Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения



Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения
Гуманизированные антитела против cd79b и иммуноконъюгаты и способы применения

 


Владельцы патента RU 2557319:

ДЖЕНЕНТЕК, ИНК. (US)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты гуманизированного анти-CD79b антитела, каждый из которых характеризуется наличием легкой и тяжелой цепи и набором 6 CDR с установленной аминокислотной последовательностью. При этом методом Biacore определен эпитоп антитела из 11 аминокислот. Рассмотрены: иммуноконъюгат антитела с лекарственным средством или средством для ингибирования роста клеток, где антитело связано со средством ковалентно, и варианты композиции, на основе эффективного количества иммуноконъюгата или антитела, используемые для ингибирования В-клеточной пролиферации; а также способ определения CD79b в образце с использованием антитела. Описаны: кодирующий антитело полинуклеотид, а также вектор экспрессии и выделенная клетка, содержащая вектор, для получения антитела. Раскрыты варианты применений антитела или иммуноконъюгата для получения лекарственного средства: для ингибирования роста клеток, экспрессирующих CD79b, для лечения индивидуума, страдающего раком, для лечения пролиферативного заболевания или для ингибирования В-клеточной пролиферации. Данное изобретение обеспечивает новые антитела, которые могут найти дальнейшее применение в терапии пролиферативных заболеваний, ассоциированных с CD79b. 17 н. и 84 з.п. ф-лы, 8 табл., 9 пр., 20 ил.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

По заявке, не являющейся временной, поданной согласно 37 CFR §1.53(b), испрашивается приоритет согласно 35 USC §119(e) по временной заявке США с серийным номером No. 60/950088, поданной 16 июля 2007 года, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям, подходящим для лечения гемопоэтической опухоли у млекопитающих, и к способам применения этих композиций.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Злокачественные опухоли (рак) являются второй из ведущих причин смертности в США, после заболеваний сердца (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). Злокачественная опухоль характеризуется повышением количества аномальных, или неопластических, клеток, происходящих из нормальной ткани, которые пролиферируют с образованием опухолевой массы, инвазией этих неопластических опухолевых клеток в соседние ткани, и образованием злокачественных клеток, которые в конечном итоге распространяются через кровь или лимфатическую систему в региональные лимфатические узлы и в отдаленные участки в результате процесса, называемого метастазированием. В злокачественном состоянии клетка пролиферирует в условиях, при которых нормальные клетки не растут. Злокачественная опухоль проявляется множеством форм, характеризующихся различными степенями инвазивности и агрессивности.

Злокачественные опухоли, которые вовлекают клетки, образованные в ходе гемопоэза - процесса, посредством которого образуются клеточные элементы крови, такие как лимфоциты, лейкоциты, тромбоциты, эритроциты и естественные киллеры - называют гемопоэтическими злокачественными опухолями. Лимфоциты, которые могут находиться в крови и лимфатической ткани и являются важными для иммунного ответа, подразделяют на два основных класса лимфоцитов: B-лимфоциты (B-клетки) и T-лимфоциты (T-клетки), которые опосредуют гуморальный и клеточно-опосредуемый иммунитет, соответственно.

B-клетки созревают в костном мозге и покидают костный мозг, экспрессируя связывающее антиген антитело на их клеточной поверхности. Когда наивная B-клетка впервые встречает антиген, к которому ее мембраносвязанное антитело является специфичным, клетка начинает быстро делиться и ее потомство дифференцируется в B-клетки памяти и эффекторные клетки, называемые "плазматическими клетками". B-клетки памяти обладают большей продолжительностью жизни и продолжают экспрессировать мембраносвязанное антитело с той же специфичностью, что и исходная родительская клетка. Плазматические клетки не продуцируют мембраносвязанное антитело, вместо этого, они продуцируют антитело в форме, которая может секретироваться. Секретируемые антитела являются основной эффекторной молекулой для гуморального иммунитета.

Связанные с B-клетками нарушения включают, но не ограничиваются ими, злокачественную лимфому (неходжкинскую лимфому, NHL), множественную миелому (MM) и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL, B-клеточный лейкоз (CD5+ B-лимфоциты). Неходжскинские лимфомы (NHL), гетерогенная группа злокачественных опухолей, главным образом, возникающих из B-лимфоцитов, составляют приблизительно 4% от всех вновь диагностируемых опухолей (Jemal, A. et al., CA-Cancer J Clin., 52: 23-47 (2002)). Агрессивная NHL составляет приблизительно 30-40% взрослой NHL (Harris, N.L. et al., Hematol. J., 1:53-66 (2001)) и включает диффузную B-крупноклеточную лимфому (DLBCL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), периферическую T-клеточную лимфому и анапластическую крупноклеточную лимфому. Комбинированная химиотерапия первой линии обеспечивает излечение менее чем половины пациентов с агрессивной NHL, и большинство пациентов в конечном итоге погибают от этого заболевания (Fischer, R.I., Semin. Oncol., 27 (suppl 12): 2-8 (2000)).

T-клетки созревают в тимусе, который обеспечивает окружающую среду для пролиферации и дифференцировки незрелых T-клеток. В ходе созревания T-клеток, T-клетки претерпевают реаранжировки генов, в результате которых образуется T-клеточный рецептор, и положительную и отрицательную селекцию, которая помогает определить фенотип клеточной поверхности зрелой T-клетки. Характерными маркерами клеточной поверхности зрелых T-клеток являются комплекс CD3:T-клеточный рецептор и один из корецепторов, CD4 или CD8.

В попытках найти эффективные клеточные мишени для терапии злокачественных опухолей исследователи проводили поиск в целях идентификации трансмембранных или иным образом ассоциированных с мембраной полипептидов, которые специфично экспрессируются на поверхности одного или нескольких конкретного типа(ов) злокачественных клеток по сравнению с одной или несколькими нормальной незлокачественной клеткой(ами). Часто, такие ассоциированные с мембраной полипептиды в большем количестве экспрессируются на поверхности злокачественных клеток по сравнению с поверхностью незлокачественных клеток. Идентификация таких ассоциированных с опухолью антигенных полипептидов клеточной поверхности обеспечила возможность специфического нацеливания злокачественных клеток на уничтожение посредством терапии на основе антител. В этом отношении, отмечается, что было выяснено, что терапия на основе антител является высоко эффективной при лечении определенных злокачественных опухолей. Например, HERCEPTIN® и RITUXAN® (оба от Genentech Inc., South San Francisco, California) представляют собой антитела, которые успешно используют для лечения рака молочной железы и неходжскинской лимфомы, соответственно. Более конкретно, HERCEPTIN® представляет собой рекомбинантное образованное из ДНК гуманизированное моноклональное антитело, которое селективно связывается с протоонкогеном внеклеточного домена рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2). Сверхэкспрессия белка HER2 наблюдается в 25-30% случаев первичного рака молочной железы. RITUXAN® представляет собой полученное способами генетической инженерии химерное моноклональное антитело мыши/человека, направленное против антигена CD20, находящегося на поверхности нормальных и злокачественных B-лимфоцитов. Оба эти антитела рекомбинантно продуцируют в клетках CHO.

В других попытках выяснить эффективные клеточные мишени для терапии злокачественной опухоли, исследователи провели поиск, чтобы идентифицировать (1) не ассоциированные с мембраной полипептиды, которые специфично продуцируются одним или несколькими конкретным типом(ами) злокачественной клетки(ок) по сравнению с одним или несколькими конкретным типом(ами) незлокачественной нормальной клетки(ок), (2) полипептиды, которые продуцируются злокачественными клетками на уровне экспрессии, который значимо превышает уровень экспрессии одной или нескольких нормальной незлокачественной клетки(ок), или (3) полипептиды, экспрессия которых по существу ограничивается до только одного (или очень ограниченного количества отличающихся) типа ткани(ей) как в злокачественном, так и в незлокачественном состоянии (например, нормальная ткань предстательной железы и опухолевая ткань предстательной железы). Такие полипептиды могут оставаться расположенными внутриклеточно или они могут секретироваться злокачественной клеткой. Более того, такие полипептиды могут экспрессироваться не самой злокачественной клеткой, а, вместо этого, клетками, которые продуцируют и/или секретируют полипептиды, обладающие эффектом стимуляции или усиления роста злокачественных клеток. Такие секретируемые полипептиды часто представляют собой белки, которые обеспечивают злокачественным клеткам преимущество при росте относительно нормальных клеток, и включают, например, такие полипептиды как ангиогенные факторы, факторы клеточной адгезии, факторы роста и т.п. Можно ожидать, что идентификация антагонистов таких не ассоциированных с мембраной полипептидов может служить в качестве эффективных лекарственных средств для лечения таких злокачественных опухолей. Более того, идентификация особенностей экспрессии таких полипептидов может быть полезной для диагностики конкретных злокачественных опухолей у млекопитающих.

Несмотря на указанные выше достижения в терапии злокачественных опухолей млекопитающих, существует существенная необходимость в дополнительных лекарственных средствах, способных детектировать наличие опухоли у млекопитающего, и в эффективном ингибировании неопластического роста клеток, соответственно. Таким образом, задачей настоящего изобретения является идентификация полипептидов, ассоциированных с клеточной мембраной, секретируемых или внутриклеточных полипептидов, экспрессия которых специфично ограничена только одним (или очень ограниченным количеством различных) типом(ами) ткани, гемопоэтическими тканями, как в злокачественном, так и в незлокачественном состоянии, и применение этих полипептидов и кодирующих их нуклеиновых кислот для получения композиций, подходящих для медикаментозного лечения и/или детекции гемопоэтической злокачественной опухоли у млекопитающих.

CD79 представляет собой компонент передачи сигнала B-клеточным рецептором, состоящий из ковалентного гетеродимера, содержащего CD79a (Igα, mb-1) и CD79b (Igβ, B29). Как CD79a, так и CD79b, содержат внеклеточный иммуноглобулиновый домен (Ig), трансмембранный домен, домен внутриклеточной передачи сигнала, домен иммунорецепторного тирозин-связывающего активаторного мотива (ITAM). CD79 экспрессируется на B-клетках и в клетках неходжкинской лимфомы (NHL) (Cabezudo et al., Haematologica, 84:413-418 (1999); D'Arena et al., Am. J. Hematol, 64: 275-281 (2000); Olejniczak et al., Immunol. Invest, 35: 93-114 (2006)). Все из CD79a и CD79b и sIg требуются для экспрессии на поверхности CD79 (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol, 13(3): 270-7)). Средняя экспрессия на поверхности CD79b на NHL сходна с поверхностной экспрессией на нормальных B-клетках, но ее уровень выше (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol, 13(3): 270-7 (2001)).

С учетом экспрессии CD79b, является полезным получение терапевтических антител к антигену CD79b, которые создают минимальную антигенность, или не создают ее, при введении пациентам, особенно при длительном лечении. Настоящее изобретение удовлетворяет эту и другие необходимости. Настоящее изобретение относится к антителам против CD79b, которые преодолевают ограничения современных терапевтических композиций, а также обеспечивают дополнительные преимущества, которые станут очевидными из подробного описания, ниже.

Применение конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), т.е. иммуноконъюгатов, для местной доставки цитотоксических и цитостатических средств, т.е. лекарственных средств для уничтожения или ингибирования опухолевых клеток при лечении злокачественной опухоли (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; US 4975278) позволяет нацеленную доставку группы лекарственного средства в опухоли, и внутриклеточное накопление в них, где системное введение этих неконъюгированных лекарственных средств может приводить к неприемлемым уровням токсичности в нормальных клетках, помимо опухолевых клеток, подлежащих устранению (Baldwin et al. (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). Попытки повысить терапевтический индекс, т.е. максимальную эффективность и минимальную токсичность ADC, сфокусированы на селективности поликлональных (Rowland et al. (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87) и моноклональных антител (mAb), а также на свойствах связывания лекарственных средств и высвобождения лекарственных средств (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549). Группы лекарственных средств, используемые в конъюгатах антитело-лекарственное средство, включают белковые токсины бактерий, такие как дифтерийный токсин, белковые токсины растений, такие как рицин, низкомолекулярные соединения, такие как ауристатины, гелданамицин (Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиды (EP 1391213; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), калихеамицин (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342), дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al. (1986), выше). Группы лекарственных средств могут влиять на цитотоксические и цитостатические механизмы, включая связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксические лекарственные средства имеют тенденцию к инактивации или снижению активности при конъюгировании с крупными антителами или белковыми лигандами рецепторов.

Пептиды ауристатина, ауристатин E (AE) и монометилауристатин (MMAE), синтетические аналоги доластатина (WO 02/088172), конъюгируют в качестве групп лекарственного средства с: (i) химерными моноклональными антителами cBR96 (специфичными к Lewis Y на карциномах); (ii) cAC10, которое является специфичным к CD30 на гематологических злокачественных опухолях (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al. (2003) Blood 102(4):1458-1465; US 2004/0018194; (iii) антителами против CD20, такими как ритуксан (WO 04/032828) для лечения экспрессирующих CD20 опухолей и иммунных нарушений; (iv) антителом против EphB2R 2H9 для лечения рака ободочной и прямой кишки (Mao et al. (2004) Cancer Research 64(3):781-788); (v) антителом против E-селектина (Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63:6387-6394); (vi) трастузумабом (HERCEPTIN®, US 2005/0238649), и (vi) антителами против CD30 (WO 03/043583). Варианты ауристатина E описаны в US 5767237 и US 6124431. Монометилауристатин E, конъюгированный с моноклональными антителами, описан в Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, представленной 28 марта 2004 года. Аналоги ауристатина MMAE и MMAF конъюгируют с различными антителами (US 2005/0238649).

Общепринятые способы присоединения, т.е. связывания ковалентными связями, группы лекарственного средства с антителом, как правило, приводят к гетерогенной смеси молекул, где группа лекарственного средства связана с несколькими участками антитела. Например, цитотоксические лекарственные средства, как правило, конъюгируют с антителами через часто многочисленные остатки лизина антитела, с образованием гетерогенной смеси антитело-лекарственное средство. В зависимости от условий реакции, гетерогенная смесь, как правило, содержит антитела с диапазоном связанных с ним групп лекарственного средства от 0 до 8 или более. Кроме того, в каждой подгруппе конъюгатов с конкретным числовым отношением групп лекарственного средства к антителу находится потенциально гетерогенная смесь, где группа лекарственного средства связана с различными участками антитела. Аналитические и препаративные способы могут быть недостаточными для разделения и охарактеризации типов молекул конъюгата антитело-лекарственное средство в гетерогенной смеси, полученной при реакции конъюгации. Антитела представляют собой крупные, комплексные и структурно разнообразные биомолекулы, часто со множество реакционно-способных функциональных групп. Их реакционная способность к линкерным реагентам и промежуточным соединениям лекарственное средство-линкер зависят от таких факторов, как pH, концентрация, концентрация соли и сорастворители. Более того, многостадийный процесс конъюгации может быть невоспроизводимым вследствие трудности контроля условий реакции и охарактеризации реагентов и промежуточных соединений.

Тиольные группы цистеина являются реакционно-способными при нейтральных значениях pH, в отличие от большинства аминов, которые являются протонированными и менее нуклеофильными при pH около 7. Поскольку свободные тиольные (RSH, сульфгидрильные) группы являются относительно реакционно-способными, белки с остатками цистеина часто находятся в окисленной форме в качестве связанных дисульфидом олигомеров или обладают дисульфидными группами со внутренними мостиками. Внеклеточные белки, как правило, не имеют свободных тиолов (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London, page 55). Тиольные группы цистеина антител, как правило, являются более реакционно-способными, т.е. более нуклеофильными, в отношении электрофильных реагентов для конъюгации, чем аминогруппы или гидроксильные группы антитела. Остатки цистеина встраивали в белки способами генетической инженерии для образования ковалентных связей с лигандами или для образования новых внутримолекулярных дисульфидных связей (Better et al. (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; US 6248564). Однако встраивание тиольных групп цистеина путем мутации различных аминокислотных остатков белка на остатки аминокислоты цистеина является потенциально проблематичной, в частности в случае неспаренных (свободных Cys) остатков или остатков, которые являются относительно доступными для реакции или окисления. В концентрированных растворах белка, как в периплазме E. coli, так и в культуральных супернатантах, или в частично или полностью очищенном белке, неспаренные остатки Cys на поверхности белка могут образовывать пары и окисляться с образованием межмолекулярных дисульфидов, и, таким образом, димеров или мультимеров белков. Образование дисульфидного димера делает новый Cys нереакционно-способным для конъюгации с лекарственным средством, лигандом или другой меткой. Более того, если белок окислительным путем образует внутримолекулярную дисульфидную связь между вновь конструированным остатком Cys и существующим остатком Cys, обе тиольные группы Cys являются недоступными для участия и взаимодействий в активном центре. Более того, белок может стать неактивным или неспецифическим вследствие неправильного сворачивания или утраты третичной структуры (Zhang et al. (2002) Anal. Biochem. 311: 1-9).

Антитела со встроенными в них остатками цистеина конструируют в качестве FAB-фрагментов антител (тио-Fab) и экспрессируют в качестве полноразмерных моноклональных антител IgG (тио-Mab) (Junutula, J. R. et al. (2008) J Immunol Methods 332:41-52; US 2007/0092940, содержание которых включено в настоящий документ в качестве ссылок). Антитела тио-Fab и тио-Mab конъюгируют через линкеры на вновь внесенных тиольных группах цистеина с помощью реакционно-способных к тиолу линкерных реагентов и реагентов лекарственное средство-линкер с получением конъюгатов антитело-лекарственное средство (тио-ADC).

