено здесь).

Каркасные последовательности предпочтительно могут быть такими, в которых аминокислотная последовательность изобретения представляет собой доменное антитело (или аминокислотную последовательность, подходящую для использования в качестве доменного антитела); однодоменное антитело (или аминокислотную последовательность, подходящую для использования в качестве однодоменного антитела); антитело "dAb" (или аминокислотную последовательность, подходящую для использования в качестве dAb); или нанотело (в том числе последовательность VHH). Опять же, подходящие каркасные последовательности должны быть известны специалистам, к примеру, из стандартных учебников и дальнейшего изложения и приведенных здесь работ предшествующего уровня техники.

В частности, каркасные последовательности, присутствующие в аминокислотных последовательностях изобретения, могут содержать один или несколько остатков Hallmark (как определено в WO 08/020079 (табл.от А-3 до А-8)), так что аминокислотная последовательность изобретения является нанотелом. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры таких каркасных последовательностей (их подходящие сочетания) станут понятными из дальнейшего изложения (напр., см. табл.А-1). В общем, нанотела (в частности, последовательности VHH и (частично) гуманизированные последовательности VHH), в частности, могут характеризоваться присутствием одного или нескольких "остатков Hallmark" в одной или нескольких каркасных последовательностях (напр., как подробно описано в WO 08/020079, со стр.61, строка 24, до стр.98, строка 3).

В предпочтительном аспекте аминокислотная последовательность изобретения содержит иммуноглобулиновую складку или способна, при подходящих условиях, образовать иммуноглобулиновую складку. Предпочтительно аминокислотная последовательность изобретения является иммуноглобулиновой последовательностью; и еще более предпочтительно аминокислотная последовательность изобретения имеет структуру:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Соответственно, настоящее изобретение касается аминокислотных последовательностей, которые в основном состоят из 4 каркасных участков (от FR1 до FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность участков (от CDR1 до CDR3, соответственно), при этом:

- CDR1 выбран из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

и/или

- CDR2 выбран из группы, состоящей из:

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

и/или

- CDR3 выбран из группы, состоящей из:

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

В этом воплощении аминокислотные последовательности содержат по меньшей мере одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR1 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), последовательностей CDR2 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения) или последовательностей CDR3 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения). Предпочтительно аминокислотные последовательности содержат по меньшей мере две последовательности CDR, выбранные из группы, состоящей из последовательностей CDR1 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), последовательностей CDR2 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения) или последовательностей CDR3 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), таким образом, что по меньшей мере одна последовательность CDR выбрана из группы, состоящей из последовательностей CDR1 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), и по меньшей мере одна последовательность CDR выбрана из группы, состоящей из последовательностей CDR2 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения); или по меньшей мере одна последовательность CDR выбрана из группы, состоящей из последовательностей CDR1 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), и по меньшей мере одна последовательность CDR выбрана из группы, состоящей из последовательностей CDR3 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения); или по меньшей мере одна последовательность CDR выбрана из группы, состоящей из последовательностей CDR2 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), и по меньшей мере одна последовательность CDR выбрана из группы, состоящей из последовательностей CDR3 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения); или же таким образом, что аминокислотная последовательность может содержать три последовательности CDR, выбранные из группы, состоящей из последовательностей CDR1 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения), из последовательностей CDR2 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения) и из последовательностей CDR3 изобретения (определенных здесь для аминокислотных последовательностей изобретения). Таким образом, настоящее изобретение также касается аминокислотных последовательностей, которые в основном состоят из 4 каркасных участков (от FR1 до FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность участков (от CDR1 до CDR3, соответственно), при этом:

- CDR1 выбран из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса;

и

- CDR2 выбран из группы, состоящей из:

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса;

и

- CDR3 выбран из группы, состоящей из:

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Предпочтительные комбинации последовательностей CDR для аминокислотных последовательностей изобретения представлены в табл.А-1.

Аминокислотные последовательности изобретения могут в основном состоять из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, происходящего из обычного четырехцепочечного антитела, или могут в основном состоять из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, происходящего антитела из тяжелой цепи. Аминокислотные последовательности изобретения могут в основном состоять из доменного антитела (или аминокислотной последовательности, подходящей для использования в качестве доменного антитела), однодоменного антитела (или аминокислотной последовательности, подходящей для использования в качестве однодоменного антитела), антитела "dAb" (или аминокислотной последовательности, подходящей для использования в качестве dAb) или нанотела.

Для общего описания (одно)доменных антител сошлемся на приведенные выше работы предшествующего уровня техники, а также на ЕР 0368684. В отношении термина "dAb" сошлемся, к примеру, на Ward et al. (1989, Nature 341: 544-6), на Holt et al. (2003, Trends Biotechnol. 21: 484-490); а также, к примеру, на WO 06/030220, WO 06/003388 и другие опубликованные патентные заявки фирмы Domantis Ltd.

Следует также отметить, что хотя они и менее предпочтительны в контексте настоящего изобретения потому, что происходят не из млекопитающих, однодоменные антитела или единичные вариабельные домены могут происходить из определенных видов акул (например, так называемые "домены IgNAR", к примеру, см. WO 05/18629).

В частности, аминокислотная последовательность изобретения в основном состоит из или может представлять собой нанотело (Nanobody®) (как определено здесь) или его подходящий фрагмент. [Примечание: Nanobody®, Nanobodies® и Nanoclone® являются зарегистрированными торговыми марками фирмы Ablynx N.V.]. Такие нанотела, направленные против IL-6R, также будут именоваться "нанотелами изобретения".

Для общего описания нанотел сошлемся на нижеследующее описание, а также на приведенные здесь работы предшествующего уровня техники, напр., описанные в WO 08/020079 (стр. 16).

В одном специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80 либо участок аминокислотных остатков, имеющий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:80, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данный участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотных отличий, причем сродство измеряется методом плазменного резонанса.

В другом специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO's:84, 89 или 91; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84, 89 или 91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данный участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:84; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:84, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данный участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:93-94; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO:

93-94, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данный участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом плазмонного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или напотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:93; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:93, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данный участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или напотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:80; и по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:84, 89 и 91; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO:84, 89 и 91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:0; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:80; и по меньшей мере SEQ ID NO:84; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:84, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:80; и по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:93-94; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO:93-94, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:80; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:80; и по меньшей мере SEQ ID NO:93; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:93, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:84, 89 и 91; либо участок аминокислотных остатков содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO:84, 89 и 91; и по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:93-94; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO:93-94, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотных различий, причем сродство измеряется методом плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:84, 89 и 91; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO:84, 89 и 91; и по меньшей мере SEQ ID NO:93; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:93, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотных различий, причем сродство измеряется методом плазмонного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:84; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:84, и по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:93-94; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO:93-94, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотных различий, причем сродство измеряется методом плазмонного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:84; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:84; и по меньшей мере SEQ ID NO:93; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:93, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотных различий, причем сродство измеряется методом плазмонного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80 и SEQ ID NO:84.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80 и SEQ ID NO:93.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:84 и SEQ ID NO:93.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:80; и по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:84, 89 и 91; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO:84, 89 и 91; и по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:93-94; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO:93-94, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотных различий, причем сродство измеряется методом плазмонного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:80; и по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:84, 89 и 91; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO:84, 89 и 91; и по меньшей мере SEQ ID NO:93; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:93, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотных различий, причем сродство измеряется методом плазмонного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:80; и по меньшей мере SEQ ID NO:84; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:84; и по меньшей мере участок аминокислотных остатков, выбранный из SEQ ID NO:93-94; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO:93-94, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотных различий, причем сродство измеряется методом плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:80; и по меньшей мере SEQ ID NO:84; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:84; и по меньшей мере SEQ ID NO:93; либо участок аминокислотных остатков, содержащий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:93, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая данные участки аминокислотных остатков, связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данные участки аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотных различий, причем сродство измеряется методом плазменного резонанса.

В следующем специфическом аспекте аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:84 и SEQ ID NO:93.

Предпочтительные комбинации последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, определенные здесь для аминокислотных последовательностей изобретения, также представлены в табл.А-1.

В одном предпочтительном аспекте аминокислотные последовательности изобретения выбираются из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:60-69;

b) аминокислотных последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одной, двух или всех своих последовательностях CDR от одной из SEQ ID NO's:60-69, при условии, что аминокислотная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием в одной, двух или всех своих последовательностях CDR связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:60-69, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и

с) последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:60-69, при условии, что аминокислотная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием от одной из SEQ ID NO's:60-69 связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:60-69, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

В другом предпочтительном аспекте аминокислотные последовательности изобретения выбираются из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:65-69;

b) аминокислотных последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одной, двух или всех своих последовательностях CDR от одной из SEQ ID NO's:65-69, при условии, что аминокислотная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием в одной, двух или всех своих последовательностях CDR связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:65-69, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и

c) последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:65-69, при условии, что аминокислотная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием от одной из SEQ ID NO's:65-69 связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:65-69, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

В следующем предпочтительном аспекте аминокислотные последовательности изобретения выбираются из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO:66;

b) аминокислотных последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одной, двух или всех своих последовательностях CDR от SEQ ID NO:66, при условии, что аминокислотная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием в одной, двух или всех своих последовательностях CDR связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием SEQ ID NO:66, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и

с) последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:66, при условии, что аминокислотная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием от SEQ ID NO; 66 связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием SEQ ID NO:66, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

При сравнении двух участков аминокислотных остатков (или двух последовательностей CDR) термин "аминокислотное отличие в одном, двух или всех своих CDR" относится к вставке, делеции или замене одного аминокислотного остатка в одном положении участка аминокислотных остатков (или последовательности CDR), содержащегося в аминокислотной последовательности изобретения, определенной в пункте Ь), по сравнению с участком аминокислотных остатков (или последовательностью CDR), содержащимся в аминокислотной последовательности изобретения, определенной в пункте а); подразумевается, что два участка аминокислотных остатков (или две последовательности CDR) могут содержать одно или максимум два таких аминокислотных отличия.

Под "аминокислотным отличием в одном, двух или всех своих CDR" понимается то, что аминокислотная последовательность изобретения может иметь не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR1 и/или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR2 и/или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR3 по сравнению с CDR1, CDR2 и/или CDR3 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69); как-то не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR1 по сравнению с CDR1 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69); или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR2 по сравнению с CDR2 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69); или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR3 по сравнению с CDR3 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69); либо не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR1 по сравнению с CDR1 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69) и не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR2 по сравнению с CDR2 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69); или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR1 по сравнению с CDR1 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69) и не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR3 по сравнению с CDR3 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69); или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR2 по сравнению с CDR2 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69) и не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR3 по сравнению с CDR3 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69); либо не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR1 по сравнению с CDR1 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69), не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR2 по сравнению с CDR2 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69) и не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR3 по сравнению с CDR3 в одной из аминокислотных последовательностей из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69).

"Аминокислотное отличие в одном, двух или всех своих CDR" может представлять собой одну или максимум две замены, делеции или вставки в одном или нескольких участках CDR или любые их комбинации, которые либо улучшают свойства аминокислотной последовательности изобретения, либо по крайней мере не ухудшают (уменьшают) слишком сильно желательные свойства или баланс или сочетание желательных свойств аминокислотной последовательности изобретения. В этом отношении полученная аминокислотная последовательность изобретения должна по крайней мере связываться с IL-6R с таким же, примерно таким же или более высоким сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей один или несколько участков аминокислотных остатков без одной или максимум двух замен, делеции или вставок, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса. Полученные аминокислотные последовательности предпочтительно таковы, что они могут связываться со специфическим эпитопом на рецепторе IL-6 со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения KA (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или константы скорости koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено здесь. Полученные аминокислотные последовательности предпочтительно обладают активностью на клетках и активностью в плазме, как определено здесь.

В одном аспекте изобретения "аминокислотное отличие в одном, двух или всех своих CDR" представлено аминокислотной заменой. Аминокислотная замена может представлять собой одну или максимум две замены в одном или нескольких участках CDR, которые либо улучшают свойства аминокислотной последовательности изобретения, либо по крайней мере не слишком сильно ухудшают желательные свойства или баланс или сочетание желательных свойств аминокислотной последовательности изобретения. В этом отношении полученная аминокислотная последовательность изобретения должна по крайней мере связываться с IL-6R с таким же, примерно таким же или более высоким сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей один или несколько участков аминокислотных остатков без одной или максимум двух замен, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса. Полученные аминокислотные последовательности предпочтительно таковы, что они могут связываться со специфическим эпитопом на рецепторе IL-6 со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения kd (действительного или кажущегося), значения KA (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или константы скорости koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено здесь. Полученные аминокислотные последовательности предпочтительно обладают активностью на клетках и активностью в плазме, как определено здесь.

Как обсуждалось выше, аминокислотные замены в CDR могут представлять собой любые возможные замены, как-то "консервативные замены" (как определено выше), причем они могут совершаться по определенным правилам (как определено здесь) и/или могут вызывать улучшение свойств полученных аминокислотных последовательностей.

Изобретение также касается аминокислотных последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из (полных) последовательностей SEQ ID NO's:60-69.

При сравнении двух аминокислотных последовательностей термин "аминокислотное отличие" относится к вставке, делеции или замене одного аминокислотного остатка в одном положении первой аминокислотной последовательности по сравнению со второй аминокислотной последовательностью; подразумевается, что две аминокислотные последовательности могут содержать одно или максимум два таких аминокислотных отличия.

"Аминокислотное отличие" может представлять собой одну или максимум две замены, делеции или вставки в аминокислотной последовательности, т.е. в одном или нескольких каркасных участках или в одном или нескольких участках CDR или в любой комбинации из них, которые либо улучшают свойства аминокислотной последовательности изобретения, либо по крайней мере не слишком сильно ухудшают желательные свойства или баланс или сочетание желаемых желательных свойств аминокислотной последовательности изобретения. В этом отношении полученная аминокислотная последовательность изобретения должна по крайней мере связываться с IL-6R с таким же, примерно таким же или более высоким сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей один или несколько участков аминокислотных остатков без одной или максимум двух замен, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса. Полученные аминокислотные последовательности предпочтительно таковы, что они могут связываться со специфическим эпитопом на рецепторе IL-6 со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения KA (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или константы скорости koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено здесь. Полученные аминокислотные последовательности также предпочтительно обладают активностью на клетках и активностью в плазме, как определено здесь. Специалист сможет определить и отобрать подходящие замены, делеции или вставки либо подходящие их комбинации и определить их влияние на свойства полученной при этом аминокислотной последовательности.

В одном аспекте изобретения "аминокислотное отличие" является аминокислотной заменой. Аминокислотная замена может представлять собой одну или максимум две замены в одном или нескольких каркасных участках или в одном или нескольких участках CDR или в любой комбинации из них, которые либо улучшают свойства аминокислотной последовательности изобретения, либо по крайней мере не слишком сильно ухудшают желательные свойства или баланс или сочетание желаемых желательных свойств аминокислотной последовательности изобретения. В этом отношении полученная аминокислотная последовательность изобретения должна по крайней мере связываться с IL-6R с таким же, примерно таким же или более высоким сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей один или несколько участков аминокислотных остатков без одной или максимум двух замен, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса. Полученные аминокислотные последовательности предпочтительно таковы, что они могут связываться со специфическим эпитопом на рецепторе IL-6 со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения Ко (действительного или кажущегося), значения KD (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или константы скорости koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено здесь. Полученные аминокислотные последовательности предпочтительно обладают активностью на клетках и активностью в плазме, как определено здесь. Специалист сможет определить и отобрать подходящие замены, делеции или вставки либо подходящие их комбинации и определить их влияние на свойства полученной при этом аминокислотной последовательности.

Как указано выше, замены, вставки или делеции могут находиться в одном или нескольких каркасных участках и/или в одном или нескольких участках CDR. Как обсуждалось выше, аминокислотная замена в одной или нескольких CDR может представлять собой любую замену, как-то "консервативную замену" (как определено выше), может совершаться по определенным правилам (как определено здесь) и/или может вызывать улучшение свойств полученных аминокислотных последовательностей.

Когда такие замены, вставки или делеции производятся в одном или нескольких каркасных участках, они могут производиться по одному или нескольким остаткам Hallmark (напр., как определено в WO 08/020079; табл.от А-3 до А-8) и/или по одному или нескольким другим положениям в каркасных остатках, хотя замены, вставки или делеции по остаткам Hallmark обычно менее предпочтительны (если только это не подходящие гуманизирующие замены, как описано здесь). В качестве неограничительных примеров, замена может быть, к примеру, консервативной заменой (как описано здесь) и/или аминокислотный остаток может заменяться другим аминокислотным остатком, который естественным образом встречается в том же положении в другом домене VHH (см. WO 08/020079, табл.от А-5 до А-8), хотя изобретение обычно не ограничивается этим.

Замены, вставки или делеции, произведенные (предпочтительно) в одном или нескольких каркасных участках, могут представлять собой замены для оптимизации последовательности каркасных участков, такие, напр., как гуманизирующие замены. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные гуманизирующие замены (и их подходящие комбинации) станут известны специалистам из приведенного изложения. Потенциально полезные гуманизирующие замены могут быть установлены сравнением последовательности каркасных участков одной из аминокислотных последовательностей изобретения, приведенных в а), с соответствующей каркасной последовательностью одной или нескольких тесно связанных с ними последовательностей VH человека, после чего в данную аминокислотную последовательность изобретения, приведенную в а), может быть введена одна или несколько установленных при этом потенциально полезных гуманизирующих замен (или их комбинаций) (любым способом, известным per se, как описано далее), и полученная аминокислотная последовательность может быть проверена на сродство к IL-6R, на стабильность, легкость и уровень экспрессии и/или на другие желательные свойства, определенные здесь. Таким образом, путем ограниченного числа проб и ошибок, специалистами из приведенного изложения могут быть установлены другие подходящие гуманизирующие замены (или их подходящие комбинации).

В зависимости от организма хозяина, используемого для экспрессии аминокислотной последовательности, нанотела или полипептида изобретения, такие делеции и/или замены могут быть составлены и таким образом, чтобы удалить один или несколько сайтов для посттрансляционной модификации (как-то один или несколько сайтов гликозилирования), что должно быть в компетенции специалистов в этой области. С другой стороны, замены или вставки могут быть составлены так, чтобы ввести один или несколько сайтов для присоединения функциональных групп (как описано здесь), к примеру, для сайт-специфичного пегилирования (опять же как описано здесь).

Как можно видеть из данных по энтропии VHH и изменчивости VHH, приведенных в табл.от А-5 до А-8 WO 08/020079, некоторые аминокислотные остатки в каркасных участках более консервативны, чем другие. В общем, хотя изобретение в самом широком смысле и не ограничивается этим, любые замены, делеции или вставки предпочтительно производятся в менее консервативных положениях. Также аминокислотные замены в целом более предпочтительны, чем аминокислотные делеции или вставки.

Полученные аминокислотные последовательности изобретения или нанотела изобретения должны предпочтительно связываться с IL-6R с таким сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения Кд (действительного или кажущегося), скорости kon и/или скорости koff или же в виде значения IC50, как описано далее), что предпочтительно они:

- связываются с hIL-6 с константой диссоциации (Ко) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с hIL-6 с константой скорости kon от 104 M-1s-1 до 107 M-1s-1, предпочтительно от 105 M-1s-1 до 107 M-1s-1, более предпочтительно около 106 M-1s-1 или больше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости kon от 104 M-1s-1 до 107 M-1s-1, предпочтительно от 10 М-1s-1 до 107 M-1s-1, более предпочтительно около 106 M-1s-1 или больше;

и/или таким, что они:

- связываются с hIL-6 с константой скорости koff от 10-3 (t½=0,69 сек) до 10-1 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости koff от 10-3 s-1 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½, в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше.

Некоторые предпочтительные значения IC50 для связывания аминокислотных последовательностей изобретения с IL-6R станут понятными из дальнейшего описания и приведенных в нем примеров.

Активность и/или эффективность аминокислотных последовательностей и нанотел изобретения и содержащих их композиций можно протестировать любым подходящим методом in vitro, на клетках, in vivo и/или на животной модели, известным per se, или любыми их сочетаниями, в зависимости от конкретного заболевания или нарушения. Подходящие методы и модели на животных должны быть известны специалистам, они включают, к примеру, анализ пролиферации на IL-6-зависимых линиях клеток, включая TF-1, XG1 и 7TD1, модель индуцированного коллагеном артрита, модель трансплантации синовиальной ткани на мышах SCID, модели гетеротрансплантации различных видов рака человека, в том числе лимфомы, миеломы, рака простаты и почечно-клеточной карциномы, модели IBD, включая TNBS, модели на приматах (напр., такие, как описано в Shinkura et al., 1998, Anticancer Research 18: 1217-1222), модели артритных заболеваний на приматах, кроме человека (напр., как описано в Vierboom et al., 2008, Drug Discov. Today: Dis Model doi:10.1016/j.ddmod. 2008.06.003), а также методы и модели на животных, используемые в нижеследующей экспериментальной части и в приведенных там работах предшествующего уровня техники (Peake et al., 2006, Rheumatology 45: 1485-9; Wahid et al., 2000, Clin. Exp. ImmunoL, 122: 133-142; Matsuno et al., 1998, Arthritis and Rheumatism 41: 2014-2021; WO 08/020079).

Например, в методе TF-1, описанном Kitamura et al. (1989, J. Cell Physiol. 140: 323), аминокислотные последовательности изобретения или нанотела изобретения могут иметь значения IC50 (при 100 ME IL-6/мл) между 10 нМ и 50 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 50 пМ, более предпочтительно между 1 нМ и 50 пМ или меньше, как-то примерно 750 или 500 пМ или меньше. При определении этим методом TF-1 аминокислотные последовательности изобретения или нанотела изобретения могут иметь значения IC50 (при 5000 ME IL-6/мл) между 50 нМ и 10 нМ, предпочтительно между 25 нМ и 1 нМ, более предпочтительно между 10 нМ и 1 нМ или меньше, как-то 8 нМ или меньше. При определении этим методом TF-1 аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше раз по сравнению со значением IC50 полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4 (см. Пример 1). При определении этим методом TF-1 аминокислотные последовательности изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше раз по сравнению со значением IC50, полученным для Tocilizumab (MRA).

При определении методом активности в плазме при значениях EC50 для IL-6 (напр., в присутствии 27,29 нг IL-6/мл, как описано в Примере 45) аминокислотные последовательности изобретения или нанотела изобретения могут иметь значения IC50 между 500 пМ и 50 пМ, предпочтительно между 250 пМ и 50 пМ, более предпочтительно между 200 пМ и 50 пМ или меньше, как-то 150 пМ или меньше. При определении методом активности в плазме при значениях ЕС95 для IL-6 (напр., в присутствии 885 нг IL-6/мл, как описано в Примере 45) аминокислотные последовательности изобретения или нанотела изобретения могут иметь значения IC50 между 1000 пМ и 100 пМ, предпочтительно между 750 пМ и 100 пМ, более предпочтительно между 500 пМ и 100 пМ или меньше, как-то 400 пМ или меньше. При определении этим методом активности в плазме аминокислотные последовательности изобретения или нанотела изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше раз по сравнению со значением IC50, полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4 (см. Пример 1). При определении этим методом активности в плазме аминокислотные последовательности изобретения или нанотела изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше раз по сравнению со значением IC50, полученным для Tocilizumab (MRA).

При определении методом связывания с мембранным IL-6R на клетках СНО аминокислотные последовательности изобретения или нанотела изобретения могут иметь значения IC50 между 10 нМ и 100 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 100 пМ, более предпочтительно между 2 нМ и 10 пМ или меньше, как-то 2 нМ или меньше.

Как должно быть ясно из приведенного изложения, в объем изобретения также входит использование частей или фрагментов либо комбинаций из двух или нескольких частей или фрагментов аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения, как определено здесь, в частности, частей или фрагментов аминокислотных последовательностей SEQ ID NO's:60-69. Так, согласно одному из воплощений изобретения, термин "аминокислотная последовательность изобретения" или "нанотело изобретения" в самом широком смысле охватывает и такие части или фрагменты.

В общем, такие части или фрагменты аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения (включая их аналоги) имеют аминокислотные последовательности, в которых, по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующей полной аминокислотной последовательности или нанотела изобретения, один или несколько аминокислотных остатков на N-конце, один или несколько аминокислотных остатков на С-конце, один или несколько смежных внутренних аминокислотных остатков или любая из комбинация были подвергнуты делеции и/или удалены.

Части или фрагменты предпочтительно таковы, что они могут связываться со специфическим эпитопом на рецепторе IL-6 со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения Ко (действительного или кажущегося), значения KD (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или koff или же в виде значения IC50, как описано далее), как определено здесь.

В частности, аминокислотные последовательности, нанотела и их части или фрагменты предпочтительно таковы, что они:

- связываются с hIL-6 с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таковы, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таковы, что они:

- связываются с hIL-6 с константой скорости kon от 104 М-1s-1 до 107 М-1s-1, предпочтительно от 105 М-1s-1 до 107 М-1s-1, более предпочтительно около 106 M-1s-1 или больше;

и/или таковы, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости kon от 104 М-1s-1 до 107 M-1s-1, предпочтительно от 105 M-1s-1 до 107 M-1s-1, более предпочтительно около 106 M-1s-1 или больше;

и/или таковы, что они:

- связываются с hIL-6 с константой скорости koff от 10-3 s-1 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½, в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше;

и/или таковы, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости koff от 10-3 s-1 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше.

Сродство частей или фрагментов против рецептора IL-6 можно определить способом, известным per se, к примеру, описанным здесь методом измерения.

Любая часть или фрагмент предпочтительно таковы, что они содержат по меньшей мере 10 смежных аминокислотных остатков, предпочтительно по меньшей мере 20 смежных аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 30 смежных аминокислотных остатков, как-то по меньшей мере 40 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности соответствующей полноразмерной аминокислотной последовательности или нанотела изобретения.

Также, любая часть или фрагмент предпочтительно таковы, что они содержат по меньшей мере один CDR1, CDR2 и/или CDR3 или по меньшей мере его часть (в частности, по меньшей мере CDR3 или по меньшей мере его часть). Более предпочтительно любая часть или фрагмент таковы, что они содержат по меньшей мере один из CDR (предпочтительно по меньшей мере CDR3 или его часть) и по меньшей мере один другой CDR (т.е. CDR1 или CDR2) или по меньшей мере его часть, предпочтительно соединенные соответствующей каркасной последовательностью или по меньшей мере ее частью. Более предпочтительно любая часть или фрагмент таковы, что они содержат по меньшей один из CDR (предпочтительно по меньшей мере CDR3 или его часть) и по меньшей часть из двух оставшихся CDR, опять же предпочтительно соединенных соответствующей каркасной последовательностью или по меньшей мере ее частью.

В соответствии с другим особенно предпочтительным, но не ограничительным воплощением, такая часть или фрагмент содержит по меньшей мере CDR3, как-то FR3, CDR3 и FR4 соответствующего полноразмерного нанотела изобретения, к примеру, как описано в Международной заявке WO 03/050531 (Lasters et al.).

Как уже указывалось выше, также можно сочетать две или несколько таких частей или фрагментов (из тех же или различных аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения), т.е. получить дополнительные части или фрагменты (как определено здесь) аминокислотной последовательности или нанотела изобретения. Также, к примеру, можно сочетать одну или несколько частей или фрагментов аминокислотной последовательности или нанотела изобретения с одной или несколькими частями или фрагментами домена VH человека.

В соответствии с одним предпочтительным воплощением, части или фрагменты имеют последовательности, которые по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, как-то на 90%, 95% или 99% или больше идентичны одной из аминокислотных последовательностей или нанотел по SEQ ID NO's:60-69.

Части и фрагменты и кодирующие их последовательности нуклеотидов могут быть получены и необязательно скомбинированы любым способом, известным per se. Например, такие части или фрагменты могут быть получены вставкой стоп-кодона в нуклеиновую кислоту, кодирующую полноразмерную аминокислотную последовательность или нанотело изобретения, а затем экспрессируя полученную при этом нуклеиновую кислоту способом, известным per se (как описано здесь). С другой стороны, могут быть получены нуклеиновые кислоты, кодирующие такие части или фрагменты, при соответствующей рестрикции нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность или нанотело изобретения или синтезируя такую нуклеиновую кислоту способом, известным per se. Части или фрагменты также могут быть получены методами синтеза пептидов, известными per se.

Изобретение далее касается соединений или конструкций, содержащих или в основном состоящих из одной или нескольких аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения и необязательно к тому же содержащих одну или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания, необязательно соединенных через один или несколько линкеров. В предпочтительном аспекте данные одна или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания являются аминокислотными последовательностями. В другом предпочтительном аспекте данные один или несколько линкеров являются аминокислотными последовательностями. Такие соединения или конструкции также именуются как "полипептиды изобретения".

Полипептид изобретения может содержать аминокислотную последовательность или нанотело изобретения, слитые на его N-конце, С-конце или и на N-конце, и на С-конце по меньшей мере с еще одной аминокислотной последовательностью, получая таким образом слитый белок, содержащий данную аминокислотную последовательность или нанотело изобретения и еще одну или несколько аминокислотных последовательностей.

