Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом



Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом
Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связываться с апатитом

 


Владельцы патента RU 2556806:

НАНО ИНТЕЛИДЖЕНТ БИОМЕДИКАЛ ЭНДЖИНИРИНГ КОРПОРЕЙШН. КО. ЛТД. (KR)

Группа изобретений относится к области биотехнологии и трансплантационной медицины и представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:40. При этом пептид обладает способностью регенерировать костную ткань и специфически связываться с поверхностью минерала апатит. Пептид способен стабильно иммобилизоваться на поверхности апатита для сохранения полезной активности и оказания воздействия на регенерацию кости в течение длительного времени. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 4 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение имеет отношение к пептиду, обладающему способностью регенерировать костную ткань и специфически связывающемуся с поверхностью минерала апатит, и конкретнее к пептиду, обладающему способностью регенерировать костную ткань и специфически связывающемуся с поверхностью минерала апатит, способному, будучи стабильно иммобилизованным на поверхности апатита, сохранять полезную активность и оказывать воздействие на регенерацию кости в течение длительного времени, благодаря сшитыми друг с другом аминокислотной последовательностью, обладающей способностью регенерировать костную ткань, и аминокислотной последовательностью, обладающей способностью связываться с апатитом, чтобы таким образом полученный пептид, обладал костеобразующим действием, а также способностью связываться с поверхностью минерала апатит, и композиции для регенерации костной ткани, содержащей данный пептид.

Предшествующий уровень техники

Кости и зубы называются твердой тканью организма. Кости состоят приблизительно на 45% из неорганических веществ, на 35% из органических веществ и на 20% из воды. Что касается зубов, эмаль приблизительно на 97% состоит из неорганических веществ, дентин на 70% состоит из неорганических веществ, а цемент зуба на 50% состоит из неорганических веществ. Содержание неорганического вещества несколько отличается в зависимости от вида животного, части тела, возраста и тому подобного.

Относительно составляющих кость веществ, большая часть органических веществ представляет собой коллаген, участвующий в образовании костей и поддержании твердости и гибкости костей, и присутствует в качестве матрикса, вызывающего избирательную адгезию клеток костей, чтобы посредством этого ориентировать костные неорганические частицы. Минерал апатит является главным компонентом кости в естественных условиях, т.е., неорганическим веществом костей позвоночных, и известен как гидроксиапатит (Ca10(PO4)6(ОН)2), гидроксилапатит, карбонатгидроксиапатит (СНАр, А-тип: Ca10(PO4)6[(ОН)2-2x(СО3)x], B-тип: Са10-х[(PO4)6-2х(СО3)](ОН)2). Известно, что вместо Са2+ содержатся очень маленькие количества Mg2+, Na+ или K+, и вместо ОН- содержатся очень маленькие количества Cl- или F-. Поэтому были проведены исследования дентальных материалов и материалов костных трансплантатов, предназначенных для заживления дефектов кости, изготовленных из минерала апатит, или с поверхностями, покрытыми апатитом.

Целью пересадки костного трансплантата является восстановление морфологических и физиологических функций кости для того, чтобы таким образом сохранить биомеханические функции. Следовательно, используемый здесь апатит-содержащий материал костных трансплантатов должен удовлетворять основным условиям, таким как незамедлительное использование, отсутствие иммунного ответа, оказание содействия быстрому образованию кости и реваскуляризации, сохранение поддержки костной тканью и целостности и т.п. Однако апатит как таковой может служить в качестве посредника, который обладает костной проводимостью, но не обладает способностью индуцировать первичный морфогенез кости, необходимый для сокращения продолжительности лечения. Для исправления этого недостатка были проведены исследования, в которых биологически активная субстанция, содержащая хемотакин (chemotactin), такая как белок внеклеточного матрикса, тканевый фактор роста, или костный морфогенетический белок, используется вместе с апатитом, и были разработаны такие продукты как INFUSE (содержащий BMP-2), GEM21S (содержащий PDGF) и тому подобное. Однако эти белки не являются стабильно иммобилизованными на поверхности апатита и высвобождаются из апатита, затем выходят в системный кровоток и таким образом разрушаются, и, поэтому сложно поддерживать активность этих белков на поверхности апатита для получения эффекта регенерации кости. Следовательно, для того, чтобы увеличить эффект регенерации кости, необходим материал, стабильно иммобилизованный на поверхности апатита и таким образом сохраняющий полезную активность.