Все ссылки, цитированные в настоящем документе, включая патентные заявки и публикации, включены в качестве ссылок в полном объеме.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к антителам против CD79b или их функциональным фрагментам, и к способу их применения для лечения гемопоэтических опухолей.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, которое связывается, предпочтительно специфично, с любым из описанных выше или ниже полипептидов. Необязательно, антитело представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, включая Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагмент, диатело (diabody), однодоменное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание антитела против полипептида CD79b с его соответствующим антигенным эпитопом. Антитела по настоящему изобретению необязательно можно конъюгировать с ингибирующим рост средством или цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, ауристатин, майтанзиноид, производное долостатина или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или сходные с ними. Антитела по настоящему изобретению необязательно можно продуцировать в клетках CHO или в бактериальных клетках, и предпочтительно они индуцируют гибель клетки, с которой они связываются. Для целей детекции, антитела по настоящему изобретению можно метить поддающейся детекции меткой, связывать с твердой подложкой или сходные с ними.

В одном аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где одновалентная аффинность (например, аффинность антитела в виде Fab-фрагмента к CD79b) или аффинность антитела к CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела в виде фрагмента IgG к CD79b) является по существу такой же как, более низкой или более высокой чем, одновалентная аффинность или аффинность в двухвалентной форме, соответственно, антитела мыши (например, аффинность антитела мыши в виде Fab-фрагмента или в виде фрагмента IgG к CD79b) или химерного антитела (например, аффинность химерного антитела в виде Fab-фрагмента или в виде фрагмента IgG к CD79b), содержащему последовательность вариабельного домена легкой цепи и тяжелой цепи, как представлено на фигуре 7 (SEQ ID NO:10) и фигурах 8A-B (SEQ ID NO:14), состоящему или по существу состоящему из них.

В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела в виде IgG к CD79b) составляет 2,0 нМ.

В одном аспекте предусмотрено антитело, которое связывается с CD79b, где антитело содержит: (a) по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из группы, состоящей из:

(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A16 представляет собой KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59)

(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой LVSKLDS (SEQ ID NO:60)

(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61)

(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62)

(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GMIDPSDSETHYNHIFKD (SEQ ID NO:63) и

(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F6, где F1-F10 представляет собой ARNLYL (SEQ ID NO:64).

В одном аспекте предусмотривается антитело, которое связывается с CD79b, где антитело содержит по меньшей мере один вариант HVR, где вариант последовательности HVR содержит модификацию по меньшей мере одного остатка последовательности, представленного в SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, 63 или 64.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:31-33).

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:23-25).

В одном аспекте изобретение относится к антителу против CD79b, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO:16. В другом аспекте изобретение относится к антителу против CD79b, содержащему вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO:12.

В одном аспекте изобретение относится к антителу против CD79b со встроенными в него остатками цистеина, содержащему один или несколько остатков аминокислоты цистеина и последовательность, выбранную из SEQ ID NO:91-122. Антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина может связываться с полипептидом CD79b. Антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина можно получать посредством процесса, включающего замену одного или нескольких аминокислотных остатков исходного антитела против CD79b цистеином.

В одном аспекте изобретение относится к антителу против CD79b со встроенными в него остатками цистеина, содержащему один или несколько свободных остатков аминокислоты цистеина, где антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина связывается с полипептидом CD79b и получено путем процесса, включающего замену одного или нескольких аминокислотных остатков исходного антитела против CD79b цистеином, где исходное антитело содержит по меньшей мере одну последовательность HVR, выбранную из:

(a) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A16 представляет собой KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59);

(b) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой LVSKLDS (SEQ ID NO:60);

(c) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61) или FQGTHFPFT (SEQ ID NO:79);

(d) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62);

(e) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18 где E1-E18 представляет собой GMIDPSDSETHYNHIFKD(SEQ ID NO:63); и

(f) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F6, где F1-F10 представляет собой ARNLYL (SEQ ID NO:64).

Антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина может представлять собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание антитела против полипептида CD79b с его соответствующим антигенным эпитопом. Антитела по настоящему изобретению необязательно можно конъюгировать с ингибирующим рост средством или цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, ауристатин или майтанзиноид. Антитела по настоящему изобретению необязательно можно продуцировать в клетках CHO или бактериальных клетках, и предпочтительно они ингибируют рост или пролиферацию клетки, с которой они связываются, или индуцируют ее гибель. Для диагностических целей, антитела по настоящему изобретению можно метить поддающейся детекции меткой, связывать с твердой подложкой, или сходные с ними.

В одном аспекте изобретение относится к способам получения антитела по изобретению. Например, изобретение относится к способу получения антитела против CD79b (которое, как определено в настоящем документе, включает интактное антитело и его фрагменты), причем указанный способ включает экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора по изобретению, кодирующего указанное антитело (или его фрагмент), и выделение указанного антитела.

В одном аспекте изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему антитело по изобретению или конъюгат антитело-лекарственное средство по изобретению, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент.

В одном аспекте изобретение относится к изделию, содержащему контейнер; и композиции, находящейся в контейнере, где композиция содержит одно или несколько антител против CD79b по изобретению.

В одном аспекте изобретение относится к набору, содержащему первый контейнер, содержащий композицию, содержащую одно или несколько антител против CD79b по изобретению; и второй контейнер, содержащий буфер.

В одном аспекте изобретение относится к применению антитела против CD79b по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение.

В одном аспекте изобретение относится к применению изделия по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение.

В одном аспекте изобретение относится к применению набора по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение.

В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования роста клетки, которая экспрессирует CD79b, причем указанный способ включает контактирование указанной клетки с антителом по изобретению, тем самым вызывая ингибирование роста указанной клетки. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу медикаментозного лечения млекопитающего, имеющего злокачественную опухоль, содержащую клетку, которая экспрессирует CD79b, причем указанный способ включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела по изобретению, тем самым эффективно осуществляя лечение указанного млекопитающего. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения или профилактики клеточно-пролиферативного нарушения, связанного с повышенной экспрессией CD79b, причем указанный способ включает введение индивиду, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антитела по изобретению, тем самым эффективно осуществляя лечение или профилактику указанного клеточно-пролиферативного нарушения. В одном варианте осуществления, указанное пролиферативное нарушение представляет собой злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования роста клетки, где рост указанной клетки по меньшей мере частично зависит от эффекта CD79b на усиление роста, причем указанный способ включает контактирование клетки с эффективным количеством антитела по изобретению, тем самым ингибируя рост указанной клетки. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу медикаментозного лечения опухоли у млекопитающего, где рост указанной опухоли по меньшей мере частично зависит от эффекта CD79b на усиление роста, причем указанный способ включает контактирование клетки с эффективным количеством антитела по изобретению, тем самым эффективно осуществляя лечение указанной опухоли. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, включающему введение пациенту фармацевтического состава, содержащего иммуноконъюгат, описанный в настоящем документе, приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент.

В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования пролиферации B-клеток, включающему воздействие на клетку иммуноконъюгата, содержащего антитело по изобретению, в условиях, позволяющих связывание иммуноконъюгата с CD79b.

В одном аспекте изобретение относится к способу определения наличия CD79b в образце, предположительно содержащем CD79b, причем указанный способ включает воздействие на указанный образец антитела по изобретению, и определение связывания указанного антитела с CD79b в указанном образце, где связывание указанного антитела с CD79b в указанном образце указывает на наличие указанного белка в указанном образце.

В одном аспекте изобретение относится к способу диагностики клеточно-пролиферативного нарушения, связанного с увеличением числа клеток, таких как B-клетки, экспрессирующих CD79b, причем способ включает контактирование тестируемых клеток в биологическом образце с любыми из указанных выше антител; определение уровня антитела, связавшегося с тестируемыми клетками в образце, путем детекции связывания антитела с CD79b; и сравнение с уровнем антитела, связавшегося с клетками, в контрольном образце, где уровень связавшегося антитела нормализован относительно количества экспрессирующих CD79b клеток в тестируемом и контрольном образцах, и где более высокий уровень антитела, связавшегося с тестируемым образцом по сравнению с контрольным образцом указывает на наличие клеточно-пролиферативного нарушения, связанного с клетками, экспрессирующими CD79b.

В одном аспекте изобретение относится к способу детекции растворимого CD79b в крови или сыворотке, причем способ включает контактирование тестируемого образца крови или сыворотке от млекопитающего, предположительно страдающего B-клеточно-пролиферативным нарушением, с антителом против CD79b по изобретению, и детекцию повышения растворимого CD79b в тестируемом образце относительно контрольного образца крови или сыворотки от здорового млекопитающего.

В одном аспекте изобретение относится к способу связывания антитела по изобретению с клеткой, которая экспрессирует CD79b, причем указанный способ включает контактирование указанной клетки с антителом по изобретению. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фигуре 1 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) кДНК PRO36249, где SEQ ID NO:1 представляет собой клон, обозначаемый в настоящем документе как "DNA225786" (также обозначаемый в настоящем документ как "CD79b"). Нуклеотидная последовательность кодирует CD79b, и кодон инициации и стоп-кодон показаны полужирным шрифтом и подчеркнуты.

На фигуре 2 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2), образованная кодирующей последовательностью SEQ ID NO:1, представленной на фигуре 1.

На фигуре 3 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:3) легкой цепи химерного 2F2 (ch2F2) IgG1 (2F2 представляет собой моноклональное антитело мыши против CD79b). Нуклеотидная последовательность кодирует легкую цепь ch2F2, представленную на фигуре 4, и первый кодон (кодирующий первую аминокислоту SEQ ID NO:4) указан полужирным шрифтом и подчеркнут.

На фигуре 4 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4), образованная кодирующей последовательностью SEQ ID NO:3, представленной на фигуре 3. Вариабельные области представляют собой не подчеркнутые области.

На фигуре 5 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:5) тяжелой цепи химерного 2F2 (ch2F2) IgG1 (2F2 представляет собой моноклональное антитело мыши против CD79b). Нуклеотидная последовательность кодирует тяжелую цепь ch2F2, представленную на фигуре 6, и первый кодон (кодирующий первую аминокислоту SEQ ID NO:6) указан полужирным шрифтом и подчеркнут.

На фигуре 6 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6), образованная кодирующей последовательностью SEQ ID NO:5, представленной на фигуре 5. Вариабельные области представляют собой не подчеркнутые участки.

На фигуре 7 представлено выравнивание последовательностей вариабельных областей легких цепей для следующих: консенсусная последовательность легкой цепи каппа I человека (обозначенная как "huKI"; SEQ ID NO:9) с VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3, VL-FR4 (SEQ ID NO:65-68, соответственно), антитело 2F2 мыши против CD79b (обозначенное как "mu2F2" и также в настоящем документе обозначаемое как "2F2"; SEQ ID NO:10), "гуманизированное" антитело с пересаженной последовательностью 2F2 (обозначаемое как "hu2F2 с пересаженной последовательностью"; SEQ ID NO:11) и вариант 7 "гуманизированного" антитела с пересаженной последовательностью 2F2 (обозначаемый как "hu2F2.D7"; SEQ ID NO:12) (содержащий 71A, 73T и 78A). Положения пронумерованы согласно Кабат, и гипервариабельные области (HVR), пересаженные из 2F2 мыши в консенсусную каркасную область вариабельной области легкой цепи каппа I, заключены в рамку.

На фигурах 8A-B представлено выравнивание последовательностей вариабельных областей тяжелых цепей для следующих: консенсусная последовательность тяжелой цепи подгруппы III человека (обозначенная как "humIII"; SEQ ID NO:13) с VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3 и VH-FR4 (SEQ ID NO:69-72, соответственно), антитело 2F2 мыши против CD79b (обозначенное как "mu2F2" и также в настоящем документе обозначаемое как "2F2"; SEQ ID NO:14), "гуманизированное" антитело с пересаженной последовательностью 2F2 (обозначаемое как "hu2F2 с пересаженной последовательностью"; SEQ ID NO:15) (содержащее 71A, 73T и 78A) и вариант 7 "гуманизированного" антитела с пересаженной последовательностью 2F2 (обозначаемый как "hu2F2.D7"; SEQ ID NO:16) (содержащий 71A, 73T и 78A). Положения пронумерованы согласно Кабат, и гипервариабельные области (HVR), пересаженные из mu2F2 в консенсусную каркасную область вариабельной области тяжелой цепи подгруппы III, заключены в рамку.

На фигуре 9 представлена последовательность HVR выбранного варианта "гуманизированного" антитела с пересаженной последовательностью 2F2 (SEQ ID NO:18), где вариант обладает множеством изменений аминокислот в отдельной области HVR "гуманизированного" антитела с пересаженной последовательностью 2F2 (часть HVR-L3 (SEQ ID NO:61) представлена на фигуре 9 в качестве SEQ ID NO:17). Последовательности вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи вне показанных аминокислотных изменений были идентичны пересаженной последовательности 2F2 и не показаны. Не было выявлено изменений в HVR-L1 (SEQ ID NO:59), HVR-L2 (SEQ ID NO:60), HVR-H1 (SEQ ID NO:62); HVR-H2 (SEQ ID NO:63) или HVR-H3 (SEQ ID NO:64) "гуманизированного" антитела с пересаженной последовательностью 2F2.

На фигуре 10 представлен анализ Biacore выбранных антител против CD79b, включая антитело ch2F2 (обозначаемое как "ch2F2"), "гуманизированное" антитело с пересаженной последовательностью 2F2 (обозначаемое как "hu2F2 с пересаженной последовательностью" и также обозначаемое в настоящем документе как "2F2 с пересаженной последовательностью"), и вариант 7 "гуманизированного" антитела с пересаженной последовательностью 2F2 (hu2F2.D7) (89F, 96F; SEQ ID NO:18) в отношении обозначенных антигенов, включая внеклеточный домен CD79b человека (huCD79becd), внеклеточный домен CD79b человека, слитый с Fc (huCD79becd-Fc), и пептид из 16 аминокислот, содержащий эпитоп для 2F2 (16-мерный пептид; SEQ ID NO:78; эпитоп из аминокислот 1-11 SEQ ID NO:78). Не выявленное связывание обозначено на фигуре как "NB".

На фигуре 11A-B (консенсусные каркасные области вариабельной области тяжелой цепи (VH)) и на фигуре 12 (консенсусные каркасные области вариабельной области легкой цепи (VL)) представлены иллюстративные последовательности акцепторных консенсусных каркасных областей человека для применения на практике настоящего изобретения со следующими идентификаторами последовательностей: (фигура 11A-B) консенсусная каркасная область VH подгруппы I человека без CDR по Кабат (SEQ ID NO:36), консенсусная каркасная область VH подгруппы I человека без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO:37-39), консенсусная каркасная область VH подгруппы II человека без CDR по Кабат (SEQ ID NO:40), консенсусная каркасная область VH подгруппы II человека без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO:41-43), консенсусная каркасная область VH подгруппы III человека без CDR по Кабат (SEQ ID NO:44), консенсусная каркасная область VH подгруппы III человека без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO:45-47), акцепторная каркасная область VH человека без CDR по Кабат (SEQ ID NO:48), акцепторная каркасная область VH человека без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO:49-50), акцепоторная каркасная область 2 VH человека без CDR по Кабат (SEQ ID NO:51) и акцепоторная каркасная область 2 VH человека без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO:52-54) и (фигура 12) консенсусная каркасная область VL подгруппы I каппа человека (SEQ ID NO:55), консенсусная каркасная область VL подгруппы II каппа человека (SEQ ID NO:56), консенсусная каркасная область VL подгруппы III каппа человека (SEQ ID NO:57) и консенсусная каркасная область VL подгруппы IV каппа человека (SEQ ID NO:58).

На фигуре 13A (легкая цепь) и 13B (тяжелая цепь) показана аминокислотная последовательность антитела по изобретению (2F2.D7). На фигурах 13A (легкая цепь) и 13B (тяжелая цепь) представлены аминокислотные последовательности каркасной области (FR), гипервариабельной области (HVR), первого константного домена (CL или CH1) и Fc-области (Fc) одного из вариантов осуществления антитела по изобретению (hu2F2.D7) (SEQ ID NO:19-26 (фигура 13A) и SEQ ID NO:27-35 (фигура 13B)). Представлены полноразмерные аминокислотные последовательности (вариабельные и константные участки) легкой и тяжелой цепей 2F2.D7 (SEQ ID NO:89 (фигура 13A) и 90 (фигура 13B) соответственно, и константные домены подчеркнуты. Показаны аминокислотные последовательности вариабельных доменов (SEQ ID NO:12 (фигура 13A для легкой цепи) и SEQ ID NO:16 (фигура 13B для тяжелой цепи)).

На фигуре 14 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей CD79b человека (SEQ ID NO:2), яванского макака (cyno) (SEQ ID NO:7) и мыши (SEQ ID NO:8). CD79b человека и яванского макака обладают 85% аминокислотной идентичностью. Указаны сигнальная последовательность, тестируемый пептид (эпитоп из 11 аминокислот для антитела 2F2, описанный в примере 1; аминокислоты 1-11 (ARSEDRYRNPK) SEQ ID NO:78), трансмембранный (TM) домен и домен иммунорецепторного связывающего тирозин активационного мотива (ITAM). Область, заключенная в рамку, представляет собой область CD79b, которая отсутствует в варианте по сплайсингу CD79b (описанном в примере 1).

На фигуре 15 представлено изображение конъюгатов антитела против CD79b со встроенными в него остатками цистеина и лекарственного средства (ADC), где группа лекарственного средства связана со встроенной группой цистеина в: легкой цепи (LC-ADC); тяжелой цепи (HC-ADC); и Fc-области (Fc-ADC).

На фигуре 16 представлены стадии: (i) восстановление аддуктов дисульфида цистеина и межцепочечных и внутрицепочечных дисульфидов в антителе против CD79b со встроенными в него остатками цистеина (тио-Mab) восстановителем TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид); (ii) частичное окисление, т.е. повторное окисление для преобразования межцепочечных и внутрицепочечных дисульфидов, посредством dhAA (дегидроаскорбиновой кислоты); и (iii) конъюгация повторно окисленного антитела с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер с образованием конъюгата антитела против CD79b со встроенными остатками цистеина и лекарственного средства (ADC).