Одна или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей могут представлять собой любую подходящую и/или желательную аминокислотную последовательность. Дополнительная аминокислотная последовательность может изменить или не изменить, переделать или иным способом повлиять на (биологические) свойства аминокислотной последовательности или нанотела изобретения и может придать или не придать дополнительную функциональность аминокислотной последовательности, нанотелу или полипептиду изобретения. Предпочтительно, дополнительная аминокислотная последовательность такова, что она придает одно или несколько желательных свойств или функциональностей аминокислотной последовательности, нанотелу или полипептиду изобретения.

Примеры таких аминокислотных последовательностей должны быть известны специалистам и в общем могут содержать все аминокислотные последовательности, используемые при слиянии пептидов на основе обычных антител и их фрагментов (в том числе scFv's и однодоменные антитела). Сошлемся, к примеру, на обзор Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005).

Например, такой аминокислотной последовательностью может быть аминокислотная последовательность, которая увеличивает время полу-жизни, растворимость или поглощение, уменьшает иммуногенность или токсичность, устраняет или ослабляет нежелательные побочные эффекты и/или придает другие полезные свойства и/или уменьшает нежелательные свойства полипептидов изобретения по сравнению с аминокислотной последовательностью или нанотелом изобретении per se. Некоторые неограничительные примеры таких аминокислотных последовательностей представлены белками сыворотки, такими как сывороточный альбумин (к примеру, см. WO 00/27435) или молекулы гаптенов (например, гаптены, распознаваемые циркулирующими антителами, к примеру, см. WO 98/22141).

Дополнительные аминокислотные последовательности также могут обеспечить второй сайт связывания, который может быть направлен против любого нужного белка, полипептида, антигена, антигенной детерминанты или эпитопа (в том числе и того же белка, полипептида, антигена, антигенной детерминанты или эпитопа, против которых направлена аминокислотная последовательность или нанотело изобретения, либо другого белка, полипептида, антигена, антигенной детерминанты или эпитопа). К примеру, дополнительная аминокислотная последовательность может обеспечить второй сайт связывания, направленный против белка сыворотки (такого, к примеру, как сывороточный альбумин человека, или другого белка сыворотки, такого как IgG), что обеспечивает увеличение времени полужизни в сыворотке. Такие аминокислотные последовательности, к примеру, включают нанотела, а также небольшие пептиды и связывающие белки, описанные в WO 91/01743, WO 01/45746 и WO 02/076489, и dAb's, описанные в WO 03/002609 и WO 04/003019. Сошлемся также на Harmsen et al. (2005, Vaccine, 23 (41): 4926-42), а также на ЕР 0368684, как и на WO 08/028977, WO 08/043821, WO 08/043822 и WO 08/068280 от Ablynx N.V.

Предпочтительные аминокислотные последовательности, которые могут придавать аминокислотным последовательностям или нанотелам изобретения увеличенное время полужизни, могут быть выбраны из SEQ ID NO's:97-99.

Такие аминокислотные последовательности, в частности, могут быть направлены против сывороточного альбумина (в особенности сывороточного альбумина человека) и/или против IgG (в особенности IgG человека). Например, такими аминокислотными последовательностями могут быть аминокислотные последовательности, направленные против сывороточного альбумина (человека), и аминокислотные последовательности, способные связываться с теми аминокислотными остатками сывороточного альбумина (человека), которые не участвуют в связывании сывороточного альбумина с FcRn (к примеру, см. WO 06/0122787), и/или аминокислотные последовательности, способные связываться с теми аминокислотными остатками сывороточного альбумина, которые не входят в состав домена III сывороточного альбумина (опять же, к примеру, см. WO 06/0122787); аминокислотные последовательности, которые обеспечивают или могут обеспечить увеличение времени полужизни (к примеру, см. WO 08/028977); аминокислотные последовательности против сывороточного альбумина человека, которые могут перекрестно реагировать с сывороточным альбумином по меньшей мере одного из видов млекопитающих, в частности, по меньшей мере одного из видов приматов (как-то, без ограничения, обезьян из рода Масаса (в частности, длиннохвостой макаки (cynomolgus monkey, Масаса fascicularis) и/или макаки резус (Масаса mulatto)) и павиана (Papio ursinus), опять же сошлемся на WO 08/028977); аминокислотные последовательности, способные связываться с сывороточным альбумином независимо от рН (к примеру, см. WO 08/043821), и/или аминокислотные последовательности, которые являются условными связывающими молекулами (к примеру, см. WO 08/043822).

В соответствии с другим воплощением, одна или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей могут содержать одну или несколько частей, фрагментов или доменов обычных 4-цепочечных антител (в частности, антител человека) и/или тяжелой цепи антител. Например, хотя обычно это и менее предпочтительно, аминокислотная последовательность или нанотело изобретения может соединяться с обычным (предпочтительно человеческим) доменом VH или VL либо с естественным или синтетическим аналогом домена VH или VL, опять же необязательно через последовательность линкера (в том числе других (одно)доменных антител типа dAb's, описанных Ward et al.).

Соответственно, в соединении или конструкции изобретения данные одна или несколько групп, остатков, молекул или единиц связывания могут быть выбраны из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, подходящих для использования в качестве доменных антител, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, подходящих для использования в качестве однодоменных антител, антител "dAb", аминокислотных последовательностей, подходящих для использования в качестве "dAb", или нанотел.

В одном аспекте изобретения соединение, конструкция или полипептид изобретения, содержащие по меньшей мере одну аминокислотную последовательность или нанотело изобретения, могут иметь увеличенное время полужизни по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью или нанотелом изобретения. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры таких соединений, конструкций и полипептидов станут понятными специалистам из приведенного далее изложения, ими могут быть, к примеру, соединения, конструкции или полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, нанотела или полипептиды изобретения, подвергнутые химической модификации для увеличения их времени полужизни (к примеру, путем пегилирования); или полипептиды изобретения, содержащие по меньшей мере одну аминокислотную последовательность или нанотело изобретения, соединенные по меньшей мере с одной молекулой (в частности, по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью), увеличивающей время полужизни нанотел изобретения. Примеры соединений, конструкций или полипептидов изобретения, содержащих такие увеличивающие время полужизни молекулы или аминокислотные последовательности, станут известны специалистам из приведенного далее изложения; к примеру, они включают, без ограничения, полипептиды, в которых одна или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения соответствующим образом соединяются с одним или несколькими сывороточными белками или их фрагментами (как-то сывороточным альбумином или его подходящими фрагментами) или с одной или несколькими единицами связывания, способными связываться с белками сыворотки (как-то, к примеру, нанотела или (одно)доменные антитела, которые могут связываться с такими белками сыворотки, как сывороточный альбумин, сывороточные иммуноглобулины типа IgG или трансферрин); полипептиды, в которых аминокислотная последовательность или нанотело изобретения соединяется с Fc-частью (как-то Fc человека) или ее подходящей частью или фрагментом; или полипептиды, в которых одна или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения соответствующим образом соединяются с одним или несколькими небольшими белками или пептидами, способными связываться с белками сыворотки (как-то белки и пептиды, описанные в WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489).

По меньшей мере одна аминокислотная последовательность или нанотело также может соединяться с одним или несколькими (предпочтительно человеческими) доменами СН1, СН2 и/или CH3, не обязательно через последовательность линкера. Например, аминокислотная последовательность или нанотело, соединенные с подходящим доменом СН1, может использоваться, к примеру, вместе с подходящими легкими цепями, для получения фрагментов антител/структур, аналогичных обычным Fab-фрагментам или F(ab')2-фрагментам, но в которых одни или (в случае F(ab')2-фрагмента) оба обычных домена VH заменены аминокислотной последовательностью или нанотелом изобретения. Аминокислотные последовательности или нанотела также могут соединяться с доменом CH3 (необязательно через линкер) для получения конструкции с увеличенным временем полужизни in vivo.

В соответствии с одним специфическим аспектом полипептида изобретения, одна или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения могут соединяться (необязательно через подходящий линкер или шарнирный участок) с одним или несколькими константными доменами (к примеру, константными доменами 2 или 3, которые могут использоваться как часть или для образования Fc-части) с Fc-частью и/или одной или несколькими частями, фрагментами или доменами антител, придающими одну или несколько эффекторных функций полипептиду изобретения и/или способность связываться с одним или несколькими Fc-рецепторами. К примеру, для этой цели, и без ограничения, одна или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей могу содержать один или несколько доменов СН2 и/или СН3 антител, как-то антител из тяжелой цепи (как описано здесь), более предпочтительно из обычных 4-цепочечных антител человека; и/или могут составлять (часть) участка Fc, к примеру из IgG (напр., IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), из IgE или из другого Ig человека, как-то IgA, IgD или IgM. Например, в WO 94/04678 описана антитела из тяжелых цепей, содержащих домен VHH камелид или его гуманизированное производное (т.е. нанотело), в котором домен СН2 и/или СН3 камелид заменен на домены СН2 и СН3 человека, получая иммуноглобулин, состоящий из 2 тяжелых цепей, каждая из которых содержит нанотело и домены СН2 и CH3 человека (но не домен СН1), причем такой иммуноглобулин обладает эффекторными функциями, которые обеспечиваются доменами СН2 и СН3, и такой иммуноглобулин может функционировать в отсутствие легких цепей. Другие аминокислотные последовательности, которые могут быть подходящим образом связаны с аминокислотными последовательностями или нанотелами изобретения, чтобы обеспечить эффекторную функцию, должны быть известны специалистам и должны выбираться на основании требуемой эффекторной функции. Сошлемся, к примеру, на WO 04/058820, WO 99/42077, WO 02/056910 и WO 05/017148, а также на обзор Holliger and Hudson, supra; и на WO 09/068628). Соединение аминокислотной последовательности или нанотела изобретения с Fc-частью также может приводить к увеличению времени полужизни по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью или нанотелом изобретения. Для некоторых применений также может подойти или даже быть предпочтительным использование Fc-части и/или константных доменов (т.е. доменов СН2 и/или СН3), придающих увеличенное время полужизни без какой-либо биологически значимой эффекторной функции. Другие подходящие конструкции, содержащие одну или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел и один или несколько константных доменов с увеличенным временем полужизни in vivo, должны быть известны специалистам и могут содержать, к примеру, две или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел, связанных с доменом СН3, необязательно, через последовательность линкера. В общем случае любой слитый белок или производные с увеличенным временем полужизни должны предпочтительно иметь молекулярный вес более 50 кД, т.е. предела отсечения для почечного всасывания.

В другом специфическом, но не ограничительном аспекте для образования полипептида изобретения можно соединить одну или несколько аминокислотных последовательностей изобретения (необязательно через подходящий линкер или шарнирный участок) с природными, синтетическими или полусинтетическими константными доменами (либо их аналогами, вариантами, мутантами, частями или фрагментами), обладающими пониженной (или практически отсутствующей) тенденцией к самоорганизации в димеры (по сравнению с константными доменами, естественньм образом присутствующими в обычных 4-цепочечных антителах). Такие мономерные (т.е. не самоорганизующиеся) варианты Fc-цепи или ее фрагменты должны быть известны специалистам. Например, Helm et al. (1996, J. Biol. Chem. 271: 7494) описали мономерные варианты Fc-цепи, которые можно использовать в полипептидных цепях изобретения.

Также мономерные варианты Fc-цепи предпочтительно таковы, что они все еще способны связываться с комплементом или соответствующими Fc-рецепторами (в зависимости от Fc-части, из которой они происходят), и/или таковы, что они все еще обладают некоторыми или всеми эффекторными функциями Fc-части, из которой они происходят (или на пониженном уровне, все еще подходящем для предназначения). С другой стороны, в такой полипептидной цепи изобретения мономерная Fc-цепь может использоваться для придания увеличенного времени полужизни полипептидной цепи, при этом мономерная Fc-цепь может и не обладать или практически не обладать эффекторньми функциями.

В общем, аминокислотные последовательности или нанотела изобретения (или содержащие их соединения, конструкции или полипептиды) с увеличенным временем полужизни предпочтительно имеют время полужизни, которое по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, как-то по меньшей мере в 5 раз, к примеру, по меньшей мере в 10 раз или более чем 20 раз больше, чем время полужизни соответствующей аминокислотной последовательности или нанотела изобретения per se. Например, аминокислотные последовательности, нанотела, соединения, конструкции или полипептиды изобретения с увеличенным временем полужизни могут иметь время полужизни, которое увеличено более чем на 1 час, предпочтительно более чем на 2 часа, более предпочтительно на 6 часов, как-то более 12 часов или даже более 24, 48 или 72 часов по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью изобретения per se.

В предпочтительном, но не ограничительном аспекте изобретения такие аминокислотные последовательности, нанотела, соединения, конструкции и полипептиды изобретения проявляют время полужизни в сыворотке человека по меньшей мере 12 часов, предпочтительно по меньшей мере 24 часа, более предпочтительно по меньшей мере 48 часов, еще более предпочтительно по меньшей мере 72 часа или больше. К примеру, соединения или полипептиды изобретения могут иметь время полужизни по меньшей мере 5 дней (как-то от 5 до 10 дней), предпочтительно по меньшей мере 9 дней (как-то от 9 до 14 дней), более предпочтительно по меньшей мере 10 дней (как-то от 10 до 15 дней) или по меньшей мере 11 дней (как-то от 11 до 16 дней), более предпочтительно по меньшей мере 12 дней (как-то от 12 до 18 дней) или больше, чем 14 дней (как-то от 14 до 19 дней).

Дополнительная аминокислотная последовательность также могут составлять сигнальную последовательность или лидерную последовательность, которая направляет секрецию аминокислотной последовательности, нанотела или полипептида изобретения из клетки хозяина после синтеза (к примеру, чтобы обеспечить пре-, про- или препро-форму полипептида изобретения, в зависимости от клетки-хозяина, используемой для экспрессии полипептида изобретения).

Дополнительная аминокислотная последовательность также может составлять последовательность или сигнал, позволяющий аминокислотной последовательности, нанотелу или полипептиду изобретения быть направленным к и/или проникать или входить в определенные органы, ткани, клетки либо части или компартменты клеток, и/или позволяющие аминокислотной последовательности, нанотелу или полипептиду изобретения проникать или пересекать биологический барьер типа клеточной мембраны, клеточный слой типа слоя эпителиальных клеток, опухоли, включая твердые опухоли, или гематоэнцефалический барьер. Подходящие примеры таких аминокислотных последовательностей должны быть известны специалистам, к примеру, они включают, без ограничения, векторы "Peptrans", упомянутые выше, последовательности, описанные Cardinale et al., и аминокислотные последовательности и фрагменты антител, известные per se, которые можно использовать для экспрессирования или получения нанотел и полипептидов изобретения в виде так называемых "интрател" ("intrabodies"), например, как описано в WO 94/02610, WO 95/22618, US 7,004,940, WO 03/014960, WO 99/07414; WO 05/01690; EP 1512696; в Cattaneo A. and Biocca S. (1997, Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag) и в Kontermann (2004, Methods 34: 163-170), а также приведенных в них дополнительных ссылках.

В соответствии с одним предпочтительным, но не ограничительным воплощением, аминокислотная последовательность или нанотело изобретения содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислотную последовательность или нанотело, так что получается полипептид изобретения, содержащий по меньшей мере два, как-то два, три, четыре, пять или больше аминокислотных последовательностей или нанотел, в которых данные аминокислотные последовательности или нанотела могут необязательно соединяться через одну или несколько последовательностей линкеров (как определено здесь). Полипептиды изобретения, содержащие две или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения, из которых по меньшей мере одна является аминокислотной последовательностью или нанотелом изобретения, также именуются в дальнейшем как "мультивалентные" полипептиды изобретения, а аминокислотные последовательности или нанотела, присутствующие в таких полипептидах, также обозначаются в дальнейшем как находящиеся в "мультивалентном формате". Например, "двухвалентный' полипептид изобретения содержит две аминокислотные последовательности и/или два нанотела, необязательно соединенные через последовательность линкера, тогда как "трехвалентный" полипептид изобретения содержит три аминокислотные последовательности и/или нанотела, необязательно соединенные через две последовательности линкеров и т.д.; причем по меньшей мере одна из аминокислотных последовательностей и/или нанотел, присутствующих в полипептиде, и вплоть до всех аминокислотных последовательностей и/или нанотел, присутствующих в полипептиде, являются аминокислотными последовательностями и/или нанотелами изобретения.

В мультивалентном полипептиде изобретения две или несколько аминокислотных последовательностей или нанотел могут быть одинаковыми или различными и могут быть направлены против одного и того же антигена или антигенной детерминанты (к примеру, против одной и той же части или эпитопа или против различных частей или эпитопов) или же, наоборот, могут быть направлены против различных антигенов или антигенных детерминант или их комбинаций. К примеру, двухвалентный полипептид изобретения может содержать: (а) две идентичные аминокислотные последовательности или нанотела; (b) первую аминокислотную последовательность или первое нанотело, направленные против первой антигенной детерминанты белка или антигена, и вторую аминокислотную последовательность или второе нанотело, направленные против той же самой антигенной детерминанты данного белка или антигена, причем они отличаются от первой аминокислотной последовательности или первого нанотела; (с) первую аминокислотную последовательность или первое нанотело, направленные против первой антигенной детерминанты белка или антигена, и вторую аминокислотную последовательность или второе нанотело, направленные против другой антигенной детерминанты данного белка или антигена; или (d) первую аминокислотную последовательность или первое нанотело, направленные против первого белка или антигена, и вторую аминокислотную последовательность или второе нанотело, направленные против второго белка или антигена (т.е. отличающегося от данного первого антигена). Точно также трехвалентный полипептид изобретения может, к примеру и без ограничения, содержать: (а) три идентичные аминокислотные последовательности или нанотела; (b) две идентичные аминокислотные последовательности или два нанотела против первой антигенной детерминанты антигена и третью аминокислотную последовательность или третье нанотело, направленные против другой антигенной детерминанты того же самого антигена; (с) две идентичные аминокислотные последовательности или два напотела против первой антигенной детерминанты антигена и третью аминокислотную последовательность или третье нанотело, направленные против второго антигена, отличного от первого антигена; (d) первую аминокислотную последовательность или первое нанотело, направленные против первой антигенной детерминанты первого антигена, вторую аминокислотную последовательность или второе нанотело, направленные против второй антигенной детерминанты данного первого антигена, и третью аминокислотную последовательность или третье нанотело, направленные против второго антигена, отличающегося от первого антигена; или (е) первую аминокислотную последовательность или первое нанотело, направленные против первого антигена, вторую аминокислотную последовательность или второе нанотело, направленные против второго антигена, отличающегося от первого антигена, и третью аминокислотную последовательность или третье нанотело, направленные против третьего антигена, отличающегося от первого и второго антигенов.

Полипептиды изобретения, содержащие по меньшей мере две аминокислотные последовательности и/или два нанотела, в которых по меньшей мере одна аминокислотная последовательность или одно нанотело направлены против первого антигена (т.е. против рецептора IL-6) и по меньшей мере одна аминокислотная последовательность или одно нанотело направлены против второго антигена (т.е. отличающегося от рецептора IL-6), также именуются "мультиспецифичными" полипептидами изобретения, а аминокислотные последовательности или нанотела, присутствующие в таких полипептидах, также обозначаются как находящиеся в "мультиспецифичном формате". Так, к примеру, "биспецифичный" полипептид изобретения - это полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность или одно нанотело, направленные против первого антигена (т.е. рецептора IL-6), и по меньшей мере еще одну аминокислотную последовательность или еще одно нанотело, направленные против второго антигена (т.е. отличающегося от рецептора IL-6), тогда как "триспецифичный" полипептид изобретения - это полипептид, который содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность или одно нанотело, направленные против первого антигена (т.е. рецептора IL-6), по меньшей мере еще одну аминокислотную последовательность или еще одно нанотело, направленные против второго антигена (т.е. отличающегося от рецептора IL-6), и по меньшей мере еще одну аминокислотную последовательность или еще одно нанотело, направленные против третьего антигена (т.е. отличающегося и от рецептора IL-6, и от второго антигена), и т.д.

Соответственно, в самом простом виде, биспецифичный полипептид изобретения - это двухвалентный полипептид изобретения (как определено здесь), содержащий первую аминокислотную последовательность или первое нанотело, направленные против рецептора IL-6, и вторую аминокислотную последовательность или второе нанотело, направленные против второго антигена, причем данные первая и вторая аминокислотная последовательность или нанотело могут необязательно соединяться через последовательности линкеров (как определено здесь); тогда как триспецифичный полипептид изобретения в самом простом виде - это трехвалентный полипептид изобретения (как определено здесь), содержащий первую аминокислотную последовательность или первое нанотело, направленные против рецептора IL-6, вторую аминокислотную последовательность или второе нанотело, направленные против второго антигена, и третью аминокислотную последовательность или третье нанотело, направленные против третьего антигена, причем данные первая, вторая и третья аминокислотные последовательности или нанотела могут необязательно соединяться через последовательности одного или нескольких, предпочтительно одного и более предпочтительно двух линкеров.

В одном специфическом аспекте полипептид изобретения представляет собой трехвалентный биспецифичный полипептид. Трехвалентный, биспецифичный полипептид изобретения в его самом простом виде может представлять собой трехвалентный полипептид изобретения (как определено здесь), содержащий две идентичные аминокислотные последовательности или два нанотела против рецептора IL-6 и третью аминокислотную последовательность или третье нанотело, направленные против другого антигена, причем данные первая, вторая и третья аминокислотные последовательности или нанотела могут необязательно соединяться через последовательности одного или нескольких, предпочтительно одного и более предпочтительно двух линкеров.

В другом специфическом аспекте полипептид изобретения представляет собой биспецифичный полипептид. Биспецифичный полипептид изобретения в самом простом виде может представлять собой двухвалентный полипептид изобретения (как определено здесь), содержащий первую аминокислотную последовательность или первое нанотело против рецептора IL-6 и вторую аминокислотную последовательность или второе нанотело, направленные против другого антигена, причем данные первая и вторая аминокислотные последовательности или нанотела могут необязательно соединяться через последовательность линкера.

В предпочтительном, но не ограничительном примере мультиспецифичный полипептид изобретения содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательности или одно нанотело изобретения и по меньшей мере одно нанотело, которое обеспечивает увеличение времени полужизни. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры таких нанотел включают нанотела, направленные против белков сыворотки, таких как сывороточный альбумин человека, тироксинсвязывающий белок, трансферрин (человека), фибриноген, иммуноглобулины, как то IgG, IgE или IgM, либо один из других белков сыворотки, приведенных в WO 04/003019.

Например, для опытов на мышах могут использоваться нанотела против сывороточного альбумина мыши (MSA), тогда как для фармацевтического применения могут использоваться нанотела против сывороточного альбумина человека.

Следующее воплощение настоящего изобретения составляет полипептидная конструкция, как описано выше, в которой данный по меньшей мере один сывороточный белок (человека) представляет собой белок из числа сывороточного альбумина (человека), сывороточных иммуноглобулинов (человека), тироксинсвязывающего белка (человека) трансферрина (человека), фибриногена (человека) и т.д.

Соответственно, в специфическом аспекте полипептидом изобретения является трехвалентный, биспецифичный полипептид, содержащий две идентичные аминокислотные последовательности или два нанотела против рецептора IL-6 и третью аминокислотную последовательность или третье нанотело, направленные против сывороточного альбумина (человека), причем данные первая, вторая и третья аминокислотные последовательности или нанотела могут необязательно соединяться через последовательности одного или нескольких, предпочтительно одного и более предпочтительно двух линкеров.

В другом специфическом аспекте полипептидом изобретения является биспецифичный полипептид, содержащий первую аминокислотную последовательность или первое нанотело против рецептора IL-6 и вторую аминокислотную последовательность или второе нанотело, направленные против сывороточного альбумина (человека), причем данные первая, вторая и третья аминокислотные последовательности или нанотела могут необязательно соединяться через последовательность линкера.

В соответствии с одним специфическим, но не ограничительным аспектом изобретения полипептиды изобретения содержат, помимо одной или нескольких аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения, по меньшей мере одно нанотело против сывороточного альбумина человека. Хотя эти нанотела против сывороточного альбумина человека и могут быть такими, как в общем описано в приведенных выше заявках фирмы Ablynx N.V. (например, см. W04/062551), но в соответствии с особенно предпочтительным, но не ограничительным воплощением данные нанотела против сывороточного альбумина человека в основном состоят из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO's:97-99.

Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры полипептидов изобретения, содержащих по меньшей мере одну аминокислотную последовательность или одно нанотело против рецептора IL-6 и по меньшей мере одну аминокислотную последовательность или одно нанотело, обеспечивающие увеличение времени полужизни, следующие:

a) SEQ ID NO's:70-72;

b) полипептидные последовательности, имеющие не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех участках CDR изобретения от одной из SEQ ID NO's:70-72, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием в одном, двух или всех участках CDR изобретения связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:70-72, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса; и

c) полипептидные последовательности, имеющие не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:70-72, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием от одной из SEQ ID NO's:70-72 связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:70-72, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры трехвалентных биспецифичных полипептидов изобретения следующие:

a) SEQ ID NO's:71-72;

b) полипептидные последовательности, имеющие не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех участках CDR изобретения от одной из SEQ ID NO's:71-72, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием в одном, двух или всех участках CDR изобретения связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:70-72, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса; и

c) полипептидные последовательности, имеющие не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:71-72, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием от одной из SEQ ID NO's:71-72 связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:71-72, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры биспецифичных полипептидов изобретения, содержащих одну аминокислотную последовательность или одно нанотело против рецептора IL-6 и одну аминокислотную последовательность или одно нанотело, обеспечивающие увеличение времени полужизни, следующие:

a) SEQ ID NO:70;

b) полипептидные последовательности, имеющие не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех участках CDR изобретения от SEQ ID NO:70, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием в одном, двух или всех участках CDR изобретения связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием SEQ ID NO:70, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса, и

c) полипептидные последовательности, имеющие не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:70, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием от SEQ ID NO:70 связывается с IL-6R с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению со связыванием SEQ ID NO:70, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

При сравнении двух участков аминокислотных остатков (или двух последовательностей CDR) термин "аминокислотное отличие в одном, двух или всех участках CDR изобретения" относится к вставке, делеции или замене одного аминокислотного остатка в одном положении участка аминокислотных остатков (или последовательности CDR) изобретения, содержащегося в полипептиде изобретения, определенном в пункте b), по сравнению с участком аминокислотных остатков (или последовательностью CDR) изобретения, содержащимся в полипептиде изобретения, определенном в пункте а); подразумевается, что два участка аминокислотных остатков (или две последовательности CDR) изобретения могут содержать одно или максимум два таких аминокислотных отличия.

Под "аминокислотным отличием в одном, двух или всех участках CDR изобретения" понимается то, что аминокислотная последовательность или нанотело изобретения, содержащееся в полипептиде изобретения, может иметь не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR1 и/или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR2 и/или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR3 (т.е. в CDR1, CDR2 и/или CDR3, образующих антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR1, CDR2 и/или CDR3 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. одной из SEQ ID NO's:60-69); как-то не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR1 (т.е. в CDR1, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR1 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR1 в одной из SEQ ID NO's:60-69); или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR2 (т.е. в CDR2, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR2 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR2 в одной из SEQ ID NO's:60-69); или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR3 (т.е. в CDR3, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR3 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR3 в одной из SEQ ID NO's:60-69); либо не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR1 (т.е. в CDR1, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR1 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR1 в одной из SEQ ID NO's:60-69), и не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR2 (т.е. в CDR2, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR2 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR2 в одной из SEQ ID NO's:60-69); или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR1 (т.е. в CDR1, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR1 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR1 в одной из SEQ ID NO's:60-69), и не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR3 (т.е. в CDR3, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR3 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR3 в одной из SEQ ID NO's:60-69); или не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR2 (т.е. в CDR2, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR2 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR2 в одной из SEQ ID NO's:60-69), и не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR3 (т.е. в CDR3, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR3 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR3 в одной из SEQ ID NO's:60-69); либо не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR1 (т.е. в CDR1, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR1 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR1 в одной из SEQ ID NO's:60-69), и не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR2 (т.е. в CDR2, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR2 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR2 в одной из SEQ ID NO's:60-69), и не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в своем CDR3 (т.е. в CDR3, образующем антигенсвязывающий сайт для связывания соединения или полипептида изобретения со специфическим эпитопом на IL-6R) по сравнению с CDR3 в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, содержащемся в одном из полипептидов из а) (т.е. CDR3 в одной из SEQ ID NO's:60-69).

"Аминокислотное отличие в одном, двух или всех своих CDR" может представлять собой одну или максимум две замены, делеции или вставки в одном или нескольких участках CDR изобретения или любые их комбинации, которые либо улучшают свойства соединения или полипептида изобретения, либо по крайней мере не слишком сильно ухудшают (уменьшают) желательные свойства или баланс или сочетание желательных свойств соединения или полипептида изобретения. В этом отношении полученное соединение или полипептид изобретения должен по крайней мере связываться с IL-6R с таким же, примерно таким же или более высоким сродством по сравнению с соединением или полипептидом, содержащей один или несколько участков CDR изобретения без одной или максимум двух замен, делений или вставок, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса. Полученные соединения или полипептиды предпочтительно таковы, что они могут связываться со специфическим эпитопом на рецепторе IL-6 со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения Кд (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или константы скорости koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено здесь. Полученные соединения или полипептиды также предпочтительно обладают активностью на клетках и активностью в плазме, как определено здесь.

