Способ определения катехоламинов и их метаболитов с использованием твердофазного флуоресцентного биосенсора

Изобретение относится к области медицины и может быть применено для определения катехоламинов их метаболитов в объектах на основе матриц сложного состава, в том числе нерастворимых в воде, без их дополнительной пробоподготовки. Способ осуществляют путем изменения принципиальной схемы формирования и измерения аналитического сигнала, регистрируемого в чувствительном слое биосенсора, - переходом к твердофазной флуоресценции. Действие биосенсора основано на реакции ферментативной дериватизации катехоламинов и их метаболитов с органическими аминами (o-фенилендиамин, этилендиамин) с образованием производных хиноксалина, флуоресцирующих в области 450-550 нм. При этом компоненты индикаторной реакции иммобилизованы в чувствительном слое на поверхности биосенсора, в результате флуоресцентный сигнал формируется и регистрируется непосредственно на твердой поверхности в режиме отражения. Наибольшую интенсивность флуоресцентного сигнала получают при использовании в качестве дериватизирующего агента o-фенилендиамина и проведении процесса при концентрации пероксидазы хрена - 10-25 нМ; концентрации пероксида водорода - 250-500 мкМ; концентрации o-фенилендиамина - 50-100 мкМ; концентрации катехоламинов и метаболитов - 5-2000 нМ. В качестве буферного раствора берут 5 мМ фосфатный буферный раствор pH 9.5-10.0. Чувствительный слой биосенсора представляет собой двухслойную пленку {хитозан - o-фенилендиамин/хитозан - пероксидаза}, нанесенную ровным слоем на поверхность стеклянной пластинки (14×40 мм). Изобретение обеспечивает простое и чувствительное определение катехоламинов и их метаболитов в объектах, анализ которых с использованием оптических методов детектирования по инструментальным причинам был ранее затруднен или невозможен вследствие мешающего влияния матрицы реального объекта, а также недостаточной чувствительности и воспроизводимости биосенсоров. 3 з.п. ф-лы, 4 ил.

 

Изобретение относится к области медицины и может быть применено для определения катехоламинов и их метаболитов в объектах на основе матриц сложного состава, в том числе нерастворимых в воде, без их дополнительной пробоподготовки.

Определение катехоламинов (КА) (допамин (ДА), адреналин (АД)) и их метаболитов (гомованилиновая и ванилилминдальная кислоты (ГВК и ВМК соответственно)) в биологических жидкостях и тканях человека является актуальной задачей современного химического анализа. Значимая проблема при определении перечисленных соединений в реальных биообъектах заключается в необходимости проведения дополнительной пробоподготовки анализируемого образца (использование токсичных или агрессивных органических растворителей, фильтрование, разделение), что существенно увеличивает погрешность результатов измерений и усложняет процедуру анализа. Перспективный подход к решению перечисленных проблем заключается в создании твердофазных оптических сенсоров, основанных на формировании и измерении аналитического сигнала не в растворе, а непосредственно на поверхности - в чувствительном слое сенсора, содержащем распознающие элементы (компоненты индикаторной системы, в том числе ферменты). Согласно исследованиям в областях, смежных биохимическому анализу, катехоламины и их метаболиты необходимо определять на наномолярном уровне и ниже. По этой причине наибольший интерес представляет разработка твердофазных оптических сенсоров с высокочувствительным детектированием отклика чувствительного слоя методом флуориметрии.