На фигуре 17 представлена (A) последовательность легкой цепи (SEQ ID NO:86) и (B) последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO:85) гуманизированного антитела против CD79b со встроенными в него остатками цистеина (thio-hu2F2.D7-HC-A118C), в котором аланин в положении 118 по EU (положение аланина по последовательности 118; положение по Кабат 114) тяжелой цепи заменен на цистеин. Группа лекарственного средства может быть связана со встроенной группой цистеина в тяжелой цепи. На каждой фигуре измененная аминокислота представлена полужирным шрифтом с двойным подчеркиванием. Однократным подчеркиванием показаны константные области. Вариабельные области представляют собой не подчеркнутые области. Fc-область обозначена курсивом. "Тио" относится к антителу со встроенным в него цистеином, а "hu" относится к гуманизированному антителу.

На фигуре 18 представлены (A) последовательность легкой цепи (SEQ ID NO:88) и (B) последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO:87) антитела против CD79b со встроенными в него остатками цистеина (Thio-hu2F2.D7-LC-V205C), в котором валин в положении 205 по Кабат (положение в последовательности: валин 210) легкой цепи заменен цистеином. Аминокислота D в положении 6 по EU (закрашена на фигуре) тяжелой цепи альтернативно может представлять собой E. Группа лекарственного средства может быть связана со встроенной группой цистеина в тяжелой цепи. На каждой фигуре измененная аминокислота показана полужирным шрифтом с двойным подчеркиванием. Однократным подчеркиванием указаны константные области. Вариабельные области представляют собой не подчеркнутые области. Fc-область обозначена курсивом. "Тио" относится к антителу со встроенными в него остатками цистеина.

На фигуре 19 представлен график ингибирования роста опухоли in vivo в модели с ксенотрансплантацией BJAB-люцифераза, который демонстрирует, что введение антител против CD79b ((a) ch2F2-SMCC-DM1, нагрузка лекарственным средством составляла приблизительно 3 (таблица 7) и (b) hu2F2.D7-SMCC-DM1, нагрузка лекарственным средством составляла приблизительно 2,3 (таблица 7)), мышам SCID, имеющим B-клеточные опухоли человека, значимо ингибировало рост опухоли. Контроли включали HERCEPTIN® (трастузумаб)-SMCC-DM1 (антитело против HER2-SMCC-DM1). "hu" относится к гуманизированному антителу и "ch" относится к химерному антителу.

На фигуре 20A представлен график ингибирования роста опухоли in vivo в модели с ксенотрансплантатом Granta-519 (лимфома из клеток мантийной зоны человека), на котором показано, что введение антитела против CD79b, hu2F2.D7-SMCC-DM1, нагрузка лекарственным средством составляла приблизительно 2,8 (таблица 8), мышам SCID, имеющим B-клеточные опухоли человека, значительно ингибировало рост опухоли. Контроли включали HERCEPTIN® (трастузумаб)-SMCC-DM1 (антитело против HER2-SMCC-DM1). На фигуре 20B представлен график процентного изменения массы мышей в исследовании с ксенотрансплантатом Granta-519 (фигура 20A и таблица 8), на котором показано, что отсутствуют значительные изменения массы в течение первых 7 суток исследования, "hu" относится к гуманизированному антителу.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам, композициям, наборам и изделиям для идентификации композиций, подходящих для лечения гематопоэтических опухолей у млекопитающих, и к способам применения указанных композиций.

В настоящем документе представлены детали этих способов, композиций, наборов и изделий.

I. Общие способы

В практике настоящего изобретения используют, если нет иных указаний, обычные способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие способы полностью описаны в литературе, такой как, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", второе издание (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, и периодические дополненные издания); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001).

II. Определения

Для целей разъяснения рассматриваемого описания, будут использованы следующие определения, и там, где это необходимо, термины, указанные в единственно числе, также включают множественное число, и наоборот. В том случае, если представленные далее определения противоречат любому документу, включенному в настоящий документ в качестве ссылки, следует руководствоваться определениями, представленными в настоящем документе.

Термины "маркер B-клеточной поверхности" или "антиген B-клеточной поверхности" в настоящем документе обозначают антиген, экспрессируемый на поверхности B-клетки, на который может быть нацелен антагонист, который с ним связывается, включая, но не ограничиваясь ими, антитела к антигену B-клеточной поверхности или растворимую форму антигена B-клеточной поверхности, способные осуществлять антагонизм связывания лиганда с природным антигеном B-клетки. Примеры маркеров B-клеточной поверхности включают маркеры поверхности лейкоцитов CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 и CD86 (для описания см. The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York). Другие маркеры B-клеточной поверхности включают RP105, FcRH2, CR2 B-клетки, CCR6, P2Х5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, BAFF, BLyS, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA, и 239287. Представляющий особый интерес маркер B-клеточной поверхности экспрессируется предпочтительно на B-клетках, по сравнению с другими не В-клеточными тканями млекопитающих, и он может экспрессироваться как на предшественнике B-клеток, так и на зрелых B-клетках.

Термин "CD79b", как используют в настоящем документе, относится к любому нативному CD79b любого позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например люди, яванские макаки (cyno)) и грызуны (например, мыши и крысы), если нет иных указаний. CD79b человека также обозначают в настоящем документе как "PRO36249" (SEQ ID NO:2) и он кодируется нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO:1), которую также обозначают в настоящем документе как "DNA225786". Термин "CD79b" включает "полноразмерное" непроцессированное CD79b, а также любую форму CD79b, которая образуется в результате процессинга в клетке. Термин также включает встречающиеся в природе варианты CD79b, например, вариант по сплайсингу, аллельные варианты и изоформы. Полипептиды CD79b, описанные в настоящем документе, можно выделять из различных источников, например, из тканей человека или из других источников, или получать, используя рекомбинантные или синтетические способы. Термин "полипептид CD79b с нативной последовательностью" включает полипептид с такой же последовательностью аминокислот, как и у соответствующего полипептида CD79b, полученного из природного источника. Такие полипептиды CD79b с нативными последовательностями можно выделять из природных источников или можно получать, используя рекомбинантные или синтетические способы. Термин "полипептид CD79b с нативной последовательностью" конкретно включает встречающиеся в природе укороченные или секретируемые формы конкретного полипептида CD79b (например, внеклеточную последовательность домена), формы встречающихся в природе вариантов (например, альтернативно сплайсированные формы) и встречающиеся в природе аллельные варианты полипептида. В некоторых вариантах настоящего изобретения, полипептиды CD79b с природными последовательностями, описанные в настоящем документе, являются зрелыми или полноразмерными полипептидами с нативной последовательностью, включающими полноразмерные последовательности аминокислот, представленными на прилагаемых рисунках. Кодон инициации и стоп кодон (если указаны) указаны полужирным шрифтом и подчеркнуты на рисунках. Остатки нуклеиновой кислоты, обозначаемые как "N" на прилагаемых рисунках представляют собой любые остатки нуклеиновых кислот. Однако хотя на прилагаемых рисунках показано, что описанные полипептиды CD79b начинаются с остатков метионина, обозначенных в настоящем документе как аминокислотное положение 1 на рисунках, вероятно и возможно, что в качестве начального аминокислотного остатка для полипептидов CD79b можно использовать другие остатки метионина, расположенные либо выше, либо ниже, от положения аминокислоты 1 на рисунках.

Термин "2F2" используют в настоящем документе для обозначения моноклонального антитела мыши против CD79b (также обозначаемого в настоящем документе как "mu2F2" или "2F2" мыши) или химерного антитела (также обозначаемого в настоящем документе как "ch2F2").

Термины "mu2F2" или "2F2 мыши" используют в настоящем документе для обозначения моноклонального антитела мыши против CD79b, где антитело мыши включает вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO:10 (фиг. 7) и вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO:14 (фиг. 8A-B). Mu2F2 можно получать из гибридом, депонированных в ATCC в качестве PTA-7712 11 июля 2006 года.

Термин "ch2F2" или "химерное антитело 2F2" используют в настоящем документе для обозначения химерного антитела (как ранее описано в патентной заявке США Ser. No. 11/462336, поданной 3 августа 2006 года), где химерное антитело включает легкую цепь SEQ ID NO:4 (фиг. 4), где указанная легкая цепь включает вариабельный домен SEQ ID NO:10 (фиг. 7) и легкую цепь константного домена IgG1 человека. Химерное антитело далее включает тяжелую цепь SEQ ID NO:6 (фиг. 6), где легкая цепь включает вариабельный домен SEQ ID NO:14 (фиг. 8A-B) и константный домен тяжелой цепи IgG1 человека.

Термины "пересаженная последовательность 2F2" или "гуманизированное" антитело с пересаженной последовательностью 2F2" или "пересаженная последовательность hu2F2" используют в настоящем документе для обозначения конкретно пересаженной последовательности, полученной пересадкой гипервариабельных областей из антитела 2F2 мыши (mu2F2) в акцепторную консенсусную VL каппа I человека (huKI) и консенсусную VH подгруппы III человека (huIII) с R71A, N73T и L78A (Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)) (см. пример 1A и фигуры 7 (SEQ ID NO:11) и 8 (SEQ ID NO:15)).

Термин "модификация" аминокислотного остатка/положения, как используют в настоящем документе, относится к изменению первичной аминокислотной последовательности по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, где указанное изменение происходит в результате изменения последовательности, вовлекающего указанные аминокислотные остатки/положения. Например, типичные модификации включают замену остатка (или в указанном положении) другой аминокислотой (например, консервативную или неконсервативную замену), вставку одной или более (обычно менее 5 или 3) аминокислот, соседних с указанным остатком/положением и делецию указанного остатка/положения. Термин "аминокислотная замена", или его вариации, относится к замене существующего аминокислотного остатка в заданной (исходной) аминокислотной последовательности отличающимся аминокислотным остатком. Обычно и предпочтительно, результатом модификации является изменение по меньшей мере одного вида физико-биохимической активности варианта полипептида по сравнению с полипептидом, содержащим исходную аминокислотную последовательность (или аминокислотную последовательность "дикого типа"). Например, в случае антитела, физико-биохимическая активность, которая изменяется, может представлять собой аффинность связывания, связывающую способность и/или эффект связывания в отношении молекулы-мишени.

Термин "антитело" используют в наиболее широком смысле и, конкретно, он охватывает, например, отдельные моноклональные антитела против CD79b (включая агонистические, антагонистические, нейтрализующие, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), композиции антител против CD79b с полиэпитопной специфичностью, поликлональные антитела, поливалентные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, одноцепочечные антитела против CD79b и фрагменты антител против CD79b (см. ниже), включая Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты, диатела, одноцепочечные антитела (sdAb) при условии, что они проявляют требуемую биологическую или иммунологическую активность. В настоящем документе термины "иммуноглобулин" (Ig) и "антитело" используют взаимозаменяемо. Антитело может быть антителом человека, гуманизированным антителом и/или антителом с созревшей аффинностью.

Термин "антитело против CD79b" или "антитело, которое связывается с CD79b" относится к антителу, которое способно связывать CD79b с достаточной аффинностью, так что антитело является подходящим в качестве диагностического и/или лекарственного средства при нацеливании на CD79b. Предпочтительно, степень связывания антитела против CD79b с неродственным не CD79b-белком составляет менее чем приблизительно 10% от связывания антитела с CD79b при измерении, например, радиоиммунным анализом (RIA). В определенных вариантах осуществления, антитело, которое связывается с CD79b, имеет константу диссоциации (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ или ≤0,1 нМ. В определенных вариантах осуществления, антитело против CD79b связывается с эпитопом CD79b, который является консервативным среди CD79b из различных видов.

"Выделенное антитело" представляет собой антитело, которое идентифицировано и отделено и/или извлечено из компонента его естественных окружающих условий. Загрязняющие компоненты его естественных окружающих условий представляют собой вещества, которые препятствуют терапевтическому применению антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитело является очищенным (1) до более чем 95% по массе антитела, как определяют способом Лоури, и наиболее предпочтительно до более чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности при SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием кумасси синего или, предпочтительно, окрашивания серебром. Выделенное антитело включает антитело в рекомбинантных клетках in situ, поскольку в этом случае отсутствует по меньшей мере один компонент условий естественного окружения антитела. Однако, как правило, выделенное антитело получают посредством по меньшей мере одной стадии очистки.

Основной элемент антитела из 4-цепей представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей (антитело IgM состоит из 5 основных гетеротетрамерных элементов вместе с дополнительным полипептидом, называемым J-цепью, и, таким образом, оно содержит 10 антиген-связывающих участков, в то время как секретируемые антитела IgA могут полимеризоваться с образованием поливалентных систем, содержащих 2-5 основных элементов из 4-цепей вместе с J-цепью). В случае IgG, элемент из 4-цепей, как правило, имеет массу 150000 дальтон. Каждая L-цепь связана с H-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как две H-цепи связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями, в зависимости от изотипа H-цепи. Каждая H- и L-цепь имеет расположенные с равными интервалами межцепочечные дисульфидные мостики. Каждая H-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (VH), за которым следуют три константных домена (CH) для каждой из α- и γ-цепей и четыре CH-домена для изотипов μ и ε. Каждая L-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (VL), за которым следует константный домен (CL) на ее другом конце. VL выравнивается с VH и CL выравнивается с первым константным доменом тяжелой цепи (CH1). Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность контакта между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Образование пары VH и VL формирует один антиген-связывающий участок. Для структуры и свойств различных классов антител, см., например, Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6.

L-цепь любых видов позвоночных может быть отнесена к одному из двух четко отличающихся типов, называемых каппа и лямбда, на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей (CH), иммуноглобулины можно отнести к различным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющих тяжелые цепи, обозначаемые как α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Классы γ и α далее подразделяются на подклассы на основе относительно небольших различий в последовательности CH и функции, например, у человека экспрессируются следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.

"Вариабельный участок" или "вариабельный домен" антитела относится к N-концевым доменам тяжелой и легкой цепи антитела. Вариабельный домен тяжелой цепи может быть обозначен как "VH". Вариабельный домен легкой цепи может быть обозначен как "VL". Эти домены, как правило, являются наиболее вариабельными частями антитела и содержат антиген-связывающие центры.

Термин "вариабельный" относится к тому факту, что последовательности определенных сегментов вариабельных доменов значительно отличаются среди антител. V-домен опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность не является равномерной на протяжении участка вариабельных доменов из 110 аминокислот. Вместо этого, V-участки состоят из относительно инвариантных участков, называемых каркасными областями (FR), из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками высокой вариабельности, называемыми "гипервариабельными областями", длина которых составляет 9-12 аминокислот. Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей содержат четыре FR, главным образом, приминающих конфигурацию β-слоев, соединенных тремя гипервариабельными участками, которые формируют петли, объединяющие структуру β-слоев, и, в некоторых случаях, формирующие ее часть. Гипервариабельные области в каждой цепи расположены вместе в непосредственной близости от FR и, совместно с гипервариабельными областями другой цепи, участвуют в формировании антиген-связывающего центра антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но они проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

"Интактное" антитело представляет собой антитело, которое содержит антиген-связывающий центр, а также CL и по меньшей мере константные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Константные домены могут представлять собой константные домены с нативной последовательностью (например, константные домены человека с нативной последовательностью) или их вариант по аминокислотной последовательности. Предпочтительно, интактное антитело обладает одной или несколькими эффекторными функциями.

"”Голое” антитело" для целей настоящего описания представляет собой антитело, которое не конъюгировано с цитотоксической группой или радиоактивной меткой.

"Фрагменты антитела" содержат часть интактного антитела, предпочтительно антиген-связывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты, диатела, линейные антитела (см., например, патент США No. 5641870, пример 2, Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 [1995]); одноцепочечные молекулы антител; и полиспецифические антитела, образованные фрагментами антител. В одном варианте осуществления, фрагмент антитела содержит антиген-связывающий центр интактного антитела и, таким образом, сохраняет способность связывать антиген.

Расщепление антител папаином приводит к образованию двух идентичных антиген-связывающих фрагментов, называемых "Fab"-фрагментами, и остаточного "Fc"-фрагмента, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Fab-фрагмент состоит из целой L-цепи вместе с доменом вариабельного участка H-цепи (VH), и первым константным доменом одной тяжелой цепи (CH1). Каждый Fab-фрагмент является одновалентным в отношении связывания антигена, т.е., он обладает одним антиген-связывающим участком. Обработка антитела пепсином приводит к одному крупному F(ab')2-фрагменту, который приблизительно соответствует двум связанным дисульфидом Fab-фрагментам, имеющим двухвалентную антиген-связывающую активность, и, кроме того, способен к перекрестному связыванию антигена. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов наличием дополнительных нескольких остатков на C-конце домена CH1, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH представляет собой обозначение для Fab', в котором остаток(ки) цистеина константных доменов обладает свободной тиольной группой. F(ab')2-фрагменты антитела исходно были получены в качестве пар Fab'-фрагментов, которые обладают шарнирными цистеинами между ними. Также известно другое химическое связывание фрагментов антител.

Fc-фрагмент содержит C-концевые части обеих H-цепей, удерживаемые вместе дисульфидами. Эффекторные функции антител определяются последовательностями Fc-участка, который также является частью, распознаваемой Fc-рецепторами (FcR), встречающимися на определенных типах клеток.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антиген-связывающий центр. Этот фрагмент состоит из димера, состоящего из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, связанных прочной нековалентной связью. В одноцепочечных типах Fv (scFv), один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи могут быть ковалентно связаны подвижным пептидным линкером, так чтобы легкая и тяжелая цепи могли ассоциировать в "димерные" структурные аналоги, аналогичные двухцепочечным типам Fv. Сворачивание этих двух доменов образует шесть гипервариабельных петель (3 петли в каждой из H- и L-цепи), которые предоставляют аминокислотные остатки для связывания антигена и обеспечивают специфичность связывания антигена антителом. Однако, даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем целый участок связывания.

"Одноцепочечные Fv", также сокращаемые как "sFv" или "scFv", представляют собой фрагменты антител, которые содержат VH и VL-домены антитела, соединенные в единую полипептидную цепь. Предпочтительно, полипептид sFv также необязательно содержит полипептидный линкер между VH и VL-доменами, которые обеспечивают возможность формирования в sFv структуры, требуемой для связывания антигена. Для обзора sFv, см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, ниже.

Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антиген-связывающими участками, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной полипептидной цепи (VH-VL). Небольшие фрагменты антител получают конструированием sFv-фрагментов (см. предыдущий абзац) с короткими линкерами (приблизительно 5-10 остатков) между VH- и VL-доменами, так что обеспечивается межцепочечное, но не внутрицепочечное, образование пар V-доменов, что приводит к двухвалентному фрагменту, т.е., фрагменту, обладающему двумя антиген-связывающими центрами. Диатела могут быть двухвалентными или биспецифическими. Биспецифические диатела представляют собой гетеродимеры из двух "пересекающихся" sFv-фрагментов, в которых VH- и VL-домены двух антител находятся на различных полипептидных цепях. Диатела описаны более подробно, например, в EP 404097; WO93/11161; Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993). Триатела (triabody) и тетратела (tetrabody) также описаны в Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134.

Как используют в настоящем документе, термин "моноклональное антитело" относится к антителу из совокупности по существу однородных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие совокупность, являются идентичными, за исключением возможных мутаций, например, встречающихся в природе мутаций, которые могут быть представлены в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфичными и направлены против одного антигенного участка. Более того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, препараты моноклонального антитела являются преимущественными в том, что их можно синтезировать без примесей других антител. Определение "моноклональный" не подразумевает того, что антитело должно быть получено каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены способом гибридом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или они могут быть получены способами рекомбинантных ДНК бактериальных, эукариотических клетках, а также в клетках животных и растений (см., например, патент США No. 4816567). "Моноклональные антитела" также могут быть получены из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных, например, в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991).

Моноклональные антитела в настоящем документе конкретно включают "химерные" антитела, в которых участок тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как оставшаяся часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность (патент США No 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 81:6851-6855 (1984)). Представляющие интерес в рамках настоящей заявки химерные антитела включают "приматизированные" антитела, содержащие антиген-связывающие последовательности вариабельного домена не относящегося к человеку примата (например, старосветской мартышки, обезьяны и т.д.) и последовательности константного домена человека.

"Гуманизированные" формы, не являющихся человеческими антител (например, грызунов), представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. В основном, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области видов, не относящихся к человеку, (донорное антитело), таких как мышь, крыса, кролик или не относящиеся к человеку приматы, которые обладают требуемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях, остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками, не являющиеся человеческими. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации проводят для дополнительного улучшения параметров антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит по существу все по меньшей мере из одного, и, как правило, из двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все FR-области представляют собой FR-области из последовательности иммуноглобулина человека. Также гуманизированное антитело необязательно содержит по меньшей мере участок константного домена (Fc) иммуноглобулина, как правило, константного домена иммуноглобулина человека. Для более подробной информации см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Также см. следующие обзорные статьи и ссылки, цитированные в них: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

"Тио", при использовании в настоящем документе, относится к антителу со встроенными в него остатками цистеина, а "hu", при использовании в настоящем документе, относится к гуманизированному антителу.

"Антитело человека" представляет собой антитело, которое содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемой у человека и/или полученной с использованием любых способов получения антител человека, как описано в настоящем документе. Это определение антитела человека, в частности, не включает гуманизированное антитело, содержащее антиген-связывающие остатки не человека. Антитела человека можно получать с использованием различных способов, известных в данной области, включая библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (1991). Также для получения моноклональных антител человека доступны способы, описанные в Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147(1): 86-95 (1991). Также см. van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001). Антитела человека можно получить путем введения антигена трансгенному животному, модифицированному для продукции таких антител в ответ на нагрузку антигеном, но имеющему поврежденные эндогенные локусы, например, иммунизированным ксеномышам (см., например, патенты США No. 6075181 и 6150584 в отношении технологии XENOMOUSETM). Также см., например, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) в отношении антител человека, полученных технологией B-клеточных гибридом человека.

Термины "гипервариабельная область", "HVR", или "HV", как используют в настоящем документе, относятся к участкам вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными по последовательности и/или образуют структурно определенные петли. Обычно антитела включают шесть гипервариабельных областей: три в VH (H1, H2, H3), и три в VL (L1, L2, L3). Используют несколько способов обозначения гипервариабельных областей, и они включены в рассматриваемое описание. Определяющие комплементарность области (CDR) по Кабат, основаны на вариабельности последовательностей и используются наиболее часто (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia вместо этого ссылается на расположение структурных петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 по Chothia, при нумерации с использованием правила нумерации Кабат, варьирует между H32 и H34 в зависимости от длины петли (это происходит из-за того, что схема нумерации Кабат помещает вставки у H35A и H35B; если ни 35A, ни 35B, не присутствуют, петля кончается у 32; если присутствует только 35A, петля кончается у 33; если присутствуют и 35A и 35B, тогда петля кончается у 34). Гипервариабельные области AbM представляют собой компромисс между CDR по Кабат и структурными петлями по Chothia, и они используются в программном обеспечении моделирования антител Oxford Molecular's AbM. "Контактные" гипервариабельные участки основаны на анализе доступных комплексных кристаллических структур. Остатки из каждого из указанных гипервариабельных участков отмечены далее.

Петля Кабат AbM Chothia Контакт
L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32…34 H30-H35B
(Нумерация по Кабат)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Нумерация по Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101

Гипервариабельные участки могут включать следующие "удлиненные гипервариабельные участки": 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в VL и 26-35B (H1), 50-65, 47-65 или 49-65 (H2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (H3) в VH. Остатки вариабельных доменов пронумерованы согласно Кабат (Kabat et al., выше) для каждого из этих определений.

“Каркасные” остатки или “FR” являются остатками вариабельных доменов, не относящихся к остаткам гипервариабельной области, как определено в настоящем описании.

Термины "нумерация остатка вариабельного домена по Кабат" или "нумерация аминокислотного положения по Кабат", и их варианты, относятся к системе нумерации, которую используют для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи в совокупности антител из Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). С использованием этой системы нумерации, истинная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество или дополнительное количество аминокислот, что соответствует укорочению FR или CDR вариабельного домена или встраиванию в них. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать одну вставку представляющей интерес аминокислоты (остаток 52a по Кабат) после остатка 52 в H2 и встроенные остатки (например, остатки 82a, 82b, и 82c, и т.д. по Кабат) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию Кабат для остатков можно определить для конкретного антитела путем выравнивания по участкам гомологии последовательности антитела со "стандартной" последовательностью с нумерацией по Кабат.

Систему нумерации Кабат обычно используют при указании на остаток в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "Систему нумерации EU" или "индекс EU" обычно используют при указании на остаток в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU, указанный в Kabat et al., выше). "Индекс EU по Кабат" относится к нумерации остатков антитела IgG1 человека EU. Если в настоящем документе нет иных указаний, указания на номера остатков в вариабельных доменах антител означают нумерацию остатков в соответствии с системой нумерации Кабат. Если в настоящем документе нет иных указаний, указания на номера остатков в константном домене антител означают нумерацию остатков в соответствии с системой нумерации EU. (например, см. предварительную заявку США No. 60/640323, фигуры для нумерации EU).

Антитело, полученное "созреванием аффинности" представляет собой антитело с одним или несколькими изменениями в одной один или нескольких его HVR, которые приводят к повышению аффинности антитела к антигену, по сравнению с исходным антителом, которое не имеет этого изменения(ий). Предпочтительные антитела, полученные "созреванием аффинности", имеют наномолярную или даже пикомолярную аффинность к антигену-мишени. Антитела, полученные созреванием аффинности, получают способами, известными в данной области. В Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) описано созревание аффинности способом "перетасовки" VH- и VL-доменов. Случайный мутагенез HVR и/или каркасных остатков описан: Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); и Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

"Блокирующее антитело" или "антитело-антагонист" представляет собой антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность антигена, который оно связывает. Предпочтительные блокирующие антитела или антитела-антагонисты частично или полностью ингибируют биологическую активность антигена.

"Антитело-агонист", как используют в настоящем документе, представляет собой антитело, которое имитирует по меньшей мере один из функциональных видов активности представляющего интерес полипептида.

"Зависимое от вида антитело", например, антитело млекопитающего против IgE человека, представляет собой антитело, которое обладает более высокой аффинностью связывания с антигеном из образца первого вида млекопитающего, относительно аффинности связывания с гомологом указанного антигена из образца второго вида млекопитающего. Обычно зависимое от вида антитело "специфично связывается" с антигеном человека (то есть, обладает величиной аффинности связывания (Kd) не более чем приблизительно 1×10-7 M, предпочтительно не более чем приблизительно 1×10-8 и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 1×10-9 M), но обладает аффинностью связывания с гомологом антигена из второго, не относящегося к человеку, вида млекопитающего, которая по меньшей мере приблизительно в 50 раз, или по меньшей мере приблизительно в 500 раз или по меньшей мере приблизительно в 1000 раз слабее, чем его аффинность связывания с антигеном человека. Зависимое от вида антитело может быть любым из различных типов антител, как раскрыто выше, но, предпочтительно, является гуманизированным антителом или антителом человека.

Термин "аффинность связывания" обычно относится к силе всех суммарных нековалентных взаимодействий между отдельным участком связывания молекулы (например, антитела) и его связывающим партнером (например, антигеном). Если нет иных указаний, как используют в настоящем документе, "аффинность связывания" относится к присущей аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно обычно представить константой диссоциации (Kd). Аффинность можно измерять обычными способами, известными в данной области, включая способы, описанные в настоящем документе. Низкоаффинные антитела обычно связывают антиген медленно, и имеют тенденцию к легкой диссоциации, тогда как высокоаффинные антитела обычно связывают антиген быстрее и имеют тендецию оставаться дольше в связанном состоянии. Специалистам известны различные способы измерения аффинности связывания, причем любой из них можно использовать для целей настоящего изобретения. Конкретные иллюстративные варианты осуществления описаны далее.

Выражение "или лучше", когда его используют в настоящем документе, при указании на аффинность связывания, относится к более сильному связыванию между молекулой и ее связывающим партнером. "Или лучше", когда его используют в настоящем документе, относится к более сильному связыванию, характеризующемуся более низким числовым значением Kd. Например, в случае антитела, аффинность которого к антигену составляет "0,6 нМ или лучше", аффинность антитела к антигену составляет <0,6 нМ, то есть 0,59 нМ, 0,58 нМ, 0,57 нМ и т.д., или любую величину, которая меньше чем 0,6 нМ.

В одном варианте "Kd" или "величину Kd" в соответствии с настоящим изобретением измеряют с помощью анализа связывания меченного радиоактивной меткой антигена (RIA), проводимого с Fab-версией представляющего интерес антитела и его антигеном, как описано в следующем анализе, в котором измеряют аффинность связывания Fab с антигеном в растворе путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией (125I)-меченного антигена в присутствии серии титров немеченного антигена, с последующей фиксацией связанного антигена на планшете, покрытом антителом против Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol 293:865-881). Чтобы установить условия для анализа, на микропланшеты для титрования (Dynex) наносят в течение ночи 5 мкг/мл фиксирующего антитела против Fab (Cappel Labs) в 50 мМ растворе карбоната натрия (рH 9,6), а затем блокируют с использованием 2% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В не адсорбирующем планшете (Nunc #269620), 100 пМ или 26 пМ [125I]-антигена смешивают с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, в соответствии с антителом против VEGF, Fab-12, в Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи; однако, инкубацию можно продолжать в течение более длительного периода (например, 65 часов), чтобы убедиться в том, что равновесие достигнуто. После этого смеси переносят на фиксирующий планшет для инкубации при комнатной температуре (например, в течение 1 часа). Затем раствор удаляют, и планшет промывают восемь раз 0,1% Tween-20 в PBS. После того, как планшеты высыхают, добавляют 150 мкл/лунка сцинтиллятора (MicroScint-20; Packard), и проводят подсчет в планшетах с использованием счетчика гамма-импульсов (Packard) в течение 10 минут. Концентрации каждого из Fab, которые обеспечивают связывание, меньшее или равное 20% от максимального связывания, выбирают для использования в конкурентных анализах связывания. В соответствии с другим вариантом Kd или величину Kd измеряют с использованием анализа способом поверхностного плазмонного резонанса, в таких анализах можно использовать BIAcoreTM-2000 или BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с чипами CM5 с иммобилизованным на них антигеном при ~10 единицах ответа (RU). В кратком изложении, биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антиген разбавляют 10 мМ ацетатом натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/минута для достижения приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После инъекции антигена инъецируют 1 M этаноламин для блокирования не вступивших в реакцию групп. Для определения показателей кинетики, двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) инъецируют в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C со скоростью потока приблизительно 25 мкл/мин. Константу ассоциации (kon) и константу диссоциации (koff) вычисляют с использованием простой модели связывания Ленгмюра "один к одному" (BIAcore Evaluation Software версии 3.2) посредством одновременного приведения в соответствие сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) вычисляют как соотношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Если константа ассоциации антитела превышает 106 M-1 с-1 в анализе способом поверхностного плазмонного резонанса, указанным выше, тогда константу ассоциации можно определять с использованием способа тушения флуоресценции, в котором измеряют повышение или снижение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение = 295 нм; испускание = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С 20 нМ антитела против антигена (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена при измерении в спектрофотометре, таком как спектрофотометр с останавливаемой струей (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco серии 8000 (Thermo Spectronic) с перемешиваемой кюветой.

"Скорость связывания" или "скорость ассоциации" или "скорость соединения" или "kon" согласно этому изобретению также можно определять с помощью указанного способа поверхностного плазмонного резонанса, описанного выше, с использованием BIAcoreTM-2000 или BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), как описано выше.

Выражение "по существу сходный" или "по существу такой же", как используют в настоящем документе, обозначает достаточно высокую степень сходства между двумя числовыми значениями (как правило, одно связано с антителом по изобретению, а другое связано с эталонным/сравнительным антителом), так что специалист в данной области может считать различие между двумя значениями небольшим или не имеющим биологической и/или статистической значимости в контексте биологического признака, измеряемого указанными значениями (например, значениями Kd). Различие между указанными двумя значениями предпочтительно составляет менее чем приблизительно 50%, предпочтительно менее чем приблизительно 40%, предпочтительно менее чем приблизительно 30%, предпочтительно менее чем приблизительно 20%, предпочтительно менее чем приблизительно 10% в качестве функции от значения для эталонного/сравнительного антитела.

Выражение "значимо сниженный" или "значимо отличающийся", как используют в настоящем документе, обозначает значимую высокую степень отличия между двумя числовыми значениями (как правило, одно связано с антителом по изобретению, а другое связано с эталонным/сравнительным антителом), так что специалист в данной области может считать различие между двумя значениями статистически значимым в контексте биологического признака, измеряемого указанными значениями (например, значениями Kd, ответом HAMA). Различие между указанными двумя значениями предпочтительно составляет более чем приблизительно 10%, предпочтительно более чем приблизительно 20%, предпочтительно более чем приблизительно 30%, предпочтительно более чем приблизительно 40%, предпочтительно более чем приблизительно 50% в качестве функции от значения для эталонного/сравнительного антитела.

"Антиген" представляет собой заданный антиген, с которым селективно связывается антитело. Антиген-мишень может представлять собой полипептид, углеводород, нуклеиновую кислоту, липид, гаптен или другое встречающееся в природе или синтетическое соединение. Предпочтительно, антиген-мишень представляет собой полипептид.

"Акцепторная каркасная область человека" для целей настоящего описания представляет собой каркасную область, содержащую аминокислотную последовательность каркасной области VL или VH, образованной каркасной областью иммуноглобулина человека или консенсусной последовательностью каркасной области человека. Акцепторная каркасная область человека, "образованная" каркасной областью иммуноглобулина человека или консенсусной последовательностью каркасной области человека может содержать саму их аминокислотную последовательность, или она может содержать существовавшие ранее изменения в аминокислотных последовательностях. Там, где присутствуют существовавшие ранее аминокислотные изменения, предпочтительно, чтобы присутствовало не более 5 и, предпочтительно, 4 или менее, или 3 или менее, существовавших ранее аминокислотных изменений. Там, где присутствуют существовавшие ранее аминокислотные изменения в VH, предпочтительно, чтобы указанные изменения существовали только в трех, двух или одном из положений 71H, 73H и 78H; например, аминокислотные остатки в указанных положениях могут представлять собой 71A, 73T и/или 78A. В одном варианте осуществления, акцепторная каркасная область VL человека идентична по последовательности каркасной области VL иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасной области человека.

"Консенсусная последовательность каркасной области человека" представляет собой каркасную область, которая представляет собой наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки при выборе каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Обычно выбор последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека осуществляют из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Обычно подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу согласно Кабат. В одном варианте осуществления, для VL, подгруппа представляет собой подгруппу каппа I по Кабат. В одном варианте осуществления, для VH, подгруппа представляет собой подгруппу III по Кабат.

"Консенсусная каркасная область VH подгруппы III" включает консенсусную последовательность, образованную аминокислотными последовательностями вариабельных областей тяжелой цепи подгруппы III по Кабат. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность консенсусной каркасной области VH подгруппы III включает по меньшей мере часть или все из каждой из следующих последовательностей: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:69)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:70)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:71)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:72).

"Консенсусная каркасная область VL подгруппы I" включает консенсусную последовательность, образованную аминокислотными последовательностями вариабельных областей легкой цепи каппа подгруппы I по Кабат. В одном варианте осуществления, аминокислотная последовательность консенсусной каркасной области VL подгруппы I включает по меньшей мере часть или все из каждой из следующих последовательностей: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:65)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:66)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:67)-L3-FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:68).

"Немодифицированная каркасная область человека" представляет собой каркасную область человека, которая имеет такую же аминокислотную последовательность, как и акцепторная каркасная область человека, например, она лишена замены(замен) аминокислоты человека на аминокислоту, не человека в акцепторной каркасной области человека.

"Измененная гипервариабельная область" для целей настоящего описания представляет собой гипервариабельную область, включающую одну или несколько (например от одной до приблизительно 16) аминокислотную замену(замен).