В одном аспекте изобретения "аминокислотное отличие в одном, двух или всех своих CDR" представлено аминокислотной заменой. Аминокислотная замена может представлять собой одну или максимум две замены в одном или нескольких участках CDR, которые либо улучшают свойства соединения или полипептида изобретения, либо по крайней мере не слишком сильно ухудшают (уменьшают) желательные свойства или баланс или сочетание желательных свойств соединения или конструкции изобретения. В этом отношении полученное соединение или полипептид изобретения должны по крайней мере связываться с IL-6R с таким же, примерно таким же или более высоким сродством по сравнению с соединением или конструкцией, содержащей один или несколько участков CDR без одной или максимум двух замен, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса. Полученные соединения или полипептиды предпочтительно таковы, что они могут связываться со специфическим эпитопом на рецепторе IL-6 со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KA (действительного или кажущегося), значения KD (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или константы скорости koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено здесь. Полученные соединения или полипептиды также предпочтительно обладают активностью на клетках и активностью в плазме, как определено здесь. Специалист в общем сможет определить и отобрать подходящие замены на основании приведенного изложения и необязательно после ограниченного числа простых экспериментов, которые могут, к примеру, включать введение ограниченного числа возможных замен и определение их влияния на свойства полученных при этом соединений или полипептидов.

Аминокислотные замены в одном или нескольких CDR изобретения могут представлять собой любые возможные замены, как-то "консервативные замены" (как определено выше), причем они могут совершаться по определенным правилам (как определено здесь) и/или могут вызывать улучшение свойств полученных соединений или полипептидов (как определено далее).

Изобретение также касается соединений или полипептидов, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из (полных) последовательностей SEQ ID NO's:70-72.

При сравнении двух соединений или полипептидов термин "аминокислотное отличие" относится к вставке, делеции или замене одного аминокислотного остатка в одном положении первого соединения или полипептида по сравнению со вторым соединением или полипептидом; подразумевается, что два соединения или полипептида могут содержать одно или максимум два таких аминокислотных отличия.

"Аминокислотное отличие" может представлять собой одну или максимум две замены, делеции или вставки в соединении или полипептиде, т.е. в одном или нескольких каркасных участках или в одном или нескольких участках CDR (которыми могут быть CDR изобретения, т.е. находящиеся в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, или другие CDR, т.е. находящиеся в SEQ ID NO:98), в последовательности линкера или любой их комбинации, которые либо улучшают свойства аминокислотной последовательности изобретения, либо по меньшей мере не слишком сильно ухудшают (уменьшают) желательные свойства или баланс или комбинацию желательных свойств соединения или полипептида изобретения. В этом отношении полученное соединение или полипептид изобретения должны по крайней мере связываться с рецептором IL-6 с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с соединением или полипептидом без одной или максимум двух замен, делеции или вставок, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса. Полученные соединения или полипептиды предпочтительно таковы, что они могут связываться со специфическим эпитопом на рецепторе IL-6 со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения KA (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или константы скорости koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено здесь. Полученные соединения или полипептиды также предпочтительно обладают активностью на клетках и активностью в плазме, как определено здесь.

В одном аспекте изобретения "аминокислотное отличие" представляет собой аминокислотную замену. Аминокислотная замена может представлять собой одну или максимум две замены в каркасных участках, в одном или нескольких участках CDR (которыми могут быть CDR изобретения, т.е. находящиеся в аминокислотной последовательности или нанотеле изобретения, или другие CDR, т.е. находящиеся в SEQ ID NO:98), в последовательности линкера или любой их комбинации, которые либо улучшают свойства аминокислотной последовательности изобретения, либо по меньшей мере не слишком сильно ухудшают (уменьшают) желательные свойства или баланс или комбинацию желательных свойств соединения или полипептида изобретения. В этом отношении полученное соединение или полипептид изобретения должны по крайней мере связываться с рецептором IL-6 с таким же, примерно таким же или большим сродством по сравнению с соединением или полипептидом без одной или максимум двух замен, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса. Полученные соединения или полипептиды предпочтительно таковы, что они могут связываться со специфическим эпитопом на рецепторе IL-6 со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения KA (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или константы скорости koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено здесь. Полученные соединения или полипептиды также предпочтительно обладают активностью на клетках и активностью в плазме, как определено здесь.

Как указано выше, замены, вставки или делеции могут находиться в одном или нескольких каркасных участках, в одном или нескольких участках CDR и/или в одной или нескольких последовательностях линкеров. Замены, вставки или делеции в CDR могут представлять собой любые возможные замены, вставки или делеции, как-то "консервативные замены" (как определено здесь), они могут совершаться по определенным правилам (как определено здесь) и/или могут вызывать улучшение свойств полученных соединений или полипептидов.

Когда такие замены, вставки или делеции производятся в одном или нескольких каркасных участках, они могут представлять собой любые возможные замены, вставки или делеции. Они могут производиться по одному или нескольким остаткам Hallmark (напр., как определено в WO 08/020079; табл.от А-3 до А-8) и/или по одному или нескольким другим положениям в каркасных остатках, хотя замены, вставки или делеции по остаткам Hallmark обычно менее предпочтительны (если только это не подходящие гуманизирующие замены, как описано здесь). В качестве неограничительных примеров, замена может быть, к примеру, консервативной заменой (как описано здесь) и/или аминокислотный остаток может заменяться другим аминокислотным остатком, который естественным образом встречается в том же положении в другом домене VHH (см. WO 08/020079, табл.от А-5 до А-8), хотя изобретение обычно не ограничивается этим.

Замены, вставки или делеции, произведенные (предпочтительно) в одном или нескольких каркасных участках, могут представлять собой замены для оптимизации последовательности, такие, напр., как гуманизирующие замены. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные гуманизирующие замены (и их подходящие комбинации) станут понятны специалистам из приведенного изложения. Потенциально полезные гуманизирующие замены могут быть установлены сравнением последовательности каркасных участков одной из аминокислотных последовательностей или нанотел изобретения, содержащихся в одном из полипептидов изобретения, приведенных в а), с соответствующей каркасной последовательностью одной или нескольких тесно связанных с ними последовательностей VH человека, после чего в данную аминокислотную последовательность или нанотело изобретения, содержащееся в одном из полипептидов изобретения, приведенных в а), может быть введена одна или несколько установленных при этом потенциально полезных гуманизирующих замен (или их комбинаций) (любым способом, известным per se, как описано далее), и полученная аминокислотная последовательность может быть проверена на сродство к IL-6R, на стабильность, легкость и уровень экспрессии и/или на другие желательные свойства, определенные здесь. Таким образом, путем ограниченного числа проб и ошибок, специалистами из приведенного изложения могут быть установлены другие подходящие гуманизирующие замены (или их подходящие комбинации).

В зависимости от организма хозяина, используемого для экспрессии соединения или полипептида изобретения, такие делеции и/или замены могут быть составлены и таким образом, чтобы удалить один или несколько сайтов для посттрансляционной модификации (как-то один или несколько сайтов гликозилирования), что должно быть в компетенции специалистов в этой области. С другой стороны, замены или вставки могут быть составлены так, чтобы ввести один или несколько сайтов для присоединения функциональных групп (как описано здесь), к примеру, для сайт-специфичного пегилирования (опять же как описано здесь).

Как можно видеть из данных по энтропии VHH и изменчивости VHH, приведенных в табл.от А-5 до А-8 WO 08/020079, некоторые аминокислотные остатки в каркасных участках более консервативны, чем другие. В общем, хотя изобретение в самом широком смысле и не ограничивается этим, любые замены, делеции или вставки предпочтительно производятся в менее консервативных положениях. Также аминокислотные замены в целом более предпочтительны, чем аминокислотные делении или вставки.

Полученные соединения изобретения или полипептиды изобретения должны предпочтительно связываться с IL-6R с таким сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения Ко (действительного или кажущегося), значения KD (действительного или кажущегося), скорости kon и/или скорости koff или же в виде значения IC50, как описано далее), что предпочтительно они:

- связываются с hIL-б с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с hIL-6 с константой скорости kon от 104 M-1s-1 до 107 M-1s-1, предпочтительно от 105 М-1s-1 до 107 M-1s-1, более предпочтительно около 106 M-1s-1 или больше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости kon от 104 М-1s-1 до 107 М-1s-1, предпочтительно от 105 М-1s-1 до 107 М-1s-1, более предпочтительно около 106 M-1s-1 или больше;

и/или таким, что они:

- связываются с hIL-6 с константой скорости koff от 10-3 s-1 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше;

и/или таким, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости koff от 10-3 s-1 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше.

Некоторые предпочтительные значения IC50 для связывания соединений и полипептидов изобретения с IL-6R станут понятными из дальнейшего описания и приведенных в нем примеров.

Активность и/или эффективность полипептидов и соединений изобретения и содержащих их композиций можно протестировать любым подходящим методом in vitro, на клетках, in vivo и/или на животной модели, известным per se, или любыми их сочетаниями, в зависимости от конкретного заболевания или нарушения. Подходящие методы и модели на животных должны быть известны специалистам, они включают, к примеру, анализ пролиферации на IL-6-зависимых линиях клеток, включая TF-1, XG1 и 7TD1, модель индуцированного коллагеном артрита, модель трансплантации синовиальной ткани на мышах SCID, модели гетеротрансплантации различных видов рака человека, в том числе лимфомы, миеломы, рака простаты и почечно-клеточной карциномы, модели IBD, включая TNBS, модели на приматах (напр., такие, как описано в Shinkura et al., 1998, Anticancer Research 18: 1217-1222), модели артритных заболеваний на приматах, кроме человека (напр., как описано в Vierboom et al., 2008, Drug Discov. Today: Dis Model doi:10.1016/j.ddmod. 2008.06.003), а также методы и модели на животных, используемые в нижеследующей экспериментальной части и в приведенных там работах предшествующего уровня техники (Peake et al., 2006, Rheumatology 45: 1485-9; Wahid et al., 2000, Clin. Exp. Immunol., 122: 133-142; Matsuno et al., 1998, Arthritis and Rheumatism 41: 2014-2021; WO 08/020079).

Например, в методе TF-1, описанном Kitamura et al. (1989, J. Cell Physiol. 140: 323), соединения изобретения или полипептиды изобретения могут иметь значения IC50 (при 100 ME IL-6/мл) между 10 нМ и 50 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 50 пМ, более предпочтительно между 1 нМ и 50 пМ или меньше, как-то примерно 750 или 500 пМ или меньше. При определении этим методом TF-1 аминокислотные последовательности изобретения или нанотела изобретения могут иметь значения IC50 (при 5000 ME IL-6/мл) между 50 нМ и 10 нМ, предпочтительно между 25 нМ и 1 нМ, более предпочтительно между 10 нМ и 1 нМ или меньше, как-то 8 нМ или меньше. При определении этим методом TF-1 соединения изобретения или полипептиды изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше раз по сравнению со значением IC50, полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4 (см. Пример 1). При определении этим методом TF-1 соединения изобретения или полипептиды изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше раз по сравнению со значением IC50, полученным для Tocilizumab (MRA).

При определении методом активности в плазме при значениях ЕС50 для IL-6 (напр., в присутствии 27,29 нг IL-6/мл, как описано в Примере 45) соединения изобретения или полипептиды изобретения могут иметь значения IC50 между 500 пМ и 50 пМ, предпочтительно между 250 пМ и 50 пМ, более предпочтительно между 200 пМ и 50 пМ или меньше, как-то 150 пМ или меньше. При определении методом активности в плазме при значениях ЕС95 для IL-6 (напр., в присутствии 885 нг IL-6/мл, как описано в Примере 45) соединения изобретения или полипептиды изобретения могут иметь значения IC50 между 1000 пМ и 100 пМ, предпочтительно между 750 пМ и 100 пМ, более предпочтительно между 500 пМ и 100 пМ или меньше, как-то 400 пМ или меньше. При определении этим методом активности в плазме соединения изобретения или полипептиды изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше раз по сравнению со значением IC50, полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4 (см. Пример 1). При определении этим методом активности в плазме соединения изобретения или полипептиды изобретения могут иметь значения IC50, которые по крайней мере такие же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше раз по сравнению со значением IC50, полученным для Tocilizumab (MRA).

При определении методом связывания с мембранным IL-6R на клетках СНО соединения изобретения или полипептиды изобретения могут иметь значения IC50 между 10 нМ и 100 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 100 пМ, более предпочтительно между 2 нМ и 10 пМ или меньше, как-то 2 нМ или меньше.

В предпочтительном аспекте соединение или полипептид изобретения содержит или в основном состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:70. В другом предпочтительном аспекте соединение или полипептид изобретения содержит или в основном состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:71. Полипептиды с такими аминокислотными последовательностями проявляют улучшенные свойства, такие, напр., как лучшее связывание и/или сродство, лучшая авидность, лучшая эффективность и активность и/или большая избирательность, наряду с их способностью частично или полностью блокировать взаимодействие IL-6/IL-6R и/или ингибировать сигнализирование через IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R.

Изобретение также касается моновалентных конструкций (также именуемых "моновалентными конструкциями изобретения"), содержащих или в основном состоящих из одной аминокислотной последовательности или нанотела изобретения. Предпочтительные моновалентные конструкции изобретения содержат или в основном состоят из SEQ ID NO's:60-69, как-то SEQ ID NO's:65-69, к примеру, SEQ ID NO:66. Такие моновалентные конструкции, а также аминокислотные последовательности и нанотела изобретения могут использоваться для получения соединений или полипептидов изобретения, таких, напр., как мультивалентные и/или мультиспецифичные соединения или полипептиды изобретения.

Соответственно, настоящее изобретение также касается применения аминокислотных последовательностей, нанотел или моновалентных конструкций изобретения для получения соединений, конструкций или полипептидов изобретения. Изобретение также касается способа получения соединений, конструкций или полипептидов изобретения, включающего связывание аминокислотной последовательности, нанотела или моновалентной конструкции изобретения с одной или несколькими другими группами, остатками, молекулами и единицами связывания. Такой способ может включать связывание аминокислотной последовательности, нанотела или моновалентной конструкции изобретения с одной или несколькими другими группами, остатками, молекулами и единицами связывания через один или несколько линкеров.

В предпочтительном аспекте одна или несколько других групп, остатков, молекул и единиц связывания представляют собой единицы связывания, как-то аминокислотные последовательности или нанотела. Соответственно, настоящее изобретение также касается применения аминокислотных последовательностей, нанотел или моновалентных конструкций изобретения для получения мультивалентных и/или мультиспецифичных соединений, конструкций или полипептидов изобретения. Изобретение также касается способа получения мультивалентных и/или мультиспецифичных соединений, конструкций или полипептидов изобретения, включающего связывание аминокислотной последовательности, нанотела или моновалентной конструкции изобретения с одной или несколькими другими единицами связывания типа аминокислотных последовательностей или нанотел. Такой способ может включать связывание аминокислотной последовательности, нанотела или моновалентной конструкции изобретения с одной или несколькими единицами связывания через один или несколько линкеров.

В специфическом аспекте настоящее изобретение также касается применения моновалентных конструкций, содержащих или в основном состоящих из одной из SEQ ID NO's:60-69 (предпочтительно SEQ ID NO's:65-69, более предпочтительно SEQ ID NO:66), для получения мультивалентных и/или мультиспецифичных соединений, конструкций или полипептидов изобретения. Изобретение также касается способа получения мультивалентных и/или мультиспецифичных соединений, конструкций или полипептидов изобретения, включающего связывание моновалентной конструкции, содержащей или в основном состоящей из одной из SEQ ID NO's:60-69 (предпочтительно SEQ ID NO's:65-69, более предпочтительно SEQ ID NO:66), с одной или несколькими единицами связывания типа аминокислотных последовательностей или нанотел. Такой способ может включать связывание моновалентной конструкции, содержащей или в основном состоящей из SEQ ID NO's:60-69 (предпочтительно SEQ ID NO's:65-69, более предпочтительно SEQ ID NO:66), с одной или несколькими единицами связывания через один или несколько линкеров.

В другом специфическом аспекте настоящее изобретение касается применения моновалентных конструкций, содержащих или в основном состоящих из одной из SEQ ID NO's:60-69 (предпочтительно SEQ ID NO's:65-69, более предпочтительно SEQ ID NO:66), для получения мультивалентных и/или мультиспецифичных соединений, конструкций или полипептидов, содержащих или в основном состоящих из SEQ ID NO's:70-72 (предпочтительно SEQ ID NO's:70-71, более предпочтительно SEQ ID NO:70 или SEQ ID NO:71). Изобретение также касается способа получения мультивалентных и/или мультиспецифичных соединений, конструкций или полипептидов, содержащих или в основном состоящих из SEQ ID NO's:70-72 (предпочтительно SEQ ID NO's:70-71, более предпочтительно SEQ ID NO:70 или SEQ ID NO:71), включающего связывание моновалентной конструкции, содержащей или в основном состоящей из одной из SEQ ID NO's:60-69 (предпочтительно SEQ ID NO's:65-69, более предпочтительно SEQ ID NO:66), с аминокислотной последовательностью, содержащей или в основном состоящей из SEQ ID NO's:98, через один или несколько линкеров.

Подходящие для мультивалентных и/или мультиспецифичных полипептидов спейсеры или линкеры должны быть известны специалистам и в общем могут представлять собой любые линкеры или спейсеры, используемые в данной области для соединения аминокислотных последовательностей. Предпочтительно такой линкер или спейсер подходит для использования при конструировании белков или полипептидов, предназначенных для фармацевтического применения.

Некоторые особенно предпочтительные спейсеры включают спейсеры и линкеры, используемые в данной области для соединения фрагментов антител или доменов антител. Они включают линкеры, указанные в приведенных выше работах предшествующего уровня техники, а также, к примеру, линкеры, используемые в данной области для конструирования диател или фрагментов scFv (в этом отношении, однако, следует отметить, что поскольку используемые в диателах и фрагментах scFv последовательности линкеров должны иметь такую длину, степень подвижности и другие свойства, которые позволяют подходящим доменам VH and VL соединяться с образованием полного антигенсвязывающего сайта, то нет никаких особых ограничений для длины или подвижности используемого в полипептиде изобретения линкера, так как каждая аминокислотная последовательность или нанотело сами по себе образуют полный антигенсвязывающий сайт.

Например, линкерами могут быть любые подходящие аминокислотные последовательности, в частности, аминокислотные последовательности, состоящие из 1-50, предпочтительно 1-30, как-то 1-20 или 1-10 аминокислотных остатков. Некоторые предпочтительные примеры таких аминокислотных последовательностей включают линкеры Gly-Ser, к примеру, типа (GlyxSery)z, как-то (Gly4Ser)3 или (Gly3Ser2)3, как описано в WO 99/42077, шарнироподобные участки типа шарнирных участков природных антител из тяжелой цепи или аналогичные последовательности (типа описанных в WO 94/04678).

Некоторые другие особенно предпочтительные линкеры - это полиаланины (типа ААА), а также линкеры, приведенные в табл.В-8, из которых особенно предпочтительны ААА, GS-7 и GS-9.

Другие подходящие линкеры обычно содержат органические соединения или полимеры, в частности те, которые подходят для использования в белках для фармацевтического применения. Например, для связывания доменов антител применялись молекулы полиэтиленгликоля, к примеру, см. WO 04/081026.

В рамках изобретения предусматривается, что длина, степень подвижности и/или другие свойства используемых линкеров (хотя они и не критичны, как это бывает у линкеров, используемых во фрагментах scFv) могут иметь некоторое влияние на свойства конечного полипептида изобретения, в том числе на сродство, специфичность или авидность к рецептору IL-6 или к одному или нескольким другим антигенам. Из приведенного изложения специалист сможет определить оптимальные линкеры для конкретных полипептидов изобретения, необязательно после некоторого числа простых экспериментов.

В рамках изобретения также предусматривается, что используемые линкеры придают полипептидам изобретения одно или несколько благоприятных свойств или функциональностей и/или обеспечивают один или несколько сайтов для образования производных и/или для присоединения функциональных групп (напр., как описано здесь для производных аминокислотных последовательностей, нанотел, соединений и полипептидов изобретения). Например, линкеры, содержащие один или несколько заряженных аминокислотных остатков, могут обеспечить улучшение гидрофильных свойств, тогда как линкеры, образующие или содержащие небольшие эпитопы или тэги (метки), могут использоваться для детектирования, идентификации и/или очистки. Опять же, из приведенного изложения специалист сможет определить оптимальные линкеры для конкретных полипептидов изобретения, необязательно после некоторого числа простых экспериментов.

Наконец, если в полипептидах изобретения используется два или несколько линкеров, то они могут быть одинаковыми или разными. Опять же, из приведенного изложения специалист сможет определить оптимальные линкеры для конкретных полипептидов изобретения, необязательно после некоторого числа простых экспериментов.

Как правило, для легкости экспрессии и продукции полипептид изобретения должен быть линейным полипептидом. Однако изобретение в самом широком смысле этим не ограничивается. Например, если полипептид изобретения содержит три или больше аминокислотных последовательностей или нанотел, возможно связать их при помощи линкера с тремя или более "плечами", причем каждое "плечо" соединяется с аминокислотной последовательностью или нанотелом с образованием "звездчатой" конструкции. Также возможно, хотя обычно это менее предпочтительно, использовать кольцевые конструкции.

Изобретение в самом широком смысле также включает производные аминокислотных последовательностей, нанотел, соединений или полипептидов изобретения. Такие производные в общем могут быть получены путем модификации, в частности химической и/или биологической (напр., энзиматической) модификации, аминокислотных последовательностей, нанотел, соединений или полипептидов изобретения и/или одного или нескольких аминокислотных остатков, образующих аминокислотные последовательности, нанотела, соединения или полипептиды изобретения.

Примеры таких модификаций, а также примеры аминокислотных остатков внутри аминокислотных последовательностей, последовательностей нанотел, соединений или полипептидов, которые можно модифицировать таким образом (либо на белковом остове, либо, предпочтительно, на боковой цепи), способов и методик, которые можно использовать для введения таких модификаций, и возможные применения и преимущества таких модификаций должны быть известны специалистам.

Например, такая модификация может включать введение (напр., посредством ковалентной связи или любым другим подходящим способом) одной или нескольких функциональных групп, остатков или молекул в аминокислотную последовательность, нанотело, соединение или полипептид изобретения, в частности, одной или нескольких функциональных групп, остатков или молекул, придающих одно или несколько желательных свойств или функциональностей аминокислотной последовательности, нанотелу, соединению или полипептиду изобретения. Примеры таких функциональных групп должны быть известны специалистам.

Например, такая модификация может включать введение (напр., посредством ковалентной связи или любым другим подходящим способом) одной или нескольких функциональных групп, увеличивающих время полужизни, растворимость и/или поглощение аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения, уменьшающих иммуногенность и/или токсичность аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения, устраняющих или ослабляющих любые нежелательные побочные эффекты аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения и/или придающих другие предпочтительные свойства и/или уменьшающих нежелательные свойства аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения; или любые комбинации из двух или нескольких вышеупомянутых. Примеры таких функциональных групп и методик для их введения должны быть известны специалистам и в общем могут включать все функциональные группы и методики, указанные в работах предшествующего уровня техники, приведенных выше, а также функциональные группы и методики, известные per se для модификации фармацевтических белков, в частности, для модификации антител или фрагментов антител (включая scFv и однодоменные антитела), в отношении которых сошлемся, к примеру, на Remington's Pharmaceutical Sciences (1980, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA). Такие функциональные группы могут, к примеру, соединяться непосредственно (например, ковалентно) с аминокислотной последовательностью, нанотелом, соединением или полипептидом изобретения, или необязательно через подходящий линкер или спейсер, как это опять же должно быть известны специалистам.

Один из наиболее широко используемых методов для увеличения времени полужизни и/или снижения иммуногенности фармацевтических белков включает присоединение подходящего фармакологически приемлемого полимера типа полиэтиленголиколя (PEG) или его производных (типа метоксиполиэтиленгликоля или mPEG). В общем, можно использовать любые подходящие формы пегилирования, как-то пегилирование, применяемое для антител и фрагментов антител (в том числе (одно)доменных антител и scFv's); сошлемся, к примеру, на Chapman (2002, Nat. Biotechnol., 54: 531-545); Veronese and Harris (2003, Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456), Harris and Chess (2003, Nat. Rev. Drug. Discov., 2: 214-21) и на WO 04/060965. Различные реагенты для пегилирования белков также коммерчески доступны, к примеру, от Nektar Therapeutics, USA.

Предпочтительно применяется направленное пегилирование, в частности, через остаток цистеина (к примеру, см. Yang et al. (2003, Protein Engineering, 16 (10): 761-770). Например, для этой цели можно присоединить PEG к природному остатку цистеина в аминокислотной последовательности, нанотеле, соединении или полипептиде изобретения, можно модифицировать аминокислотную последовательность, нанотело, соединение или полипептид изобретения так, чтобы было удобно ввести один или несколько остатков цистеина для присоединения PEG, или же слить аминокислотную последовательность, содержащую один или несколько остатков цистеина для присоединения PEG, с N- и/или С-концом аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения, причем все применяемые методы белковой инженерии известны per se специалистам.

Предпочтительно для аминокислотных последовательностей, нанотел, соединений или полипептидов изобретения используется PEG с молекулярным весом более 5000, как-то более 10000 и менее 200000, как-то менее 100000; к примеру, в диапазоне 20000-80000.

Другая, обычно менее предпочтительная модификация включает N-связанное или 0-связанное гликозилирование, обычно как часть котрансляционной и/или посттрансляционной модификации, в зависимости от клетки-хозяина, используемой для экспрессирования аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения.

Еще одна модификация может включать введение одной или нескольких детектируемых меток или других генерирующих сигналы групп или молекул, в зависимости от предполагаемого применения меченой аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения. Подходящие метки и методы их присоединения, использования и детектирования должны быть известны специалистам, к примеру, они включают, без ограничения, флуоресцентные метки (как-то флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальдегид и флуорескамин, а также флуоресцентные металлы, как-то 152Eu или другие металлы лантанидного ряда), фосфоресцентные метки, хемилюминесцентные метки или биолюминесцентные метки (как-то люминал, изолюминол, тероматические эфиры акридиния, имидазол, соли акридиния, эфиры оксалата, диоксетан или GFP и его аналоги), радиоизотопы (как-то 3H, 125I, 32P, 35S, 14С, 51Cr, 36Cl, 57Co, 58Со, 59Fe и 15Se), металлы, хелаты металлов или катионы металлов (к примеру, такие катионы металлов, как 99mTc, 123I, 111In, 131I, 97Ru, 67Cu, 67Ga и 68Ga и другие металлы или катионы металлов, которые особенно подходят для применения при диагностике и интраскопии in vivo, in vitro или in situ (как-то 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr и 56Fe), а также хромофоры и ферменты (как-то малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза, изомераза дельта-5-стероидов, дрожжевая алкогольдегидрогеназа, альфа-глицерофосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, биотинавидинпероксидаза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозоксидаза, β-галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза). Другие подходящие метки должны быть известны специалистам, к примеру, они включают молекулы, которые можно детектировать методами ЯМР- или ЭСР-спектроскопии.

Такие меченые аминокислотные последовательности, нанотела, соединения или полипептиды изобретения, к примеру, могут использоваться при анализе in vitro, in vivo или in situ (включая методы иммуноанализа, известные per se, как-то ELISA, RIA, EIA и другие методы "по принципу сэндвича" и т.д.), а также для диагностики и интраскопии in vivo, в зависимости от выбора конкретной метки.

Как должно быть известно специалистам, другие модификации могут включать введение хелатирующей группы, к примеру, для хелатирования одного или нескольких металлов или катионов металлов, означенных выше. Подходящие хелатирующие группы, к примеру, включают, без ограничения, диэтилентриаминпентауксусную кислоту ((DTPA) или этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).

Еще одна модификация может включать введение функциональной группы, составляющей одну часть специфической связывающей пары, такой как пара биотин-(стрепт)авидин. Такая функциональная группа может использоваться для связывания аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения с другим белком, полипептидом или химическим соединением, связанным с другой половиной связывающей пары, т.е. через образование связывающей пары. Например, аминокислотная последовательность, нанотело, соединение или полипептид изобретения может быть конъюгирован с биотином и соединен с другим белком, полипептидом, соединением или носителем, конъюгированным с авидином или стрептавидином. Например, такая конъюгированная аминокислотная последовательность, нанотело, соединение или полипептид изобретения может использоваться в качестве репортера, к примеру, в диагностической системе, где вырабатывающий детектируемый сигнал реагент конъюгирован с авидином или стрептавидином. Такие связывающие пары, к примеру, могут использоваться для связывания аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения с носителями, в том числе пригодными для фармацевтических целей. Одним неограничительным примером служат липосомные лекарственные формы, описанные Cao and Suresh (2000, Journal of Drug Targetting, 8 (4); 257). Такие связывающие пары могут использоваться и для связывания фармацевтически активного агента с аминокислотной последовательностью, нанотелом, соединением или полипептидом изобретения.

Другие возможные химические и энзиматические модификации должны быть известны специалистам. Такие модификации могут производиться и для исследовательских целей (напр., для изучения взаимоотношения функция-активность). Сошлемся, к примеру, на Lundblad and Bradshaw (1997, Biotechnol. Appl. Biochem., 26: 143-151).