Известен способ определения адреналина с помощью оптоволоконного флуоресцентного биосенсора на основе фермента - лакказы, иммобилизованной в матрице {тетрааминофталоцианин меди - Fe3O4} (Huang J., Fang H., Liu С., Gu E., Jiang D. A novel fiber optic biosensor for the determination of adrenaline based on immobilized laccase catalysis. Anal. Lett. 2008. V.41. №8. P.1430-1442). Сенсор представляет собой ячейку, в которую помещена матрица, содержащая иммобилизованную лакказу, а также отделенные от нее тефлоновой мембраной частицы додецилсульфата трис(4,7-дифенил-1,10-фенантролин) рутения (II). Через прозрачное окошко ячейка контактирует с оптическим волокном. Действие сенсора основано на реакции окисления фенола кислородом в присутствии лакказы до o-хинона, приводящей к потреблению кислорода в системе. Аналитическим сигналом служит уменьшение интенсивности флуоресценции комплекса рутения в присутствии кислорода. Аналитический сигнал регистрируют в режиме отражения непосредственно в растворе (λех=450 нм, λem=600 нм). Однако измерение аналитического сигнала непосредственно в растворе не позволяет анализировать непрозрачные и мутные среды без их дополнительной пробоподготовки (растворение в токсичных органических растворителях, экстракция, фильтрование).

Известен принятый за прототип способ определения фенола, простейших изомерных o- и n-дифенольных соединений и флавоноидов с использованием твердофазных спектрофотометрических биосенсоров на основе оптически прозрачных пленок {хитозан-пероксидаза}, закрепленных на поверхности стеклянных пластинок (I.A. Veselova, L.I. Malinina, P.V. Rodionov, T.N. Shekhovtsova. Properties and analytical application of self-assembled complex {peroxidase-chitosan}. Talanta 102 (2012) 101-109). Действие биосенсора основано на ферментативном окислении фенольного соединения (до соответствующего o- или n-хинона) и последующем взаимодействии продукта окисления с хитозаном с образованием аддукта Михаэля, характеризующегося максимумом поглощения в области 345-355 нм. Формирование чувствительного слоя биосенсора осуществляют равномерным нанесением смеси {хитозан-пероксидаза} на поверхность горизонтально расположенной стеклянной пластинки и ее последующем высушивании на воздухе при комнатной температуре. Для проведения индикаторной реакции биосенсор выдерживают необходимое время в реакционной системе. Для измерения аналитического сигнала биосенсор извлекают из раствора, высушивают на воздухе при комнатной температуре и далее закрепляют на фронтальной поверхности кюветного отделения спектрофотометра. Аналитический сигнал регистрируют в режиме поглощения относительно чистой стеклянной пластинки. Окисление пероксидом водорода (H2O2, 1 мМ) проводят в 5 мМ фосфатном буферном растворе pH 6.5 в присутсвии пероксидазы из корней хрена (10 нМ) при комнатной температуре в течение 24 ч. Однако низкая технологичность указанного процесса обусловливается длительностью времени проведения анализа, кроме того, описанный спектрофотометрический биосенсор позволяет определять фенольные соединения на уровне не ниже микромолярного, а также не позволяет определять катехоламины и их метаболиты.

Предлагаемое изобретение решает задачу простого и чувствительного определения катехоламинов и их метаболитов в объектах, анализ которых с использованием оптических методов детектирования по инструментальным причинам был ранее затруднен или невозможен вследствие мешающего влияния матрицы реального объекта, а также недостаточной чувствительности и воспроизводимости биосенсоров.

Поставленная задача решается изменением принципиальной схемы формирования и измерения аналитического сигнала - переходом к твердофазной флуоресценции. Новизна при этом заключается в том, что компоненты индикаторной реакции иммобилизованы в чувствительном слое на поверхности биосенсора, в результате флуоресцентный сигнал формируется и регистрируется непосредственно на твердой поверхности в режиме отражения. Действие предложенного авторами биосенсора основано на реакции ферментативной дериватизации катехоламинов и их метаболитов с органическими аминами (o-фенилендиамином, этилендиамином) с образованием производных хиноксалина, флуоресцирующих в области 450-550 нм.