Термин "немодифицированная гипервариабельная область" для целей настоящего описания представляет собой гипервариабельную область, имеющую такую же аминокислотную последовательность, как и антитело не человека, из которого она получена, то есть гипервариабельную область, в которой отсутствует одна или несколько аминокислотных замен.

Антитело, "которое связывает" представляющий интерес антиген, например, ассоциированный с опухолью полипептидный антиген-мишень, представляет собой антитело, которое связывает антиген с достаточной аффинностью, так что антитело является подходящим в качестве лекарственного средства для нацеливания его на клетку или ткань, экспрессирующие антиген, и которое не реагирует перекрестно с другими белками в значительной степени. В таких вариантах осуществления степень связывания антитела с белком-"не мишенью" будет составлять менее 10% от связывания антитела с его специфическим белком-мишенью, как определяют в анализе сортировки активированных флуоресценцией клеток (FACS) или с помощью радиоиммунной преципитации (RIA). Что касается связывания антитела с молекулой-мишенью, термины "специфическое связывание" или "специфически связывается с" или является "специфичным к" конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени, означают связывание, которое на поддающемся измерению уровне отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание можно измерить, например, путем определения связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая обычно представляет собой молекулу со сходной структурой, которая не обладает активностью связывания. Например, специфическое связывание можно определить по конкуренции с контрольной молекулой, которая является сходной с мишенью, например, с избытком немеченой мишени. В этом случае на специфическое связывание указывает то, что связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. Термины "специфическое связывание" или "специфически связывается с" или является "специфическим к" конкретному полипептиду или эпитопу на конкретной полипептиде-мишени, как используют в настоящем документе, может быть проиллюстрирован, например, молекулой, имеющей Kd для мишени по меньшей мере приблизительно 10-4 M, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10-5 M, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10-6 M, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10-7 M, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 10-8 M, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10-9 M, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10-10 M, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10-11 M, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10-12 M, или более. В одном варианте осуществления, термин "специфическое связывание" относится к связыванию, когда молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде без связывания на существенном уровне с каким-либо другим полипептидом или эпитопом полипептида.

Антитело, которое "ингибирует рост опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид CD79b" или "ингибирующее рост" антитело представляет собой антитело, которое приводит к поддающемуся измерению ингибированию роста злокачественных клеток, экспрессирующих или сверхэкспрессирующих соответствующий полипептид CD79b. Полипептид CD79b может представлять собой трансмембранный полипептид, экспрессированный на поверхности злокачественной клетки, или он может представлять собой полипептид, который продуцируется и секретируется злокачественной клеткой. Предпочтительные ингибирующие рост антитела против CD79b ингибируют рост экспрессирующих CD79b опухолевых клеток более чем на 20%, предпочтительно от приблизительно 20% до приблизительно 50%, и более предпочтительно более чем на 50% (например, от приблизительно 50% до приблизительно 100%) по сравнению с соответствующим контролем, причем контролем обычно являются опухолевые клетки, которые не обработаны тестируемым антителом. В одном варианте осуществления, ингибирование роста можно измерить при концентрации антитела приблизительно от 0,1 до 30 мкг/мл или приблизительно от 0,5 нМ до 200 нМ в клеточной культуре, где ингибирование роста определяют через 1-10 суток после воздействия на опухолевые клетки антитела. Ингибирование роста опухолевых клеток in vivo можно определять различными способами, такими как способы, описанные в разделе "Экспериментальные примеры", ниже. Антитело является ингибирующим рост in vivo, если введение антитела против CD79b в концентрации от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг массы тела приводит к уменьшению размера опухоли или пролиферации опухолевых клеток в течение приблизительно от 5 суток до 3 месяцев с момента первого введения антитела, предпочтительно в течение приблизительно от 5 до 30 суток.

Антитело, которое "индуцирует апоптоз" представляет собой антитело, которое индуцирует запрограммированную гибель клеток, как определяют по связыванию аннексина V, фрагментации ДНК, сморщиванию клетки, расширению эндоплазматической сети, фрагментации клетки, и/или образованию мембранных везикул (называемых апоптотическими тельцами). Обычно такой клеткой является клетка, сверхэкспрессирующая полипептид CD79b. Предпочтительно, клетка представляет собой опухолевую клетку, например, гематопоэтическую клетку, такую как B-клетка, T-клетка, базофил, эозинофил, нейтрофил, моноцит, тромбоцит или эритроцит. Доступны различные способы оценки клеточных событий, связанных с апоптозом. Например, транслокацию фосфатидилсерина (PS) можно измерить по связыванию аннексина; фрагментацию ДНК можно оценить по лестничной ДНК; и конденсацию ядро/хроматин вместе с фрагментацией ДНК можно оценить по увеличению числа гиподиплоидных клеток. Предпочтительно, антитело, которое индуцирует апоптоз, представляет собой антитело, которое вызывает индукцию связывания аннексина приблизительно от 2 до 50 раз, предпочтительно приблизительно от 5 до 50 раз, и наиболее предпочтительно приблизительно от 10 до 50 раз превышающее связывание аннексина необработанными клетками в анализе связывания аннексина.

Антитело, которое "индуцирует гибель клеток", представляет собой антитело, которое приводит к тому, что живые клетки становятся неживыми. Клетка представляет собой клетку, экспрессирующую полипептид CD79b и является клеткой такого типа, которая специфически экспрессирует или сверхэкспрессирует полипептид CD79b. Такая клетка может быть злокачественной или нормальной клеткой конкретного клеточного типа. Полипептид CD79b может представлять собой трансмембранный полипептид, экспрессируемый на поверхности злокачественной клетки, или может представляет собой полипептид, который продуцируется и секретируется злокачественной клеткой. Клетка может представлять собой злокачественную клетку, например, B-клетку или T-клетку. Гибель клетки in vitro можно определять в отсутствии комплемента и иммунных эффекторных клеток, чтобы отличить ее от гибели клетки, индуцируемой антителозависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичностью (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC). Таким образом, анализ гибели клетки можно проводить с использованием инактивированной нагреванием сыворотки (то есть, в отсутствии комплемента) и в отсутствии иммунных эффекторных клеток. Для выяснения того, способно ли антитело индуцировать гибель клетки, можно оценивать утрату целостности мембраны, как оценивают по захвату йодида пропидия (PI), трипана синего (см. Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) или 7AAD, относительно необработанных клеток. Предпочтительными индуцирующими гибель клетки антителами являются антитела, которые индуцируют захват PI в анализе захвата PI в клетках BT474.

"Эффекторные функции" антитела относятся к таким видам биологической активности, которые являются свойственными Fc-области (Fc-области с нативной последовательностью или варианта Fc-участка по аминокислотной последовательности) антитела, и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточно-опосредуемую цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора; BCR) и активацию B-клеток.

Термин "Fc-область" используют в настоящем документе для определения C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc-области с нативной последовательностью и варианты Fc-областей. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно определяют как отрезок от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Pro230, до его C-конца. C-концевой лизин (остаток 447 в системе нумерации EU) Fc-области может быть удален, например, в процессе получения или очистки антитела, или при рекомбинантном конструировании нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может включать совокупности антител, во всех из которых удален остаток K447, совокупности антител, в которых не удален остаток K447, и совокупности антител, содержащие смесь антител, содержащих и не содержащих остаток K447.

"Функциональная Fc-область" обладает "эффекторной функцией" Fc-области с нативной последовательностью. Примеры "эффекторных функций" включают связывание C1q; CDC; связывание Fc-рецептора; ADCC; фагоцитоз; отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток; BCR) и т.д. Такие эффекторные функции обычно требуют, чтобы Fc-область была объединена со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела) и их можно оценить, используя различные анализы, как описано, например, в разделе "Определения" настоящего документа.

"Fc-область с нативной последовательностью" включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, встречающейся в природе. Fc-области человека с нативной последовательностью включают Fc-область IgG1 человека с нативной последовательностью (аллотипы не-A и A); Fc-область IgG2 человека с нативной последовательностью; Fc-область IgG3 человека с нативной последовательностью; и Fc-область IgG4 человека с нативной последовательностью, а также их встречающиеся в природе варианты.

"Вариант Fc-области" включает аминокислотную последовательность, которая отличается от Fc-области с нативной последовательностью тем, что содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, предпочтительно одну или несколько аминокислотную замену(замен). Предпочтительно, вариант Fc-область включает по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с Fc-областью с нативной последовательностью или с Fc-областью исходного полипептида, например от приблизительно одной до приблизительно десяти аминокислотных замен, и предпочтительно от приблизительно одной до приблизительно пяти аминокислотных замен в Fc-области с нативной последовательностью или в Fc-области исходного полипептида. Вариант Fc-области в настоящем документе предпочтительно обладает по меньшей мере приблизительно 80% гомологией с Fc-областью с нативной последовательностью и/или Fc-областью исходного полипептида, и наиболее предпочтительно он обладает гомологией с ними по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно он обладает гомологией с ними по меньшей мере приблизительно 95%.

"Антителозависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность" или "ADCC" относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемые Ig, связанные с Fc-рецепторами (FcR), находящимися на определенных цитотоксических клетках (например, естественных киллерных (NK) клетках, нейтрофилах и макрофагах), вызывают специфичное для этих цитотоксических эффекторных клеток связывание с несущей антиген клеткой-мишенью, а затем уничтожают клетки-мишени посредством цитотоксинов. Антитела являются "оружием" цитотоксических клеток, и они абсолютно необходимы для такого уничтожения. Основные клетки для осуществления ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на кроветворных клетках представлена в таблице 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Для оценки активности представляющей интерес молекулы в отношении ADCC, можно проводить анализ ADCC in vitro, такой как анализ, описанный в патенте США No. 5500362 или 5821337. Подходящие для таких анализов эффекторные клетки включают периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC) и естественные киллерные (NK) клетки. Альтернативно, или дополнительно, активность представляющей интерес молекулы в отношении ADCC можно оценивать in vivo, например, в модели на животных, такой как описана в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

Термины "Fc-рецептор" или "FcR" обозначают рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Более того, предпочтительным FcR является FcR, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно-сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые обладают сходными аминокислотными последовательностями, отличающимися, главным образом, своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный тирозин-связывающий активирующий мотив (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный тирозин-связывающий ингибирующий мотив (ITIM), (см. обзор M. в Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR описаны в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). К термину "FcR" в настоящем описании относятся другие FcR, в том числе FcR, которые будут выявлены в будущем. Термин также включает в себя неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994)).

Связывание с FcRn человека in vivo и период полужизни в сыворотке для полипептидов с высокой аффинностью связывания FcRn человека можно анализировать, например, у трансгенных мышей или в трансфицированных клеточных линиях человека, экспрессирующих FcRn человека, или у приматов, которым вводят полипептиды с вариантом Fc-области. В WO 2000/42072 (Presta) описаны варианты антител с повышенным или сниженным связыванием с FcR. См. также, например, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).

"Эффекторные клетки человека" представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют эффекторную функцию ADCC. Примеры лейкоцитов человека, которые осуществляют ADCC, включают периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC), естественные киллерные (NK) клетки, моноциты, цитотоксические T-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительными являются PBMC и NK-клетки. Эффекторные клетки можно выделять из их природных источников, например, из крови.

"Комплемент-зависимая цитотоксичность" или "CDC" относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического каскада комплемента начинается со связывания первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), связанными с распознаваемым им антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Варианты полипептидов с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области и повышенной или сниженной способностью связывать C1q описаны в патенте США No. 6194551B1 и WO1999/51642. См. также, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Термин "содержащее Fc-область антитело" относится к антителу, которое включает Fc-область. C-концевой лизин (остаток 447 согласно системе нумерации EU) Fc-области может быть удален, например, во время очистки антитела или путем рекомбинантного конструирования антитела, кодируемого нуклеиновой кислотой. Таким образом, композиция, включающая содержащее Fc-область антитело, в соответствии с настоящим изобретением может включать антитело, содержащее K447, антитело, из которого полностью удален K447, или смесь антител, содержащих и не содержащих остаток K447.

Термин "внеклеточный домен" полипептида CD79b или "ECD" относится к форме полипептида CD79b, которая по существу не содержит трансмембранного и цитоплазмического доменов. Обычно, ECD полипептида CD79b содержит менее 1% таких трансмембранных и/или цитоплазмических доменов, и предпочтительно он содержит менее 0,5% таких доменов. Понятно, что любые трансмембранные домены, идентифицированные для полипептидов CD79b по настоящему изобретению, идентифицируют в соответствии с критериями, обычно используемыми в данной области для идентификации гидрофобного домена такого типа. Точные границы трансмембранного домена могут варьировать, но, наиболее вероятно, не более чем приблизительно на 5 аминокислот в любую сторону от домена, как исходно определено в настоящем документе. Таким образом, необязательно внеклеточный домен полипептида CD79b может содержать приблизительно 5 или менее аминокислот с любой стороны границы между трансмембранным доменом/внеклеточным доменом, как указано в примерах или описании, и такие полипептиды, содержащие или не содержащие связанного с ними сигнального пептида, и кодирующие их нуклеиновые кислоты предусматриваются настоящим изобретением.

Приблизительное положение "сигнальных пептидов" полипептида CD79b, описанного в настоящем документе, может быть показано в настоящем описании и/или на соответствующих рисунках. Однако следует отметить, что C-концевая граница сигнального пептида может варьировать, но наиболее вероятно, не более чем приблизительно на 5 аминокислот в любую сторону от C-концевой границы сигнального пептида, как исходно идентифицировано в настоящем документе, где C-концевая граница сигнального пептида может быть определена в соответствии с критериями, которые обычно используют в данной области для идентификации такого типа элемента аминокислотной последовательности (см. например, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) и von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Кроме того, известно, что в некоторых случаях отщепление сигнальной последовательности от секретируемого полипептида не является полностью одинаковым, что приводит более чем к одному виду секретируемого полипептида. Такие зрелые полипептиды, в которых сигнальный пептид отщепляется в пределах не более чем приблизительно 5 аминокислот с каждой из сторон C-концевой границы сигнального пептида, как идентифицировано в настоящем документе, и кодирующие их полинуклеотиды предусматриваются настоящим изобретением.

Термин "вариант полипептида CD79b" означает полипептид CD79b, предпочтительно активный полипептид CD79b, как описано в настоящем документе, обладающий по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности с полноразмерным полипептидом CD79b с нативной последовательностью, как описано в настоящем документе, последовательность полипептида CD79b, в которой отсутствует сигнальный пептид, как описано в настоящем документе, внеклеточный домен полипептида CD79b с сигнальным пептидом, или без него, или любой другой фрагмент полноразмерной последовательности полипептида CD79b, как описано в настоящем документе (такой, как фрагменты, которые кодируются нуклеиновой кислотой, которая представляет собой только часть полной кодирующей последовательности полноразмерного полипептида CD79b). Такие варианты полипептида CD79b включают, например, полипептиды CD79b, где добавлен или удален один или несколько аминокислотных остатков на N- или C-конце полноразмерной нативной аминокислотной последовательности. Обычно вариант полипептида CD79b обладает по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью аминокислотной последовательности с полноразмерным полипептидом CD79b с нативной последовательностью, как описано в настоящем документе, последовательностью полипептида CD79b, в которой отсутствует сигнальный пептид, как описано в настоящем документе, внеклеточным доменом полипептида CD79b с сигнальным пептидом или без него, как описано в настоящем документе, или любым другим конкретно определенным фрагментом полноразмерной последовательности полипептида CD79b, как описано в настоящем документе. Обычно варианты полипептида CD79b имеют длину по меньшей мере приблизительно 10 аминокислот, альтернативно по меньшей мере приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 аминокислот или более. Необязательно, варианты полипептидов CD79b содержат не более одной консервативной аминокислотной замены по сравнению с полипептидом CD79b с нативной последовательностью, альтернативно не более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен по сравнению с полипептидом CD79b с нативной последовательностью.

"Процентную (%) идентичность аминокислотных последовательностей" в отношении последовательности пептида или полипептида, т.е. последовательностей полипептидов CD79b, идентифицированных в настоящем документе, определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в конкретной последовательности пептида или полипептида, т.е. последовательности полипептида CD79b, после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, и не считая какие-либо консервативные замены частью идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процентной идентичности аминокислотных последовательностей можно проводить различными способами, которые известны в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для проведения выравнивания, включая любые алгоритмы, требуемые для достижения максимального выравнивания на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей. Однако для целей, представленных в настоящем документе, значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2, где полный исходный текст для программы ALIGN-2 предоставлен в таблице 1, ниже. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была составлена в Genentech, Inc. и исходный текст, представленный в таблице 1, ниже, был представлен с пользовательской документацией в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной через Genentech, Inc., South San Francisco, California или ее можно составить из исходного текста, представленного в таблице 1, ниже. Программа ALIGN-2 должна быть составлена для применения на операционной системе UNIX, предпочтительно цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и не изменяются.

В случаях, когда ALIGN-2 используют для сравнений аминокислотных последовательностей, % идентичность аминокислотных последовательностей для данной аминокислотной последовательности A к, с или против данной аминокислотной последовательности B (что альтернативно может быть сформулировано как данная аминокислотная последовательность A, которая обладает определенной % идентичностью аминокислотной последовательности или содержит % идентичность аминокислотной последовательности, к, с или против данной аминокислотной последовательности B), или вычисляют следующим образом:

100 умножить на частное X/Y

где X представляет собой число аминокислотных остатков, оцененных как идентичные совпадения программой для выравнивания последовательностей ALIGN-2 при выравнивании этой программой A и B, и где Y представляет собой общее количество аминокислотных остатков в B. Понятно, что когда длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, % идентичность аминокислотных последовательностей A к B не равна % идентичности аминокислотных последовательностей B к A.