Производные предпочтительно таковы, что они связываются со специфическим эптопом на рецепторе IL-6 со сродством (соответствующим образом измеренным и/или выраженным в виде значения KD (действительного или кажущегося), значения KA (действительного или кажущегося), константы скорости kon и/или koff или же в виде значения IC50, как описано далее), которое определено здесь.

В частности, такие производные изобретения предпочтительно таковы, что они:

- связываются с hIL-6 с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таковы, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше;

и/или таковы, что они:

- связываются с hIL-6 с константой скорости kon от 104 М-1s-1 до 107 М-1s-1, предпочтительно от 105 М-1s-1 до 107 М-1s-1, более предпочтительно около 106 М-1s-1 или больше;

и/или таковы, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости kon от 104 М-1s-1 до 107 М-1s-1, предпочтительно от 105 М-1s-1 до 107 М-1s-1, более предпочтительно около 106 М-1s-1 или больше;

и/или таковы, что они:

- связываются с hIL-6 с константой скорости koff от 10-3 s-1 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше;

и/или таковы, что они:

- связываются с cynoIL-6R с константой скорости koff от 10-3 s-1 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше.

Как указано выше, изобретение также касается белков или полипептидов, которые в основном состоят из или содержат по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, нанотело, соединение или полипептид изобретения. Под "в основном состоят" подразумевается то, что аминокислотная последовательность белка или полипептида изобретения либо точно такая же, как аминокислотная последовательность, нанотело, соединение или полипептид изобретения, либо соответствует аминокислотной последовательности, нанотелу, соединению или полипептиду изобретения, имеющим ограниченное число аминокислотных остатков, как-то 1-20 аминокислотных остатков, к примеру, 1-10 аминокислотных остатков, предпочтительно 1-6 аминокислотных остатков, как-то 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков, вставленных на N-конце, на С-конце, либо и на N-конце, и на С-конце аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида.

Данные аминокислотные остатки могут или не могут изменить, переделать или иным образом повлиять на (биологические) свойства аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида изобретения и могут или не могут придать дополнительную функциональность аминокислотной последовательности, нанотелу или полипептиду изобретения. Например, такие аминокислотные остатки:

a) могут включать N-концевой остаток Met, к примеру, в результате экспрессии в гетерологичных клетках-хозяевах или организме-хозяине;

b) могут составлять сигнальную последовательность или лидерную последовательность, направляющую секрецию аминокислотной последовательности, нанотела или полипептида изобретения из клетки-хозяина после синтеза. Подходящие секреторные лидерные пептиды должны быть известны специалистам и могут быть такими, как описано далее. Обычно лидерная последовательность связана с N-концом аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида, хотя изобретение в самом широком смысле этим не ограничивается;

c) могут составлять последовательность или сигнал, позволяющий аминокислотной последовательности, нанотелу, соединению или полипептиду быть направленным к и/или проникать или входить в определенные органы, ткани, клетки либо части или компартменты клеток, и/или позволяющие аминокислотной последовательности, нанотелу или полипептиду изобретения проникать или пересекать биологический барьер типа клеточной мембраны, клеточный слой типа слоя эпителиальных клеток, опухоли, включая твердые опухоли, или гематоэнцефалический барьер. Подходящие примеры таких аминокислотных последовательностей должны быть известны специалистам. Некоторые неограничительные примеры - это небольшие пептидные вектора ("вектора Peptrans"), описанные в WO 03/026700 и в Temsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001); Temsamani and Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (004) и Rousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001), последовательность мембранного транслокатора, описанная Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003). C-концевые и N-концевые аминокислотные последовательности для внутриклеточного таргетирования фрагментов антител, к примеру, описаны Cardinale et al.. Methods, 34, 171 (2004). Другие подходящие методы для внутриклеточного таргетирования включают экспрессирование и/или использование так называемых "интрател", содержащих аминокислотные последовательности, нанотела, соединения или полипептиды изобретения, как указано ниже;

d) могут составлять метку ("tag"), к примеру, аминокислотную последовательность или остаток, позволяющий или способствующий очистке аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида, к примеру, аффинными методами, направленными против данной последовательности или остатка. После этого данную последовательность или остаток можно удалить (напр., путем химического или энзиматического отщепления) для получения аминокислотной последовательности, нанотела, соединения или полипептида (для этой цели метка необязательно может быть связана с аминокислотной последовательностью, последовательностью нанотела, соединения или полипептида через отщепляемую последовательность линкера либо содержать отщепляемый мотив). Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры таких остатков - множественные остатки гистидина, остатки глутатиона и метка myc-tag типа AAAEQKLISEEDLNGAA (SEQ ID NO:100);

e) могут представлять собой один или несколько аминокислотных остатков, которые были подвергнуты функционализации и/или могут служить в качестве сайта для присоединения функциональных групп. Подходящие аминокислотные остатки и функциональные группы должны быть известны специалистам и включают, без ограничения, аминокислотные остатки и функциональные группы, указанные здесь для производных аминокислотных последовательностей, нанотел, соединений и полипептидов изобретения.

Аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды и нуклеиновые кислоты изобретения могут быть получены способом, известным per se, как должно быть ясно специалистам из приведенного здесь дальнейшего описания. Например, аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения могут быть получены любым способом, известным per se для получения антител, в частности, для получения фрагментов антител (в том числе однодоменных антител и фрагментов scFv). Некоторые предпочтительные, но не ограничительные способы получения аминокислотных последовательностей, нанотел, полипептидов и нуклеиновых кислот включают способы и методики, описанные здесь.

Как должно быть известно специалистам, один особенно полезный способ получения аминокислотных последовательностей, нанотел и/или полипептидов изобретения в общем включает стадии:

- экспрессирование в подходящих клетках-хозяевах или организме-хозяине (также именуется как "хозяин по изобретению") либо в другой подходящей системе экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей данную аминокислотную последовательность, нанотело или полипептид изобретения (также именуется как "нуклеиновая кислота изобретения"), после чего необязательно следует:

- выделение и очистка полученной при этом аминокислотной последовательности, нанотела или полипептида изобретения.

В частности, такой способ может включать стадии:

- культивирование и/или содержание хозяина по изобретению в таких условиях, что данный хозяин по изобретению экспрессирует и/или продуцирует по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, нанотело и/или полипептид изобретения; после чего необязательно следует:

- выделение и очистка полученной при этом аминокислотной последовательности, нанотела или полипептида изобретения.

Соответственно, настоящее изобретение также касается нуклеиновых кислот и последовательностей нуклеотидов, кодирующих аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды или моновалентные конструкции изобретения (также именуются как "нуклеиновая кислота изобретения"). Нуклеиновая кислота изобретения может иметь вид одноцепочечной или двуцепочечной ДНК или РНК, предпочтительно в виде двуцепочечной ДНК. Например, нуклеотидные последовательности изобретения могут представлять собой геномную ДНК, кДНК или синтетическую ДНК (как-то ДНК с употребительностью кодонов, которая была подвергнута специальной адаптации для экспрессии в заданных клетках-хозяевах или организме-хозяине).

В соответствии с одним воплощением изобретения, нуклеиновая кислота изобретения находится практически в выделенном виде, как определено здесь. Нуклеиновая кислота изобретения также может иметь вид, находиться в и/или быть частью вектора, такого, к примеру, как плазмида, космида или YAC, которые опять же могут находиться практически в выделенном виде.

Нуклеиновые кислоты изобретения могут быть получены или приготовлены способом, известным per se, на основе приведенной здесь информации об аминокислотных последовательностях, нанотелах и/или полипептидах изобретения, и/или могут быть выделены из подходящего природного источника. К тому же, как это должно быть ясно специалистам, для получения нуклеиновой кислоты изобретения можно соединить подходящим образом несколько нуклеотидных последовательностей, как-то по меньшей мере одну последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислотную последовательность или нанотело, вместе с нуклеиновыми кислотами, к примеру, кодирующими один или несколько линкеров.

Методы создания нуклеиновых кислот изобретения должны быть известны специалистам, к примеру, они могут включать, без ограничения, автоматизированный синтез ДНК; сайт-направленный мутагенез; сочетание двух или нескольких природных и/или синтетических последовательностей (либо двух или нескольких их частей); введение мутаций, приводящих к экспрессии укороченного продукта экспрессии; введение одного или нескольких сайтов рестрикции (напр., для создания кассет и/или участков, которые легко расщепляются и/или сшиваются при помощи соответствующих рестрикционных ферментов); и/или введение мутаций с помощью реакции ПЦР, использую один или несколько "несовпадающих" праймеров. Эти и другие методики должны быть известны специалистам, опять же сошлемся на стандартные руководства, такие как Sambrook et al. и Ausubel et al., упомянутые выше, а также на нижеследующие Примеры.

Нуклеиновая кислота изобретения также может иметь вид, находиться в и/или быть частью генетической конструкции, как это должно быть известно специалистам. Такие генетические конструкции в общем содержат по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту изобретения, которая необязательно связана с одним или несколькими элементами генетических конструкций, известными per se, такими, к примеру, как один или несколько подходящих регуляторных элементов (как-то подходящих промоторов, энхансеров, терминаторов и т.д.), и приведенными здесь дополнительными элементами генетических конструкций. Такие генетические конструкции, содержащие по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту изобретения, также именуются как "генетические конструкции изобретения".

Генетические конструкции изобретения могут представлять собой ДНК или РНК, предпочтительно двуцепочечную ДНК. Генетические конструкции изобретения также могут иметь вид, подходящий для трансформации заданных клеток-хозяев или организма-хозяина, либо вид, подходящий для встраивания в геномную ДНК заданных клеток-хозяев, либо вид, подходящий для независимой репликации, поддержания и/или наследственности в заданном организме-хозяине. Например, генетические конструкции изобретения могут иметь вид вектора, такого, к примеру, как плазмида, космида, YAC, вирусный вектор или транспозон. В частности, вектор может быть экспрессионным вектором, т.е. вектором, который может обеспечить экспрессию in vitro и/или in vivo (напр., в подходящих клетках-хозяевах, организме-хозяине и/или системе экспрессии).

В предпочтительном, но не ограничительном воплощении генетическая конструкция изобретения включает;

a) по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту изобретения, функционально связанную с

b) одним или несколькими регуляторными элементами, такими как промотор и необязательно подходящий терминатор; и необязательно также

c) один или несколько дополнительных элементов генетических конструкций, известных per se;

при этом термины "регуляторный элемент", "промотор", "терминатор" и "функционально связанный" имеют свое обычное значение в данной области (как описано далее); причем данные "дополнительные элементы", присутствующие в генетической конструкции, могут, к примеру, представлять собой последовательности 3'- или 5'-UTR, лидерные последовательности, селекционные маркеры, экспрессионные маркеры/гены-репортеры и/или элементы, которые могут способствовать или повышать (эффективность) трансформации или встраивания. Эти и другие подходящие элементы для таких генетических конструкций должны быть известны специалистам и могут, к примеру, зависеть от типа используемой конструкции, предполагаемых клеток-хозяев или организма-хозяина; способа, которым данные нуклеотидные последовательности изобретения будут экспрессироваться (напр., через конститутивную, кратковременную или индуцибельную экспрессию); и/или используемого метода трансформации. Так, регуляторные последовательности, промоторы и терминаторы, известные per se для экспрессии и продукции антител и фрагментов антител (в том числе однодоменных антител и фрагментов scFv), могут применяться по сути аналогичным образом.

Предпочтительно в генетических конструкциях изобретения данная по меньшей мере одна нуклеиновая кислота и данные регуляторные элементы и необязательно данные один или несколько дополнительных элементов "функционально связаны" друг с другом, под этим обычно подразумевается, что они находятся во функциональной взаимосвязи друг с другом. Например, промотор считается "функционально связанным" с кодирующей последовательностью, если данный промотор способен инициировать или иным образом контролировать/регулировать транскрипцию и/или экспрессию кодирующей последовательности (при этом данная кодирующая последовательность понимается как находящаяся "под контролем" данного промотора). В общем, когда две нуклеотидные последовательности функционально связаны, они будут находиться в одной и той же ориентации и обычно в одной и той же рамке считывания. Они также должны быть практически смежными, хотя это может и не требоваться.

Предпочтительно регуляторные и дополнительные элементы генетических конструкций изобретения таковы, что они способны обеспечивать предназначенные им биологические функции в заданных клетках-хозяевах или организме-хозяине.

Например, промотор, энхансер или терминатор должен быть "функциональным" в заданных клетках-хозяевах или организме-хозяине, под чем подразумевается, что (к примеру) данный промотор должен быть способен инициировать или иным образом контролировать/регулировать транскрипцию и/или экспрессию последовательности нуклеотидов - т.е. кодирующей последовательности - с которой они функционально связаны (как определено здесь).

Некоторые особенно предпочтительные промоторы включают, без ограничения, промоторы, известные per se для экспрессии в указанных здесь клетках-хозяевах, в частности, промоторы для экспрессии в бактериальных клетках, как-то указанные здесь и/или те, которые использовались в Примерах.

Селекционный маркер должен быть таким, чтобы он давал возможность - при соответствующих условиях отбора - отличить клетки-хозяева и/или организмы-хозяева, которые были (успешно) трансформированы нуклеотидной последовательностью изобретения, от тех клеток/организмов-хозяев, которые не были (успешно) трансформированы. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры таких маркеров - это гены, обеспечивающие устойчивость против антибиотиков (таких как канамицин или ампициллин), гены, обеспечивающие устойчивость к температуре или гены, позволяющие поддерживать клетки-хозяева или организм-хозяина в отсутствие определенных факторов, соединений и/или (пищевых) компонентов в среде, которые необходимы для выживания нетрансформированных клеток или организмов.

Лидерная последовательность должна быть такой, чтобы в заданных клетках-хозяевах или организме-хозяине она способствовала желательным посттрансляционным модификациям и/или направляла транскрибированную РНК в желательную часть или органеллу клетки. Лидерная последовательность также может способствовать секреции продукта экспрессии из данной клетки. При этом лидерная последовательность может представлять собой любую про-, пре- или препро-последовательность, работающую в клетках-хозяевах или организме-хозяине. Лидерные последовательности могут и не требоваться для экспрессии в бактериальных клетках. Например, лидерная последовательность, известная per se для экспрессии и продукции антител и фрагментов антител (в том числе однодоменных антител и фрагментов scFv), может использоваться по сути аналогичным образом.

Экспрессионный маркер или ген-репортер должны быть такими, чтобы в клетках-хозяевах или организме-хозяине они способствовали детектированию экспрессии (гена или последовательности нуклеотидов, находящейся в) генетической конструкции. Экспрессионный маркер может необязательно также способствовать определению локализации экспрессируемого продукта, напр., в определенной части или органелле клетки и/или в определенных клетках, тканях, органах или частях многоклеточного организма. Такие гены-репортеры могут экспрессироваться и в виде белка, слитого с аминокислотной последовательностью, нанотелом или полипептидом изобретения. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры включают флуоресцентные белки, такие как GFP.

Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры подходящих промоторов, терминаторов и дополнительных элементов включают те, которые можно использовать для экспрессии в указанных здесь клетках-хозяевах; в частности те, которые подходят для экспрессии в бактериальных клетках типа тех, что указаны здесь, и/или те, которые использовались в нижеследующих Примерах. В отношении некоторых (других) не ограничивающих примеров промоторов, селекционных маркеров, лидерных последовательностей, экспрессионных маркеров и дополнительных элементов, которые могут присутствовать/использоваться в генетических конструкциях изобретения - таких как терминаторы, энхансеры транскрипции и/или трансляции и/или факторы интеграции - сошлемся на общие справочники, такие как Sambrook et al. и Ausubel et al., указанные выше, а также на примеры, приведенные в WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US 7,207,410, US 5,693,492 и ЕР 1085089. Другие примеры должны быть известны специалистам. Сошлемся также на приведенные выше работы предшествующего уровня техники и приведенные в них другие ссылки.

Генетические конструкции изобретения в общем могут быть получены соответствующим соединением нуклеотидных последовательностей изобретения с одним или несколькими дополнительными элементами, описанными выше, к примеру, с помощью методик, описанных в общих справочниках типа Sambrook et al. и Ausubel et al., указанных выше.

Зачастую генетические конструкции изобретения получают путем введения нуклеотидной последовательности изобретения в подходящий (экспрессионный) вектор, известный per se. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры подходящих экспрессионных векторов приведены в нижеследующих Примерах, а также были указаны ранее.

Нуклеиновые кислоты изобретения и/или генетические конструкции изобретения могут использоваться для трансформации клеток-хозяев или организма-хозяина, т.е. для экспрессии и/или продукции аминокислотной последовательности, нанотела или полипептида изобретения. Подходящие хозяева или клетки-хозяева должны быть известны специалистам и могут представлять собой, к примеру, любые подходящие грибковые, прокариотические или эукариотические клетки или клеточные линии или любые подходящие грибковые, прокариотические или эукариотические организмы, например:

- бактериальные штаммы, в том числе грамотрицательные штаммы, как-то штаммы Escherichia coli; или Proteus, к примеру, Proteus mirabilis; или Pseudomonas, к примеру, Pseudomonas fluorescens; и грамположительные штаммы, как-то штаммы Bacillus, к примеру. Bacillus subtilis или Bacillus brevis; или Streptomyces, к примеру, Streptomyces lividans; или Staphylococcus, к примеру, Staphylococcus carnosus; или Lactococcus, к примеру, Lactococcus lactis;

- клетки грибов, в том числе клетки из видов Trichoderma, к примеру, Trichoderma reesei; или Neurospora, к примеру, Neurospora crassa; или Sordaria, к примеру, Sordaria macrospora; или Aspergillus, к примеру, Aspergillus niger или Aspergillus sojae; или из других мицелиальных грибов;

- клетки дрожжей, в том числе клетки из видов Saccharomyces, к примеру, Saccharomyces cerevisiae; или Schizosaccharomyces, к примеру, Schizosaccharomyces pombe; или Pichia, к примеру, Pichia pastoris или Pichia methanolica; или Hansenula, к примеру, Hansenula polymorpha', или Kluyveromyces, к примеру, Kluyveromyces lactis; или Arxula, к примеру, Arxula adeninivorans, или Yarrowia, к примеру, yarrow/a lipolytica,

- клетки или клеточные линии из амфибий, как-то ооциты Xenopus;

- клетки или клеточные линии из насекомых, как-то клетки/клеточные линии из Lepidoptera, в том числе клетки Spodoptera SF9 и Sf21, или клетки/клеточные линии из Drosophila, как-то клетки Schneider и Кс;

- растения или растительные клетки, к примеру, в растениях табака; и/или

- клетки или клеточные линии млекопитающих, к примеру, клетки или клеточные линии из человека, клетки или клеточные линии из млекопитающих, в том числе клетки СНО, клетки ВНК (к примеру, клетки ВНК-21) и клетки или клеточные линии человека, как-то клетки HeLa, COS (к примеру, COS-7) и PER.C6;

а также другие хозяева или клетки-хозяева, известные per se, для экспрессии и продукции антител или фрагментов антител (в том числе однодоменных антител и фрагментов scFv), которые должны быть известны специалистам. Сошлемся также на приведенные выше работы предшествующего уровня техники, а также, к примеру, на WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al. (1998, Res. Immunol. 149(6): 589-99), Riechmann and Muyldermans (1999, J. Immunol. Methods, 231(1-2): 25-38), van der Linden (2000, J. Biotechnol. 80(3): 261-70), Joosten et al. (2003, Microb. Cell Fact. 2(1): 1), Joosten et al. (2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66(4): 384-92.); и приведенные в них другие ссылки.

Аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения также можно ввести и экспрессировать в одной или нескольких клетках, тканях или органах многоклеточного организма, к примеру, для профилактических и/или терапевтических целей (напр., генной терапии). Для этого в клетки или ткани можно ввести нуклеотидные последовательности изобретения любым подходящим способом, к примеру, сами по себе (напр., с помощью липосом) или после встраивания их в подходящий вектор для генной терапии (к примеру, полученный из ретровирусов типа аденовируса или парвовирусов типа аденоассоциированных вирусов). Как должно быть известно специалистам, такая генная терапия может осуществляться in vivo и/или in situ в организме пациента путем введения нуклеиновой кислоты изобретения или подходящего вектора для генной терапии, кодирующего ее, пациенту или в определенные клетки или определенные ткани или органы пациента; или же можно обработать подходящие клетки (которые часто отбирают из организма подлежащего лечению пациента, как-то эксплантированные лимфоциты, аспираты костного мозга или биопсии тканей) in vitro нуклеотидной последовательностью изобретения, а затем соответствующим образом заново ввести в организм пациента. Все это можно осуществить с помощью векторов для генной терапии, методик и систем доставки, которые хорошо известны специалистам и описаны, к примеру, в Culver K.W. (1994, "Gene Therapy", p.xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y.); Giordano (1996, Nature Medicine 2: 534-539); Schaper (1996, Circ. Res. 79:911-919); Anderson (1992, Science 256:808-813); Verma (1994, Nature 389: 239); Isner (1996, Lancet 348: 370-374); Muhlhauser (1995, Circ. Res. 77: 1077-1086); Onodera (1998, Blood 91:30-36); Verma (1998, Gene Ther. 5: 692-699); Nabel (1997, Ann. N.Y. Acad. Sci, 811: 289-292); Verzeletti (1998, Hum. Gene Ther. 9: 2243-51); Wang 1996, Nature Medicine 2: 714-716); WO 94/29469; WO 97/00957; US 5,580,859; или Schaper (1996, Current Opinion in Biotechnology 7: 635-640). Например, в этой области была описана экспрессия in situ фрагментов scFv (Afanasieva et al. (2003, Gene Ther., 10:1850-1859) и диател (Blanco et al., 2003, J. ImmunoL, 171:1070-1077).

Для экспрессии аминокислотных последовательностей, нанотел или полипептидов в клетках их можно также экспрессировать в виде так называемых "интрател", к примеру, как описано в WO 94/02610, WO 95/22618, US 7,004,940, WO 03/014960, в Cattaneo A. and Biocca S. (1997, Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag) и в Kontermann (2004, Methods 34:163-170).

Аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения могут вырабатываться, к примеру, в молоке трансгенных млекопитающих, к примеру, в молоке кроликов, коров, коз или овец (например, см. US 5,741,957, US 5,304,489 и US 5,849,992 насчет общих методов введения трансгенов в млекопитающих), в растениях или частях растений, в том числе их листьях, цветах, фруктах, семенах, корнях или клубнях (к примеру, в табаке, кукурузе, сое или люцерне), или, к примеру, в куколках шелкопряда Bombix mori.

Более того, аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения также можно экспрессировать и/или продуцировать в бесклеточных системах экспрессии, а подходящие примеры таких систем должны быть известны специалистам. Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры включают экспрессию в системе зародышей пшеницы; в лизатах ретикулоцитов кролика; или в системе Zubay E.coli.

Как указано выше, одним из преимуществ использования нанотел является то, что полипептиды на их основе могут быть получены посредством экспрессии в подходящей бактериальной системе, и подходящие бактериальные системы экспрессии, векторы, клетки-хозяева, регуляторные элементы и др. должны быть известны специалистам, к примеру, из приведенных выше ссылок. Однако следует отметить, что изобретение в самом широком смысле не ограничивается экспрессией в бактериальных системах.

Предпочтительно в изобретении используется экспрессионная система (in vivo или in vitro) типа бактериальной системы экспрессии, которая обеспечивает полипептиды изобретения в виде, подходящем для фармацевтического применения, причем такие системы экспрессии опять же должны быть известны специалистам. Специалистам также должно быть известно, что полипептиды изобретения, подходящие для фармацевтического применения, могут быть получены методами синтеза пептидов.

Для производства в промышленном масштабе предпочтительными гетерологичными хозяевами для (промышленного) получения нанотел или содержащих нанотела белковых лекарств являются штаммы Е. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae, пригодные для крупномасштабной экспрессии/производства/ферментации, в частности, для крупномасштабной фармацевтической экспрессии/производства/ферментации. Подходящие примеры таких штаммов должны быть известны специалистам. Такие штаммы и системы продукции/экспрессии к тому же выпускаются такими компаниями, как Biovitrum (Uppsala, Швеция).

С другой стороны, для крупномасштабной экспрессии/производства/ферментации, в частности, для крупномасштабной фармацевтической экспрессии/производства/ферментации можно использовать линии клеток млекопитающих, в частности, клетки яичников китайского хомячка (СНО). Опять же такие системы экспрессии/производства тоже выпускаются некоторыми компаниями, указанными выше.

Выбор конкретной системы экспрессии будет отчасти зависеть от потребности в некоторых пост-трансляционных модификациях, более конкретно, в гликозилировании. Получение рекомбинантных белков, содержащих нанотела, для которых желательно или требуется гликозилирование, влечет за собой использование экспрессирующих хозяев от млекопитающих, которые обладают способностью гликозилировать экспрессируемый белок. В этом отношении специалистам должно быть известно, что полученный профиль гликозилирования (т.е. вид, число и положение присоединенных остатков) будет зависеть от клеток или линии клеток, используемых для экспрессии. Предпочтительно используются клетки или линии клеток человека (дающие белок, который в основном имеет профиль гликозилирования человека) или линии клеток других млекопитающих, которые могут обеспечить профиль гликозилирования, который по сути и/или функционально будет таким же, как профиль гликозилирования у человека или по крайней мере похож на него. В общем, прокариотические организмы типа Е. coli не обладают способностью к гликозилированию белков, а при использовании низших эукариотов типа дрожжей обычно получается профиль гликозилирования, который отличается от профиля гликозилирования человека. Тем не менее, следует понимать, что в изобретении могут использоваться все вышеприведенные клетки-хозяева и экспрессионные системы, в зависимости от намеченной аминокислотной последовательности, нанотела или полипептида.

Так, в соответствии с одним неограничительным воплощением изобретения аминокислотная последовательность, нанотело или полипептид изобретения являются гликозилированными. В соответствии с другим неограничительным воплощением изобретения, аминокислотная последовательность, нанотело или полипептид изобретения не являются гликозилированными.

В соответствии с одним предпочтительным, но не ограничительным воплощением изобретения аминокислотная последовательность, нанотело или полипептид изобретения продуцируются в бактериальных клетках, в частности, в бактериальных клетках, пригодных для крупномасштабного фармацевтического производства, типа клеток из штаммов, приведенных выше.

В соответствии с другим предпочтительным, но не ограничительным воплощением изобретения аминокислотная последовательность, нанотело или полипептид изобретения продуцируются в дрожжевых клетках, в частности, в дрожжевых клетках, пригодных для крупномасштабного фармацевтического производства, типа клеток из видов, приведенных выше.

В соответствии с еще одним предпочтительным, но не ограничительным воплощением изобретения аминокислотная последовательность, нанотело или полипептид изобретения продуцируются в клетках млекопитающих, в частности, в клетках человека или клетках из клеточной линии человека, в особенности в клетках человека или клетках из клеточной линии человека, пригодных для крупномасштабного фармацевтического производства, типа клеточных линий, приведенных выше.

Если для получения аминокислотных последовательностей, нанотел и полипептидов изобретения используется экспрессия в клетках-хозяевах, то аминокислотные последовательности, нанотела или полипептиды изобретения могут либо вырабатываться внутриклеточно (напр., в цитозоле, в периплазме или тельцах включения), а затем выделяться из клеток-хозяев и необязательно дополнительно очищаться; либо вырабатываться внеклеточно (напр., в среде, в которой культивируются клетки хозяина), а затем выделяться из культуральной среды и необязательно дополнительно очищаться. При использовании эукариотических клеток хозяина обычно предпочтительней внеклеточное получение, так как оно значительно облегчает дальнейшее выделение и последующий процессинг полученных аминокислотных последовательностей, нанотел, полипептидов и белков. Бактериальные клетки типа приведенных выше штаммов Е. coli в норме не секретируют белки из клетки, за исключением некоторых классов белков, таких как токсины и гемолизин, а секреторная продукция в Е. coli означает транслокацию белков через внутреннюю мембрану в периплазматическое пространство. Периплазматическая продукция имеет ряд преимуществ перед продукцией в цитозоле. Например, N-концевая аминокислотная последовательность секретируемого продукта может быть идентичной природному генному продукту после отщепления сигнальной последовательности для секреции специфической сигнальной пептидазой. К тому же протеазная активность в периплазме оказывается гораздо ниже, чем в цитоплазме. Кроме того, очистка белков упрощается вследствие меньшего количества балластных белков в периплазме. Другое преимущество состоит в том, что могут образовываться правильные дисульфидные связи потому, что периплазма обеспечивает более окислительную среду, чем цитоплазма. Белки, подвергаемые суперэкспрессии в Е. coli, часто находятся в нерастворимых агрегатах, так называемых тельцах включения. Эти тельца включения могут находиться в цитозоле или в периплазме; извлечение биологически активных белков из этих телец включения требует процесса денатурации/повторной укладки. Многие рекомбинантные белки, в том числе терапевтические белки, выделяют из телец включения. С другой стороны, как это должно быть известно специалистам, можно использовать рекомбинантные штаммы бактерий, которые были генетически модифицированы так, чтобы они секретировали нужный белок, в частности, аминокислотную последовательность, нанотело или полипептид изобретения.