Наибольшую интенсивность флуоресцентного сигнала получают при использовании в качестве дериватизирующего агента o-фенилендиамина и проведении процесса при концентрации пероксидазы хрена - 10-25 нМ; концентрации пероксида водорода - 250-500 мкМ; концентрации o-фенилендиамина - 50-100 мкМ; концентрации катехоламинов и метаболитов - 5-2000 нМ. В качестве буферного раствора берут 5 мМ фосфатный буферный раствор pH 9.5-10.0. Чувствительный слой биосенсора представляет собой двухслойную пленку {хитозан - o-фенилендиамин/хитозан - пероксидаза}, нанесенную ровным слоем на поверхность стеклянной пластинки (14×40 мм). Объем смеси {хитозан - o-фенилендиамин} - 100 мкл, объем смеси {хитозан - пероксидаза} - 150 мкл, объемная доля хитозана в пленке 95%. Биосенсор устанавливают в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркальная пластинка 14×40 мм) под углом 75 градусов относительно источника возбуждения (ксеноновая лампа).

Нами впервые был предложен подход, заключающийся в иммобилизации дериватизирующих агентов (o-фенилендиамина, этилендиамина) в хитозановой пленке на поверхности стекла и регистрации флуоресцентного сигнала непосредственно на твердой поверхности в чувствительном слое сенсора, что позволяет проводить анализ в непрозрачных и мутных средах.

Технический результат предлагаемого изобретения при этом состоит в улучшении технологичности процесса из-за исключения необходимости проведения дополнительной пробоподготовки анализируемого образца (кроме разбавления); чувствительность по сравнению с аналогом и прототипом возрастает до 3-70 нМ; время анализа сокращается до 30 с.

Анализ известных технических решений позволяет сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение не известно из уровня техники, что свидетельствует о его соответствии критерию "новизна".

Сущность настоящего изобретения для специалистов не следует явным образом из уровня техники, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию "изобретательский уровень".

Возможность проведения способа на традиционном оборудовании с достижением поставленной задачи свидетельствует о соответствии изобретения критерию "промышленная применимость".

На фиг.1 представлена схема формирования чувствительного слоя биосенсора.

На фиг.2 представлена схема проведения индикаторной реакции.

На фиг.3 представлена схема измерения аналитического сигнала с использованием оптического биосенсора.

На фиг.4 представлены спектры флуоресценции чувствительного слоя биосенсора в отсутствие (1) и в присутствии АД (2) (сАД - 0.5 мкМ; время реакции 30 с).

Приведенные примеры подтверждают, но не ограничивают заявляемое изобретение.

Пример 1. Способ получения в чувствительном слое биосенсора 2,3-бензо-7-метиламин-хиноксалина, флуоресцирующего производного катехоламинов, на примере ферментативной дериватизации ДА с o-фенилендиамином

В качестве производного катехоламинов был взят допамин (ДА). Реакцию дериватизации ДА с o-фенилендиамином проводили по следующей методике: в стеклянную пробирку последовательно вводили 4.8 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора (pH 9.5), раствор ДА (0.2-2.0 мкМ в системе) и 0.100 мл 25 мМ раствора Н2О2 (0.5 мМ в системе). Реакционную смесь тщательно перемешивали и погружали в нее биосенсор, чувствительный слой которого содержал пероксидазу (25 нМ в системе) и o-фенилендиамин (100 мкМ в системе). Биосенсор выдерживали в реакционной системе в течение 30 с, извлекали и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для измерения аналитического сигнала биосенсор устанавливали в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркальная пластинка) под углом 75 градусов относительно источника возбуждения (ксеноновая лампа) и регистрировали интенсивность флуоресценции чувствительного слоя (λех=440-450 нм, λem=520 нм). Предел обнаружения - 70 нМ.