Настоящие изобретатели предприняли попытку преодолеть проблемы предшествующего уровня техники, как описано выше. В результате этого, изобретатели настоящего изобретения подтвердили, что пептид, обладающий одновременно и костеобразующей способностью и способностью связываться с апатитом, может находиться в устойчивом состоянии при связывании с поверхностью апатита, и при этом оказывать содействие перемещению, пролиферации и дифференцировке клеток, связанных с регенерацией, и в итоге максимально увеличивать способность костной ткани к регенерации и демонстрировать сильный терапевтический эффект при регенерации костной ткани, и таким образом, осуществили настоящее изобретение.

Раскрытие изобретения

Цель настоящего изобретения - предоставить пептид, обладающий способностью восстанавливать костную ткань и связываться с апатитом, причем данный пептид стабильно иммобилизуется на поверхности минерала апатит и сохраняет свою активность.

Другая цель настоящего изобретения - предоставить материал костного трансплантата и биоматериал для регенерации кости, в котором пептид иммобилизован на поверхности апатита.

Для достижения вышеназванных целей настоящее изобретение предоставляет пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связывающийся с апатитом, при этом пептид, обладающий способностью регенерировать кость, и пептид, обладающий способностью связываться с апатитом, связываются между собой.

Настоящее изобретение также предоставляет материал костного трансплантата и биоматериал для регенерации кости, в котором на поверхности апатита иммобилизован пептид.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - полученные с помощью конфокального микроскопа изображения ткани, взятой через 4 недели после трансплантации FITC-меченого костного минерала в область дефекта в основании черепа кролика (фиг.1А - костный минерал без связанного пептида, и фиг.1B - костный минерал со связанным пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:40, меченный FITC).

Фиг.2 показывает результаты исследования образцов крови, взятых за один день до и через 1 день, 3 дня, 7 дней, 14 дней, 21 день и 28 дней после трансплантации FITC-меченого костного минерала в область дефекта в основании черепа кролика, после чего высвобожденные в кровь пептиды были измерены с помощью флюориметра (RFI - относительный индекс флуоресценции, синяя линия - отрицательный контроль, показывающий результаты измерения в плазме без флуоресцентного вещества).

Фиг.3 - изображения, показывающие степень регенерации кости через 2 недели после трансплантации костного минерала со связанным пептидом в область дефекта в основании черепа кролика (фиг.3а - материал для костного трансплантата со связанным пептидом SEQ ID NO:36, фиг.3b - материал для костного трансплантата со связанным пептидом SEQ ID NO:35, и фиг.3с - материал для костного трансплантата со связанным пептидом SEQ ID NO:40).

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Если не указано иное, все использованные в описании технические и научные термины имеют те же самые значения, которые в большинстве случаев понятны для специалистов в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В целом, используемая в описании номенклатура хорошо известна и обычно применяется в данной области техники.

Для выявления пептида в соответствии с настоящим изобретением получены аминокислотные последовательности активных центров костного морфогенетического белка и белка внеклеточного матрикса и затем подвергнуты химической модификации, чтобы тем самым сохранить их активную структуру.

Один аспект настоящего изобретения имеет отношение к пептиду, обладающему способностью регенерировать костную ткань и связывающемуся с апатитом, в котором, по меньшей мере, один пептид, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:35 и, по меньшей мере, один пептид, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO:36 до SEQ ID NO:39, связываются друг с другом.

В настоящем изобретении пептид, связывающийся с минералом апатит, может быть выбран из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:36 (STLPIPHEFSRE), SEQ ID NO:37 (VTKHLNQISQSY), SEQ ID NO:38 (SVSVGMKPSPRP) и SEQ ID NO:39 (NRVFEVLRCVFD). Пептид химически присоединяется к N-концу пептида, обладающего способностью регенерировать костную ткань, для увеличения способности связываться с апатитом, который является составной частью кости, и таким образом стабильно связывается с материалом костного трансплантата или имплантатом, покрытым апатитом.

В настоящем изобретении пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань, может быть выбран из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:35.