Так, в соответствии с одним неограничительным воплощением изобретения аминокислотная последовательность, нанотело или полипептид изобретения представляет собой аминокислотную последовательность, нанотело или полипептид, которые были получены внутриклеточно и были выделены из клеток-хозяев, в частности, из бактериальных клеток или из телец включения в бактериальных клетках. В соответствии с другим неограничительным воплощением изобретения аминокислотная последовательность, нанотело или полипептид изобретения были получены внеклеточно и были выделены из среды, в которой культивировались клетки-хозяева.

Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры промоторов для использования в таких клетках-хозяевах включают:

- для экспрессии в Е. coli: lac-промотор (и его производные, такие как промотор lacUV5); арабинозный промотор; лево- (PL) и правосторонний (PR) промотор фага лямбда; промотор оперона trp; гибридные lac/trp-промоторы (tac и trc); промотор Т7 (более конкретно гена 10 фага Т7) и промоторы других Т-фагов; промотор гена устойчивости к тетрациклину Tn10; инженерные варианты вышеприведенных промоторов, включающие одну или несколько копий последовательности внешнего регуляторного оператора;

- для экспрессии в S. cerevisiae: конститутивные: ADH1 (алкогольдегидрогеназы 1), ENO (енолазы), CYC1 (цитохрома с iso-1), GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы), PGK1 (фосфоглицераткиназы), PYK1 (пируваткиназы); регулируемые: GAL1,10,7 (ферментов метаболизма галактозы), ADH2 (алькогольдегидрогеназы 2), PHO5 (кислой фосфатазы), CUP1 (медного металлотионеина); гетерологичные: CaMV (35S промотор вируса мозаики цветной капусты);

- для экспрессии в Pichia pastoris: промотор АОХ1 (алкогольоксидазы I);

- для экспрессии в клетках млекопитающих: энхансер/промотор немедленно ранних генов цитомегаловируса человека (hCMV); вариант промотора немедленно ранних генов цитомегаловируса человека (hCMV), содержащий последовательности двух тетрациклиновых операторов с тем, чтобы промотор регулировался репрессором Tet; промотор тимидинкиназы (ТК) вируса Herpes simplex; энхансер/промотор длинного терминального повтора (RSV LTR) вируса саркомы Рауса; промотор фактора элонгации 1α (hEF-1α) человека, шимпанзе, мыши или крысы; ранний промотор SV40; промотор длинного терминального повтора HIV-1; β-актиновый промотор.

Некоторые предпочтительные, но не ограничительные примеры векторов для использования с этими клетками хозяина включают:

- вектора для экспрессии в клетках млекопитающих: pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110). pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199), pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) и 1ZD35 (ATCC 37565), а также системы экспрессии на вирусной основе типа тех, что на основе аденовируса;

- вектора для экспрессии в бактериальных клетках: вектора рЕТ (Novagen) и вектора pQE (Qiagen);

- вектора для экспрессии в клетках дрожжей или других грибков: pYES2 (Invitrogen) и экспрессионные вектора для Pichia (Invitrogen);

- вектора для экспрессии в клетках насекомых: pBlueBacII (Invitrogen) и другие бакуловирусные вектора;

- вектора для экспрессии в растениях или в клетках растений: например, вектора на основе вируса мозаичности цветной капусты или вируса мозаичности табака, подходящие штаммы Agrobacterium или вектора на основе Ti-плазмиды.

Некоторые предпочтительные, но не ограничительные секреторные последовательности для использования с этими клетками хозяина включают:

- для использования в бактериальных клетках типа Е. coil: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB и подобные им; сигнальный пептид TAT; С-терминальный сигнал секреции гемолизина;

- для использования в дрожжевых клетках: препро-последовательность α-фактора спаривания, фосфатазы (phol), инвертазы (Sue) и др.;

- для использования в клетках млекопитающих: собственный сигнал в случае, если белок мишени имеет эукариотическое происхождение; сигнальный пептид V-J2-C κ-цепи Ig мыши; и др.

Подходящие методы трансформации организма или клеток-хозяев по изобретению должны быть известны специалистам и могут зависеть от искомых клеток-хозяев/организма-хозяина и используемой генетической конструкции. Опять же сошлемся на приведенные выше справочники и патентные заявки.

После трансформации может выполняться стадия выявления и отбора тех клеток-хозяев или организмов-хозяев, которые были успешно трансформированы нуклеотидной последовательностью/генетической конструкцией изобретения. Это может быть, к примеру, стадия отбора на основе селекционного маркера, присутствующего в генетической конструкции изобретения, или стадия, включающая детектирование аминокислотной последовательности изобретения, напр., с помощью специфических антител.

Трансформированные клетки-хозяева (которые могут быть в виде стабильной клеточной линии) или организмы-хозяева (которые могут быть в виде стабильной мутантной линии или штамма) составляют следующие аспекты настоящего изобретения.

Предпочтительно эти клетки-хозяева или организмы-хозяева таковы, что они экспрессируют или (по крайней мере) способны экспрессировать (напр., в подходящих условиях) аминокислотную последовательность, нанотело или полипептид изобретения (а в случае организма хозяина: по меньшей мере в одной его клетке, части или органе). Изобретение также включает последующие поколения, потомство и/или отпрысков клеток-хозяев или организма-хозяина по изобретению, которые, к примеру, могут быть получены делением клеток либо половым или бесполым размножением.

Для получения/экспрессирования аминокислотных последовательностей изобретения трансформированные клетки-хозяева или трансформированный организм-хозяин в общем можно содержать, поддерживать и/или культивировать в таких условиях, чтобы (желательная) аминокислотная последовательность, нанотело или полипептид изобретения экспрессировался/вырабатывался. Подходящие условия должны быть известны специалистам и обычно зависят от используемых клеток/организмов-хозяев, а также от регуляторных элементов, контролирующих экспрессию (соответствующей) нуклеотидной последовательности изобретения. Опять же сошлемся на справочники и патентные заявки, указанные выше в разделе о генетических конструкциях изобретения.

В общем, подходящие условия могут включать использование подходящей среды, наличие подходящего источника питания и/или подходящих питательных веществ, использование подходящей температуры и необязательно присутствие подходящего индуцирующего фактора или соединения (напр., когда нуклеотидная последовательность изобретения находится под контролем индуцибельного промотора); причем все они могут быть выбраны специалистами. Опять же при таких условиях аминокислотные последовательности изобретения могут экспрессироваться конститутивным образом, кратковременным образом или только тогда, когда они индуцированы соответствующим образом.

Специалистам также должно быть известно, что аминокислотная последовательность, нанотело или полипептид изобретения могут (сначала) зарождаться в незрелом виде (как указано выше), а затем подвергаться посттрансляционной модификации, в зависимости от используемых клеток-хозяев/организма-хозяина. К тому же аминокислотная последовательность, нанотело или полипептид изобретения могут подвергаться гликозилированию, что опять же зависит от используемых клеток хозяев/организма-хозяина.

Аминокислотную последовательность, нанотело или полипептид изобретения можно затем отделить от клеток-хозяев/организма-хозяина и/или от среды, в которой клетки-хозяева или организм-хозяин культивировались, используя методы выделения и/или очистки белков, известные per se, как-то методы (препаративной) хроматографии и/или электрофореза, методы дробного высаживания, аффинные методы (напр., с использованием специфической, отщепляемой аминокислотной последовательности, слитой с аминокислотной последовательностью, нанотелом или полипептидом изобретения), и/или методы препаративной иммунологии (напр., с использованием антител против подлежащей выделению аминокислотной последовательности).

В общем, для фармацевтического применения полипептиды изобретения могут быть составлены в виде фармацевтического препарата или композиций, включающих по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, нанотело или полипептид изобретения и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант, и необязательно один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений. В качестве неограничительных примеров такие лекарственные формы может находиться в виде, подходящем для перорального введения, для парентерального введения (как-то для внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции или внутривенной инфузии), для местного применения, для введения путем ингаляции, в виде кожного пластыря, импланта, суппозитория и др. Такие подходящие формы для введения - которые могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими, в зависимости от способа введения - а также способы и носители для применения при их изготовлении, должны быть известны специалистам и описаны далее.

Так, в следующем аспекте изобретение касается фармацевтических композиций, содержащих по меньшей мере одну аминокислотную последовательность изобретения, по меньшей мере одно нанотело изобретения или по меньшей мере один полипептид изобретения и по меньшей мере один подходящий носитель, разбавитель или эксципиент (т.е. пригодный для фармацевтического применения), и необязательно одно или несколько дополнительных активных веществ. В предпочтительном аспекте изобретение касается фармацевтической композиции, содержащей SEQ ID NO:70 и по меньшей мере один подходящий носитель, разбавитель или эксципиент (т.е. пригодный для фармацевтического применения), и необязательно одно или несколько дополнительных активных веществ. В другом предпочтительном аспекте изобретение касается фармацевтической композиции, содержащей SEQ ID NO:71 и по меньшей мере один подходящий носитель, разбавитель или эксципиент (т.е. пригодный для фармацевтического применения), и необязательно одно или несколько дополнительных активных веществ.

В общем, аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения могут быть составлены и введены любым подходящим способом, известным per se, для чего сошлемся, к примеру, на приведенные выше работы предшествующего уровня техники (в частности, на WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865 и WO 04/041867), а также на стандартные справочники, такие как Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, USA (1990) или Remington, Science and Practice of Pharmacy, 21th ed., Lippincott, Williams and Wilkins (2005).

Например, аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения могут быть составлены и введены любым способом, известным per se для обычных антител и фрагментов антител (включая антитела scFv и диатела) и других фармацевтически активных белков. Такие лекарственные формы и способы их получения должны быть известны специалистам и включают, к примеру, препараты, пригодные для парентерального введения (к примеру, внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, внутрипросветного, внутриартериального или интратекального введения) или для местного (чрескожного или интрадермального) применения.

Препараты для парентерального введения могут представлять собой, к примеру, стерильные растворы, суспензии, дисперсии или эмульсии, пригодные для вливания или инъекций. Подходящие носители или разбавители для таких препаратов включают, к примеру, без ограничения, стерильную воду и водные буфера и растворы, такие как физиологический раствор с фосфатным буфером, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хенкса; водные масла; глицерин; этанол; гликоли типа пропиленгликоля, а также минеральные масла, животные жиры и растительные масла, к примеру, арахисовое масло, соевое масло, а также их подходящие смеси. Обычно предпочтительны водные растворы или суспензии.

Аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения также могут вводиться методами доставки для генной терапии. Напр., см. U.S. 5,399,346, включенный путем ссылки во всей полноте. При использовании методов доставки для генной терапии первичные клетки, трансфецированные геном, кодирующим аминокислотную последовательность, напотело или полипептид изобретения, можно дополнительно трансфецировать тканеспецифичными промоторами для определенных органов, тканей, трансплантатов, опухолей или клеток, а также трансфецировать сигнальными и стабилизирующими последовательностями для субклеточной экспрессии.

Так, аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения можно вводить системно, напр., перорально, в комбинации с таким фармацевтически приемлемым носителем, как инертный разбавитель или усваиваемый годный в пищу носитель. Их можно заключить в желатиновые капсулы с твердой или мягкой оболочкой, компрессировать в таблетки или непосредственно включать в пищу в рацион пациента. Для перорального терапевтического введения аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения можно сочетать с одним или несколькими эксципиентами и применять в виде принимаемых внутрь таблеток, буккальных таблеток, лепешек, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, вафель и т.п. Такие композиции и препараты должны содержать по меньшей мере 0,1% аминокислотной последовательности, нанотела или полипептида изобретения. Их содержание в композициях и препаратах, конечно, может варьировать и для удобства может составлять от 2% до 60% от веса данной стандартной дозовой формы. Содержание аминокислотной последовательности, нанотела или полипептида изобретения в таких терапевтически полезных композициях таково, чтобы достигался уровень эффективной дозы.

Таблетки, лепешки, пилюли, капсулы и т.п. также могут содержать следующее: связующие вещества, как-то трагакантовую камедь, гуммиарабик, кукурузный крахмал или желатин; эксципиенты, как-то бифосфат кальция; дезинтегрирующие агенты, как-то кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и др.; смягчающие вещества, как-то стеарат магния; и подсластители, как-то сахароза, фруктоза, лактоза или аспартам, или же можно добавить ароматизаторы, как-то масло перечной мяты, масло грушанки или вишневый ароматизатор. Когда стандартной дозовой формой являются капсулы, они могут содержать, наряду с материалами вышеприведенного типа, жидкий носитель, такой как растительное масло или полиэтиленгликоль. Могут присутствовать различные другие материалы в виде оболочки или иным образом модифицирующие физическую форму твердых дозовых форм. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты желатином, воском, шеллаком или сахаром и др. Сироп или эликсир может содержать аминокислотные последовательности, нанотела или полипептиды изобретения, сахарозу или фруктозу в качестве подсластителей, метил- и пропилпарабен в качестве консервантов, краситель и ароматизатор типа вишневого или апельсинового ароматизатора. Конечно, любой материал, используемый при приготовлении стандартных дозовых форм, должен быть фармацевтически приемлемым и практически нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения можно включать в препараты и устройства для замедленного высвобождения.

Препараты и формы для перорального введения также могут снабжаться энтеросолюбильным покрытием, которое позволяет конструкции изобретения быть устойчивой к желудочной среде и проходить в кишечник. В общем случае препараты и формы для перорального введения могут быть составлены соответствующим образом для доставки в любую желательную часть желудочно-кишечного тракта. Кроме того, для доставки в желудочно-кишечный тракт могут использоваться подходящие свечи.

Аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения также могут вводиться внутривенно или внутрибрюшинно путем вливания или инъекции. Растворы аминокислотных последовательностей, нанотел и полипептидов изобретения или их солей могут быть приготовлены на воде, необязательно смешанной с нетоксичным поверхностно-активным веществом. Также можно приготовить дисперсии в глицерине, жидком полиэтиленгликоле, триацетине и их смесях, а также в маслах. При обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консерванты для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические дозовые формы, пригодные для инъекций или инфузий, могут включать стерильные водные растворы или дисперсии либо стерильные порошки, содержащие активный ингредиент, которые адаптированы для приготовления ex tempore стерильных растворов или дисперсий для инъекций или инфузий и необязательно заключены в липосомы. В любом случае конечная дозовая форма должна быть стерильной, жидкой и стабильной в условиях изготовления и хранения. Жидким носителем может быть растворитель или жидкая дисперсная среда, содержащая, к примеру, воду, этанол и полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), растительные масла, нетоксичные глицериновые эфиры и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, к примеру, формированием липосом, соблюдением требуемого размера частиц в случае дисперсий или с помощью детергентов. Предотвратить действие микроорганизмов можно при помощи различных антибактериальных и противогрибковых средств, к примеру, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и др. Во многих случаях будет предпочтительно включать изотонические агенты, к примеру, сахара, буферы или хлорид натрия. Продолжительное всасывание композиций для инъекций достигается использованием в композициях веществ, замедляющих всасывание, к примеру, моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные растворы для инъекций готовят введением аминокислотных последовательностей, нанотел и полипептидов изобретения в требуемых количествах в соответствующий растворитель вместе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, как положено, с последующей стерилизацией фильтрованием. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами их получения являются методы высушивания под вакуумом и высушивания с замораживанием, которые дают порошок активного ингредиента вместе с любым дополнительным желательным ингредиентом, присутствующим в предварительно стерилизованных фильтрованием растворах.

Для местного применения аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения могут применяться в чистом виде, если они представляют собой жидкости. Однако вообще желательно наносить их на кожу в виде композиций или составов, в сочетании с дерматологически приемлемым носителем, который может быть твердым или жидким.

Применимые твердые носители включают мелкозернистые твердые вещества, такие как тальк, глина, микрокристаллическая целлюлоза, кремнезем, глинозем и т.д. Применимые жидкие носители включают воду, гидроксиалкилы или гликоли или смеси вода-спирт/гликоль, в которых могут растворяться или диспергироваться в эффективных количествах аминокислотные последовательности, нанотела и полипептиды изобретения, необязательно с помощью нетоксичных детергентов. Для оптимизации свойств для данного применения можно добавлять адъюванты, как-то отдушки и дополнительные противомикробные средства. Полученные жидкие композиции можно наносить из абсорбирующих прокладок, применяющихся для пропитки бинтов и других перевязочных материалов, или распылять на пораженный участок с помощью помповых или аэрозольных пульверизаторов.

Вместе с жидкими носителями для образования растекающихся паст, гелей, мазей, мыл и т.п. для нанесения непосредственно на кожу пользователя также можно использовать такие загустители, как синтетические полимеры, жирные кислоты, соли и эфиры жирных кислот, жирные спирты, модифицированные целлюлозы или модифицированные минеральные материалы.

Примеры полезных дерматологических композиций, которые могут применяться для доставки аминокислотных последовательностей, нанотел и полипептидов изобретения на кожу, известны в этой области; к примеру, см. Jacquet et al. (US 4,608,392), Geria (US 4,992,478), Smith et al. (US 4,559,157) и Wortzman (US 4,820,508).

Применимые дозы аминокислотных последовательностей, нанотел и полипептидов изобретения можно определить сравнением их активности in vitro и активности in vivo на животных моделях. Методы экстраполяции эффективных доз от мышей и других животных на человека известны в данной области; к примеру, см. US 4,938,949.

Обычно концентрация аминокислотных последовательностей, нанотел и полипептидов изобретения в жидкой композиции типа лосьона составляет от 0,1 до 25% масс., предпочтительно от 0,1 до 10% масс. Концентрация в полутвердых и твердых композициях типа геля или порошка составляет 0,1-5%, предпочтительно 0,5-2,5% масс.

Количество аминокислотных последовательностей, нанотел и полипептидов изобретения, требующееся для лечения, зависит не только от конкретной выбранной аминокислотной последовательности, нанотела или полипептида изобретения, но и от способа применения, природы подлежащего лечению заболевания и возраста и состояния пациента, и в конечном счете состоит на усмотрении лечащего врача или клинициста. Также и дозировка аминокислотных последовательностей, нанотел и полипептидов изобретения варьирует в зависимости от клеток, опухоли, ткани, трансплантата или органа мишени.

Требуемая доза для удобства может быть представлена в отдельной дозе или в виде дробных доз, вводимых через соответствующие интервалы, например, в виде двух, трех, четырех или больше дробных доз в день. Сама дробная доза может и далее делиться, напр., на ряд дискретных свободно разнесенных введений, таких как многократные ингаляции из аппарата для вдувания (ингалятора) или внесением нескольких капель в глаза. Режим введения может включать продолжительное каждодневное лечение. Под "продолжительным" имеется в виду по меньшей мере две недели и предпочтительно длительностью в несколько недель, месяцев или лет. Необходимые модификации этого дозового интервала могут быть установлены рядовым специалистом в этой области одним лишь простым подбором, с учетом приведенных здесь положений. См. Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. В случае любых осложнений дозировку может скорректировать индивидуальный врач.

В другом аспекте изобретение касается способа профилактики и/или лечения по меньшей мере одного связанного с IL-6R заболевания и/или нарушения, который включает введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности изобретения, нанотела изобретения, полипептида изобретения, соединения изобретения, конструкции изобретения и/или содержащей их фармацевтической композиции.

В контексте настоящего изобретения термин "профилактика и/или лечение" включает не только предотвращение и/или лечение заболевания, но также вообще включает предотвращение возникновения болезни, замедление или обращение вспять развития болезни, предотвращение или замедление появления одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, уменьшение и/или ослабление одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, уменьшение тяжести и/или продолжительности заболевания и/или любых связанных с ним симптомов, и/или предотвращение дальнейшего усиления тяжести заболевания и/или любых связанных с ним симптомов, предотвращение, уменьшение или обращение вспять любых физиологических повреждений, вызванных заболеванием, и вообще любое фармакологическое действие, которое является благотворным для получающего лечение пациента.

Субъектом для лечения может быть любое теплокровное животное, но в особенности млекопитающее и более предпочтительно человек. Как это должно быть известно специалистам, субъектом для лечения должно быть лицо, страдающее или подвергающееся риску возникновения указанных здесь заболеваний и нарушений.

Изобретение касается способа профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания и/или нарушения, связанного с IL-6, с IL-6R, с комплексом IL-6/IL-6R, с их биологической или фармакологической активностью и/или с биологическими или сигнальными путями, в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R, который включает введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности изобретения, нанотела изобретения, полипептида изобретения, соединения изобретения, конструкции изобретения и/или содержащей их фармацевтической композиции. В частности, изобретение касается способа профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания и/или нарушения, которое можно предотвратить и/или лечить путем модулирования IL-6, IL-6R, комплекса IL-6/IL-6R, их биологической или фармакологической активности и/или биологических или сигнальных путей, в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R, который включает введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности изобретения, нанотела изобретения, полипептида изобретения, соединения изобретения, конструкции изобретения и/или содержащей их фармацевтической композиции. В частности, такое фармацевтически активное количество может составлять количество, достаточное для модулирования IL-6, IL-6R, комплекса IL-6/IL-6R, их биологической или фармакологической активности и/или биологических или сигнальных путей, в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R.

Изобретение также касается способа профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания и/или нарушения, которое можно предотвратить и/или лечить введением пациенту аминокислотной последовательности изобретения, нанотела изобретения или полипептида изобретения, который включает введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности изобретения, нанотела изобретения, полипептида изобретения, соединения изобретения, конструкции изобретения и/или содержащей их фармацевтической композиции.

Более конкретно изобретение касается способа профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания и/или нарушения, выбранного из группы, состоящей из перечисленных здесь заболеваний и нарушений, который включает введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности изобретения, нанотела изобретения, полипептида изобретения, соединения изобретения, конструкции изобретения и/или содержащей их фармацевтической композиции.

В частности, настоящее изобретение касается способа профилактики и/или лечения сепсиса, различных форм рака, резорбции костей, остеопороза, кахексии, псориаза, мезангиального пролиферативного гломерулонефрита, саркомы Капоши, связанной со СПИДом лимфомы, воспалительных заболеваний, который включает введение фармакологически активного количества аминокислотной последовательности изобретения, нанотела изобретения, полипептида изобретения и/или содержащей их фармацевтической композиции. Различные виды рака можно выбирать из группы, состоящей из множественной миеломы (ММ), почечно-клеточной карциномы (RCC), плазмоцитарной лейкемии, лимфомы, В-лимфопролиферативных нарушений (BLPD) и рака простаты. Воспалительные заболевания можно выбирать из группы, состоящей из ревматоидного артрита, системного юношеского идиопатического артрита, гипергаммаглобулинемии, болезни Крона, язвенного колита, системной красной волчанки (SLE), рассеянного склероза, болезни Кэстлмана, IgM-гаммопатии, миксомы сердца, астмы, аллергической астмы и аутоиммунного инсулинозависимого сахарного диабета.

В одном предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается способа профилактики и/или лечения сепсиса, различных форм рака, резорбции костей, остеопороза, кахексии, псориаза, мезангиального пролиферативного гломерулонефрита, саркомы Капоши, связанной со СПИДом лимфомы и воспалительных заболеваний, который включает введение фармацевтически активного количества SEQ ID NO:70 и/или содержащей ее фармацевтической композиции. В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается способа предотвращения и/или лечения сепсиса, различных форм рака, резорбции костей, остеопороза, кахексии, псориаза, мезангиального пролиферативного гломерулонефрита, саркомы Капоши, связанной со СПИДом лимфомы и воспалительных заболеваний, который включает введение фармацевтически активного количества of SEQ ID NO:71 и/или содержащей ее фармацевтической композиции. Различные виды рака можно выбирать из группы, состоящей из множественной миеломы (ММ), почечно-клеточной карциномы (RCC), плазмоцитарной лейкемии, лимфомы, В-лимфопролиферативных нарушений (BLPD) и рака простаты. Воспалительные заболевания можно выбирать из группы, состоящей из ревматоидного артрита, системного юношеского идиопатического артрита, гипергаммаглобулинемии, болезни Крона, язвенного колита, системной красной волчанки (SLE), рассеянного склероза, болезни Кэстлмана, IgM-гаммопатии, миксомы сердца, астмы, аллергической астмы и аутоиммунного инсулинозависимого сахарного диабета.

В другом воплощении изобретение касается способа иммунотерапии, в частности пассивной иммунотерапии, который включает введение субъекту, страдающему или подвергающемуся риску возникновения указанных здесь заболеваний и нарушений, фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности изобретения, нанотела изобретения, полипептида изобретения, соединения изобретения, конструкции изобретения и/или содержащей их фармацевтической композиции.

В вышеизложенных способах аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, соединения и/или конструкции изобретения и/или содержащие их композиции могут вводиться любым подходящим способом, в зависимости от конкретной используемой фармацевтической формы или композиции. Так, аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, соединения и/или конструкции изобретения и/или содержащие их композиции могут вводиться, к примеру, перорально, парентерально (напр., внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно или любым другим способом введения в обход желудочно-кишечного тракта), через нос, через кожу, местно или при помощи свечей, ингаляций, что опять же зависит от используемой конкретной фармацевтической формы или композиции. Клиницист сможет выбрать подходящий способ введения и подходящую фармацевтическую форму или композицию, которую следует использовать при таком введении, в зависимости от заболевания и/или нарушения, которое нужно предотвратить или лечить, и других факторов, хорошо известных клиницистам.

Аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, соединения и/или конструкции изобретения и/или их содержащие композиции вводятся согласно режиму лечения, подходящему для профилактики и/или лечения заболевания и/или нарушения, которое нужно предотвратить или лечить. Клиницист в общем сможет определить подходящий режим лечения, тяжесть заболевания, которое нужно лечить, и/или тяжесть его симптомов, конкретные аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, соединения или конструкции изобретения, которые следует использовать, конкретный способ введения и конкретную фармацевтическую форму или композицию, которую следует использовать, возраст, пол, вес, диету, общее состояние пациента и подобные факторы, хорошо известные клиницистам.

В общем, режим лечения должен включать введение одной или нескольких аминокислотных последовательностей, нанотел, полипептидов, соединений и/или конструкций изобретения либо одной или нескольких композиций, их содержащих, в одной или нескольких фармацевтически эффективных дозах. Конкретное число вводимых доз может быть установлено клиницистом, опять же на основании факторов, приведенных выше.

В общем, для профилактики и/или лечения указанных здесь заболеваний и нарушений и в зависимости от конкретного заболевания или нарушения, которое следует лечить, потенциальной активности используемых конкретных аминокислотных последовательностей, нанотел, полипептидов, соединений и конструкций изобретения, конкретного способа введения и используемой конкретной фармацевтической формы или композиции, аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, соединения и конструкции изобретения в общем должны вводиться в количестве между 1 г и 0,01 мкг на кг веса тела в день, предпочтительно между 0,1 г и 0,1 мкг на кг веса тела в день, как-то 1, 10, 100, 1000 мкг на кг веса тела в день, либо непрерывно (напр., вливанием) в виде разовой суточной дозы, либо в виде нескольких дробных доз в течение дня. Клиницист в общем сможет определить подходящую суточную дозу в зависимости от факторов, указанных выше. Также должно быть ясно, что в конкретных случаях клиницист может и отойти от этих количеств, к примеру, на основании факторов, приведенных выше, и своего экспертного суждения. В общем, некоторые рекомендации по вводимым дозам можно получить из тех доз, которые обычно вводятся для сравнимых обычных антител или фрагментов антител против той же мишени и вводимых практически тем же способом, но принимая во внимание различия в сродстве/авидности, эффективности, биологическом распределении, времени полужизни и тому подобные факторы, хорошо известные специалистам.

Обычно в вышеизложенном способе применяется только одна аминокислотная последовательность, нанотело, полипептид, соединение или конструкция изобретения. Однако в рамки данного изобретения входит и применение двух или нескольких аминокислотных последовательностей, нанотел, полипептидов, соединений и/или конструкций изобретения в сочетании.

Аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, соединения и конструкции изобретения также можно применять в комбинации с одним или несколькими дополнительными фармацевтически активными соединениями или началами, т.е. в виде комбинированного режима лечения, который может давать или не давать синергический эффект. Опять же клиницист сможет выбрать такие дополнительные соединения или начала, а также подходящий комбинированный режим лечения на основании факторов, приведенных выше, и своего экспертного суждения.

В частности, аминокислотные последовательности, нанотела, полипептиды, соединения и конструкции изобретения можно применять в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями или началами, которые применяются или могут применяться для профилактики и/или лечения заболеваний и нарушений, указанных выше, в результате чего можно получить или не получить синергический эффект. Примеры таких соединений и начал, а также путей, способов и фармацевтических форм или композиций для их введения должны быть известны клиницистам.

При применении двух или нескольких субстанций или начал в составе комбинированного режима лечения их можно вводить одним и тем же способом введения или различными способами введения, практически в одно и то же время или в разное время (напр., практически одновременно, последовательно или по чередующейся схеме). Если субстанции или начала вводятся одновременно одним и тем же способом введения, то их можно вводить в виде отдельных фармацевтических форм или композиций либо в составе комбинированной формы или композиции, как это должно быть известно специалистам.