Пример 2. Способ получения в чувствительном слое биосенсора 2,3-бензо-7-гидроксиметиламин-хиноксалина, флуоресцирующего производного катехоламинов, на примере ферментативной дериватизации АД с o-фенилендиамином

В качестве производного катехоламинов был взят адреналин (АД). Реакцию дериватизации АД с o-фенилендиамином проводили по следующей методике: в стеклянную пробирку последовательно вводили 4.8 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора (pH 9.75), раствор АД (0.1-1.0 мкМ в системе) и 0.070 мл 25 мМ раствора H2O2 (0.35 мМ в системе). Реакционную смесь тщательно перемешивали и погружали в нее биосенсор, чувствительный слой которого содержал пероксидазу (25 нМ в системе) и o-фенилендиамин (100 мкМ в системе). Биосенсор выдерживали в реакционной системе в течение 30 с, извлекали и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для измерения аналитического сигнала биосенсор устанавливали в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркальная пластинка) под углом 75 градусов относительно источника возбуждения (ксеноновая лампа) и регистрировали интенсивность флуоресценции чувствительного слоя (λex=440-450 нм, λem=540 нм). Предел обнаружения - 50 нМ.

Пример 3. Способ получения в чувствительном слое биосенсора 2,3-бензо-хиноксалин-7-уксусной кислоты, флуоресцирующего производного метаболитов катехоламинов, на примере ферментативной дериватизации ГВК с o-фенилендиамином

В качестве производного метаболитов катехоламинов была взята гомованилиновая кислота (ГВК). Реакцию дериватизации ГВК с o-фенилендиамином проводили по следующей методике: в стеклянную пробирку последовательно вводили 4.8 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора (pH 10.0), раствор ГВК (10-100 нМ в системе) и 0.050 мл 25 мМ раствора H2O2 (0.25 мМ в системе). Реакционную смесь тщательно перемешивали и погружали в нее биосенсор, чувствительный слой которого содержал пероксидазу (10 нМ в системе) и o-фенилендиамин (100 мкМ в системе). Биосенсор выдерживали в реакционной системе в течение 30 с, извлекали и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для измерения аналитического сигнала биосенсор устанавливали в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркальная пластинка) под углом 75 градусов относительно источника возбуждения (ксеноновая лампа) и регистрировали интенсивность флуоресценции чувствительного слоя (λех=440-450 нм, λem=540 нм). Предел обнаружения - 5 нМ.

Пример 4. Способ получения в чувствительном слое биосенсора 2,3-бензо-хиноксалин-7-гидроксиуксусной кислоты, флуоресцирующего производного метаболитов катехоламинов, на примере ферментативной дериватизации ВМК с o-фенилендиамином

В качестве производного метаболитов катехоламинов была взята ванилилминдальная кислота (ВМК). Реакцию дериватизации ВМК с o-фенилендиамином проводили по следующей методике: в стеклянную пробирку последовательно вводили 4.8 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора (pH 9.5), раствор ВМК (5-75 нМ в системе) и 0.070 мл 25 мМ раствора H2O2 (0.35 мМ в системе). Реакционную смесь тщательно перемешивали и погружали в нее биосенсор, чувствительный слой которого содержал пероксидазу (10 нМ в системе) и o-фенилендиамин (50 мкМ в системе). Биосенсор выдерживали в реакционной системе в течение 30 с, извлекали и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для измерения аналитического сигнала биосенсор устанавливали в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркальная пластинка) под углом 75 градусов относительно источника возбуждения (ксеноновая лампа) и регистрировали интенсивность флуоресценции чувствительного слоя (λex=440-450 нм, λem=530 нм). Предел обнаружения - 3 нМ.

Как видно из приведенных примеров, предлагаемое изобретение решает задачу получения флуоресцирующих производных катехоламинов и их метаболитов непосредственно в чувствительном слое твердофазного оптического биосенсора.