"Вариант полинуклеотида CD79b" или "вариант последовательности нуклеиновой кислоты CD79b" означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид CD79b, предпочтительно активный полипептид CD79b, как определено в настоящем документе, и которая обладает по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерную последовательность полипептида CD79b с нативной последовательностью, идентифицированного в настоящем документе, полноразмерную последовательность полипептида CD79b с нативной последовательностью, в которой отсутствует сигнальный пептид, как описано в настоящем документе, внеклеточный домен полипептида CD79b с сигнальным пептидом, или без него, как описано в настоящем документе, или любой другой фрагмент полноразмерной последовательности полипептида CD79b, как описано в настоящем документе (такой, как фрагменты, которые кодируются нуклеиновой кислотой, которая представляет собой только часть полной кодирующей последовательности полноразмерного полипептида CD79b). Как правило, такие варианты полинуклеотидов CD79b обладают по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по меньшей мере приблизительно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерную последовательность полипептида CD79b с нативной последовательностью, как описано в настоящем документе, полноразмерную последовательность полипептида CD79b с нативной последовательностью, в которой отсутствует сигнальный пептид, как описано в настоящем документе, внеклеточный домен полипептида CD79b с сигнальным пептидом, или без него, как описано в настоящем документе, или любой другой фрагмент полноразмерной последовательности полипептида CD79b, как описано в настоящем документе. Варианты не включают нативную нуклеотидную последовательность.

Как правило, длина вариантов полинуклеотидов CD79b составляет по меньшей мере 5 нуклеотидов, альтернативно она составляет по меньшей мере приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 или 1000 нуклеотидов, где в этом контексте термин "приблизительно" означает указанную длину нуклеотидной последовательности плюс или минус 10% от этой указанной длины.

"Процентную идентичность (%) последовательностей нуклеиновых кислот" в отношении последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих CD79b, идентифицированных в настоящем документе, определяют как процент нуклеотидов в последовательности-кандидате, которые идентичны нуклеотидам в представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты CD79b, после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процентной идентичности последовательностей нуклеиновых кислот можно проводить различными способами, которые находятся в пределах специальных знаний, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Однако для целей, представленных в настоящем документе, значения % идентичности последовательностей нуклеиновых кислот получают с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2, где полный исходный текст для программы ALIGN-2 предоставлен в таблице 1, ниже. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была составлена в Genentech, Inc. и исходный текст, представленный в таблице 1, ниже, был представлен с пользовательской документацией в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной через Genentech, Inc., South San Francisco, California или ее можно составить из исходного текста, представленного в таблице 1, ниже. Программа ALIGN-2 должна быть составлена для применения на операционной системе UNIX, предпочтительно цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и не изменяются.

В случаях, когда ALIGN-2 используют для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, % идентичность последовательностей нуклеиновых кислот для данной последовательности нуклеиновой кислоты C к, с, или против данной последовательности нуклеиновой кислоты D (которая альтернативно может быть сформулирована как данная последовательность нуклеиновой кислоты C, которая имеет или включает определенную % идентичность последовательности нуклеиновой кислоты к, с, или против данной последовательности нуклеиновой кислоты D) вычисляют следующим образом:

100, умноженное на частное W/Z

где W представляет собой количество нуклеотидов, оцененных как идентичные совпадения программой для выравнивания последовательностей ALIGN-2 при выравнивании этой программой C и D, и где Z представляет собой общее число нуклеотидов в D. Понятно, что когда длина последовательности нуклеиновой кислоты C не равна длине последовательности нуклеиновой кислоты D, % идентичность последовательности нуклеиновой кислоты C относительно D не будет равна % идентичности последовательности нуклеиновой кислоты D относительно C. Если конкретно не указано иное, все значения % идентичности последовательностей нуклеиновых кислот, используемые в настоящем документе, получены, как описано в предыдущем абзаце с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

В других вариантах осуществления варианты полинуклеотидов CD79b представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид CD79b и которые способны гибридизоваться предпочтительно в жестких условиях гибридизации и промывания с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полноразмерный полипептид CD79b, как описано в настоящем документе. Варианты полипептидов CD79b могут представлять собой полипептиды, которые кодируются вариантами полинуклеотидов CD79b.

Термин "полноразмерная кодирующая область", когда его используют в отношении нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CD79b, относится к последовательности нуклеотидов, которая кодирует полноразмерный полипептид CD79b по настоящему изобретению (который часто изображен инициирующим кодоном и стоп-кодоном, включительно, на прилагаемых рисунках). Термин "полноразмерная кодирующая область", когда его используют в отношении нуклеиновой кислоты, депонированной в ATCC, относится к кодирующей полипептид CD79b части кДНК, которая встроена в вектор, депонированный в ATCC (который часто изображен начальным кодоном и стоп-кодоном, включительно, на прилагаемых рисунках (инициирующий кодон и стоп-кодон обозначены полужирным шрифтом и подчеркнуты на рисунках)).

"Выделенный", при применении для описания различных полипептидов CD79b, описанных в настоящем документе, означает полипептид, который идентифицирован и отделен и/или выделен из компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой материалы, которые, как правило, препятствуют диагностическому и терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления такие полипептиды будут очищать (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (2) до гомогенности при SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием кумасси синего или, предпочтительно, окрашивания серебром. Такие выделенные полипептиды включают соответствующие полипептиды в рекомбинантных клетках in situ, поскольку в этом случае будет отсутствовать по меньшей мере один компонент природного окружения полипептида CD79b. Однако, как правило, такие полипептиды можно получать посредством по меньшей мере одной стадии очистки.

"Выделенная" нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид CD79b, или нуклеиновая кислота, кодирующая другой полипептид, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в природном источнике кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид находится в другой форме или условиях, чем форма и условия, в которых она встречается в природе. Таким образом, выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, отличаются от конкретной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, которая существует в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, включает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды, содержащиеся в клетках, которые обычно экспрессируют полипептид, где, например, молекула нуклеиновой кислоты находится в положении на хромосоме, отличном от положения на хромосоме в природных клетках.

Термин "последовательности контроля" относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Последовательности контроля, которые пригодны для прокариот, включают, например, промотор, необязательно последовательность оператора и участок связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируются в качестве пребелка, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосом является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, чтобы облегчить трансляцию. Как правило, "функционально связанный" означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, и, в случае секреторной лидерной последовательности, являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Связывание осуществляют посредством лигирования в соответствующих участках рестрикции. Если таких участков нет, используют синтетические олигонуклеотидные соединительные элементы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

"Жесткость" реакций гибридизации легко определяет специалист в данной области, и, как правило, она представляет собой эмпирическое вычисление, зависящее от длины зонда, температуры промывания и концентрации соли. Как правило, для надлежащего отжига более длинные зонды требуют более высоких температур, в то время как более короткие зонды требуют более низких температур. Гибридизация, как правило, зависит от способности денатурированной ДНК к повторному отжигу, когда комплементарные цепи присутствуют в окружающей среде при температуре, ниже их температуры отжига. Чем более высокой является степень требуемой гомологии между зондом и гибридизуемой последовательностью, тем более высокой является относительная температура, которую можно использовать. В результате, из этого следует, что более высокие относительные температуры будут обеспечивать тенденцию к более жестким условиям реакции, в то время как более низкие температуры снижают жесткость. Для дополнительных деталей и разъяснения жесткости реакций гибридизации, см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Жесткие условия" или "условия высокой жесткости", как определено в настоящем документе, можно определить как условия, при которых: (1) используют низкую ионную силу и высокую температуру промывания, например 0,015 M хлорид натрия/0,0015 M цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°С; (2) используют в ходе гибридизации денатурирующее средство, такое как формамид, например, 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% Ficoll/0,1% поливинилпирролидоном/50 мМ натрий-фосфатным буфером при pH 6,5 с 750 мМ хлоридом натрия, 75 мМ цитратом натрия при 42°C; или (3) проводят гибридизацию в течение ночи в растворе, в котором используется 50% формамид, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 x раствор Денхардта, облученная ультразвуковым облучением ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана при 42°C, с промыванием в течение 10 минут при 42°C в 0,2 x SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) с последующим промыванием высокой жесткости в течение 10 минут, состоящим из 0,1 x SSC, содержащего EDTA, при 55°C.

"Условия умеренной жесткости" можно определить, как описано в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, и они включают применение менее жесткого раствора для промывания и условий гибридизации (например, температуры, ионной силы и %SDS), чем раствор для промывания и условия гибридизации, описанные выше. Примером умеренно жестких условий является инкубация в течение ночи при 37°C в растворе, содержащем: 20% формамид, 5 x SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ трицитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 7,6), 5 x раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мг/мл денатурированной расщепленной ДНК спермы лосося, с последующим промыванием фильтров в 1 x SSC при приблизительно 37-50°С. Специалисту будет понятно, каким образом корректировать температуру, ионную силу и т.д., в случае необходимости приспосабливания к таким факторам, как длина зонда и т.п.

Термин "меченный эпитопом", при применении в настоящем документе, относится к химерному полипептиду, содержащему полипептид CD79b, или антитело против CD79b, слитые с "полипептидом-меткой". Полипептид-метка имеет достаточное количество остатков для обеспечения эпитопа, против которого можно получать антитело, но в то же время является достаточно коротким, чтобы не препятствовать активности полипептида, с которым он слит. Также полипептид-метка предпочтительно является совершенно уникальным, так что антитело по существу не вступает в перекрестные реакции с другими эпитопами. Подходящие полипептиды-метки, как правило, имеют по меньшей мере шесть аминокислотных остатков и, как правило, между приблизительно 8 и 50 аминокислотных остатков (предпочтительно, между приблизительно 10 и 20 аминокислотных остатков).

"Активный" или "активность" для целей, представленных в настоящем документе, относится к форме(ам) полипептида CD79b, которая сохраняет биологическую и/или иммунологическую активность нативного или встречающегося в природе CD79b, где "биологическая" активность относится к биологической функции (либо ингибиторной, либо стимулирующей), обеспечиваемой нативным или встречающимся в природе CD79b, отличной от способности индуцировать образование антитела против антигенного эпитопа, которым обладает нативный или встречающийся в природе CD79b, и "иммунологическая" активность относится к способности индуцировать образование антитела против антигенного эпитопа, которым обладает нативный или встречающийся в природе CD79b.

Термин "антагонист" используют в наиболее широком смысле, и он включает любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность нативного полипептида CD79b. Аналогично, термин "агонист" используют в наиболее широком смысле, и он включает любую молекулу, которая имитирует биологическую активность нативного полипептида CD79b. Подходящие молекулы агонистов и антагонистов конкретно включают антитела-антагонисты или антитела-агонисты, или фрагменты этих антител, фрагменты или варианты по аминокислотной последовательности нативных полипептидов CD79b, пептиды, антисмысловые олигонуклеотиды, низкомолекулярные органические молекулы и т.д. Способы идентификации антагонистов или агонистов полипептида CD79b могут включать контактирование полипептида CD79b с молекулой-кандидатом агониста или антагониста и измерение поддающегося детекции изменения одного или нескольких видов биологической активности, обычно ассоциированных с полипептидом CD79b.

"Очищенный" означает, что молекула присутствует в образце в концентрации по меньшей мере 95% по массе, или по меньшей мере 98% по массе образца, в котором она содержится.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена по меньшей мере от одной другой молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована, например, в ее природном окружении. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кроме того, включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты находится вне хромосомы или в области хромосомы, которая отличается от ее природного расположения на хромосоме.

Термин "вектор", как используют в настоящем документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной осуществлять транспорт другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Одним типом вектора является "плазмида", которая относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является фаговый вектор. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут встраиваться в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и, тем самым, они реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называют в настоящем документе "рекомбинантными экспрессирующими векторами" (или просто, "рекомбинантными векторами"). Как правило, экспрессирующие векторы, применяемые в способах рекомбинантных ДНК, часто имеют форму плазмид. В настоящем описании, термины "плазмида" и "вектор" могут быть использованы взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора.

Термин "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", используемые в настоящем документе взаимозаменяемо, относится к полимерам нуклеотидов любой длины, и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который может быть включен в полимер ДНК- или РНК-полимеразой, или посредством синтетической реакции. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. До и после сборки полимера может происходить модификация нуклеотидной структуры, если она происходит. Последовательность нуклеотидов может прерываться ненуклеотидными компонентами. Кроме того, полинуклеотид может быть модифицирован после полимеризации, например, конъюгацией с осуществляющим мечение компонентом. Другие типы модификаций включают, например, "кэпы", замену одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, например, такие как модификации незаряженными связями (например, метилфосфонатами, фосфотриэфирами, фосфоамидатами, карбаматами и т.д.) и заряженными связями (например, фосфоротиоатами, фосфородитиоатами, и т.д.), модификации выступающими группами, например, такими как белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), модификации интеркаляторами (например, акридином, псораленом, и т.д.), модификации хелаторами (например, металлами, радиоактивными металлами, бором, окислительными металлами и т.д.), модификации алкилирующими соединениями, модификации модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любые гидроксильные группы, обычно присутствующие в сахарах, могут быть заменены, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, они могут быть защищены стандартными защитными группами или активированы для образования дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или они могут быть конъюгированы с твердыми или полу-твердыми подложками. 5'- и 3'-концевой OH может быть фосфорилирован или замещен аминами или органическими кэпирующими группами из от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть преобразованы в стандартные защитные группы. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые, главным образом, известны в данной области, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил-, 2'-фтор- или 2'-азидорибозу, карбоциклические аналоги сахаров, альфа-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, сахара пиранозы, сахара фуранoзы, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одна или несколько фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными линкерными группами. Эти альтернативные линкерные группы включают, но не ограничиваются ими, варианты осуществления, где фосфат заменен на P(O)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), "(O)NR2 ("амидат"), P(O)R, P(O)OR', CO или CH2 ("формацеталь"), где каждый R или R' независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий простую эфирную связь (-O-), арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не обязательно, чтобы все связи в полинуклеотиде были идентичными. Представленное выше описание применимо ко всем полинуклеотидам, указанным в настоящем документе, включая РНК и ДНК.

"Олигонуклеотид", как используют в настоящем документе, относится, главным образом, к коротким, как правило, одноцепочечным, как правило, синтетическим полинуклеотидам длиной, как правило, но не обязательно, менее 200 нуклеотидов. Термины "олигонуклеотид" и "полинуклеотид" не являются взаимоисключающими. Представленное выше описание полинуклеотидов в равной степени и полностью применимо к олигонуклеотидам.

Термины "злокачественная опухоль" и "злокачественный" относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, гемопоэтические злокачественные опухоли или связанные с кровью злокачественные опухоли, такие как лимфома, лейкоз, миелома или лимфоидные злокачественные опухоли, а также злокачественные опухоли селезенки и злокачественные опухоли лимфатических узлов, а также карциному, бластому и саркому. Более конкретные примеры злокачественной опухоли включают ассоциированные с B-клетками злокачественные опухоли, включая например, высокодифференцированные, промежуточные и низкодифференцированные лимфомы (включая B-клеточные лимфомы, например, такие как B-клеточная лимфома ассоциированной со слизистой оболочкой лимфоидной ткани и неходжскинская лимфома (NHL), лимфома из клеток мантийной зоны, лимфома Беркитта, мелколимфоцитарная лимфома, лимфома маргинальной зоны, диффузная крупноклеточная лимфома, фолликулярная лимфома и лимфома Ходжкина, и T-клеточные лимфомы) и лейкозы (включая вторичный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), такой как B-клеточный лейкоз (CD5+ B-лимфоциты), миелоидный лейкоз, такой как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, лимфоидный лейкоз, такой как острый лимфобластный лейкоз (ALL) и миелодисплазия), и другие гематологические и/или ассоциированные с B-клетками или T-клетками злокачественные опухоли. Также включаются злокачественные опухоли вспомогательных кроветворных клеток, включая полиморфноядерные лейкоциты, такие как базофилы, эозинофилы, нейтрофилы и моноциты, дендритные клетки, тромбоциты, эритроциты и естественные киллерные клетки. Также включаются злокачественные B-клеточно-пролиферативные нарушения, выбранные из следующих: лимфома, неходжкинская лимфома (NHL), агрессивная NHL, рецидивирующая агрессивная NHL, рецидивирующая вялотекущая NHL, рефрактерная NHL, рефрактерная вялотекущая NHL, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелколимфоцитарная лимфома, лейкоз, волосатоклеточный лейкоз (HCL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) и лимфома из клеток мантийной зоны. Источники B-клеточных злокачественных опухолей включают следующие: B-клеточная лимфома маргинальной зоны происходит из B-клеток памяти в маргинальной зоне, фолликулярная лимфома и диффузная крупноклеточная B-лимфома происходят из центроцитов в светлой зоне герминативных центров, хронический лимфоцитарный лейкоз и мелкоклеточный лимфоцитарный лейкоз происходят из B1-клеток (CD5+), лимфома из клеток мантийной зоны происходит из наивных B-клеток в мантийной зоне, и лимфома Беркитта происходит из центробластов в темной зоне герминативных центров. Ткани, которые включают кроветворные клетки, называемые в настоящем документе "тканями гемопоэтических клеток", включают тимус и костный мозг и периферические лимфоидные ткани, такие как селезенка, лимфатические узлы, лимфоидные ткани, ассоциированные со слизистой оболочкой, такие как ассоциированные с кишечником лимфоидные ткани, миндалевидные железы, пейеровы бляшки и аппендикс и лимфоидные ткани, ассоциированные с другими слизистыми оболочками, например, с выстилкой бронхов. Другие конкретные примеры таких злокачественных опухолей включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, злокачественную опухоль брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстого кишечника, рак ободочной и прямой кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, карциному печени, лейкоз и другие лимфопролиферативные нарушения, и различные типы рака головы и шеи.