К тому же при применении двух или нескольких активных субстанций или начал в составе комбинированного режима лечения каждая из субстанций или начал может вводиться в том же количестве и тем же способом, что и при применении соединения или начала самих по себе, и такое комбинированное применение может давать или не давать синергический эффект. Однако, если комбинированное применение двух или нескольких активных субстанций или начал дает синергический эффект, то можно и уменьшить количество одной, нескольких или всех вводимых субстанций или начал, и при этом все же получить желательное терапевтическое действие. К примеру, это может быть полезно для избежания, ограничения или уменьшения любых нежелательных побочных явлений, связанных с применением одной или нескольких субстанций или начал, когда они применяются в своих обычных количествах, и при этом все же получить желательный фармацевтический или терапевтический эффект.

Эффективность режима лечения, применяемого согласно изобретению, можно определить и/или отслеживать любым способом, известным per se для данных заболеваний и/или нарушений, как это должно быть ясно клиницистам. Клиницист также сможет, когда это нужно и на индивидуальной основе, изменить или модифицировать конкретный режим лечения с тем, чтобы получить требуемый терапевтический эффект, избежать, ограничить или уменьшить нежелательные побочные эффекты и/или добиться подходящего баланса между достижением требуемого терапевтического эффекта, с одной стороны, и избежанием, ограничением или уменьшением нежелательных побочных эффектов, с другой.

В общем, следует придерживаться режима лечения до достижения требуемого терапевтического эффекта и/или так долго, пока будет сохраняться требуемый терапевтический эффект. Опять же, это может определить клиницист.

В другом аспекте изобретение касается применения аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или (моновалентной) конструкции изобретения при изготовлении фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного связанного с IL-6R заболевания.

Изобретение также касается применения аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или (моновалентной) конструкции изобретения при изготовлении фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного из заболеваний и нарушений, связанных с IL-6, IL-6R, комплексом IL-6/IL-6R и/или с сигнальными путями и/или биологическими функциями и реакциями, в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R; и/или для применения в одном или нескольких способах, описанных здесь.

Изобретение также касается применения аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или (моновалентной) конструкции изобретения при изготовлении фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания или нарушения, которое можно предотвратить и/или лечить путем модулирования IL-6, IL-6R, комплекса IL-6/IL-6R, их биологической или фармакологической активности и/или биологических или сигнальных путей, в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R.

Изобретение также касается применения аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или (моновалентной) конструкции изобретения при изготовлении фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания или нарушения, которое можно предотвратить и/или лечить введением пациенту аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или конструкции изобретения.

Более конкретно изобретение касается применения аминокислотной последовательности, нанотела, полипептида, соединения или конструкции изобретения при изготовлении фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения связанных с IL-6R заболеваний, в частности, для профилактики и/или лечения сепсиса, различных форм рака, резорбции костей, остеопороза, кахексии, псориаза, мезангиального пролиферативного гломерулонефрита, саркомы Капоши, связанной со СПИДом лимфомы, воспалительных заболеваний, которое включает введение фармакологически активного количества аминокислотной последовательности изобретения, нанотела изобретения, полипептида изобретения и/или содержащей их фармацевтической композиции. Различные виды рака можно выбирать из группы, состоящей из множественной миеломы (ММ), почечно-клеточной карциномы (RCC), плазмоцитарной лейкемии, лимфомы, В-лимфопролиферативных нарушений (BLPD) и рака простаты. Воспалительные заболевания можно выбирать из группы, состоящей из ревматоидного артрита, системного юношеского идиопатического артрита, гипергаммаглобулинемии, болезни Крона, язвенного колита, системной красной волчанки (SLE), рассеянного склероза, болезни Кэстлмана, IgM-гаммопатии, миксомы сердца, астмы, аллергической астмы и аутоиммунного инсулинозависимого сахарного диабета.

Изобретение также касается аминокислотных последовательностей, нанотел, соединений или конструкций, полипептидов, моновалентных конструкций изобретения или содержащих их фармацевтических композиций для применения в предотвращении и/или лечении по меньшей мере одного связанного с IL-6R заболевания и/или нарушения.

Изобретение также касается аминокислотных последовательностей, нанотел, соединений или конструкций, полипептидов, моновалентных конструкций изобретения или содержащих их фармацевтических композиций для применения в предотвращении и/или лечении по меньшей мере одного заболевания и/или нарушения, связанного с IL-6, IL-6R, комплексом IL-6/IL-6R, их биологической или фармакологической активностью и/или биологическими или сигнальными путями, в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R.

Изобретение также касается аминокислотных последовательностей, нанотел, соединений или конструкций, полипептидов, моновалентных конструкций изобретения или содержащих их фармацевтических композиций для применения в предотвращении и/или лечении по меньшей мере одного заболевания и/или нарушения, которое можно предотвратить и/или лечить путем модулирования IL-6, IL-6R, комплекса IL-6/IL-6R, их биологической или фармакологической активности и/или биологических или сигнальных путей, в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R.

Изобретение также касается аминокислотных последовательностей, нанотел, соединений или конструкций, полипептидов, моновалентных конструкций изобретения или содержащих их фармацевтических композиций для применения в предотвращении и/или лечении по меньшей мере одного заболевания и/или нарушения, которое можно предотвратить и/или лечить введением пациенту аминокислотной последовательности изобретения, нанотела изобретения или полипептида изобретения.

Изобретение также касается аминокислотных последовательностей, нанотел, соединений или конструкций, полипептидов, моновалентных конструкций изобретения или содержащих их фармацевтических композиций для применения в предотвращении и/или лечении сепсиса, различных форм рака, резорбции костей, остеопороза, кахексии, псориаза, мезангиального пролиферативного гломерулонефрита, саркомы Капоши, связанной со СПИДом лимфомы, воспалительных заболеваний, которое включает введение фармакологически активного количества аминокислотной последовательности изобретения, нанотела изобретения, полипептида изобретения и/или содержащей их фармацевтической композиции. Различные виды рака можно выбирать из группы, состоящей из множественной миеломы (ММ), почечно-клеточной карциномы (RCC), плазмоцитарной лейкемии, лимфомы, В-лимфопролиферативных нарушений (BLPD) и рака простаты. Воспалительные заболевания можно выбирать из группы, состоящей из ревматоидного артрита, системного юношеского идиопатического артрита, гипергаммаглобулинемии, болезни Крона, язвенного колита, системной красной волчанки (SLE), рассеянного склероза, болезни Кэстлмана, IgM-гаммопатии, миксомы сердца, астмы, аллергической астмы и аутоиммунного инсулинозависимого сахарного диабета.

Субъектом для лечения может быть любое теплокровное животное, но в особенности млекопитающее, более предпочтительно человек. Как это должно быть известно специалистам, субъектом для лечения должно быть лицо, страдающее или подвергающееся риску возникновения указанных здесь заболеваний и нарушений.

Опять же в такой фармацевтической композиции одна или несколько аминокислотных последовательностей, нанотел, полипептидов, соединений или конструкций изобретения также может комбинироваться соответствующим образом с одним или несколькими другими активными началами типа тех, что указаны здесь.

Настоящее изобретение далее раскрывается на следующих Примерах, которые никоим образом не должны восприниматься как ограничительные. Полное содержание всех ссылок (включая ссылки на литературу, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и находящиеся на рассмотрении патентные заявки), приведенных по всей заявке, настоящим прямо включено в нее путем ссылки, в частности, в отношении содержания вышеприведенных работ.

АСПЕКТЫ

Аспект 1. Аминокислотная последовательность, направленная против IL-6R, которая содержит один или несколько участков аминокислотных остатков, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса;

и/или

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

и/или

e) SEQ ID NO's:93-95; or

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

Аспект 2. Аминокислотная последовательность по аспекту 1, содержащая два или больше участков аминокислотных остатков, выбранных из следующего:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

и/или

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса;

и/или

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

с тем, что (i) когда первый участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно а) или b), то второй участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно с), d), е) или f); (ii) когда первый участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно с) или d), то второй участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно а), b), е) или f); либо (iii) когда первый участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно е) или f), то второй участок аминокислотных остатков соответствует одной из аминокислотных последовательностей согласно а), b), с) или d).

Аспект 3. Аминокислотная последовательность по аспекту 1 или 2, содержащая три или больше участков аминокислотных остатков, причем первый участок аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса;

второй участок аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из:

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса; и

третий участок аминокислотных остатков выбран из группы, состоящей из:

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Аспект 4. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-3, которая содержит иммуноглобулиновую складку или при соответствующих условиях способна образовать иммуноглобулиновую складку.

Аспект 5. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-4, которая является иммуноглобулиновой последовательностью.

Аспект 6. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-5, которая по существу состоит из 4 каркасных участков (от FR1 до FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность участков (от CDR1 до CDR4, соответственно), при этом:

- CDR1 выбран из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

и/или

- CDR2 выбран из группы, состоящей из:

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

и/или

- CDR3 выбран из группы, состоящей из:

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Аспект 7. Аминокислотная последовательность по аспекту 6, которая по существу состоит из 4 каркасных участков (от FR1 до FR4, соответственно) и 3 определяющих комплементарность участков (от CDR1 до CDR4, соответственно), при этом:

- CDR1 выбран из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:80-82; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:80-82, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

и

- CDR2 выбран из группы, состоящей из:

c) SEQ ID NO's:84-91; или

d) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84-91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса;

и

- CDR3 выбран из группы, состоящей из:

e) SEQ ID NO's:93-95; или

f) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-95, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

Аспект 8. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-7, которая содержит по меньшей мере:

a) SEQ ID NO:80; или

b) участок аминокислотных остатков, имеющий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:80, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

Аспект 9. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-8, которая содержит по меньшей мере один участок аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO's:84, 89 или 91; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:84, 89 или 91, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Аспект 10. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-9, которая содержит по меньшей мере:

a) SEQ ID NO:84; или

b) участок аминокислотных остатков, имеющий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:84, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

Аспект 11. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-10, которая содержит по меньшей мере один участок аминокислотных остатков, выбранный из следующего:

a) SEQ ID NO's:93-94; или

b) участков аминокислотных остатков, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:93-94, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Аспект 12. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-11, которая содержит по меньшей мере:

a) SEQ ID NO:93; или

b) участок аминокислотных остатков, имеющий не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:93, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая такой участок аминокислотных остатков, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с аминокислотной последовательностью, содержащей данный участок аминокислотных остатков без 2 или 1 аминокислотного отличия, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Аспект 13. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-12, которая содержит по меньшей мере два участка аминокислотных остатков, выбранные из следующего:

a. SEQ ID NO:80 и SEQ ID NO:84;

b. SEQ ID NO:80 и SEQ ID NO:93; или

с. SEQ ID NO:84 и SEQ ID NO:93.

Аспект 14. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-13, которая содержит SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:84 и SEQ ID NO:93.

Аспект 15. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-14, которая по существу состоит из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, происходящей из обычного четырехцепочечного антитела, или же по существу состоит из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, происходящей из антитела из тяжелой цепи.

Аспект 16. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-15, которая по существу состоит из доменного антитела (или аминокислотной последовательности, пригодной для использования в качестве доменного антитела), однодоменного антитела (или аминокислотной последовательности, пригодной для использования в качестве однодоменного антитела), антитела "dAb" (или аминокислотной последовательности, пригодной для использования в качестве dAb) или нанотела.

Аспект 17. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-16, выбранная из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:60-69;

b) последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех своих CDR от одной из SEQ ID NO's:60-69, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех своих CDR, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с одной из SEQ ID NO's:60-69, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

c) последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:60-69, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:60-69, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:60-69, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Аспект 18. Аминокислотная последовательность по аспекту 17, выбранная из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO's:65-69;

b) последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех своих CDR от одной из SEQ ID NO's:65-69, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех своих CDR, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с одной из SEQ ID NO's:65-69, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

c) последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:65-69, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:65-69, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:65-69, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Аспект 19. Аминокислотная последовательность по аспекту 18, выбранная из группы, состоящей из:

a) SEQ ID NO:66;

b) последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех своих CDR от SEQ ID NO:66, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех своих CDR, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению с одной из SEQ ID NO:66, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса;

c) последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO:66, при условии, что аминокислотная последовательность, содержащая не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от SEQ ID NO's:66, связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению со связыванием SEQ ID NO:66, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Аспект 20. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-19, которая специфически связывается с hIL-6R с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше.

Аспект 21. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-20, которая специфически связывается с cynoIL-6R с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше.

Аспект 22. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-21, которая специфически связывается с HIL-6R с константой скорости kon от 104 M-1s-1 до 107 М-1s-1, предпочтительно от 105 M-1s-1 до 107 M-1s-1, более предпочтительно около 106 M-1s-1 или больше.

Аспект 23. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-22, которая специфически связывается с cynoIL-6R с константой скорости kon от 104 M-1s-1 до 107 М-1s-1, предпочтительно от 107 M-1s-1 до 107 M-1s-1, более предпочтительно около 106 М-ls-l или больше.

Аспект 24. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-23, которая специфически связывается с hIL-6R с константой скорости koff от 10-3 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше.

Аспект 25. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-24, которая специфически связывается с cynoIL-6R с константой скорости koff от 10-3 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше.

Аспект 26. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-25, которая при определении методом TF-1 имеет значение IC50 (при 100 ME IL-6/мл) между 10 нМ и 50 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 50 пМ, более предпочтительно между 1 нМ и 50 пМ или меньше, как-то около 750 или 500 пМ или меньше.

Аспект 27. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-26, которая при определении методом TF-1 имеет значение IC50 (при 5000 ME IL-6/мл) между 50 нМ и 1 нМ, предпочтительно между 25 нМ и 1 нМ, более предпочтительно между 10 нМ и 1 нМ или меньше, как-то около 8 нМ или меньше.

Аспект 28. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-27, которая при определении методом TF-1 имеет значение IC50, которое по крайней мере такое же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4.

Аспект 29. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-28, которая при определении методом TF-1 имеет значение IC50, которое по крайней мере такое же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для Tocilizumab (MRA).

Аспект 30. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-29, которая при определении методом активности в плазме при значении EC50 для IL-6 имеет значение IC50 между 500 пМ и 50 пМ, предпочтительно между 250 пМ и 50 пМ, более предпочтительно между 200 пМ и 50 пМ или меньше, как-то 150 пМ или меньше.

Аспект 31. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-30, которая при определении методом активности в плазме при значении EC50 для IL-6 имеет значение IC50 между 1000 пМ и 100 пМ, предпочтительно между 750 пМ и 100 пМ, более предпочтительно между 500 пМ и 100 пМ или меньше, как-то 400 пМ или меньше.

Аспект 32. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-31, которая при определении методом активности в плазме по аспекту 30 или 31 имеет значение IC50, которое по крайней мере такое же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4.

Аспект 33. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-32, которая при определении методом активности в плазме по аспекту 30 или 31 имеет значение IC50, которое по крайней мере такое же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для Tocilizumab (MRA).

Аспект 34. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-33, которая имеет значение IC50 для связывания с мембранным IL-6R на клетках СНО между 10 нМ и 100 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 100 пМ, более предпочтительно между 2 нМ и 10 пМ или меньше, как-то 2 нМ или меньше.

Аспект 35. Соединение или конструкция, которая содержит или по существу состоит из одной или нескольких аминокислотных последовательностей по любому из аспектов 1-34 и необязательно дополнительно содержит одну или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания, необязательно соединенных через один или несколько линкеров.

Аспект 36. Соединение или конструкция по аспекту 35, в которой данные одна или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания выбраны из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, пригодных для использования в качестве доменных антител, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, пригодных для использования в качестве однодоменных антител, "dAb", аминокислотных последовательностей, пригодных для использования в качестве dAb, или нанотел.

Аспект 37. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-36, которая является мультивалентной конструкцией, такой, напр., как двухвалентная или трехвалентная конструкция.

Аспект 38. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-37, которая является мультиспецифичной конструкцией, такой, напр., как биспецифичная или триспецифичная конструкция.

Аспект 39. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-39, которая обладает увеличенным временем полужизни по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью по любому из аспектов 1-34 per se.

Аспект 40. Соединение или конструкция по аспекту 39, в которой данные одна или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания придают соединению или конструкции увеличенное время полужизни по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью по любому из аспектов 1-20.

Аспект 41. Соединение или конструкция по аспекту 39, в которой данные одна или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания, придающих соединению или конструкции увеличенное время полужизни, выбраны из группы, состоящей из белков сыворотки или их фрагментов, единиц связывания, способных связываться с белками сыворотки, Fc-части и небольших белков или пептидов, способных связываться с сывороточными белками.

Аспект 42. Соединение или конструкция по аспекту 39, в которой данные одна или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания, придающих соединению или конструкции увеличенное время полужизни, выбраны из группы, состоящей из сывороточного альбумина человека или его фрагментов.

Аспект 43. Соединение или конструкция по аспекту 39, в которой данные одна или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания, придающих соединению или конструкции увеличенное время полужизни, выбраны из группы, состоящей из единиц связывания, способных связываться с сывороточным альбумином (как-то сывороточным альбумином человека) или сывороточным иммуноглобулином (как-то IgG).

Аспект 44. Соединение или конструкция по аспекту 39, в которой данные одна или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания, придающих соединению или конструкции увеличенное время полужизни, выбраны из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, пригодных для использования в качестве доменных антител, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, пригодных для использования в качестве однодоменных антител, антител "dAb", аминокислотных последовательностей, пригодных для использования в качестве dAb, или нанотел, способных связываться с сывороточным альбумином (как-то сывороточным альбумином человека) или сывороточным иммуноглобулином (как-то IgG).

Аспект 45. Соединение или конструкция по аспекту 39, в которой данные одна или несколько других групп, остатков, молекул или единиц связывания, придающих соединению или конструкции увеличенное время полужизни, выбраны из SEQ ID NO's:97-99.

Аспект 46. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-45, выбранная из следующих полипептидных последовательностей:

a) SEQ ID NO's:70-72;

b) полипептидных последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех участках CDR изобретения от одной из SEQ ID NO's:70-72, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием в одном, двух или всех участках CDR изобретения связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:70-72, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

c) полипептидных последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:70-72, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием от одной из SEQ ID NO's:70-72 связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:70-72, причем сродство измеряется методом поверхностного плазмонного резонанса.

Аспект 47. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-46, выбранная из следующих полипептидных последовательностей:

a) SEQ ID NO's:70-71;

b) полипептидных последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия в одном, двух или всех участках CDR изобретения от одной из SEQ ID NO's:70-71, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием в одном, двух или всех участках CDR изобретения связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:70-71, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

c) полипептидных последовательностей, имеющих не более 2, предпочтительно не более 1 аминокислотного отличия от одной из SEQ ID NO's:70-71, при условии, что полипептидная последовательность не более чем с 2, предпочтительно не более чем с 1 аминокислотным отличием от одной из SEQ ID NO's:70-71 связывается с IL-6R примерно с таким же или большим сродством по сравнению со связыванием одной из SEQ ID NO's:70-71, причем сродство измеряется методом поверхностного плазменного резонанса.

Аспект 48. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-47, которая содержит или по существу состоит из SEQ ID NO:70.

Аспект 49. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-47, которая содержит или в основном состоит из SEQ ID NO:71.

Аспект 50. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-49, которая специфически связывается с hIL-6 с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше.

Аспект 51. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-50, которая специфически связывается с cynoIL-6 с константой диссоциации (KD) от 1 нМ до 1 пМ или меньше, предпочтительно от 500 пМ до 1 пМ или меньше, более предпочтительно от 100 пМ до 1 пМ или меньше и еще более предпочтительно от 50 пМ до 1 пМ или меньше.

Аспект 52. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-51, которая специфически связывается с hIL-6R с константой скорости kon от 104 М-1s-1 до 107 М-1s-1, предпочтительно от 105 М-1s-1 до 107 М-1s-1, более предпочтительно около 106 M-1s-1 или больше.

Аспект 53. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-52, которая специфически связывается с cynoIL-6R с константой скорости kon от 104 М-1s-1 до 107 M-1s-1, предпочтительно от 105 М-1s-1 до 107 М-1s-1, более предпочтительно около 106 М-1s-1 или больше.

Аспект 54. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-53, которая специфически связывается с hIL-6R с константой скорости koff от 10-3 s-1 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше.

Аспект 55. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-54, которая специфически связывается с cynoIL-6R с константой скорости koff от 10-3 s-1 (t½=0,69 сек) до 10-6 s-1 (давая почти необратимый комплекс с t½ в несколько дней), предпочтительно от 10-4 s-1 до 10-6 s-1, более предпочтительно от 10-5 s-1 до 10-6 s-1, как-то около 10-5 s-1 или меньше.

Аспект 56. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-55, которая при определении методом TF-1 имеет значение IC50 (при 100 ME IL-6/мл) между 10 нМ и 50 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 50 пМ, более предпочтительно между 1 нМ и 50 пМ или меньше, как-то около 750 или 500 пМ или меньше.

Аспект 57. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-56, которая при определении методом TF-1 имеет значение IC50 (при 5000 ME IL-6/мл) между 50 нМ и 1 нМ, предпочтительно между 25 нМ и 1 нМ, более предпочтительно между 10 нМ и 1 нМ или меньше, как-то около 8 нМ или меньше.

Аспект 58. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-57, которая при определении методом TF-1 имеет значение IC50, которое по крайней мере такое же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4.

Аспект 59. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-58, которая при определении методом TF-1 имеет значение IC50, которое по крайней мере такое же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для Tocilizumab (MRA).

Аспект 60. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-59, которая при определении методом активности в плазме при значении ЕС50 для IL-6 имеет значение IC50 между 500 пМ и 50 пМ, предпочтительно между 250 пМ и 50 пМ, более предпочтительно между 200 пМ и 50 пМ или меньше, как-то 150 пМ или меньше.

Аспект 61. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-60, которые при определении методом активности в плазме при значении ECos для IL-6 имеет значение IC50 между 1000 пМ и 100 пМ, предпочтительно между 750 пМ и 100 пМ, более предпочтительно между 500 пМ и 100 пМ или меньше, как-то 400 пМ или меньше.

Аспект 62. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-61, которая при определении методом активности в плазме по аспекту 60 или 61 имеет значение IC50, которое по крайней мере такое же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для контрольного IgG, приведенного в SEQ ID NO:1 и 2, или контрольного Fab, приведенного в SEQ ID NO:3 и 4.

Аспект 63. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-62, которая при определении методом активности в плазме по аспекту 60 или 61 имеет значение IC50, которое по крайней мере такое же или предпочтительно лучше по меньшей мере в два раза, предпочтительно в три раза, более предпочтительно в четыре раза, еще более предпочтительно в 5 раз, в 7 раз или больше чем 7 раз по сравнению со значением IC50, полученным для Tocilizumab (MRA).

Аспект 64. Соединение или конструкция по любому из аспектов 35-63, которая имеет значение IC50 для связывания с мембранным IL-6R на клетках СНО между 10 нМ и 100 пМ, предпочтительно между 5 нМ и 100 пМ, более предпочтительно между 2 нМ и 10 пМ или меньше, как-то 2 нМ или меньше.

Аспект 65. Моновалентная конструкция, содержащая или по существу состоящая из одной аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34.

Аспект 66. Применение аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34 или моновалентной конструкции по аспекту 65 при получении мультивалентного соединения или конструкции по любому из аспектов 37-64.

Аспект 67. Способ получения аминокислотной последовательности по любому из аспектов 37-64, включающий связывание аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34 или моновалентной конструкции по аспекту 65 с одной или несколькими группами, остатками, молекулами или единицами связывания.

Аспект 68. Способ по аспекту 67 для получения мультивалентного соединения или конструкции по любому из аспектов 37-64, включающий связывание аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34 или моновалентной конструкции по аспекту 65 с другими группами, остатками, молекулами или единицами связывания через один или несколько линкеров.

Аспект 69. Нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность по любому из аспектов 1-34 либо соединение или конструкцию по любому из аспектов 35-64, которая может быть получена при экспрессии кодирующей ее нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности или моновалентной конструкции по аспекту 65.

Аспект 70. Нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность по аспекту 69, которая находится в виде генетической конструкции.

Аспект 71. Хозяин или клетка-хозяин, которые экспрессируют или при соответствующих условиях способны экспрессировать аминокислотную последовательность по любому из аспектов 1-34, соединение или конструкцию по любому из аспектов 35-64, которая может быть получена при экспрессии кодирующей ее нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, или моновалентную конструкцию по аспекту 65; и/или которые содержат нуклеиновую кислоту или нуклеотидную последовательность по аспекту 69 или генетическую конструкцию по аспекту 70.

Аспект 72. Способ получения аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34, соединения или конструкции по любому из аспектов 35-64, которая может быть получена при экспрессии кодирующей ее нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, или моновалентной конструкции по аспекту 65; причем способ по крайней мере включает стадии:

a) экспрессирования в подходящих клетках-хозяевах или организме-хозяине или в другой подходящей системе экспрессии нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности по аспекту 69 или генетической конструкции по аспекту 70;

необязательно с последующим:

b) выделением и/или очисткой полученной при этом аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34, соединения или конструкции по любому из аспектов 35-64, которая может быть получена при экспрессии кодирующей ее нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, или моновалентной конструкции по аспекту 65.

Аспект 73. Способ получения аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34, соединения или конструкции по любому из аспектов 35-64, которая может быть получена при экспрессии кодирующей ее нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, или моновалентной конструкции по аспекту 65; причем способ по крайней мере включает стадии:

а) культивирования и/или содержания хозяина или клетки-хозяина по аспекту 71 в таких условиях, при которых данный хозяин или клетка-хозяин экспрессируют и/или продуцируют по меньшей мере одну аминокислотную последовательности по любому из аспектов 1-34, соединение или конструкцию по любому из аспектов 35-64, которая может быть получена при экспрессии кодирующей ее нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, или моновалентную конструкцию по аспекту 65;

необязательно с последующим:

b) выделением и/или очисткой полученной при этом аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34, соединения или конструкции по любому из аспектов 35-64, которая может быть получена при экспрессии кодирующей ее нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, или моновалентной конструкции по аспекту 65.

Аспект 74. Композиция, содержащая по меньшей мере одну аминокислотную последовательность по любому из аспектов 1-34, соединение или конструкцию по любому из аспектов 35-64, моновалентную конструкцию по аспекту 65 либо нуклеиновую кислоту или нуклеотидную последовательность по аспекту 69 или 70.

Аспект 75. Композиция по аспекту 74, которая является фармацевтической композицией.

Аспект 76. Композиция по аспекту 74, которая является фармацевтической композицией и дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или адъювант и необязательно содержит один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.

Аспект 77. Способ профилактики и/или лечения по меньшей мере одного из заболеваний или нарушений, связанных с IL-6, IL-6R, комплексом IL-6/IL-6R и/или сигнальными путями и/или биологическими функциями и реакциями, в которых участвует IL-6, IL-6R или комплекс IL-6/IL-6R, который включает введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтически активного количества по меньшей мере одной аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34, соединения или конструкции по любому из аспектов 35-64, моновалентной конструкции по аспекту 65 или композиции по любому из аспектов 75-76.

Аспект 78. Способ по аспекту 77, в котором заболевания и нарушения, связанные с IL-6, IL-6R, комплексом IL-6/IL-6R и/или сигнальными путями и/или биологическими функциями и реакциями, в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R, выбирают из группы, включающей сепсис, различные формы рака, резорбцию костей, остеопороз, кахексию, псориаз, мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, саркому Капоши, связанную со СПИДом лимфому и воспалительные заболевания.

Аспект 79. Способ по аспекту 78, в котором различные формы рака выбирают из группы, содержащей множественную миелому (ММ), почечно-клеточную карциному (RCC), плазмоцитарную лейкемию, лимфому, В-лимфопролиферативные нарушения (BLPD) и рак простаты.

Аспект 80. Способ по аспекту 78, в котором воспалительные заболевания выбирают из группы, состоящей из ревматоидного артрита, системного юношеского идиопатического артрита, гипергаммаглобулинемии, болезни Крона, язвенного колита, системной красной волчанки (SLE), рассеянного склероза, болезни Кэстлмана, IgM-гаммопатии, миксомы сердца, астмы, аллергической астмы и аутоиммунного инсулинозависимого сахарного диабета.

Аспект 81. Способ профилактики и/или лечения по меньшей мере одного из заболеваний или нарушений, которые можно предотвратить или лечить введением нуждающемуся в этом субъекту аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34, соединения или конструкции по любому из аспектов 35-64 или моновалентной конструкции по аспекту 65, при этом способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтически активного количества по меньшей мере одной аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34, соединения или конструкции по любому из аспектов 35-64, моновалентной конструкции по аспекту 65 или композиции по любому из аспектов 75-76.

Аспект 82. Применение аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34, соединения или конструкции по любому из аспектов 35-64 или моновалентной конструкции по аспекту 65 при получении фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного из заболеваний или нарушений, связанных с IL-6, IL-6R, комплексом IL-6/IL-6R и/или сигнальными путями и/или биологическими функциями и реакциями, в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R; и/или для применения в одном или нескольких способах по аспектам 77-81.

Аспект 83. Аминокислотная последовательность по любому из аспектов 1-34, соединение или конструкция по любому из аспектов 35-64 или моновалентная конструкция по аспекту 65 для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного из заболеваний или нарушений, связанных с IL-6, IL-6R, комплексом IL-6/IL-6R и/или сигнальными путями и/или биологическими функциями и реакциями, в которых участвует IL-6, IL-6R и/или комплекс IL-6/IL-6R; и/или для применения в одном или нескольких способах по аспектам 77-81.