1. Способ определения катехоламинов и их метаболитов, характеризующийся использованием флуоресцентного биосенсора путем ферментативной дериватизации катехоламинов и их метаболитов с образующими конденсированные структуры аминами, причем аналитический сигнал регистрируется непосредственно в чувствительном слое сенсора, закрепленном на поверхности подложки, чувствительный слой биосенсора содержит иммобилизованный фермент и дериватизирующий агент и представляет собой двухслойную пленку - о-фенилендиамин/хитозан-пероксидаза, сформированнную последовательным нанесением смеси хитозан - о-фенилендиамин и смеси хитозан - пероксидаза на поверхность стеклянной пластинки; для проведения индикаторной реакции биосенсор выдерживается 30 с в реакционной системе и высушивается на воздухе при комнатной температуре; для измерения аналитического сигнала биосенсор устанавливается в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью под углом 75 градусов относительно источника возбуждения, причем интенсивность флуоресценции чувствительного слоя регистрируется в режиме отражения.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют пероксидазу из корней хрена, в качестве окислителя используют пероксид водорода, в качестве амина используют о-фенилендиамин; процесс проводят при концентрации пероксидазы хрена - 10-25 нМ; концентрации пероксида водорода - 250-500 мкМ, концентрации дериватизирующего агента - 50-100 мкМ; концентрации катехоламинов и метаболитов - 5-2000 нМ; в качестве буферного раствора берут 5 мМ фосфатный буферный раствор pH 9.5-10.0.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что формирование чувствительного слоя осуществляют последовательным нанесением 100 мкл смеси хитозан - о-фенилендиамин и 150 мкл смеси хитозан - пероксидаза на поверхность стеклянной пластинки 14×40 мм; объемная доля хитозана в пленке - 95%; после нанесения каждого слоя поверхность биосенсора высушивается на воздухе при комнатной температуре.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для измерения аналитического сигнала биосенсор устанавливается в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью, зеркальной пластинкой 14×40 мм, под углом 75 градусов относительно источника возбуждения, ксеноновой лампы.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для диагностики некроза кишки при мезентериальной ишемии. Сущность изобретения заключается в моделировании у крыс острой мезентериальной ишемии с последующим определением количества лимфоцитов в центральной венозной крови, и при снижении их более чем на 80% от средних нормальных значений диагностируют некроз кишки.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и жирового поражения печени у больных с синдромом дислипидемии, заключающийся в том, что у больного в сыворотке крови определяют активность фермента антиоксидантной системы глутатионредуктазы (ГЛР), которую оценивают спектрофотометрическим методом, и при значении ГЛР менее или равно 14,6 мкмоль/л/мин диагностируют жировую болезнь печени, при концентрации ГЛР более 14,6 мкмоль/л/мин - хронический вирусный гепатит.
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии. С помощью спектроскопа комбинированного рассеяния проводят серию регистрации спектров области новообразования и здоровой кожи.
Изобретение относится к медицине, а именно к детской офтальмологии, и описывает способ диагностики миопии у детей дошкольного возраста, заключающийся в том, что в слезной жидкости ребенка определяют активность фермента γ-глутамилтранспептидазы и при ее значении свыше 11 Е/л диагностируют заболевание.

Изобретение относится к области медицинской биохимии и представляет собой способ определения концентрации катионов цинка в сыворотке крови с одновременным определением соотношения катионов цинка и катионов меди, включающий использование в качестве основного реагента раствор дитизона в четыреххлористом углероде, инкубацию при комнатной температуре в щелочной среде, удаление органической фазы и колориметрию коллоидных растворов пробы сыворотки крови и стандартного раствора при 535 нм, расчет концентрации катионов цинка, колориметрию коллоидных растворов пробы сыворотки крови и стандартного раствора при при 435 нм и расчет молярного соотношения катионов цинка и меди.