В частности, пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань, может быть, по меньшей мере, одним пептидом, выбранным из группы, состоящей из:

а) аминокислотной последовательности в положениях 2-18 каждого из костных морфогенетических белков (ВМР)-2, 4 и 6 [SEQ ID NO:1 для BMP-2, SEQ ID NO:2 для BMP-4 и SEQ ID NO:3 для BMP-6]; аминокислотной последовательности в положениях 16-34 (SEQ ID NO:4), аминокислотной последовательности в положениях 47-71 (SEQ ID NO:5), аминокислотной последовательности в положениях 73-92 (SEQ ID NO:6), аминокислотной последовательности в положениях 88-105 (SEQ ID NO:7), аминокислотной последовательности в положениях 83-302 (SEQ ID NO:8), аминокислотной последовательности в положениях 335-353 (SEQ ID NO:9) и аминокислотной последовательности в положениях 370-396 (SEQ ID NO:10) BMP-2; аминокислотной последовательности в положениях 74-93 (SEQ ID NO:11), аминокислотной последовательности в положениях 293-313 (SEQ ID NO:12), аминокислотной последовательности в положениях 360-379 (SEQ ID NO:13) и аминокислотной последовательности в положениях 382-402 (SEQ ID NO:14) BMP-4; аминокислотной последовательности в положениях 91-110 (SEQ ID NO:15), аминокислотной последовательности в положениях 407-418 (SEQ ID NO:16), аминокислотной последовательности в положениях 472-490 (SEQ ID NO:17) и аминокислотной последовательности в положениях 487-510 (SEQ ID NO:18) BMP-6; и аминокислотной последовательности в положениях 98-117 (SEQ ID NO:19), аминокислотной последовательности в положениях 320-340 (SEQ ID NO:20), аминокислотной последовательности в положениях 400-409 (SEQ ID NO:21) и аминокислотной последовательности в положениях 405-423 (SEQ ID NO:22) BMP-7;

(b) аминокислотной последовательности в положениях 62-69 (SEQ ID NO:23), аминокислотной последовательности в положениях 140-148 (SEQ ID NO:24), аминокислотной последовательности в положениях 259-277 (SEQ ID NO:25), аминокислотной последовательности в положениях 199-204 (SEQ ID NO:26), аминокислотной последовательности в положениях 151-158 (SEQ ID NO:27), аминокислотной последовательности в положениях 275-291 (SEQ ID NO:28), аминокислотной последовательности в положениях 20-28 (SEQ ID NO:29), аминокислотной последовательности в положениях 65-90 (SEQ ID NO:30), аминокислотной последовательности в положениях 150-170 (SEQ ID NO:31) и аминокислотной последовательности в положениях 280-290 (SEQ ID NO:32) костного сиалопротеина II (BSP II); и

(c) аминокислотной последовательности в положениях 149-169, YGLRSKS (SEQ ID NO:33), KKFRRPDIQYPDAT (SEQ ID NO:34), и YGLRSKSKKFRRPDIQYPDAT (SEQ ID NO:35) костного сиалопротеина I (BSP I, остеопонтин).

Другой аспект настоящего изобретения имеет отношение к материалу костного трансплантата и биоматериалу для регенерации кости, в котором пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань, иммобилизован на поверхности апатита.

В настоящем изобретении биоматериал для регенерации кости может отличаться тем, что его выбирают из группы, состоящей из металлов, природных полимеров и синтетических полимеров.

В настоящем изобретении для того, чтобы обеспечить возможность связывания пептида, обладающего способностью регенерировать костную ткань и связывающегося с апатитом, с поверхностью апатита материала костного трансплантата или биоматериала для регенерации кости, материал костного трансплантата, состоящий из апатита или биоматериала, такого как металл, природный полимер или синтетический полимер, имеющий поверхность, покрытую апатитом, может быть погружен в раствор пептида, и в данном случае химический перекрестносшивающий агент для связывания не требуется.

Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связывающийся с апатитом, согласно настоящему изобретению стабильно иммобилизован на поверхности апатита, чтобы посредством этого повысить его стабильность и сохранить его активность в течение длительного времени. Таким образом, при пересадке пептида в организм, пептид стабильно удерживается в локальном участке трансплантации, и тем самым сохраняется его влияние на регенерацию кости, что соответствует предъявляемым требованиям к способам лечения, предназначенным для регенерации костной ткани и периодонта.

Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связывающийся с апатитом, в соответствии с настоящим изобретением может связываться с апатитом, выбранным из группы, состоящей из полученных из организма костных минералов гидроксилапатита, синтетического гидроксиапатита, карбонатапатита, трикальцийфосфата и монокальцийфосфата.

В настоящем изобретении содержание пептида, обладающего способностью регенерировать костную ткань и связывающегося с апатитом, предпочтительно составляет 1~100 мг на единицу веса (1 г) материала костного трансплантата, и более предпочтительно составляет 20~80 мг на единицу веса материала костного трансплантата.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, пептид SEQ ID NO:36, обладающий способностью связываться с апатитом, и пептид SEQ ID NO:35, обладающий способностью регенерировать костную ткань, были связаны между собой, для того, чтобы получить пептид SEQ ID NO:40, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связывающийся с апатитом. Затем, было проверено, происходит ли стабильное связывание полученного пептида с материалом костного трансплантата. Кроме того, способность регенерировать костную ткань проверяли путем пересадки материала костного трансплантата, в котором пептид был стабильно иммобилизован на поверхности апатита, в область дефекта в основании черепа.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет подробно описано с помощью примеров. Данные примеры приводятся только для пояснения настоящего изобретения, и специалистам в данной области техники понятно, что объем настоящего изобретения не ограничиваются этими примерами.

Пример 1. Приготовление «умного» пептида, обладающего способностью регенерировать костную ткань и специфически связывающегося с поверхностью минерала апатит

Методом F-moc твердофазного химического синтеза при помощи синтезатора пептидов был последовательно с N-конца синтезирован пептид, содержащий последовательность YGLRSKSKKFRRPDIQYPDAT (SEQ ID NO:35), обладающую способностью регенерировать костную ткань, полученную из остеопонтина, и пептид STLPIPHEFSRE (SEQ ID NO:36), обладающий способностью связываться с апатитом. Другими словами, синтез был проведен с использованием смолы Rink (0,075 ммоль/г, 100~200 меш, сшивание 1% DVB) с которой Fmoc-(9-фторенилметоксикарбонил) связывается как блокирующая группа. 50 мг смолы Rink помещали в синтезатор, и затем подвергали набуханию с DMF. После этого 20% раствор пиперидин/DMF использовали для удаления Fmoc-группы. 0,5М раствор аминокислот (растворитель: DMF), 1,0М раствор DIPEA (растворитель: DMF&NMP) и 0,5 М раствор HBTU (растворитель: DMF) последовательно вводили в 5, 10, и 5 эквивалентных количествах, соответственно, с С-конца пептида, и затем проводили реакцию в течение 1~2 часов в атмосфере азота. Когда снятие защитных групп и связывание завершалось, дважды промывали DMF и NMP. Даже после присоединения последней аминокислоты проводили снятие защитных групп для удаления Fmoc-группы.

Для подтверждения синтеза использовали нингидриновую реакцию. Протестированную и полностью синтезированную смолу высушивали над THF или DCM. Затем вводили TFA смесь для расщепления в соотношении 20 мл на 1 г смолы, и затем перемешивали в течение 3 часов, с последующим фильтрованием для разделения смолы и смеси с растворенным в ней пептидом. Отфильтрованный раствор удаляли при помощи роторного испарителя, после чего вводили сюда холодный эфир или большое количество холодного эфира вводили непосредственно в TFA смесь для кристаллизации пептида в твердую фазу, которую затем выделяли центрифугированием. В этот момент TFA смесь полностью удаляли с помощью нескольких промывок эфиром и центрифугирования. Полученный таким образом пептид растворяли в дистиллированной воде, а затем высушивали сублимацией.

NH2-STLPIPHEFSRE-YGLRSKSKKFRRPDIQYPDAT-COONH2□ (SEQ ID NO:40)

Синтезированный пептид отщепляли от смолы, промывали и высушивали сублимацией, а после этого выделяли и очищали методом жидкостной хроматографии. Очищенный пептид подвергали MALDI-анализу для подтверждения его молекулярной массы.

Для тестирования стабильности in vivo, проводили связывание 10 эквивалентных количеств флуоресцеинизотиоцианата (FITC) с N-концом с использованием триэтиламина (1 мл на 1 г смолы) во время приготовления пептида SEQ ID NO:40. Синтез пептида был подтвержден определением его молекулярной массы с помощью MALDI-TOF.