Аспект 84. Производное аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34, соединения или конструкции по любому из аспектов 35-64 или моновалентной конструкции по аспекту 65.

Аспект 85. Производное по аспекту 84, способное специфически связываться с IL-6R.

Аспект 86. Производное по любому из аспектов 84-85, у которого время полужизни в сыворотке по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, как-то по меньшей мере в 5 раз, к примеру, по меньшей мере в 10 раз или больше чем 20 раз больше, чем время полужизни соответствующей аминокислотной последовательности по любому из аспектов 1-34 per se, соединения или конструкции по любому из аспектов 35-64 per se или моновалентной конструкции по аспекту 65 per se.

Аспект 87. Производное по любому из аспектов 84-86, у которого время полужизни в сыворотке увеличено более чем на 1 час, предпочтительно более чем на 2 часа, более предпочтительно более чем на 6 часов, как-то более чем на 12 часов или даже более чем на 24, 48 или 72 часа по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью по любому из аспектов 1-34 per se, соединением или конструкцией по любому из аспектов 35-64 per se или моновалентной конструкцией по аспекту 65 per se.

Аспект 88. Производное по любому из аспектов 84-87, у которого время полужизни в сыворотке человека составляет по меньшей мере 12 часов, предпочтительно по меньшей мере 24 часа, более предпочтительно по меньшей мере 48 часов, еще более предпочтительно по меньшей мере 72 часа или больше; например, по меньшей мере 5 дней (как-то от 5 до 10 дней), предпочтительно по меньшей мере 9 дней (как-то от 9 до 14 дней), более предпочтительно по меньшей мере 10 дней (как-то от 10 до 15 дней) или по меньшей мере 11 дней (как-то от 11 до 16 дней), более предпочтительно по меньшей мере 12 дней (как-то от 12 до 18 дней или больше) или больше чем 14 дней (как-то от 14 до 19 дней).

Аспект 89. Производное по любому из аспектов 84-88, которое является пегилированным производным.

Аспект 90. Композиция, содержащая по меньшей мере одно производное по любому из аспектов 84-89.

ПРИМЕРЫ

I. Выделение связывающих IL-6R панотел

Пример 1. Материалы

Материалы, использовавшиеся для выделения связывающих IL-6R нанотел, приведены в табл.С-1.

Были созданы два репрезентативных иммуноглобулина против IL-6R человека, описанные в ЕР 0628639 (Fab-фрагмент и полный IgG), которые использовались в качестве контрольных соединений. Fab-фрагмент и полный IgG конструировали на основе L-цепи, названной "RVLa" (см. ЕР 0628639 В1, табл.2, версия (а)), и Н-цепи, названной "RVHf" (см. ЕР 0628639 В1, табл.3, версия (f)). Именно эта L-цепь и эта Н-цепь были выбраны для конструирования контрольных соединений потому, что согласно ЕР 0628639 В1 (к примеру, см. абзац [0074]) перестроенное человеческое антитело, содержащее данную L-цепь и данную Н-цепь, проявляло способность к связыванию с IL-6R человека на том же уровне, что и РМ1, моноклональное антитело мыши против IL-6R человека (опять же см. ЕР 0628639 В1, абзац [009] и приведенные в нем дополнительные ссылки).

Полный контрольный IgG состоял из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1 (тяжелая цепь) и SEQ ID NO:2 (легкая цепь). Fab-фрагмент состоял из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:3 (участки VLb и VHf тяжелой цепи, слитые с участком CH1 из IgG1 человека) и SEQ ID NO:4 (вариабельная область легкой цепи перестроенного человеческого РМ-1, слитая с Ckappa человека).

Кодирующие фрагменты ДНК получали методом сборочной ПЦР (assembly PCR) с помощью частично перекрывающихся олигонуклеотидов. Продукты ПЦР клонировали в единый двухцистронный вектор, позволяющий экспрессировать функциональные, соединенные дисульфидной связью Fab-фрагменты в периплазме Е. coli. Полный IgG продуцировали в клетках СНО, трансфецированных 2 экспрессирующими векторами, содержащими гены легкой и тяжелой цепи. Ген, кодирующий тяжелую цепь, получали путем слияния VHf с константной областью IgG1 человека. Легкая цепь описана в ЕР 0628639.

Пример 2. Иммунизация

Иммунизировали двух лам (81 и 82) с помощью IL-6R человека (Peprotech) по схеме иммунизации, приведенной в табл.С-2.

По завершении графика иммунизации у каждого животного анализировали иммунные ответы методом ELISA. Для этого на покрытом нейтравидином микропланшете фиксировали биотинилированный IL-6R (2 мкг/мл). Добавляли серийные разведения образцов сыворотки, взятых через 0, 28, 39 и 43 дня (начальное разведение 1:500), и детектировали связанный IgG ламы добавлением меченных HRP козьих антител против IgG ламы. В качестве субстрата использовали ТМВ. Результаты представлены на Фиг.1.

Иммунные ответы также анализировали методом FACS: серийные разведения (начальное разведение 1:100) образцов сыворотки, взятых через 0, 28 и 43 дня, инкубировали с клетками U266 (миелома человека). Связанный IgG ламы детектировали с помощью меченных FITC козьих антител против IgG ламы. Результаты представлены на Фиг.2.

В целом эти данные свидетельствуют, что у обоих животных выработался хороший иммунный ответ против IL-6R, и по меньшей мере часть IgG ламы распознает IL-6R на поверхности клеток U266.

Пример 3. Конструирование библиотек

Для амплификации кодирующих нанотела фрагментов генов в качестве исходного материала для RT-PCR использовали РНК, выделенную из PBLs и лимфатических узлов. Эти фрагменты клонировали в экспрессионный вектор, происходящий из pUC119, который содержал промотор LacZ, кодирующую последовательность белка pill колифага, ген устойчивости к ампициллину или карбенициллину, сайт множественного клонирования и лидерную последовательность gen3. В одной рамке с кодирующей последовательностью нанотела вектор кодировал С-концевую метку с-myc и метку (His)6. Фаг получали по стандартной методике и после стерилизации фильтрованием хранили при 4°С для дальнейшего использования. Характеристики сконструированных библиотек приведены в табл.С-3.

Пример 4. Отбор

Отбор из вышеприведенных библиотек проводили с использованием различных условий, приведенных в табл.С-4.

При всех условиях проводили только один цикл отбора. Каждый продукт отбора анализировали на степень обогащения (содержание фага в элюате относительно контроля), разнообразие (профиль HinfI) и процент IL-6R-положительных клонов (ELISA). По этим параметрам отбирали наилучшие выборки для дальнейшего анализа. Для этого продукцию из каждого отбора снова клонировали в виде пула в экспрессионный вектор, происходящий из pUC119, который содержал промотор LacZ, ген устойчивости к ампициллину или карбенициллину, сайт множественного клонирования и лидерную последовательность gen3. В одной рамке с кодирующей последовательностью нанотела вектор кодировал С-концевую метку с-myc и метку (His)6. Отбирали колонии и культивировали их в глубоких 96-луночных планшетах (объем 1 мл), а затем индуцировали экспрессию нанотел добавлением IPTG. Периплазматические экстракты получали по стандартной методике.

Пример 5. Скрининг

Периплазматические экстракты сначала анализировали на их способность к ингибированию взаимодействия IL-6/IL-6R. Для этого составляли 2 независимые пробы для определения методом Alphascreen, которые схематически представлены на Фиг.3. В пробе 1 Периплазматические экстракты инкубировали с растворимым рецептором IL-6 (1 нМ), биотинилированным IL-6 (3 нМ), покрытыми стрептавидином донорными шариками и покрытыми MAb BN-12 акцепторными шариками (20 мкг/мл). Нанотела, положительные при этом определении, могли ингибировать либо взаимодействие IL-6/IL-6R, либо взаимодействие IL-6R/MAb BN-12. Чтобы различить эти 2 возможности, составляли вторую пробу (проба 2). В этой пробе периплазматические экстракты инкубировали с биотинилированным IL-6R (0,3 нМ), покрытыми стрептавидином донорными шариками и покрытыми MAb BN-12 акцепторными шариками (10 мкг/мл). Нанотела, оказавшиеся положительными в пробе 1, но отрицательными в пробе 2, считались ингибиторами IL-6/IL-6R.

В обеих пробах периплазматические экстракты разводили в 25 раз, что примерно соответствует конечной концентрации 40 нМ. Статистическая сводка по программе скрининга представлена в приведенной ниже табл.С-5. Нанотела, проявляющие самое сильное ингибирование, отбирали для анализа константы скорости koff на приборе Biacore и секвенирования ДНК. На Фиг.4 представлены белковые последовательности ингибиторных нанотел, отобранных для дальнейшего анализа на клетках. В табл.С-6 приведены значения koff для этих ингибиторных нанотел.

Пример 6. Экспрессирование и очистка нанотел

Отобранные нанотела экспрессировали в Е. coli в виде белков с метками с-myc и (His)6 в культурах объемом 50 или 250 мл. Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ IPTG и продолжали в течение 4 ч при 37°С. После центрифугирования клеточных культур готовили периплазматические экстракты путем замораживания-оттаивания осадков. Эти экстракты использовали в качестве исходного материала для аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC). Нанотела элюировали из колонки с помощью 150 мМ имидазола, после чего подвергали диализу против PBS. Общий выход и выход на 1 л культуры клеток приведен в табл.С-7. SDS-PAGE очищенных нанотел (кроме РМР28Е11) представлен на Фиг.5.

Пример 7. Анализ конкуренции меяеду белками

14 очищенных нанотел тестировали методом Alphascreen на ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R. К IL-6R (0,3 нМ) добавляли серийные разведения очищенных белков (диапазон концентраций: 500 нМ - 10 пМ) и инкубировали в течение 15 мин. После этого добавляли 3 нМ биотинилированного IL-6 и покрытые BN-12 акцепторные шарики и эту смесь инкубировали в течение 1 часа. Наконец, добавляли стрептавидиновые донорные шарики и после 1 часа инкубации считывали планшет на считывающем устройстве Envision. В качестве контроля включали BR-6 и Fab-фрагмент, описанный в Примере 1. Результаты представлены на Фиг.6.

Для всех 14 нанотел наблюдались кривые доза-эффект со значениями IC50 в пределах от 48 пМ до 1,7 нМ (табл.С-8). Самыми сильными нанотелами в этом методе оказались РМР32С9 и РМР35Н4. Для РМР33А3 достигалось лишь частичное (-50%) ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R.

Пример 8. Определение сродства у полученных нанотел

Константы сродства (Kd) индивидуальных нанотел и контрольного Fab-фрагмента, описанного в Примере 1, определяли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе Biacore 3000. Вкратце, на сенсорном чипе СМ5 фиксировали IL-6R через аминогруппу при плотности 800-1000 отн. ед. Нанотела впрыскивали при 5 различных концентрациях между 1 и 50 пМ. Скорость протока составляла 45 мкл/мин во всех экспериментах. Фазы ассоциации и диссоциации составляли 3 и 10 мин, соответственно. Чип регенерировали с помощью глицин/HCl рН 1,5. Кривые связывания при различных концентрациях нанотел использовали для расчета кинетических параметров kon, koff и Kd (табл.С-9).

Пример 9. Активность нанотел на клетках XG1

Все очищенные нанотела тестировали методом XG1. XG1 - это IL-6-зависимая линия клеток миеломы человека. Полумаксимальная пролиферация достигается при ~20 пг/мл IL-6. Определения в основном проводили, как описано Zhang et al. (1994, Blood 83: 3654-3663). В качестве контроля включали контрольный Fab-фрагмент, описанный в Примере 1. Значения IC50 составляли от 90 пМ до 50 нМ (приведены в табл.С-10). Небольшую подгруппу нанотел также тестировали этим методом в присутствии 1 мг/мл HSA.

Пример 10. Активность нанотел на клетках TF-1

Нанотела также тестировали на их способность к ингибированию IL-6-зависимой пролиферации клеток TF-1 (ЕСАСС no.93022307; 1989, J. Cell Physiol., 140: 323; 1993, Exp. Cell Res., 208: 35) путем блокирования связывания IL-6 с IL-6R на поверхности клеток. Для этого серийные разведения нанотел проинкубировали с фиксированным количеством клеток TF-1 в течение 2 часов при 37°С. После этого добавляли IL-6 до конечной концентрации 2 нг/мл. IL-6-зависимая пролиферация клеток продолжалась в течение 72 часов, а ее измеряли по включению меченного тритием тимидина. Значения IC50 приведены в табл.С-11.

Пример 11. Конкуренция с контрольным Fab за связывание с IL-6R

Все 14 нанотел анализировали на их способность к ингибированию связывания контрольного Fab, описанного в Примере 1, с IL-6R при определении на основе метода Alphascreen. В этом методе 100 нМ очищенных нанотел инкубировали с 0,4 нМ биотинилированного IL-6R. Добавляли покрытые контрольным Fab акцепторные шарики и покрытые стрептавидином донорные шарики и измеряли концентрацию комплекса контрольный Fab/IL-6R. Значения, полученные в присутствии нанотел, сравнивали с контролем, в который не добавляли нанотела, получая соотношения между 2 значениями, выраженные в %, которые приведены в табл.С-12. Все нанотела, кроме IL6R03, не проявляли или проявляли лишь частичное ингибирование связывания контрольного Fab с IL-6R, что означает, что их эпитопы не перекрываются или только частично перекрываются с эпитопом контрольного Fab.

Пример 12. Связывание нанотел с клетками U266

Связывание нанотел с мембраносвязанным IL-6R, экспрессированным на клетках U266, анализировали методом FACS. Анализ проводили на очищенных нан отелах из отобранных клонов (IL6R04, IL6R09, IL6R11, IL6R13 и IL6R14). Результаты представлены на Фиг.7. Все нанотела связывались с экспрессированным на поверхности клеток IL-6R человека.

Пример 13. Связывание нанотел с IL-6R из плазмы человека

Растворимый IL-6R присутствует в плазме человека в концентрации 80-400 нг/мл. Чтобы установить, будут ли нанотела IL6R03, IL6R04 и IL6R13 связываться с IL-6R из плазмы, исследовали эффект плазмы человека на связывание нанотел с клетками U266. Плазма человека ингибировала связывание с клетками U266, свидетельствуя, что все 3 нанотела способны связываться с IL-6R из плазмы человека (см. Фиг.8).

Пример 14. Перекрестная реактивность нанотел к IL-6R мыши

Перекрестную реактивность нанотел к IL-6R мыши анализировали методом ELISA. Для этого 500 нМ нанотел наносили на микропланшет, покрытый IL-6R мыши и человека при 1 мкг/мл. Детектирование осуществляли с помощью антител против туе и против мыши с HRP в качестве первого и второго антитела, соответственно. На Фиг.10 представлены оптические плотности. Ни у одного из исследованных нанотел не наблюдалось связывания с IL-6R мыши.

Пример 15. Сводка по выделению связывающих IL-6R нанотел

Иммунизация 2 лам рекомбинантным IL-6R дала комплект из 14 уникальных нанотел, способных блокировать взаимодействие между IL-6 и IL-6R. Этот комплект подвергали подробному анализу и на основании всех экспериментальных данных для дальнейшей разработки были отобраны нанотела IL6R03, IL6R04 и IL6R13. Наиболее важные характеристики нанотел приведены в табл.С-13.

II. Форматирование нанотел против IL-6R

Пример 16. Получение мультивалентных конструкций

Нанотела против IL-6R, описанные в предыдущих разделах, также экспрессировали в виде биспецифичных конструкций, состоящих из С-концевого напотела против SA (ALB1), линкера из 9 аминокислот Gly/Ser и N-концевого напотела против IL-6R. Кроме того, сконструировали 4 трехвалентные, биспецифичные нанотела, состоящие из С-концевого и N-концевого нанотела против IL-6R и нанотела против SA (ALB1) посредине, которые все соединяются через линкеры из 9 аминокислот Gly/Ser. IDs этих нанотел приведены в табл.С-14.

Пример 17. Экспрессирование биспецифичных нанотел против IL-6R

Конструкции для биспецифичных нанотел экспрессировали в Е. coli в виде белков с метками с-тус и (His)6, а затем очищали из культуральной среды методами аффинной хроматографии с иммобилизованным ионом металла (IMAC) и эксклюзионной хроматографии (SEC). Общий выход и выход на 1 л культуры клеток приведен в табл.С-15. SDS-PAGE очищенных нанотел представлен на Фиг.11.

Пример 18. Анализ конкуренции меяаду белками

Очищенные биспецифичные нанотела тестировали методом Alphascreen на ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R. К IL-6R (0,3 нМ) добавляли серийные разведения очищенных белков (диапазон концентраций: 250 нМ-5 пМ) и инкубировали в течение 15 мин. После этого добавляли 3 нМ биотинилированного IL-6 и покрытые BN-12 акцепторные шарики и эту смесь инкубировали в течение 1 часа. Наконец, добавляли стрептавидиновые донорные шарики и после 1 часа инкубации считывали планшет на считывающем устройстве Envision. В качестве контроля включали BR-6 и Fab-фрагмент, описанный в Примере 1. Результаты представлены на Фиг.12.

Для всех нанотел наблюдались кривые доза-эффект со значениями IC50 в пределах от 123 пМ до 1,67 нМ (табл.С-16).

Пример 19. Активность нанотел на клетках XG1

Биспецифичные нанотела тестировали методом пролиферации XG1. Значения IC50 составляли от 60 пМ до 65 нМ. Нанотела также тестировали этим методом в присутствии 1 мг/мл сывороточного альбумина человека. Значения IC50 Для биспецифичных нанотел составляли от 190 пМ до 90 нМ. В качестве контроля включали контрольный IgG, описанный в Примере 1. Значения IC50 приведены в табл.С-17.

При тестировании форматированных нанотел методом XG1 в присутствии альбумина наблюдалось падение активности. Активности форматированных нанотел IL6R24, IL6R44 и IL6R49 превосходили или находились в тех же пределах, что и у контрольного IgG в присутствии сывороточного альбумина.

Пример 20. Определение сродства к IL-6R

Анализировали связывание биспецифичных нанотел с IL-6R методом поверхностного плазменного резонанса. Определяли кинетические параметры, которые приведены в табл.С-18. У нанотел в двухвалентном формате (IL6R23, IL6R24, IL6R33) не наблюдалось существенного падения сродства к IL-6R.

Пример 21. Определение сродства к сывороточному альбумину Анализировали связывание форматированных нанотел с сывороточным альбумином методом поверхностного плазмонного резонанса. Определяли константы сродства (Kd), которые приведены в табл.С-19. Для сравнения включали связывающее альбумин нанотело Alb-1 (SEQ ID NO:97). Сродство было в пределах ранее форматированных нанотел, содержащих один и тот же строительный блок против сывороточного альбумина, хотя в целом наблюдалась меньшая активность. Это было особенно заметно в отношении сродства к сывороточному альбумину мыши.

Пример 22. Связывание форматированных нанотел с клетками U266 Связывание форматированных нанотел из отобранных клонов (IL6R23, IL6R24, IL6R29, IL6R33, IL6R44 и IL6R53) с клетками U266 анализировали методом FACS. Результаты представлены на Фиг.13 и 14. Двухвалентные нанотела IL6R23, IL6R24, IL6R29 и IL6R33 проявляли меньшее связывание по сравнению с моновалентными строительными блоками, тогда как у трехвалентных нанотел IL6R44 и IL6R53 наблюдалось такое же связывание.

III. Оптимизация последовательностей нанотел против IL-6R

Пример 23. Стратегия оптимизации последовательностей

Белковые последовательности каждого из нанотел IL6R03, IL6R04 и IL6R13 сопоставляли с 5 ближайшими последовательностями из зародышевой линии человека, имеющими наибольшую степень гомологии (Фиг.15). Аминокислотные отличия в каркасных участках от консенсусной последовательности зародышевой линии человека выделены цветами. Аминокислотные отличия, выделенные светло-серым цветом, отбирали для конверсии в человеческие, тогда как аминокислоты, выделенные темно-серым цветом, оставляли без изменений. Сначала был создан комплект из 4 оптимизированных по последовательности вариантов для каждого из 3 нанотел (стадия 1). Эти варианты подвергали анализу по ряду параметров, а полученные результаты использовали для создания второго комплекта нанотел (стадия 2). Белковые последовательности всех оптимизированных по последовательности вариантов представлены на Фиг.16.

Пример 24. Оптимизация последовательностей на стадии 1 В процессе оптимизации последовательностей на стадии 1 были созданы и проанализированы следующие 12 вариантов.

IL6R03: IL6R61, IL6R62, IL6R63 и IL6R64

IL6R04: IL6R71, IL6R72, IL6R73 и IL6R74

IL6R13: IL6R81, IL6R82, IL6R83 и IL6R84

Аминокислотные последовательности всех этих различных вариантов представлены на Фиг.16.

Исследование оптимизированных нанотел методом конкуренции за IL-6/IL-6R

Оптимизированные по последовательности клоны IL6R03, IL6R04 и IL6R13 тестировали методом Alphascreen на ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R. К IL-6R (0,3 нМ) добавляли серийные разведения очищенных нанотел и инкубировали в течение 15 мин. После этого добавляли 3 нМ биотинилированного IL-6 и покрытые BN-12 акцепторные шарики и эту смесь инкубировали в течение 1 часа. Наконец, добавляли стрептавидиновые донорные шарики и после 1 часа инкубации считывали планшет на считывающем устройстве Envision. В качестве контроля включали исходные клоны. Результаты представлены на Фиг.17, Фиг.18 и Фиг.19.

У всех оптимизированных по последовательности вариантов IL6R03 (IL6R61, 62 и 64) значения IC50 были в пределах 2-кратного значения IC50 IL6R03, тогда как IL6R63 проявлял в ~4 раза меньшее значение IC50.

Для оптимизированных по последовательности вариантов IL6R04 не наблюдалось существенных отличий по значениям IC50 между IL6R04 и 4 оптимизированными вариантами.

Для оптимизированных по последовательности вариантов IL6R13 значения IC50 У IL6R81 и IL6R83 были почти идентичны таковому у IL6R13, тогда как у 2 вариантов, несущих мутацию RAT→KGL в каркасном участке 2 (IL6R82 и IL6R84), проявлялось падение активности.

Определение сродства

Оптимизированные по последовательности варианты IL6R03, IL6R04 и IL6R13 также подвергали анализу на связывание с IL-6R на приборе Biacore. Кинетические параметры приведены в табл.С-20.

Для оптимизированных по последовательности вариантов IL6R03 значения Kd у IL6R61, 62 и 63 все были в пределах 2-кратного значения Kd IL6R03. Значение Kd у IL6R64 не было определено.

Для оптимизированных по последовательности вариантов IL6R04 не наблюдалось существенных отличий по значениям Kd между IL6R04 и 4 оптимизированными вариантами.

Для оптимизированных по последовательности вариантов IL6R13 значения Kd у IL6R81 и IL6R83 были очень близки значению Kd у IL6R13, тогда как у 2 вариантов, несущих мутацию RAT→KGL в каркасном участке 2 (IL6R82 и IL6R84), проявлялось сильное падение сродства.

В целом эти наблюдения полностью соответствуют результатам, полученным при анализе конкуренции методом Alphascreen.

Пример 25. Оптимизация последовательностей на стадии 2 Исходя из данных по сродству и активности на стадии 1, было решено создать следующий комплект вариантов:

- для IL6R03 объединяли все мутации, имеющиеся у вариантов IL6R61, 62, 63 и 64, получая ILR65;

- для IL6R04 объединяли все мутации, имеющиеся у вариантов IL6R71, 72, 73 и 74, получая ILR75;

- для IL6R13 был создан комплект из 6 новых вариантов (IL6R85-90), несущих различные мутации (комбинации) последовательности RAT в FR2. Эти мутации вводили за основу IL6R83, так как этот оптимизированный по последовательности вариант не отличался от IL6R13 ни по сродству, ни по активности.

Анализ константы скорости koff у оптимизированных вариантов IL6R13

Оптимизированные по последовательности варианты IL6R85-90 в виде периплазматических экстрактов подвергали анализу на приборе Biacore. Для расчета значений koff использовали кривые диссоциации (табл.С-21). У нанотел IL6R87-89 значения koff были близки к таковым у IL6R13, тогда как у нанотел IL6R85, 86 и 90 они были в 10 раз выше.

Исследование оптимизированных нанотел методом конкуренции за IL-6/IL-6R

Оптимизированные по последовательности варианты IL6R85-90 в виде периплазматических экстрактов тестировали методом Alphascreen на их способность ингибировать взаимодействие IL-6/IL-6R. Результаты представлены на Фиг.20.

Нанотела IL6R87, 88 и 89 блокировали взаимодействие IL-6/IL-6R сильнее, чем варианты IL6R13 - 85, 86 и 90. Эти результаты полностью соответствуют наблюдениям, сделанньм на приборе Biacore. Сравнение аминокислотных последовательностей оптимизированных вариантов IL6R13 показало, что за снижение koff и активности ответственна мутация T45L. Поэтому для дальнейшего изучения был выбран наиболее близкий человеку вариант без мутации T45L, т.е. IL6R88.

Этот вариант экспрессировали, очищали и анализировали на ингибирование взаимодействия IL-6/IL-6R вместе с очищенными клонами IL6R65 и IL6R75. Существенных отличий между различными оптимизированными по последовательности клонами (IL6R65, IL6R75 and IL6R88) и соответствующими неоптимизированными вариантами (IL6R03, IL6R04 и IL6R13, соответственно) не наблюдалось (Фиг.21).

Определение сродства

Константы сродства (IQ) оптимизированных по последовательности клонов IL6R65, 75 и 88 к IL-6R человека определяли методом поверхностного плазменного резонанса на приборе Biacore 3000. Вкратце, на сенсорном чипе СМ5 фиксировали IL-6R через аминогруппу при плотности 800-1000 отн.ед. Остальные реакционноспособные группы инактивировали. Связывание нанотел оценивали при различных концентрациях от 0,5 до 50 нМ. Каждый образец впрыскивали в течение 4 мин при скорости потока в 45 мкл/мин, что способствует связыванию со связанным с чипом антигеном. Затем через чип пропускали буфер для связывания без нанотел с такой же скоростью, что способствует диссоциации связавшихся нанотел. Кинетические параметры оптимизированных по последовательности вариантов IL6R03, 04 и 13 приведены в табл.С-22.

Существенных отличий по константам сродства между исходными и оптимизированными по последовательности нанотелами не наблюдалось.

Определение активности на клетках

Оптимизированные по последовательности нанотела подвергали анализу методом XG-1. Результаты представлены на Фиг.22. Значения IC50 приведены в табл.С-23. Оптимизация последовательности не имела существенного влияния на активность по подавлению вызванной IL-6 пролиферации при определении на клетках.

IV. Дополнительные характеристики оптимизированных нанотел

Пример 26. Определение сродства к IL-6R длиннохвостой макаки (супо)

Сродство IL6R03-IL6R65, IL6R04-IL6R75 и IL6R13-IL-6R88 к cynoIL-6R (макаки) определяли методом SPR на приборе Biacore 3000. Вкратце, на сенсорном чипе СМ5 фиксировали cynoIL-6R через аминогруппу при плотности 760 отн.ед. Остальные реакционноспособные группы инактивировали. Связывание нанотед оценивали при различных концентрациях от 1,25 до 100 нМ. Каждый образец впрыскивали в течение 4 мин при скорости потока в 45 мкл/мин, что способствует связыванию со связанным с чипом антигеном. Затем через чип пропускали буфер для связывания без нанотел с такой же скоростью, что способствует диссоциации связавшихся нанотел. Кинетические параметры приведены в табл.С-24.

Хотя и были некоторые отличия по константам сродства между IL6R04 и IL6R75, но из этого эксперимента ясно, что у обеих молекул сродство к IL-6R макаки было значительно ниже, чем к IL-6R человека. Напротив, у IL6R03 и IL6R65 константы сродства к IL-6R макаки были в тех же пределах, что и к IL-6R человека. Вне ожидания, кристаллическая структура комплекса IL-6/IL-6R/gp130 (Boulanger et al.) показывает, что IL-6-связывающий сайт на IL-6R полностью консервативен между человеком и макакой, свидетельствуя, что IL6R04 связывается с другим эпитопом.

Пример 27. Тестирование оптимизированных по последовательности нанотел методом активности в плазме с использованием плазмы человека и макаки

Для того, чтобы оценить перекрестную реактивность IL6R65 и IL6R75 к IL-6R длиннохвостой макаки, проводили определение активности в плазме методом ELISA, используя в качестве источника sIL-6R плазму человека или макаки. При этом серийные разведения нанотел преинкубировали с плазмой и IL-6 человека (50 нг/мл). После этого проводили захват SIL-6R из плазмы на покрытый BN-12 планшет и детектировали связанный IL-6 с помощью биотинилированных поликлональных антител и конъюгата стрептавидин-HRP.

Как видно из Фиг.23А, IL6R201 и IL6R65 способны полностью блокировать связывание IL-6 с SIL-6R человека, но IL6R65 оказался менее сильным, чем IL6R201 и чем контрольный IgG и контрольный Fab, описанные в Примере 1. Как видно из Фиг.23В, IL6R65 способен полностью блокировать связывание IL-6 с SIL-6R макаки с эффективностью, сравнимой с контрольным Fab, описанным в Примере 1.