Изобретение относится к биологии, токсикологической и аналитической химии, а именно к способам определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораторий.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ прогнозирования развития полипозного риносинусита у больных бронхиальной астмой, который осуществляется путем определения в крови пациентов показателей эндотоксикоза: лейкоцитов, молекул средней массы, креатинина, мочевины и скорости оседания эритроцитов; прогноз осуществляют с помощью дискриминантного уравнения: D=6,900×лейкоциты(×10^9/л)+2,640×скорость оседания эритроцитов (мм/ч)+17,819×молекулы средней массы (ед.
Изобретение относится к области медицины и может найти применение для оценки действия цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) на деформабельность эритроцитов в период гестации.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа диагностики нарушения почек у собак, включающего стадию измерения уровня экспрессии группы биомаркеров в биологическом образце от собаки, где биомаркеры представляют собой кластерин (CLU), секретируемый связанный с frizzle белок-2 (SFRP2); матрилин-2 (Matn2); лумикан (LUM); декорин (DCN); альфа 1 (III) цепи коллаген, вариант 12 (COL3A1); ретинол-связывающий белок 4 (rbp4); ММР-9; трансферрин (TF); Аро-С-1 (АроС1); и ингибин-бета A (INHBA).

Изобретение относится к области медицины, а именно к оториноларингологии, и может использоваться для прогнозирования восстановления слуховой функции у больных с острой сенсоневральной тугоухостью (ОСНТ).

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к биохимии, гигиене, стоматологии, медицинской экологии, может быть использовано для выявления степени адаптации к производственным условиям при взаимодействии с вредными и опасными факторами. Определяют значения спонтанного свечения, периода индукции и амплитуды быстрой вспышки за 5 мин регистрации, рассчитывают коэффициент адаптационного риска (КАР) по формуле: КАР=Сn-А/π, где: КАР - коэффициент адаптационного риска; Сn - спонтанное свечение; А - амплитуда быстрой вспышки; π - период индукции. При значении КАР 0,066-3,85 усл.ед. адаптацию оценивают как удовлетворительную или компенсированную, при значении КАР 3,88-6,5 усл.ед. адаптацию оценивают как напряженную, при значении КАР 6,6-9,5 усл.ед. адаптацию оценивают как неудовлетворительную, при значении КАР 9,6 усл.ед. и более - как срыв адаптации. Использование изобретения повышает точность оценки за счет определения критериев для отнесения обследуемых в группы по уровню адаптации. 1 табл., 8 пр.

Группа изобретений относится к медицине. Представлен портативный анализатор для исследования пробы биологической жидкости, содержащий корпус с магазином, имеющим отделения для размещения используемых для анализа диагностических полосок или тест-полосок, имеющих зону для биологической жидкости, анализирующее устройство с щелевидным приемником для используемой диагностической полоски или тест-полоски, оснащенной с одного конца электрическими контактами, и индикаторное устройство для отображения не менее одного результата анализа, причем корпус со стороны задней части выполнен с понижением, образующим плоскую поверхность, на которой вдоль корпуса или поперечно ему выполнены выступы, разделяющие плоскую поверхность понижения на отделения для размещения диагностических полосок или тест-полосок и образующие магазин, расположенных параллельно не менее чем в один ряд, при этом отделения закрыты снимаемой или открываемой крышкой, являющейся частью корпуса. Также описаны 2 других варианта портативного анализатора. Достигается расширение эксплуатационных качеств и повышение эффективности. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 12 ил.

Изобретение относится к области спортивной медицины, а именно к методам лабораторной диагностики уровня физической нагрузки на организм спортсмена. Для этого определяют содержание кальция и белка в ротовой жидкости до и после физической нагрузки, а также через день после физической нагрузки. Критерием полноценного восстановления организма спортсмена-волейболиста считают восстановление содержания ионов кальция и белка в ротовой жидкости после физической нагрузки к первоначальным значениям, оценивая при этом временной интервал, необходимый для этого процесса. Изобретение позволяет проводить определение резервных возможностей организма и его адаптированности спортсменов-волейболистов к физической нагрузке. 2 ил., 4 табл.