"B-клеточная злокачественная опухоль" в настоящем документе включает неходжскинскую лимфому (NHL), в том числе низкодифференцированную/фолликулярную NHL, мелколимфоцитарную NHL (SL), промежуточно-дифференцированную/фолликулярную NHL, промежуточно-дифференцированную диффузную NHL, высокодифференцированную иммунобластную NHL, высокодифференцированную лимфобластную NHL, высокодифференцированную мелкоклеточную NHL с нерасщепленными ядрами, NHL с массивным поражением, лимфому из клеток мантийной зоны, ассоциированную со СПИД лимфому, и макроглобулинемию Вальденстрема; неходжскинскую лимфому (NHL), болезнь Ходжкина с преобладанием лимфоцитов (LPHD), мелколимфоцитарную лимфому (SLL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), вялотекущую NHL, включая рецидивирующую вялотекущую NHL и рефрактерную к ритуксимабу вялотекущую NHL; лейкоз, в том числе острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз, хронический миелобластный лейкоз; лимфому клеток мантийной зоны; и другие гематологические злокачественные опухоли. Такие злокачественные опухоли можно лечить антителами, направленными против маркеров B-клеточной поверхности, таких как CD79b. В настоящем документе предусматриваются, что такие заболевания можно лечить путем введения антитела, направленного против маркера B-клеточной поверхности, такого как CD79b, и оно включает введение неконъюгированного ("голого") антитела или антитела, конъюгированного с цитотоксическим средством, как описано в настоящем документе. Также в настоящем документе предусматривается, что такие заболевания можно лечить комбинированной терапией, включающей антитело против CD79b или конъюгат антитела против CD79b с лекарственным средством по изобретению в сочетании с другим антителом или конъюгатом антитела и лекарственного средства, другим цитотоксическим средством, лучевой терапией или другим способом лечения, проводимым одновременно или последовательно. В иллюстративном способе лечения по изобретению, антитело против CD79b по изобретению вводят в сочетании с антителом против CD20, иммуноглобулином, или его связывающим CD20 фрагментом, либо вместе, либо последовательно. Антитело против CD20 может представлять собой “голое” антитело или конъюгат антитела и лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления комбинированной терапии, антитело против CD79b представляет собой антитело по настоящему изобретению, а антитело против CD20 представляет собой Rituxan® (ритуксимаб).

Как используют в рамках настоящей заявки, термин "неходжскинская лимфома" или "NHL" относится к злокачественной опухоли лимфатической системы, отличной от лимфом Ходжкина. Лимфомы Ходжкина можно отличить от неходжкинских лимфом, главным образом, по наличию клеток Рид-Штернберга при лимфомах Ходжкина и отсутствию указанных клеток при неходжскинских лимфомах. Примеры неходжскинских лимфом, которые охватывает используемый в настоящей заявке термин, включают в себя любые лимфомы, которые специалист в данной области (например, онколог или патолог) может определить как неходжкинскую лимфому в соответствии с системами классификации, известными в данной области, такими как Пересмотренная европейско-американская классификация лимфом (REAL), как описано в Color Atlas of Clinical Hematology, (Third Edition), A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Limited 2000). Cм., в частности фиг. 11.57, 11.58 и 11.59. Более конкретные примеры включают, но не ограничиваются ими, рецидивирующую или рефрактерную NHL, пограничную низкодифференцированную NHL, NHL стадии III/IV, устойчивую к химиотерапии NHL, лимфобластный лейкоз и/или лимфому предшественников B-клеток, мелколимфоцитарную лимфому, B-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз и/или пролимфоцитарный лейкоз и/или мелколимфоцитарную лимфому, B-клеточную пролимфоцитарную лимфому, иммуноцитому и/или лимфоплазматическую лимфому, B-клеточную лимфому маргинальной зоны, лимфому маргинальной зоны селезенки, экстранодальную MALT-лимфому маргинальной зоны, волосатоклеточный лейкоз, плазмацитому и/или плазмаклеточную миелому, низкодифференцированную/фолликулярную лимфому, промежуточно-дифференцированную/фолликулярную NHL, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому центрального фолликула (фолликулярную), промежуточно-дифференцированную диффузную NHL, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, NHL с агрессивным течением (в том числе пограничную NHL с агрессивным течением и рецидивирующую NHL с агрессивным течением), NHL, рецидивировавшую после аутологичной трансплантации стволовых клеток или устойчивую к ней, первичную медиастинальную крупноклеточную B-клеточную лимфому, первичную эффузионную лимфому, высокодифференцированную иммунобластную NHL, высокодифференцированную лимфобластную NHL, высокодифференцированную мелкоклеточную NHL с нерасщепленными ядрами, NHL с массивным поражением, лимфому Беркитта, лимфобластный лейкоз и/или лимфому крупных гранулярных предшественников T-клеток (периферических), фунгоидный микоз и/или синдром Сезари, лимфомы кожных покровов (кожные), анапластическую крупноклеточную лимфому, ангиоцентричную лимфому.

"Нарушение" представляет собой любое состояние, при котором может быть полезным лечение веществом/молекулой или способом по изобретению. Оно включает хронические и острые нарушения или заболевания, включая патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающего к рассматриваемому нарушению. Неограничивающие примеры нарушений, подлежащих лечению согласно настоящему описанию, включают злокачественные состояния, такие как злокачественные и доброкачественные опухоли; не лейкозы и лимфоидные злокачественные опухоли; нейрональные, глиальные, астроглиальные, гипоталамические нарушения и нарушения других желез, макрофагальные, эпителиальные, стромальные и бластоцельные нарушения; и воспалительные, иммунологические и другие связанные с ангиогенезом нарушения. Кроме того, нарушения включают состояния, такие как B-клеточно-пролиферативные нарушения и/или B-клеточные опухоли, например, лимфому, неходжкинскую лимфому (NHL), агрессивную NHL, рецидивирующую агрессивную NHL, рецидивирующую вялотекущую NHL, рефрактерную NHL, рефрактерную вялотекущую NHL, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелколимфоцитарную лимфому, лейкоз, волосатоклеточный лейкоз (HCL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) и лимфому из клеток мантийной зоны.

Термины "клеточно-пролиферативное нарушение" и "пролиферативное нарушение" относятся к нарушениям, которые ассоциированы с аномальной, в некоторой степени, клеточной пролиферацией. В одном варианте осуществления, клеточно-пролиферативное нарушение представляет собой злокачественную опухоль.

"Опухоль", как используют в настоящем документе, относится к любому неопластическому клеточному росту и пролиферации, как злокачественным, так и доброкачественным, и к любым предзлокачественным и злокачественным клеткам и тканям.

"Аутоиммунное заболевание" в настоящем документе представляет собой заболевание или нарушение, возникающее в собственных тканях индивидуума и направленное против них, или отдельный его признак или его проявление, или состояние, возникающее как его следствие. При многих из этих аутоиммунных и воспалительных нарушений, может существовать ряд клинических и лабораторных маркеров, включая, но не ограничиваясь ими, гипергаммаглобулинемию, высокие уровни аутоантител, отложения комплексов антиген-антитело в тканях, польза от лечения кортикостероидами или иммунодепрессивными средствами, и агрегаты лимфоидных клеток в пораженных тканях. Не ограничиваясь какой-либо теорией, касающейся опосредуемого B-клетками аутоиммунного заболевания, полагают, что B-клетки демонстрируют патогенный эффект при аутоиммунных заболеваниях человека через множество механических каскадов, включая продукцию аутоантител, образование иммунных комплексов, активацию дендритных клеток и T-клеток, синтез цитокинов, прямое высвобождение хемокинов, и обеспечение очага для эктопического неолимфогенеза. Каждый из этих каскадов может участвовать в патологии аутоиммунных заболеваний в различной степени.

"Аутоиммунное заболевание" может быть органоспецифическим заболеванием (т.е., иммунный ответ специфично направлен против системы органов, такой как эндокринная система, гемопоэтическая система, кожа, сердечно-легочная система, желудочно-кишечная и печеночная системы, почечная система, щитовидная железа, уши, нервно-мышечная система, центральная нервная система и т.д.) или системным заболеванием, которое может поражать множество систем органов (например, системная красная волчанка (SLE), ревматоидный артрит, полимиозит, и т.д.). Предпочтительно, такие заболевания включают аутоиммунные ревматологические нарушения (например, такие как ревматоидный артрит, синдром Шегрена, склеродермия, волчанка, такая как SLE и волчаночный нефрит, полимиозит/дерматомиозит, криоглобулинемия, синдром антифосфолипидных антител, и псориатический артрит), аутоиммунные желудочно-кишечные нарушения и нарушения печени (например, такие как воспалительные заболевания кишечника (например, язвенный колит и болезнь Крона), аутоиммунный гастрит и пернициозную анемию, аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, и глютеновую энтеропатию), васкулит (например, такой как ANCA-отрицательный васкулит и ANCA-ассоциированный васкулит, включая васкулит Черджа-Строса, гранулематоз Вегенера и микроскопический полиангиит), аутоиммунные неврологические нарушения (например, такие как рассеянный склероз, опсоклонус-миоклонус синдром, миастения, оптический миелоневрит, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и аутоиммунные полиневропатии), почечные нарушения (например, такие как гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, и болезнь Бергера), аутоиммунные дерматологические нарушения (например, такие как псориаз, крапивница, уртикария, пемфигус обыкновенный, буллезный пемфигоид и кожная красная волчанка), гематологические нарушения (например, такие как тромбоцитопеническая пурпура, тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, посттрансфузионная пурпура и аутоиммунная гемолитическая анемия), атеросклероз, увеит, аутоиммунные болезни слуха (например, такие как болезнь внутреннего уха и потеря слуха), болезнь Бехчета, синдром Рейно, трансплантацию органов и аутоиммунные эндокринные нарушения (например, такие как связанные с диабетом аутоиммунные заболевания, такие как инсулин-зависимый сахарный диабет (IDDM), болезнь Аддисона и аутоиммунное заболевание щитовидной железы (например, болезнь Грэйвса и тиреоидит)). Более предпочтительные такие заболевания включают, например, ревматоидный артрит, язвенный колит, ANCA-ассоциированный васкулит, волчанку, рассеянный склероз, синдром Шегрена, болезнь Грэйвса, IDDM, пернициозную анемию, тиреоидит и гломерулонефрит.