Пример 2. Подтверждение in vitro стабильности «умного» пептида, обладающего способностью регенерировать костную ткань и специфически связывающегося с поверхностью минерала апатит

1200 мг пептида, приготовленного в примере 1, растворили в 1 мл тридистиллированной воды, а затем добавили 4 г бычьего костного материала (OCS-B, NIBEC), оставили для выпадения осадка на 24 часа и затем высушили сублимацией.

4 г материала костного трансплантата со связанным пептидом поместили в 20 мл PBS, после чего был проведен тест на высвобождение пептида при 37°С. Через 7 дней, 20 мл растворителя для элюирования (который был первоначально введен) полностью удалили, а затем вновь добавили 20 мл нового растворителя для элюирования, чтобы продолжить элюирование при 37°С. В вышеуказанном порядке, тест элюирования пептида проводили в течение 14 дней, 28 дней, 56 дней, 84 дня и 100 дней. После завершения элюирования материал костного трансплантата собирали и измеряли содержание пептида.

Способ получения опытной жидкости

Точно взвешивали 3 г материала костного трансплантата со связанным пептидом и затем измельчали в порошок. Точно отвешивали около 2 г порошка, соответствующие 160 мг пептида, помещали в 40 мл раствора А (подвижная фаза), а затем обрабатывали ультразвуком в течение 1 часа. После этого при перемешивании проводили экстракцию при 37±2°С в течение 24 часов, а затем верхний слой экстрагированного растворителя отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, а затем фильтровали через миллипоровый фильтр 0,22 мкм. Оттуда брали 1 мл и смешивали с 3 мл раствора А, который затем фильтровали через миллипоровый фильтр 0,22 мкм, затем отфильтрованный раствор использовали в качестве исследуемой жидкости.

Способ получения стандартной жидкости

Стандартный пептидный продукт высушивали в сушильной печи (силикагель) в течение 5 часов, затем точно отвешивали 10 мг и растворяли, добавив раствор А в качестве подвижной фазы, и точно 10 мл использовали в качестве стандартной жидкости.

Метод тестирования

Для получения площадей пика исследуемой жидкости и стандартной жидкости, AT и AS, 10 мл каждой из жидкостей исследовали с помощью жидкостной хроматографии при следующих условиях.

Количество пептида (мг) = количество стандартного пептидного продукта (мг) Х

Режим работы

Измерительный прибор: аналитический ВЭЖХ (Shimadzu, Japan)

Колонка: наполненная С18-связанным силикагелем с размером 5 мкм (длина: 250 нм, внутренний диаметр: 4,6 мм)

Подвижная фаза: 0,1% трифторуксусная кислота/DDW (раствор А), 0,098% трифторуксусная кислота /ацетонитрил (раствор В)

Детектор: UV абсорбционный спектрометр (измерение длины волны: 230 нм)

Скорость потока: 1 мл/мин

Температура колонки: постоянная приблизительно 40°С

Таблица 1
Условия градиента:
Время (мин) Состав раствора В (%)
1 5
35 100
45 100
50 5
60 5

Тестирование элюирования проводили в течение 100 дней, чтобы измерить пик пептида в элюирующей жидкости. В результате (фиг.2), пик пептида наблюдался в Лотах №1, 2 и 3 со временем удерживания 14.196 мин. После завершения элюирования были измерены количества пептида для Лотов №1, 2 и 3, которые составили 9,2 мг; 9,18 мг и 9,78 мг, соответственно (фиг.3). Это свидетельствует о том, что пептид, связанный с материалом костного трансплантата, не высвобождается в элюирующую жидкость, и следовательно, пептид был стабильно иммобилизован на материале костного трансплантата.