Изобретение относится к медицине и описывает способ оценки эффективности включения мексидола в комбинированную терапию острого коронарного синдрома по динамике липидно-фосфолипидного спектра сыворотки крови, где устанавливают влияние мексидола на редукцию волнообразного характера изменений липидно-фосфолипидных комплексов сыворотки крови с их стабилизацией на уровне, достаточном для обеспечения энергопластических потребностей организма и миокарда, что оценивают как положительный результат комбинированного лечения больных с ОКС. На основании улучшения клинико-функциональных показателей и редуцирования волнообразного характера изменений липидно-фосфолипидных комплексов сыворотки крови со стабилизацией их концентрации на постоянно высоком уровне оценивается как положительный результат комбинированного лечения больных с ОКС. 2 пр., 2 ил.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам диагностики активности эксцизионной репарации повреждений ДНК, и касается определения экспрессии ключевого белка эксцизионной репарации ERCC1 (excision repair cross-complementing protein 1) в солидных опухолях человека. Способ иммунофлуоресцентного анализа белка эксцизионной репарации ERCC1 в солидных опухолях человека включает приготовление одноклеточных суспензий из опухолевой ткани и культуры сравнения, фиксацию в 4%-ном растворе формальдегида, инкубацию с Tween 20, отмывку с помощью фосфатного буфера pH 7,4, инкубацию с первичными (клон 8F1) и вторичными (флуоресцентный краситель DyLight 650) антителами, двойную отмывку с помощью фосфатного буфера pH 7,4, проведение анализа данных на проточном цитофлуориметре; использование монослойной культуры рака молочной железы человека линии MCF-7 в качестве культуры сравнения; расчет уровня экспрессии белка с помощью статистического теста Колмогорова-Смирнова, а расчет интенсивности экспрессии с помощью геометрического среднего флуоресценции опухолевых клеток. Использование способа позволяет количественно оценить экспрессию белка ERCC1, что исключает субъективный компонент в оценке результата. 2 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к перинатологии и неонатологии. Предлагаемый способ включает определение концентрации серомукоида в надосадочной части биологической жидкости носоглоточного аспирата. При значениях концентрации серомукоида 0,135-0,195 единиц оптической плотности отмечают отсутствие воспалительных заболеваний головного мозга и его оболочек у доношенных новорожденных с внутриутробной цитомегаловирусно-герпетической инфекцией. При концентрации серомукоида 0,196-0,256 единиц оптической плотности диагностируют воспалительные заболевания головного мозга и его оболочек у доношенных новорожденных с внутриутробной цитомегаловирусно-герпетической инфекцией. Применение изобретения обеспечивает раннюю диагностику воспалительных заболеваний головного мозга и его оболочек у доношенных новорожденных с внутриутробной цитомегаловирусно-герпетической инфекцией. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, и позволяет определить способность эритроцитов генерировать оксид азота (NO). Способ включает взятие у обследуемого образца крови, перемешивание образца с антикоагулянтом, помещение половины данного образца в условия гипоксии, затем получение плазмы крови из частей образца, подвергавшихся и не подвергавшихся гипоксии, определение в обеих частях содержания оксида азота и вычисление разницы полученных величин в сравнении с аналогичными данными в контрольной группе. По результатам сравнения судят о состоянии NO-генерирующей функции эритроцитов. Данный способ позволяет оценить вклад усиленной или пониженной NO-генерирующей функции эритроцитов в патогенез гипертонической болезни и других заболеваний, связанных с состояниями гипоксии, тромбоза, нарушения регуляции сосудистого тонуса и обмена оксида азота. 4 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