Пример 28. Тестирование оптимизированных по последовательности нанотел методом активности в плазме при высоких концентрациях IL-6

Определение активности в плазме на плазме человека также использовали для тестирования способности нанотел блокировать IL-6 при высоких концентрациях. IL6R04, IL6R65 и контрольный Fab, описанный в Примере 1, тестировали при значениях ЕС50 для IL-6 (50 нг/мл) и ЕС95 для IL-6 (885 нг/мл). Результаты представлены на Фиг.24. Видно, что IL6R04 оказался наиболее активным при ECso для IL-6. А при ЕС95 для IL-6 контрольный Fab и IL6R65 все-таки способны полностью блокировать SIL-6R плазмы, хотя и при более высоких концентрациях, указывая на то, что эти 2 молекулы связываются с эпитопом, который перекрывается с IL-6-связывающим сайтом. Значение IC50 у контрольного Fab повышалось с 0,55 нМ до 8,47 нМ, а IC50 У IL6R65 повышалось с 2,61 нМ до 66,25 нМ.

Пример 29. Исследование конкуренции на приборе Biacore

Эксперименты на Biacore проводились для того, чтобы исследовать, могут ли IL-6 и IL6R65 связываться с IL-6R одновременно. Контрольный Fab (Фиг.25А), IL6R201/75 (Фиг.25В) или IL6R65 (Фиг.25С) сажали на IL-6R, после чего проводили связывание IL-6 с комплексом. Почти никакого связывания IL-6 не наблюдалось с контрольным Fab и IL6R65. Когда же IL-6 сажали на IL-6R и впрыскивали нанотела, все 3 нанотела оказались способными связываться с комплексом. Но в случае контрольного Fab и IL6R65, вероятно, это было вызвано вытеснением IL-6 вследствие меньшего сродства IL-6 к IL-6R.

Наконец, проводили связывание IL-6R с покрытым IL-6 чипом в присутствии или в отсутствие нанотел (Фиг.25D). При этом подтвердились прежние результаты, а именно, что IL-6R не захватывается в присутствии контрольного Fab или IL6R65.

В заключение отметим, что эксперименты по картированию эпитопов на приборе Biacore показали, что и контрольный Fab, и IL6R65 садятся на тот же эпитоп, что и IL-6. В то время, как IL6R65 и контрольный Fab способны полностью блокировать связывание IL-6 с IL-6R, нанотело IL6R201 не способно предотвратить связывание IL-6 с IL-6R, когда оно связано с рецептором.

V. Созревание аффинности у IL6R65

Пример 30. Стратегия диверсификации для созревания аффинности

Участки CDR нанотела IL6R65 подвергали рандомизации с применением 2 нижеследующих стратегий.

1. Каждый остаток в CDR заменяли на ряд других остатков со сходным химизмом боковой цепи:

K↔R

A↔S↔T

I↔L↔V

F↔Y

N↔D

Q↔E

G→A

M→L

H, C, W, P оставляли без изменений.

2. Каждый остаток в CDR заменяли на ряд аминокислот, встречающихся в природе в этом положении. Вводили только те аминокислоты, которые наиболее часто встречаются в каждом положении, чтобы ограничить разнообразие в данном положении. Такой подход применялся только для рандомизации CDR1 и CDR2.

Рандомизацию CDR1 и CDR2 проводили параллельно с применением 2 стратегий, описанных выше, a CDR3 подвергали рандомизации отдельно по стратегии 1, получая в итоге 3 библиотеки. Все 3 библиотеки создавали собственными силами методом ПЦР с перекрыванием и наращиванием с помощью вырожденных олигонуклеотидов. Теоретическое разнообразие для каждой из библиотек составляло примерно 1×106. Фрагменты, кодирующие варианты нанотел, клонировали в вектор для фагового дисплея. Фактический размер всех 3 библиотек составлял примерно 1×108 (100-кратный охват теоретического разнообразия). Проводили один цикл отбора с использованием различных концентраций биотинилированного IL-6R (0, 1, 10 и 100 пМ) в растворе. При таких условиях не наблюдалось обогащения для библиотеки CDR3, тогда как для обеих библиотек CDR1/2 наблюдалось дозо-зависимое обогащение. Продукцию из библиотек CDR1/2 подвергали анализу в виде периплазматических экстрактов методом ELISA, а клоны с наибольшими сигналами впоследствии тестировали на приборе Biacore. Лучшие 30 клонов при анализе методом ELISA проявляли значения koff между 2,1×10-3 и 2,6×10-4 s-1. Все 5 нанотел с наименьшими значениями koff секвенировали, экспрессировали и очищали (Фиг.26).

Пример 31. Экспрессирование и очистка нанотел

Созревшие по аффинности нанотела экспрессировали в Е. coli в виде белков с метками с-тус и (His)6 в культурах объемом 250 мл. Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ IPTG и продолжали в течение 4 ч при 37°С. После центрифугирования клеточных культур готовили периплазматические экстракты путем замораживания-оттаивания осадков. Эти экстракты использовали в качестве исходного материала для аффинной хроматографии с иммобилизованным ионом металла (IMAC). Нанотела элюировали из колонки с помощью 150 мМ имидазола, а затем обессоливали на колонке Hiprep26/10.

Пример 32. Определение сродства у созревших по аффинности вариантов на приборе Biacore

Нанотело IL6R65 (оптимизированное по последовательности) и 5 созревших по аффинности вариантов подвергали анализу на приборе Biacore. Регистрировали кривые связывания при различных концентрациях очищенных нанотел и использовали их для расчета константы сродства. Значения Kd у этих 5 клонов составляли от 0,34 до 0,95 нМ, что соответствует 13-кратному улучшению относительно IL6R65 (исходного нанотела) для наилучшего варианта (Фиг.27).

Пример 33. Определение сродства у созревших по аффинности вариантов методом активности в плазме

Все 5 созревших по аффинности нанотел и оптимизированное по последовательности нанотело также тестировали методом активности в плазме. При этом нанотела в различных концентрациях смешивали с содержащей растворимый IL-6R плазмой из человека или длиннохвостой макаки при фиксированной концентрации IL-6 человека (2,4 или 42 нМ). После 1 часа инкубации смесь переносили на планшет Maxisorp, покрытый MAb BN-12 против IL-6R (Diaclone). Количество связанного IL-6 определяли последующим добавлением биотинилированного поликлонального антитела против IL-6 (R&D Systems) и конъюгата стрептавидин-HRP. В качестве субстрата использовали ТМВ. Измеряли превращение субстрата при 450 нм (Фиг.28).

Пример 34. Исследование созревших по аффинности вариантов методом TF-1

Созревшие по аффинности нанотела также тестировали на их способность к ингибированию IL-6-зависимой пролиферации клеток TF-1 (ЕСАСС по.93022307; 1989, J. Cell Physiol., 140: 323; 1993, Exp. Cell Res., 208: 35) путем блокирования связывания IL-6 с IL-6R на поверхности клеток. Для этого серийные разведения нанотел проинкубировали с фиксированным количеством клеток TF-1 в течение 2 часов при 37°С. После этого добавляли IL-6 до конечной концентрации 2 нг/мл. IL-6-зависимая пролиферация клеток продолжалась в течение 72 часов, а ее измеряли по включению меченного тритием тимидина (Фиг.29).

Значения IC50 У созревших по аффинности нанотел были вплоть до 17 раз лучше, чем у IL6R65, но все-таки все варианты были менее активными, чем контрольный IgG.

Пример 35. Исследование конкуренции на приборе Biacore

Эксперименты на Biacore проводились для того, чтобы исследовать, может ли IL-6 связываться с IL-6R одновременно с IL6R65 и с 2 его созревшими по аффинности вариантами (7D6 и 7С4). В этих экспериментах IL-6R сажали на покрытый BN-12 чип и насыщали его нанотелом IL6R65 (Фиг.30А), 7D6 (Фиг.30В) или 7С4 (Фиг.30С). Затем оценивали связывание IL-6 с комплексом 1Е-6Р-нанотело впрыскиванием цитокина в концентрации 100 нМ. Кроме того, также определяли связывание всех 3 нанотел с IL-6R в комплексе с IL-6.

Результаты для IL6R65 (Фиг.30А) сравнимы с результатами, полученными ранее, и подтверждают, что IL6R65 и IL-6 распознают один и тот же эпитоп на IL-6R. Как и ожидалось, созревшие по аффинности варианты IL6R65 и IL-6 тоже распознают один и тот же эпитоп на IL-6R (Фиг.30В-С).

Пример 36. Дальнейшее созревание аффинности

Далее был создан комплект из 47 нанотел, содержащих различные комбинации полезных мутаций в CDR1/2 и CDR3. Эти мутации были установлены тщательным анализом белковых последовательностей и значений koff у всех клонов нанотел, выделенных из библиотек рандомизации CDR. Значения koff У этих клонов 2-го поколения составляли от 4,2Е-04 до 4.5Е-05 s-1. Для дальнейшего анализа были отобраны 5 клонов, проявляющих наименьшие значения koff (20F6, 20А11, 20Е10, 21А10, 21D11). Их последовательности приведены на Фиг.31.

Пример 37. Экспрессирование нанотел и очистка вариантов из второго цикла

Созревшие по аффинности нанотела экспрессировали в Е. coli в виде белков с метками с-myc и (His)6 в культурах объемом 250 мл. Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ IPTG и продолжали в течение 4 ч при 37°С. После центрифугирования клеточных культур готовили периплазматические экстракты путем замораживания-оттаивания осадков. Эти экстракты использовали в качестве исходного материала для аффинной хроматографии с иммобилизованным ионом металла (IMAC). Нанотела элюировали из колонки с помощью 150 мМ имидазола, а затем обессоливали на колонке Hiprep26/10.

Пример 38. Определение температуры плавления

Температуростойкость нанотел анализировали методом теплового сдвига. Значения Тт были сходными у всех созревших по аффинности нанотел и слегка выше в сравнении с IL6R65. Значения Tm приведены в табл.С-25.

Пример 39. Определение сродства у вариантов из 2-го цикла на приборе Biacore

Кинетические параметры для нанотела IL6R65 (оптимизированного по последовательности) и 5 созревших по аффинности вариантов определяли на приборе Biacore Т100. Константы скорости ассоциации (ka) определяли из кривых связывания при 2 различных концентрациях очищенного нанотела и фиксированной концентрации IL-6R, который фиксировали на чипе через mAb BN-12. Значения kd определяли при одной концентрации нанотел, используя IL-6R, ковалентно фиксированный на чипе. Значения ka, kd и KD приведены в табл.С-26.

Пример 40. Исследование вариантов из 2-го цикла методом TF-1

Биологическую активность вариантов из 2-го цикла исследовали методом TF-1, а данные представлены на Фиг.32. Созревшие по аффинности клоны из 2-го цикла обладали в 5-8 раз большей активностью, чем клон 7С4 из 1-го цикла, и были в 2,5-4 раза сильнее, чем стандартный контрольный IgG, описанный в Примере 1. Наилучшим клоном оказался 20А11 со значением IC50 в 0,4 нМ (в 4 раза сильнее по сравнению со стандартом).

Пример 41. Исследование вариантов из 2-го цикла методом активности в плазме

Ингибирование растворимого IL-6R анализировали методом активности в плазме при высокой и низкой концентрации IL-6. Варианты из 2-го цикла были как минимум столь же сильными, что и контрольный IgG при определении методом активности в плазме (0,1-0,2 нМ), что было на пределе чувствительности этого метода. При высокой концентрации IL-6 (ЕС95) созревшие по аффинности мутанты все еще были способны блокировать связывание IL-6 с sIL-6R и оказались в 3-4 раза более сильными, чем контрольный IgG. В этом методе не наблюдалось отличий между вариантами из 1-го и 2-го цикла. Как и ожидалось, все исследованные клоны обладали перекрестной реактивностью с макакой (Фиг.33).

Пример 42. Связывание с PBMCs человека в цельной крови

Очищенные нанотела IL6R65 и РМР20А11 тестировали методом FACS на связывание с PBMCs человека. Связывание с клетками детектировали с помощью биотинилированного mAb против His и меченного РЕ стрептавидина (Фиг.34). Как IL6R65, так и созревший по аффинности вариант РМР20А11 связывались с нейтрофилами, моноцитами и субпопуляцией лимфоцитов. Это согласуется с профилем экспрессии IL-6R.

VI. Форматирование созревших по аффинности нанотел

Пример 43. Получение мультивалентных конструкций

РМР20А11 форматировали в виде двухвалентных и трехвалентных нанотел со связывающим альбумин нанотелом ALB8. Сводка по различным нанотелам представлена в табл.С-27.

Пример 44. Нейтрализация мембранного IL-6R в методе TF-1

В первом эксперименте проверяли, будут ли форматированные нанотела ингибировать сигнализирование через IL-6R, используя в качестве модельной системы линию клеток TF-1. Нанотела 20А11, IL6R304, IL6R305 и IL6R306 дозо-зависимым образом и полностью блокировали индуцированную IL-6 пролиферацию клеток TF-1, которая опосредована мембранным IL-6R (Фиг.35, табл.С-28).

Эти результаты показывают, что все форматированные нанотела являются более сильными, чем контрольный IgG, описанный в Примере 1, при ингибировании активности мембранного IL-6R. По сравнению с его моновалентным эквивалентом IL6R304, IL6R305 ингибирует опосредованные IL-6 ответы в ~7 раз сильнее, что свидетельствует о сильном взаимодействии IL6R305 с мембранным IL-6R. IL6R306 менее активен, чем IL6R305, и проявляет только в 2 раза большую эффективность, что IL6R304. Это свидетельствует о том, что формат IL6R306 является менее благоприятным и то, что у IL6R306 невозможно сильное связывание.

Далее проверяли, могут ли форматированные нанотела все-таки полностью ингибировать сигнализирование через IL-6R при патологических концентрациях IL-6. Действительно, 20А11, IL6R304, IL6R305 и IL6R306 дозо-зависимым образом и полностью блокировали пролиферацию клеток TF-1, индуцированную IL-6 при 5000 МЕ/мл (Фиг.36, табл.С-29). Как и ожидалось, значения IC50 смещались по сравнению с экспериментами, проведенными при 100 МЕ/мл. В согласии с предыдущими результатами, IL6R305 сильнее всех блокировал индуцированное IL-6 сигнализирование через мембранный IL-6R.

Поскольку нанотела действительно взаимодействуют с IL-6R, то проверяли, может ли связывание нанотел с этим рецептором вызывать активацию клеток, ведущую к их пролиферации. Клетки TF-1 инкубировали при избытке нанотел в присутствии или в отсутствие 100 МЕ/мл IL-6 (Фиг.37). Как и ожидалось, IL6R304 и IL6R305 полностью предотвращали опосредованную IL-6 пролиферацию. В самом деле, IL6R305 и IL6R306 ингибировали вызванную IL-6 пролиферацию до уровня фона (включения 3H-тимидина, измеренного в отсутствие факторов роста), свидетельствуя о том, что IL6R304 и IL6R305 полностью блокировали действие IL-6.

IL6R304 и IL6R305 не вызывали пролиферацию клеток TF-1 в отсутствие факторов роста, что свидетельствует о том, что эти соединения не обладают антагонистическим действием на клетки TF-1.

Пример 45. Нейтрализация sIL-6R форматированными созревшими по аффинности нанотелами в методе ELISA

Способность строительного блока IL6R20A11 и его форматированных вариантов к предотвращению связывания IL-6 человека с sIL-6R в плазме анализировали по активности в плазме методом ELISA. Поскольку концентрация sIL-6R в плазме колеблется, то нужно использовать одну и ту же плазму в различных опытах для сравнения активности нанотел. Также сначала проводили титрование IL-6 при инкубации в плазме, чтобы определить, при какой концентрации будет использоваться IL-6 вместе с нанотелами. Значения ЕС50 и ЕС95 для IL-6 в плазме человека составили 27,29 нг/мл и 885 нг/мл, соответственно. Именно эти концентрации использовались впоследствии при тестировании активности нанотел при нормальной и высокой концентрации IL-6.

IL6R20A11 и его форматированные варианты сравнивали с контрольным IgG, описанным в Примере 1. Полученные значения IC50 для различных нанотел приведены в табл.С-30. При значении ЕС50 для IL-6 (Фиг.38А, В) и моновалентные, и двухвалентные нанотела попадали в тот же самый интервал, что и контрольный IgG. Несмотря на то, что IL6R304 имеет только один сайт связывания, он проявлял такое же значение IC50, как и контрольный IgG (0,229 нМ против 0,258 нМ). IL6R305 оказался в два раза сильнее, чем IL6R304 (IC50 =0,137 нМ), что согласуется с наличием 2 сайтов связывания. Но IL6R306 оказался менее сильным, чем IL6R304 и контрольный IgG, и проявлял IC50 в 0,412 нМ.

Скорее всего, был достигнут предел определения по чувствительности. В самом деле, концентрация sIL-6R в плазме составляла ~30 нг/мл или 0,6 нМ. Поэтому нужно было заблокировать нанотелами лишь 0,3 нМ sIL-6R (50% в плазме), что означает, что минимальное значение IC50, которое может быть получено, составляет 0,15 нМ. Это и соответствует полученным значениям IC50. Однако, если концентрация IL-6 повысится до 885 нг/мл, то нанотелам будет труднее конкурировать с IL-6 и может обнаружиться большее различие по активности. Действительно, при высокой концентрации IL-6 нанотела IL6R20A11, IL6R304 и IL6R305 оказались более сильными, чем контрольный IgG, a IL6R306 - нет (Фиг.38С, D). Соотношение IC50 при высокой и низкой концентрации IL-6 приведено в табл.С-30. Очевидно, повышение IL-6 больше повлияло на контрольный IgG и IL6R306, чем на другие нанотела. Это также наблюдалось при определении методом TF-1 (см. Пример 44).

Пример 46. Связывание форматированных созревших по аффинности нанотел с мембранным IL-6R

Для того, чтобы заблокировать сигналирование от IL-6, нужно нейтрализировать нанотелами и растворимый, и мембранный IL-6R. Поэтому анализировали связывание различных форматированных нанотел с экспрессирующими IL-6R клетками методом проточной цитометрии.

Связывание с экспрессирующими IL-6R клетками СНО

Для анализа связывания нанотел против IL-6R с мембранным IL-6R использовали устойчиво трансфецированные клетки СНО, экспрессирующие IL-6R человека (Фиг.39А). В качестве отрицательного контроля использовали IL-6R-отрицательные клетки СНО (Фиг.39В). Все 4 нанотела проявляли насыщаемое связывание с экспрессирующими IL-6R клетками, тогда как на IL-6R-отрицательных клетках выявлялись только очень слабые сигналы при высокой концентрации нанотел.

Средние значения флуоресценции РЕ выводили в GraphPad и строили графики 4PL для определения значений ЕС50. Они приведены в табл.С-31. В отличие от метода TF-1, на IL6R305 как будто не повлиял эффект авидности в этих условиях: он оказался лишь в 2 раза сильнее IL6R304 (0,8984 против 1,939 нМ). Как и в методах TF-1 и ELISA в плазме, IL6R306 связывался хуже с IL-6R-положительными клетками.

Связывание с лейкоцитами периферической крови

Для демонстрации связывания нанотел с мембранньм IL-6R в физиологических условиях использовали PBL человека. Этот матрикс очень близок к ситуации in vivo, так как он содержит HSA (~50 мг/мл), sIL-6R (~30 нг/мл), клетки, экспрессирующие мембранный IL-6R (Т-клетки CD4+, моноциты, гранулоциты), и IL-6R-отрицательные клетки (большинство циркулирующих В-клеток, Т-клетки CD8+). Нанотела инкубировали в обработанной ЭДТА крови из 2-х доноров, и связавшиеся нанотела детектировали методом проточной цитометрии. Лимфоциты, моноциты и гранулоциты засекали по характеристикам FSC/SSC (Фиг.40), а связавшиеся нанотела детектировали на канале РЕ.

Как видно из Фиг.40 (справа), гранулоциты и моноциты равномерно окрашивались нанотелами. Напротив, окрашивалась только часть лимфоцитов. Это наблюдается в виде двойного пика на гистограмме РЕ. Средняя флуоресценция 3 пропускаемых популяций после инкубации при различной концентрации нанотел представлена на Фиг.41, а полученные значения ЕС50 приведены в табл.С-32.

Пример 47. Сродство форматированных созревших по аффинности нанотел к сывороточному альбумину человека и макаки (cyno)

Проводили кинетический анализ биспецифичных, двухвалентных и трехвалентных нанотел IL6R304, IL6R305 и IL6R306 на сывороточном альбумине человека и макаки методом SPR на приборе Biacore 3000. Результаты представлены на Фиг.42 и приведены в табл.С-33. Нанотела IL6R304, 305 и 306 проявляли сходные кинетические константы скорости и сродства (17-23 нМ) для SA человека и макаки. Сродство к SA у форматированных нанотел против IL-6R было в 6,5 раз ниже, чем у моновалентного нанотела ALB11 против SA за счет снижения в 2,5 раза скорости ассоциации и повышения в 2,5 раза скорости диссоциации.

Пример 48. Сродство к IL-6R человека и макаки (cyno)

Проводили кинетический анализ на IL-6R человека и макаки методом SPR на приборе Biacore Т 100. Вследствие указаний на изменение конформации IL-6R при его иммобилизации непосредственно на чипе скорость ассоциации измеряли на IL-6R, захваченном BN-12. Скорость диссоциации измеряли на иммобилизированном непосредственно IL-6R из-за отсутствия средства захвата с меньшей скоростью диссоциации, чем взаимодействие HaHOTeno-IL-6R. Результаты представлены в табл.С-34 и на Фиг.43.

Скорость ассоциации 20А11 (IL6R300; SEQ ID NO:66) снижалась менее чем в 2 раза при форматировании со строительным блоком против SA (IL6R304). Скорость диссоциации для IL6R304 на IL-6R человека была на или ниже предела обнаружения прибора Biacore. Скорость диссоциации на IL-6R макаки была ≥2 раза выше, чем на IL-6R человека, но все еще возле предела обнаружения. Расчетное сродство у IL6R304 составило ≤14 пМ на IL-6R человека и 25 пМ на IL-6R макаки.

Пример 49. Межвидовая перекрестная реактивность IL6R20A11

Перекрестную реактивность IL6R20A11 и его форматированных вариантов к sIL-6R длиннохвостой макаки (cyno) анализировали по активности в плазме методом ELISA, используя плазму макаки. Также использовали конкуренцию в методе ELISA для определения перекрестной реактивности IL6R20A11 к sIL-6R макаки и мыши.

Активность в плазме методом ELISA

Сначала проводили титрование IL-6 человека при инкубации в плазме макаки и определили, что значение ЕС50 для IL-6 составляет 50,11 нг/мл. Именно эта концентрация использовалась впоследствии при тестировании перекрестной реактивности нанотел к sIL-6R в плазме макаки. Как видно из Фиг.44, IL6R20A11 и его форматированные варианты четко проявляли перекрестную реактивность к sIL-6R макаки. Наблюдался тот же порядок ранжирования, что и в плазме человека, и соотношение значений IC50 в плазме человека и плазме макаки было сходным для всех соединений (табл.С-35).

Конкуренция методом ELISA

Активность в плазме методом ELISA может применяться только, если BN-12 способно захватывать sIL-6R в плазме из данного вида и если связывание IL-6 с sIL-6R можно детектировать. Поэтому был разработан более общий метод конкуренции в методе ELISA. Этот метод основан на связывании IL6R20A11 с захваченным нейтравидином комплексом IL-6R-биотин. Вкратце, 0.4 нМ IL6R20A11 преинкубировали с серийными разведениями плазмы из различных видов, содержащих эндогенный sIL-6R, после чего проводили захват свободного IL6R20A11 на биотинилированный sIL-6R человека, иммобилизованный на покрытом нейтравидином планшете, и детектировали с помощью FITC-mAb против VHH и конъюгата антител против FITC с HRP. Концентрация IL6R20A11 в 0,4 нМ соответствует концентрации, дающей 50% от максимального сигнала (ЕС50=0,35±0,021 нМ; n=4).

Как видно из Фиг.45, IL6R20A11 четко проявляло перекрестную реактивность к sIL-6R макаки, что подтверждает результаты на Biacore. Напротив, не наблюдалось связывания с sIL-6R мыши. Плазма человека и макаки также конкурировала за связывание IL6R20A11 с рекомбинантным sIL-6R, а плазма мыши - нет. На самом деле наблюдалось возрастание сигналов при высоких концентрациях плазмы мыши, что вероятно было обусловлено детектированием иммуноглобулинов мыши в этом методе.

Пример 50. Специфичность IL6R20A11 к IL-6R

IL-6R принадлежит к семейству рецепторов цитокинов I типа. Поскольку участок связывания цитокинов у этих рецепторов консервативен, специфичность IL6R20A11 к IL-6R анализировали путем анализа связывания с рецепторами, родственными IL-6R. Связывание IL6R20A11 с LIF-R, CNTF-R, OSM-R и IL-11R/Fc анализировали по конкуренции за связывание методом ELISA. Как видно из Фиг.46, sIL-6R из положительного контроля ингибировал связывание IL6R20A11 на планшете. Значение IC50 для sIL-6R (0,03 нМ) соответствует ожидаемому IC50, исходя из используемого количества IL6R20A11 (0,025 нМ и 0,05 нМ). Ни один из родственных IL-6R белков не конкурировал за связывание IL6R20A11 с SIL-6R, даже при 100-кратном молярном избытке (5 нМ). В аналогичных условиях оказалось, что CLF-1/CLC, IL12-p40, IL-27B и gp130/Fc тоже не взаимодействуют с 0.05 нМ IL6R20A11, даже при таких высоких концентрациях, как 100 нМ (результаты не приводятся).

VII. Анализ ФК/ФД IL6R304 и IL6R305 in vivo

Целью данного исследования был анализ фармакокинетики (ФК), фармакодинамики (ФД) и иммуногенности 2 оптимизированных по последовательности, созревших по аффинности нанотел против рецептора интерлейкина-6 (IL-6R), а именно IL6R304 и IL6R305, у длиннохвостых макак после однократного внутривенного введения болюсом. За введением нанотел следовало 7 ежедневных подкожных инъекций рекомбинантного IL-6 человека (h), начиная с 24 часов после введения нанотел. Конечной целью данного исследования эффективности in vivo была оценка способности этих нанотел против IL-6R к ингибированию индуцируемых hIL-6 параметров и сравнение их эффективности друг с другом и со стандартным контролем из Примера 1.

У человека и других приматов, как сообщалось, рекомбинантный hIL-6 индуцирует синтез белков острой фазы. Белки острой фазы определяются как класс таких белков плазмы, как С-реагирующий белок (CRP), сывороточный амилоид А, гаптоглобин, фибриноген, альбумин и трансферрин, концентрация которых в плазме повышается или понижается как минимум на 25% в ответ на воспаление, главным образом вследствие изменения их продукции гепатоцитами. Профили продукции цитокинов и реакции острой фазы разнятся при различных воспалительных состояниях. Поэтому изменения белков острой фазы отражают наличие и интенсивность воспаления, что делает их важными для диагностики. Главными стимуляторами продукции белков острой фазы являются связанные с воспалением цитокины, которые вырабатываются при воспалительных процессах: IL-6, IL-1β, α-фактор некроза опухолей (TNF-α), γ-интерферон (INF-γ), трансформирующий фактор роста β (TGF-β) и возможно IL-8.

Пример 51. Схема исследования

В этом исследовании 6 групп (группы 6-11, табл.С-36) из 2-3 животных получали однократные в/в инъекции IL6R304 или IL6R305. Тестировали 3 различные дозы обеих нанотел, а именно 0,4,2 или 10 мг/кг. Кроме того, животные в группе 12 (n=3) получали носитель и служили отрицательным контролем, тогда как животным группы 13 (n=3) вводили 5 мг/кг контрольного IgG (табл.С-36).

Начиная с TD1, т.е. через 24 часа после введения тестируемых веществ, всем животным вводили ежедневно на протяжении 7 дней hIL-6 (5 мкг/кг; Фиг.47).

До и после введения hIL-6, в заданные моменты времени, брали пробы крови из головной вены или большой подкожной вены ноги (см. Фиг.47). Дополнительные пробы крови брали в день TDO для анализа ФК (см. табл.С-37).

Пример 52. Эффект напотел на вызванные hIL-6 реакции острой фазы (фаза 2)

Изучали эффект нанотел и положительного контроля IgG на индукцию реакций острой фазы при ежедневном введении 7 раз подряд hIL-6. Изучаемые параметры: уровень CRP, уровень фибриногена и число тромбоцитов.

В группе отрицательного контроля (группа 12) уровень CRP повышался сразу же после первого введения hIL-6, а максимальный уровень достигался уже на 2-й день. Максимальный уровень составлял 0,2-0,8 мг/мл, и это плато сохранялось до 8-го дня, т.е. на следующий день после последнего введения hIL-6 (Фиг.48А).

Эти изменения полностью подавлялись при предварительной обработке 5 мг/кг контрольного IgG (Фиг.48В). Однократная обработка сравнимой дозой (2 мг/кг) или в 5 раз большей дозой (10 мг/кг) нанотел IL6R304 и IL6R305 также давала почти полное подавление индукции CRP на всем протяжении эксперимента (Фиг.48С и D). Только животное №18 в группе с наивысшей дозой IL6R30