Таблица 2
Результаты высвобождения пептида SEQ ID NO:40 из костного минерала
Лот №. день Название Время удерживания Площадь Высота мг
1 7 RT14.196 0.000 0 0 0
14 RT14.196 0.000 0 0 0
28 RT14.196 0.000 0 0 0
56 RT14.196 0.000 0 0 0
84 RT14.196 0.000 0 0 0
100 RT14.196 0.000 0 0 0
2 7 RT14.196 0.000 0 0 0
14 RT14.196 0.000 0 0 0
28 RT14.196 0.000 0 0 0
56 RT14.196 0.000 0 0 0
84 RT14.196 0.000 0 0 0
100 RT14.196 0.000 0 0 0
3 7 RT14.196 0.000 0 0 0
14 RT14.196 0.000 0 0 0
28 RT14.196 0.000 0 0 0
56 RT14.196 0.000 0 0 0
84 RT14.196 0.000 0 0 0
100 RT14.196 0.000 0 0 0
Таблица 3
Содержание пептида SEQ ID NO:40, оставшегося в костном минерале
Lot No. Название Время удерживания Площадь высота мг
1 RT14.196 14.244 1176751 51132 9.2
2 RT14.196 14.235 1174499 51711 9.19
3 RT14.196 14.229 124963 56018 9.78

Пример 3. Подтверждение стабильности in vivo «умного» пептида, обладающего способностью регенерировать костную ткань и специфически связывающегося с поверхностью минерала апатит

Пептид SEQ ID NO:40, меченный FITC, был осажден в бычьем костном минерале (OCS-B, NIBEC). Полученный костный минерал пересаживали кролику в область дефекта в своде черепа, а затем скарифицировали через 4 недели. После этого, костный минерал, пересаженный в область дефекта в своде черепа, исследовали при помощи конфокального микроскопа (Olympus, Япония). Костный минерал со связанным пептидом SEQ ID NO:40, меченным FITC, в количестве 10 мг и 20 мг пересаживали в область дефекта в своде черепа. Кровь отбирали до пересадки и через 1 день, 3 дня, 7 дней, 14 дней, 21 день и 28 дней после пересадки, и затем при помощи флюориметра определяли, высвобождался пептид или нет в систему кровообращения.

В результате было подтверждено, что пептид был полностью иммобилизован на поверхности материала костного трансплантата, пересаженном в область дефекта в своде черепа и не распространялся в окружающую ткань (фиг.1B). Значения RFI не имели различия по сравнению со значениями до пересадки, что подтверждало, что пептид, содержавшийся в костном минерале, не высвобождался в кровь, и этот факт доказывал, что пептид был действительно иммобилизован на поверхности костного минерала (фиг.2).

Пример 4. Подтверждение способности регенерировать костную ткань in vivo «умного» пептида, обладающего способностью регенерировать костную ткань и специфически связывающегося с поверхностью апатита

Каждому из пептидов SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 и SEQ ID NO:40, полученному в примере, предоставили возможность связаться с материалом костного трансплантата тем же способом, как в примере 2, затем его трансплантировали в область дефекта в своде черепа кролика. Способность пептидов регенерировать костную ткань была подтверждена. В области свода черепа кролика под анестезией был создан круглый дефект кости диаметром 8 мм (белый новозеландский кролик, видовое название: cuniculus). Материал костного трансплантата и пептид-содержащий материал костного трансплантата были пересажены в область костного дефекта (50 мг для каждого дефекта), затем были наложены швы и на надкостницу и на кожу. Животное умерщвляли через 2 недели после пересадки, а взятый образец фиксировали в растворе формалина. Ткань подвергали заливке для приготовления образца толщиной 20 мкм. Приготовленный препарат окрашивали основным фуксином и толуидиновым синим для получения недеминерализованного образца. Изготовленный таким образом образец изучали при помощи оптического микроскопа и фотографировали.

Фиг.3 показывает результат регенерации кости с помощью материала костного трансплантата, содержащего «умный» пептид, который обладает способностью регенерировать костную ткань и специфически связывается с поверхностью апатита. Наименьший результат регенерации кости наблюдался при применении материала костного трансплантата со связанным пептидом SEQ ID NO:36 (а, пептид, связанный с апатитом). Было замечено, что материал костного трансплантата со связанным пептидом SEQ ID NO:35 (b, пептид, обладающий действием на регенерацию кости) обладал повышенным действием на регенерацию кости по сравнению с a), а материал костного трансплантата со связанным пептидом SEQ ID NO:40 (c, «умный» пептид, обладающий способностью регенерировать кость и специфически связывающийся с поверхностью минерала апатит) обладал существенно повышенным действием на регенерацию кости по сравнению и с a) и с b). Из вышесказанного следует, что как таковой пептид, связанный с апатитом, не был эффективен для регенерации кости, и есть основания полагать, что этот пептид не является стабильно связанным с материалом костного трансплантата, и поэтому оказывает меньшее воздействие на регенерацию кости по сравнению с «умным» пептидом, у которого есть обе эти способности. Таким образом, как ожидается большой эффект на регенерацию кости при использовании «умного» пептида, обладающего способностью регенерировать кость и специфически связывающегося с поверхностью апатита, в материале костного трансплантата, изготовленном из апатита, или в имплантате, покрытом апатитом.