Изобретение касается способа оценки эффективности защиты лимфоцитов от апоптоза, относится к медицине и может быть использовано в биохимии, кардиологии и терапии. Способ включает выделение лимфоцитов, инкубацию клеток 48 часов при температуре 37°С и 5% содержанием СО2, количественное определение жизнеспособности лимфоцитов по включению трипанового синего и биохимическое определение концентрации восстановленного и окисленного глутатиона в лизате лимфоцитов после предварительной инкубации в течение 30 минут с 10 ммоль 2-винилпиридином. Дополнительно в инкубационную среду, содержащую лимфоциты, вводят 1,4-дитиоэритритол и аскорбиновую кислоту в конечной концентрации 3,0 ммоль и 0,1 ммоль соответственно. При росте белково-связанного глутатиона на 18%-35%, а восстановленного глутатиона на 25-41% считают защиту низкоэффективной. При росте белково-связанного глутатиона на 36% и более и восстановленного глутатиона на 42% и более считают защиту высокоэффективной. Использование предлагаемого способа позволяет констатировать защиту клеток от апоптоза. Предлагаемый способ прост в осуществлении и интерпретации полученных результатов. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и предназначено для выявления риска развития преэклампсии. Для прогнозирования риска развития преэклампсии у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья, выделяют ДНК из периферической венозной крови и проводят анализ полиморфизмов генов цитокинов. Прогнозируют минимальный риск развития преэклампсии при сочетании трех генетических вариантов четырех генетических полиморфизмов: G I-ТАС (rs4512021) и +36 GG TNFR1; +250 A Ltα, G I-TAC (rs4512021) и +36 GG TNFR1; +250 G Ltα (rs909253), +36 A TNFR1 (rs767455), -403 G/A RANTES (rs2107538). Использование изобретения позволяет повысить эффективность выявления риска развития преэклампсии. 4 ил., 2 табл., 4 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и предназначено для выявления риска развития и степени тяжести преэклампсии. Для прогнозирования риска возникновения преэклампсии тяжелого течения у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья, выделяют ДНК из периферической венозной крови и анализируют генетические полиморфизмы: -308 G/A TNFα (rs1800629), +36 A/G TNFR1 (rs767455), -801 G/A SDF 1(rs1801157), C/G MCP-1 (rs285765). Повышенный риск развития преэклампсии тяжелого течения прогнозируют при наличии сочетания генетических вариантов -801A SDF1, +36 GG TNFR1 и -308 A TNFα. Пониженный риск развития преэклампсии тяжелого течения прогнозируют при наличии сочетания генетических вариантов -801 G SDF1 и G МСР (rs 285765). Использование изобретения позволяет повысить эффективность выявления тяжелого течения преэклампсии. 4 ил., 2 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области медицины и может быть применено для определения катехоламинов их метаболитов в объектах на основе матриц сложного состава, в том числе нерастворимых в воде, без их дополнительной пробоподготовки. Способ осуществляют путем изменения принципиальной схемы формирования и измерения аналитического сигнала, регистрируемого в чувствительном слое биосенсора, - переходом к твердофазной флуоресценции. Действие биосенсора основано на реакции ферментативной дериватизации катехоламинов и их метаболитов с органическими аминами с образованием производных хиноксалина, флуоресцирующих в области 450-550 нм. При этом компоненты индикаторной реакции иммобилизованы в чувствительном слое на поверхности биосенсора, в результате флуоресцентный сигнал формируется и регистрируется непосредственно на твердой поверхности в режиме отражения. Наибольшую интенсивность флуоресцентного сигнала получают при использовании в качестве дериватизирующего агента o-фенилендиамина и проведении процесса при концентрации пероксидазы хрена - 10-25 нМ; концентрации пероксида водорода - 250-500 мкМ; концентрации o-фенилендиамина - 50-100 мкМ; концентрации катехоламинов и метаболитов - 5-2000 нМ. В качестве буферного раствора берут 5 мМ фосфатный буферный раствор pH 9.5-10.0. Чувствительный слой биосенсора представляет собой двухслойную пленку {хитозан - o-фенилендиаминхитозан - пероксидаза}, нанесенную ровным слоем на поверхность стеклянной пластинки. Изобретение обеспечивает простое и чувствительное определение катехоламинов и их метаболитов в объектах, анализ которых с использованием оптических методов детектирования по инструментальным причинам был ранее затруднен или невозможен вследствие мешающего влияния матрицы реального объекта, а также недостаточной чувствительности и воспроизводимости биосенсоров. 3 з.п. ф-лы, 4 ил.

Наверх