Настоящее изобретение подробно описано, опираясь на его отдельные признаки, при этом специалистам в данной области техники очевидно, что эти специфические технологии являются только предпочтительными вариантами осуществления, и таким образом объем настоящего изобретения не ограничиваются этими вариантами осуществления. Таким образом, действительный объем настоящего изобретения определяются сопутствующей формулой изобретения и ее эквивалентом. Все модификации и изменения настоящего изобретения легко могут использоваться специалистом в данной области техники, и эти модификации или изменения включаются в объем настоящего изобретения.

Пептид, обладающий способностью связываться с минералом апатит и способностью регенерировать костную ткань, в соответствии с настоящим изобретением связывается с поверхностью апатита, благодаря чему находится в стабильном состоянии, и вследствие этого может использоваться в замещающем кость материале, металле, природных полимерах или синтетических полимерах, покрытых апатитом, для применения в стоматологии или ортопедии; может оказывать содействие перемещению, пролиферации и дифференцировке клеток, связанных с регенерацией, и в результате, максимальному увеличению регенерации костной ткани; может стабильно присутствовать, сохраняя активность пептида, будучи имплантированным в организм, и, таким образом, является пригодным для развития терапевтических технологий регенерации костной ткани с использованием пептида.

1. Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связывающийся с апатитом, в котором пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:35, и пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:36, связаны между собой.

2. Пептид, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связывающийся с апатитом, в котором пептид представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:40.

3. Пептид по п. 1 или 2, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связывающийся с апатитом, где пептид иммобилизован на поверхности апатита.

4. Пептид по п.3, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связывающийся с апатитом, в котором апатит выбран из группы, состоящей из полученных из организма костных минералов гидроксилапатита, синтетического гидроксиапатита, карбонат-апатита, трикальцийфосфата и монокальцийфосфата.

5. Пептид по п. 3, в котором содержание пептида составляет 1-100 мг на единицу веса (1 г) материала костного трансплантата.

6. Пептид по п.1 или 2, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связывающийся с апатитом, где пептид иммобилизован на поверхности биосовместимого материала, покрытого апатитом.

7. Пептид по п. 6, характеризующийся тем, что биосовместимый материал выбирают из группы, состоящей из металлов, природных полимеров и синтетических полимеров.

8. Пептид по п. 6, обладающий способностью регенерировать костную ткань и связывающийся с апатитом, в котором апатит выбирают из группы, состоящей из полученных из организма костных минералов гидроксилапатита, синтетического гидроксиапатита, карбонат-апатита, трикальцийфосфата и монокальцийфосфата.

9. Пептид по п. 6, в котором содержание пептида составляет 1-100 мг на единицу веса (1 г) материала костного трансплантата для регенерации кости.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты гуманизированного анти-CD79b антитела, каждый из которых характеризуется наличием легкой и тяжелой цепи и набором 6 CDR с установленной аминокислотной последовательностью и по меньшей мере одним свободным цистеиновым аминокислотным остатком, выбранным из А118С (по Европейской нумерации) в тяжелой цепи и V205C (по нумерации Кэбат) в легкой цепи.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новым IL-17-ингибирующим полипептидам, соответствующим слитым белкам, к композициям и применению их в медицинских целях.

Представленная группа изобретений касается слитых белков, нуклеиновых кислот, кодирующих такие белки, экспрессирующей кассеты, обеспечивающей экспрессию нуклеиновой кислоты, вектора, включающего такую кассету, способа диагностики in vitro-боррелиоза, набора для такой диагностики, в которых используют упомянутые белки, а также вакцинной композиции для профилактики боррелиоза, включающей такие белки.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам, содержащим вариант родостомина, и может быть использовано в медицине. Получают полипептид, селективный в отношении интегрина αvβ3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, конъюгированной на N-конце посредством линкерной аминокислотной последовательности, содержащей комбинацию аминокислот глицина и серина, с вариантом человеческого сывороточного альбумина (HSA) с SEQ ID NO:4.

Изобретения относятся к химерным белкам, нуклеиновой кислоте, кодирующей такой белок, экспрессирующей кассете, обеспечивающей экспрессию нуклеиновой кислоты, вектора, включающего экспрессирующую кассету, способу диагностики и набора для диагностики.

Изобретение относится к биохимии, в частности, к новым мутантам стрептокиназы. Предложены как мутантные полипептиды стрептокиназы, так и слитые белки, обладающие активностью стрептокиназы.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к одиночному вариабельному домену, направленному против IL-6R, к полипептиду и конструкции, направленным против IL-6R, содержащим указанный одиночный вариабельный домен, а также к способам их получения.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собой рекомбинантный слитый белок формулы S-L-R, в том числе SR10, SR13, SR15, SdR10, SdR13 или SdR15, специфически узнающий меланомные клетки, в котором S - мономер стрептавидина, L - линкер, имеющий аминокислотную последовательность Ser-Arg-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, содержащую сайт расщепления энтеропептидазой и обозначаемую как «d», или аминокислотную последовательность Ser-Arg-Ala-Gly-Ala,R - меланома-адресующий олигопептид, представляющий собой R10, имеющий аминокислотную последовательность Asp-Gly-Ala-Arg-Tyr-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Asp-Gly, или R13, имеющий аминокислотную последовательность Leu-Ser-Gly-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Glu-Glu, или R15, имеющий аминокислотную последовательность Asp-Gly-Phe-Pro-Gly-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Ser-Gln-Glu.

Представленная группа изобретений относится к области биотехнологии и касается слитого белка DLK1-Fc и его применения для ингибирования метастазов рака, полинуклеотида, кодирующего такой белок, экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, клетки-хозяина, продуцирующей указанный слитый белок, способа получения слитого белка путем культивирования указанной клетки-хозяина, композиции, содержащей указанный слитый белок, и способа ингибирования метастазов рака.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и касается вакцины против гриппа, вызываемого известными штаммами вирусов гриппа А и В, а также возможными реассортантами.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ печати биологических лигандов, представляющих собой олигосахариды, и/или полисахариды, и/или пептиды, и/или гликопептиды, и/или биотин.

Изобретение относится к cпособу иммобилизации белковых молекул на поверхности магнитоуправляемых наночастиц железа, покрытых углеродной оболочкой. Способ включает взаимодействие порошка с растворенным в воде 4-карбоксибензолдиазоний тозилатом для формирования ковалентной связи органических функциональных групп с поверхностью порошка наночастиц железа, покрытых углеродной оболочкой.

Изобретение относится к области медицины, биологии и ветеринарии. .
Изобретение относится к области биотехнологии ферментных препаратов, может быть использовано для очистки и фракционирования целлюлолитических ферментов и касается способов получения аффинного адсорбента.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения афинного сорбента для очистки коллагеназ, и может быть использовано для выделения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые используются в медицине, биохимии, пищевой промышленности, в ферментативном синтезе пептидов, а также для исследовательских целей.
Изобретение относится к медицине, в частности к травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, стоматологии и нейрохирургии. Биодеградируемый материал для замещения костной ткани содержит 50-52% мас.

Изобретение относится к области медицины. Описана биорезорбируемая гидрогелевая полимерная композиция для сердечно-сосудистой хирургии в виде пленки, полученная взаимодействием природных полимеров, биологически активных веществ, растворителя и пластификатора, где в качестве полимеров используют сшитые биорезорбируемые полимеры - желатин, хитозан, или смеси - хитозан и желатин, хитозан и полигидроксибутират, в качестве биологически активных веществ или их смесей используют антиоксидант - L-карнозин, антикоагулянт - гепарин, антиагрегант - дипиридамол, ацетилсалициловую кислоту, нестероидное противовоспалительное вещество - ацетилсалициловую кислоту, антимикробные препараты - ципрофлоксацин, метронидазол, при этом механическая прочность пленки не менее 1,2 МПа, относительное удлинение - не более 160%, модуль упругости - 0,4-5 МПа.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, травматологии, общей хирургии, стоматологии, комбустиологии, пластической хирургии, косметологии. .
Наверх