Конкретные примеры других аутоиммунных заболеваний, как определено в настоящем документе, которые в некоторых случаях охватывают заболевания, приведенные выше, включают, но не ограничиваются ими, артрит (острый и хронический, ревматоидный артрит, включая ревматоидный артрит с ювенильным началом и стадии артрита, такие как ревматоидный синовит, артрит при подагре или подагрический артрит, острый иммунологический артрит, хронический воспалительный артрит, дегенеративный артрит, индуцированный коллагеном типа II артрит, инфекционный артрит, артрит Лайма, пролиферативный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла, артрит позвоночника, остеоартрит, хронический проградиентный артрит, деформирующий артрит, первичный хронический полиартрит, реактивный артрит, связанный с менопаузой артрит, связанный с истощением эстрогенов артрит и анкилозирующий спондилит/ревматоидный спондилит), аутоиммунное лимфопролиферативное заболевание, воспалительные гиперпролиферативные заболевания кожи, псориаз, такой как бляшковый псориаз, каплевидный псориаз, пустулезный псориаз, и псориаз ногтей, атопию, включая атопические заболевания, такие как сенная лихорадка и синдром Джоба, дерматит, включая контактный дерматит, хронический контактный дерматит, эксфолиативный дерматит, аллергический дерматит, аллергический контактный дерматит, уртикарию, герпетиформный дерматит, монетовидный дерматит, себорейный дерматит, неспецифический дерматит, первичный раздражающий контактный дерматит и атопический дерматит, x-сцепленный гипер-IgM синдром, аллергические внутриглазные воспалительные заболевания, крапивницу, такую как хроническая аллергическая крапивница и хроническая идиопатическая крапивница, включая хроническую аутоиммунную крапивницу, полимиозит/дерматомиозит, ювенильный дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз, склеродермию (в том числе системную склеродермию), склероз, такой как системная склеродермия, рассеянный склероз (MS), такой как спино-оптический MS, первично-прогрессирующий MS (PPMS) и ремитирующий MS (RRMS), прогрессирующая системная склеродермия, атеросклероз, артериосклероз, множественный склероз и атаксический склероз, оптический миелоневрит (NMO), воспалительное заболевание кишечника (IBD) (например, болезнь Крона, опосредуемые иммунной системой заболевания желудочно-кишечного тракта, воспаление желудочно-кишечного тракта, колит, такой как язвенный колит, colitis ulcerosa, микроскопический колит, коллагенозный колит, полипозный колит, некротизирующий энтероколит и трансмуральный колит, и аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника), воспаление кишечника, гангренозную пиодермию, узловатую эритему, первичный склерозирующий холангит, респираторный дистресс-синдром, в том числе респираторный дистресс-синдром у взрослых или острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), менингит, воспаление всей или части сосудистой оболочки глаза, воспаление радужной оболочки глаза, хориоидит, аутоиммунное гематологическое нарушение, реакцию "трансплантат против хозяина", ангионевротический отек, такой как наследственный ангионевротический отек, повреждение черепно-мозговых нервов, например, при менингите, герпес беременных, пемфигоид беременных, зуд мошонки, аутоиммунное преждевременное нарушение овуляции, внезапную потерю слуха вследствие аутоиммунного состояние, опосредуемые IgE заболевания, такие как анафилаксия и аллергический и атопический ринит, энцефалит, такой как энцефалит Расмуссена и лимбический энцефалит или энцефалит ствола головного мозга, увеит, такой как передний увеит, острый передний увеит, гранулематозный увеит, негранулематозный аутоиммунный увеит, гломерулонефрит (GN) с нефротическим синдромом и без него, такой как острый или хронический гломерулонефрит, такой как первичный GN, опосредуемый иммунной системой GN, мембранозный GN (мембранозная нефропатия), идиопатический мембранозный GN или идиопатическая мембранозная нефропатия, мембранный или мембранозно-пролиферативный GN (MPGN), в том числе тип I и тип II, и быстро прогрессирующий GN, пролиферативный нефрит, аутоиммунную множественную недостаточность эндокринных желез, баланит, включая ограниченный плазмоклеточный баланит, баланопостсит, кольцевидную эритему, стойкую дисхромическую эритему, полиморфную эритему, кольцевую гранулему, блестящий лишай, склеротический и атрофический лишай, простой хронический лишай, шиловидный лишай, плоский лишай, ламеллярный ихтиоз, эпидермолитический гиперкератоз, предзлокачественный кератоз, гангренозную пиодермию, аллергические состояния и ответы, пищевую аллергию, аллергию на лекарственные средства, аллергию на насекомых, редкие аллергические нарушения, такие как мастоцитоз, аллергическую реакцию, экзему, включая аллергическую или атопическую экзему, астеатозную экзему, дисгидратическую экзему и везикулярную ладонно-подошвенную экзему, астму, такую как asthma bronchiale, бронхиальная астма и аутоиммунная астма, состояния, в которые вовлечена инфильтрация T-клеток и хронический воспалительный ответ, иммунные реакции против чужеродных антигенов, таких как фетальные группы крови A-B-O в процессе беременности, хроническое воспалительное заболевание легких, аутоиммунный миокардит, нарушение адгезии лейкоцитов, волчанку, включая волчаночный нефрит, волчаночный церебрит, детскую волчанку, непочечную волчанку, внепочечную волчанку, дискоидную волчанку или дискоидную красную волчанку, волчанку с алопецией, SLE, такую как кожная SLE или подострая кожная SLE, неонатальный волчаночный синдром (NLE), диссеминированную красную волчанку, волчанку, ювенильный сахарный диабет (I типа), в том числе детский IDDM, взрослый сахарный диабет (II типа), аутоиммунный диабет, идиопатический несахарный диабет, диабетическую ретинопатию, диабетическую нефропатию, диабетический колит, диабетическое нарушение крупных артерий, иммунный ответ, ассоциированный с острой и замедленной гиперчувствительностью, опосредуемой цитокинами и T-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, гранулематоз, в том числе лимфоматоидный гранулематоз, агранулоцитоз, васкулит (включая васкулит крупных сосудов, такой как ревматическая полимиалгия и гигантоклеточный артериит (Такаясу), васкулит сосудов среднего калибра, такой как болезнь Кавасаки и узелковый периартериит, иммуноваскулит, васкулит в ЦНС, кожный васкулит, васкулит при гиперчувствительности, некротизирующий васкулит, такой как фибриноидный некротизирующий васкулит и системный некротизирующий васкулит, и ANCA-ассоциированный васкулит, такой как синдром Черджа-Стросс (CSS), гранулематоз Вегенера и микроскопический полиангиит), височный артериит, апластическую анемию, аутоиммунную апластическую анемию, Кумбс-положительную анемию, анемию Диамонда-Блэкфана, гемолитическую анемию или иммунную гемолитическую анемию, в том числе аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), пернициозную анемию (anemia perniciosa), болезнь Аддисона, истинную эритроцитарную анемию или аплазию (PRCA), дефицит фактора VIII, гемофилию A, аутоиммунную нейтропению, цитопении, такие как панцитопения, лейкопени, заболевания, в которые вовлечен диапедез лейкоцитов, воспалительные нарушения в ЦНС, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, синдром множественного поражения органов, такой как вторичные синдромы при септицемии, травме или геморрагии, заболевания, опосредуемые комплексами антиген-антитело, заболевание, связанное с антителами против клубочковой базальной мембраны, антифосфолипидный синдром, неврит двигательных нейронов, аллергический неврит, болезнь/синдром Бехчета, синдром Кастельмана, синдром Гудпасчера, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, пемфигоид или пемфигус, такой как буллезный пемфигоид, рубцовый пемфигоид (пемфигоид слизистых оболочек), кожный пемфигоид, обыкновенный пемфигус, паранеопластический пемфигус, листовидный пемфигус, пемфигус слизистой оболочки и эритематозный пемфигус, приобретенный буллезный эпидермолиз, воспаление глаза, предпочтительно аллергическое воспаление глаза, такое как аллергический конъюнктивит, буллезное заболевание, связанное с линейными IgA, аутоиммунное воспаление конъюнктивы, аутоиммунные полиэндокринопатии, болезнь или синдром Рейтера, термическое поверждение вследствие аутоиммунного состояния, преэклампсия, иммунокомплексное нарушение, такое как иммунокомплексный нефрит, опосредуемый антителами нефрит, нейровоспалительные нарушения, полиневропатии, хроническую невропатию, такую как IgM-полиневропатии или опосредуемая IgM невропатия, тромбоцитопению (например, такая как развивается у пациентов с инфарктом миокарда), в том числе тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (TTP), посттрансфузионную пурпуру (PTP), индуцированную гепарином тромбоцитопению и аутоиммунную или иммунноопосредуемую или тромбоцитопению, например, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), в том числе хроническую или острую ITP, склерит, такой как идиопатический кератосклерит, эписклерит, аутоиммунное заболевание яичек и яичников, в том числе аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотиреоз, гипопаратиреоз, аутоиммунные эндокринные заболевания, в том числе тиреоидит, такой как аутоиммунный тиреоидит, болезнь Хашимото, или подострый тиреоидит (тиреоидит Хашимото) или подострый тириоидит, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, идиопатический гипотиреоз, болезнь Грэйвса, глазная болезнь Грэйвса (офтальмопатия или ассоциированная с щитовидной железой офтальмопатия), полигландулярные синдромы, такие как аутоиммунные полигландулярные синдромы, например, типа I (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), паранеопластические синдромы, в том числе неврологические паранеопластические синдромы, такие как миастенический синдром Ламберта-Итона или синдром Итона-Ламберта, синдром мышечной скованности или "негнущегося индивида", энцефаломиелит, такой как аллергический энцефаломиелит и экспериментальный аллергический энцефаломиелит (EAE), миастению, такую как ассоциированная с тимомой миастения, церебеллярную дегенерацию, нейромиотонию, опсоклонус или опсоклонус-миоклонус синдром (OMS), и сенсорную невропатию, многоочаговую моторную невропатию, синдром Шихана, аутоиммунный гепатит, хронический гепатит, волчаночный гепатит, гигантоклеточный гепатит, хронический активный гепатит или аутоиммунный хронический активный гепатит, пневмонит, такой как лимфоидный интерстициальный пневмонит (LIP), облитерирующий бронхиолит (не зависимый от трансплантата) в противоположность NSIP, синдром Гийена-Барре, болезнь Бергера (IgA-нефропатию), идиопатическую IgA-нефропатию, линейный IgA-дерматоз, острый фебрильный нейтрофильный дерматоз, субкорнеальный пустулезный дерматоз, транзиторный акантолитический дерматоз, цирроз, такой как первичный билиарный цирроз, пневмоцирроз, синдром аутоиммунной энтеропатии, глютеиновую болезнь, целиакию, брюшные афты (глютеновую энтеропатию), рефрактерные афты, идиопатические афты, криоглобулинемию, такую как смешанная криоглобулинемия, боковой амиотрофический склероз (ALS; болезнь Лу Геринга), болезнь коронарных артерий, аутоиммунное заболевание уха, такое как аутоиммунное заболевание внутреннего уха (AIED), аутоиммунную потерю слуха, полихондрит, такой как рефрактерный или рецидивирующий полихондрит, легочно-альвеолярный протеиноз, кератит, такой как синдром Когана/несифилитический интерстициальный кератит, паралич Белла, болезнь/синдром Свита, аутоиммунные красные угри, связанная с опоясывающим лишаем боль, амилоидоз, незлокачественный лимфоцитоз, первичный лимфоцитоз, который включает моноклональный B-клеточный лимфоцитоз (например, доброкачественную моноклональную гаммапатию и моноклональную гаммапатию неясного значения, MGUS), периферическую невропатию, паранеопластический синдром, каналопатии, такие как эпилепсия, мигрень, аритмия, мышечные нарушения, глухота, слепота, пароксизмальный паралич, и каналопатии ЦНС, аутизм, воспалительную миопатию, очаговый или сегментный или очаговый сегментный гломерулосклероз (FSGS), эндокринную офтальмопатию, увеоретинит, хориоретинит, аутоиммунное гепатологическое нарушение, фибромиалгию, множественную эндокринную недостаточность, синдром Шмидта, адреналит, атрофию желудка, пресенильную деменцию, демиелинизирующие заболевания, такие как аутоиммунные демиелинизирующие заболевания и хроническая демиелинизирующая полиневропатия, синдром Дресслера, очаговую алопецию, тотальную алопецию, синдром CREST (кальциноз, синдром Рейно, нарушение моторики пищевода, склеродактилия и телеангиэктазия), мужское и женское аутоиммунное бесплодие, например, вследствие антител против спарматозоидов, смешанное заболевание соединительной ткани, болезнь Чагаса, ревматическую атаку, повторяющийся выкидыш, альвеолит у сельскохозяйственных рабочих, полиформную эритему, посткардиотомический синдром, синдром Кушинга, легочную аллергию птицеловов, аллергический гранулематозный ангиит, доброкачественный лимфоцитарный ангиит, синдром Альпорта, альвеолит, такой как аллергический альвеолит и фиброзный альвеолит, интерстициальное заболевание легкого, трансфузионную реакцию, лепру, малярию, паразитарные заболевания, такие как лейшманиоз, кипаносомиоз, шистосомоз, аскариоз, аспергиллез, синдром Самптера, синдром Каплана, денге, эндокардит, эндомиокардиальный фиброз, диффузный интерстициальный фиброз легких, интерстициальный фиброз легких, фиброзирующий медиастинит, фиброз легких, идиопатический фиброз легких, кистозный фиброз, эндофтальмит, возвышенную стойкую эритему, гемолитическую болезнь новорожденных, эозинофильный фасциит, синдром Шульмана, синдром Фелти, филариоз, циклит, такой как хронический циклит, гетерохронический циклит, иридоциклит (острый или хронический), или циклит Фукса, пурпуру Геноха-Шенлейна, инфекцию вирусом иммунодефицита человека (HIV), SCID, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), инфекцию эховирусом, сепсис (синдром системного воспалительного ответа (SIRS)), эндотоксемию, панкреатит, тироксикоз, инфекцию парвовирусом, инфекцию вирусом краснухи, поствакцинальный синдром, врожденную инфекцию вирусом краснухи, инфекцию вирусом Эпштейна-Барр, паротит, синдром Эванса, аутоиммунную недостаточность половых желез, хорею Сиденгама, постстрептококковый нефрит, облитерирующий тромбоангиит, тиреотоксикоз, сухотку спинного мозга, хориоидит, гигантоклеточную полимиалгию, хронический пневмонит с гиперчувствительностью, конъюнктивит, такой как весенний катар, сухой кератоконъюнктивит и эпидемический кератоконъюнктивит, идиопатический нефритический синдром, нефропатию с минимальными изменениями, повреждение доброкачественное семейное и при ишемии-реперфузии, реперфузию трансплантированного органа, аутоиммунную реакцию в сетчатке, воспаление сустава, бронхит, хроническое обструктивное заболевание воздушных путей/легких, силикоз, афты, афтозный стоматит, артериосклеротические нарушения (сосудистую недостаточность головного мозга), такие как артериосклеротическая энцефалопатия и артериосклеротическая ретинопатия, асперматогенез, аутоиммунный гемолиз, болезнь Бека, криоглобулинемию, контрактура Дюпюитрена, факоанафилактический эндофтальмит, аллергический энтерит, узловатую лепрозную эритему, идиопатический паралич лицевого нерва, синдром хронической усталости, ревматическую лихорадку, болезнь Хеммена-Рича, сенсоневральную потерю слуха, пароксизмальную гемоглобинурию, гипогонадизм, регионарный илеит, лейкопению, инфекционный мононуклеоз, поперечный миелит, первичную идиопатическую микседему, нефроз, ophtalmia symphatica (симпатическую офтальмию), офтальмию новорожденных, оптический неврит, гранулематозный орхит, панкреатит, острый полирадикулит, гангренозную пиодермию, тиреоидит Кервена, приобретенную атрофию селезенки, незлокачественную лимфому, лимфофолликулярный тимус, витилиго, синдром токсического шока, пищевое отравление, состояния, вовлекающие инфильтрацию T-клеток, дефицит адгезии лейкоцитов, иммунные ответы, ассоциированные с острой и замедленной гиперчувствительностью, опосредуемой цитокинами и T-лимфоцитами, заболевания вовлекающие диапедез лейкоцитов, синдром полиорганного поражения, опосредуемые комплексами антиген-антитело заболевания, заболевания, направленные против мембраны клубочков, аутоиммунные полиневропатии, оофорит, первичную микседему, аутоиммунный атрофический гастрит, ревматические заболевания, смешанное заболевание соединительной ткани, нефротический синдром, инсулит, полиэндокринную недостаточность, аутоиммунные полигландулярные синдромы, включая аутоиммунный полигландулярный синдром I типа, идиопатический гипопаратиреоз взрослых (AOIH), кардиомиопатию с дилятацией, приобретенный буллезный эпидермолиз (EBA), гемохромацитоз, миокардит, нефротический синдром, первичный склерозирующий холангит, гнойный или негнойный синусит, острый или хронический синусит, синсут решетчатой кости, лобной кости, верхней челюсти или клиновидной кости, связанное с эозинофилами нарушение, такое как эозинофилия, эозинофилия с инфильтрацией в легкие, синдром эозинофилии-миалгии, синдром Леффлера, хроническую эозинофильную пневмонию, тропическую легочную эозинофилию, бронхолегочный аспергиллез, аспергиллому, или содержащие эозинофилы гранулемы, анафилаксию, серонегативный спондилоартрит, полиэндокринное аутоиммунное заболевание, склерозирующий холангит, хронический кожно-слизистый кандидоз склеры и эписклеры, синдром Брутона, транзиторную гаммаглобулинемию новорожденных, синдром Вискотта-Олдрича, атаксию-телеангиэктазию, аутоиммунные нарушения, ассоциированные с коллагеновыми заболеваниями, ревматизм, такой как хронический артроревматизм, лимфаденит, снижение ответа кровяного давления, сосудистую дисфункцию, тканевое повреждение, сердечно-сосудистую ишемию, гипералгезию, церебральную ишемию и заболевание, сопровождающее васкуляризацию, аллергические нарушения, связанные с гиперчувствительностью, гломерулонефрит, ишемическое реперфузионное нарушение, реперфузионное повреждение миокарда и других тканей, лимфоматозный трахеобронхит, воспалительный дерматоз, дерматоз с острыми воспалительными компонентами, полиорганную недостаточность, буллезные заболевания, кортикальный некроз почек, острый гнойный менингит или другие воспалительные нарушения центральной нервной системы, глазные и орбитальные воспалительные нарушения, синдромы, ассоциированные с трансфузией гранулоцитов, индуцированную цитокинами токсичность, нарколепсию, острое тяжелое воспаление, пиелит, эндартериальную гиперплазию, язву желудка, вальвулит и эндометриоз. В настоящем документе предусматриваются, что такие заболевания можно лечить путем введения антитела, направленного против маркера B-клеточной поверхности, такого как CD79b, и оно включает введение неконъюгированного ("голого") антитела или антитела, конъюгированного с цитотоксическим средством, как описано в настоящем документе. Также в настоящем документе предусматривается, что такие заболевания можно лечить комбинированной терапией, включающей антитело против CD79b или конъюгат антитела против CD79b с лекарственным средством по изобретению в сочетании с другим антителом или конъюгатом антитела и лекарственного средства, другим цитотоксическим средством, лучевой терапией или другим способом лечения, проводимым одновременно или последовательно.

"Проведение лечения" или "лечение" или "смягчение течения" относится как к терапевтическим, так и к профилактическим или превентивным мерам, где целью является предотвратить или замедлить (уменьшить) намеченное патологическое состояние или нарушение. Индивиды, нуждающиеся в лечении, включают индивидов, уже имеющих нарушение, а также индивидов, имеющих предрасположенность к нарушению, или индивидов у которых нарушение подлежит профилактике. Индивида или млекопитающее успешно "лечат" от экспрессирующей полипептид CD79b злокачественной опухоли, если после получения терапевтического количества антитела против CD79b способами по настоящему изобретению, у пациента наблюдают заметное и/или поддающееся измерению снижение или отсутствие одного или нескольких из следующих: снижение количества злокачественных клеток или отсутствие злокачественных клеток; снижение размера опухоли; ингибирование (т.е., замедление до некоторой степени и предпочтительно остановка) инфильтрации злокачественных клеток в периферические органы, включая распространение злокачественной опухоли в мягкую ткань и кость; ингибирование (т.е., замедление до некоторой степени и предпочтительно остановка) метастазирования опухолей; ингибирование, до некоторой степени, роста опухоли; и/или смягчение, до некоторой степени, одного или нескольких симптомов, ассоциированных с конкретной злокачественной опухолью; снижение заболеваемости или смертности, и улучшение качества жизни. В зависимости от того, может ли антитело против CD79b предотвращать рост и/или уничтожать существующие злокачественные клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Снижение этих признаков или симптомов также может ощущаться пациентом.

Указанные выше параметры для оценки успешного лечения и улучшения заболевания легко определять общепринятыми способами, известными терапевту. Для терапии злокачественной опухоли, эффективность можно определять, например, посредством оценки времени до прогрессирования заболевания (TTP) и/или определения скорости ответа (RR). Метастазирование можно определять посредством определения стадии заболевания и посредством сканирования костей и тестов уровня кальция и других ферментов для определения распространения в кость. Также для поиска распространения в таз и лимфатические узлы в данной области можно получать CT-изображения. Рентгенографию грудной клетки и измерение уровней ферментов печени известными способами используют для поиска метастазов в легкие и печень, соответственно. Другие общепринятые способы мониторинга заболевания включают трансректальную ультразвуковую эхографию (TRUS) и трансректальную пункционную биопсию (TRNB).

Для рака мочевого пузыря, который представляет собой более локализованную злокачественную опухоль, способы определения прогрессирования заболевания включают цитологическую оценку мочи цистоскопией, мониторинг наличия крови в моче, визуализацию уротелиального тракта с помощью ультразвукового исследования или внутривенную пиелографию, компьютерную томографию (CT) и магнитно-резонансную томографию (MRI). Наличие отдаленных метастазов можно оценивать посредством CT живота, рентгенографии грудной клетки или радионуклидной визуализации скелета.

"Длительное" введение относится к введению средства(средств) постоянно в противоположность кратковременному режиму, чтобы поддерживать исходный терапевтический эффект (активность) в течение длительного периода времени. "Прерывающееся" введение представляет собой лечение, которое не проводится без прерывания, а вместо этого является циклическим.

"Индивид" представляет собой позвоночное. В определенных вариантах осуществления, позвоночным является млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, сельскохозяйственных животных (таких как коровы), спортивных животных, домашних животных (таких как кошки, собаки и лошади), приматов, мышей и крыс. В определенных вариантах осуществления, млекопитающим является человек.

"Млекопитающее" для целей лечения, смягчения симптомов злокачественной опухоли относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, и животных зоопарков, спортивных животных, или домашних животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы, свиньи, кролики и т.д. Предпочтительно, млекопитающее представляет собой человека.

Введение "в сочетании с" одним или несколькими дополнительными лекарственными средствами включает одновременное (совместное) и последовательное введение в любом порядке.

Как используют в настоящем документе, "носители" включают фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для клетки или млекопитающего, подвергаемых их воздействию, в используемых дозировках и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный pH-буферный раствор. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфат, цитрат, и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные (менее чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; спирты сахаров, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN®, полиэтиленгликоль (PEG) или PLURONICS®.

Под "твердой фазой" или "твердой подложкой" подразумевают неводную матрицу, на которую антитело против CD79b может прикрепляться или связываться. Примеры твердой фазы, охватываемые в настоящем документе, включают твердую фазу, образованную частично или полностью из стекла (например, стекла с контролируемым размером пор), полисахаридов (например, агарозы), полиакриламидов, полистирола, поливинилового спирта и силиконов. В определенных вариантах осуществления, в зависимости от контекста, твердая фаза может включать лунку планшета для анализа; в других вариантах осуществления, она представляет собой колонку для очистки (например, колонку для аффинной хроматографии). Также этот термин включает дисперсную твердую фазу из дискретных частиц, такую как твердая фаза, описанная в патенте США No. 4275149.

"Липосома" представляет собой небольшую везикулу, состоящую из различных типов липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, которые пригодны для доставки лекарственного средства (такого как антитело против CD79b) млекопитающему. Компоненты липосомы обычно образуют двухслойную структуру, сходную с размещением липидов биологических мембран.

"Низкомолекулярное" соединение или "низкомолекулярное" органическое соединение, как определено в настоящем документе, имеет молекулярную массу менее чем приблизительно 500 Дальтон.

"Индивид", "субъект" или "пациент" представляет собой позвоночное. В определенных вариантах осуществления, позвоночное представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, сельскохозяйственных животных (таких как коровы), спортивных животных, домашних животных (таких как кошки, собаки и лошади), приматов, мышей и крыс. В определенных вариантах осуществления, млекопитающим является человек.

Термин "фармацевтический состав" относится к препарату, который имеет такую форму, чтобы обеспечить эффективность биологической активности активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для индивида, которому состав будут вводить. Такой состав может быть стерильным.

"Стерильный" состав является асептическим или не содержит живых микроорганизмов и их спор.

"Эффективное количество" антитела, описанного в настоящем документе, представляет собой количество, достаточное для осуществления конкретной поставленной цели. "Эффективное количество" можно определять эмпирически и общепринятыми способами, в зависимости от поставленной цели.

Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству антитела или другого лекарственного средства, эффективному для "лечения" заболевания или нарушения у индивида или млекопитающего. В случае злокачественной опухоли, терапевтически эффективное количество лекарственного средства может снижать количество злокачественных клеток; уменьшать размер опухоли; ингибировать (т.е., замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) инфильтрацию злокачественных клеток в периферические органы; ингибировать (т.е., замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или смягчать до некоторой степени один или несколько симптомов, ассоциированных со злокачественной опухолью. См. определение "лечения" в настоящем документе. В зависимости от того, может ли лекарственное средство препятствовать росту и/или уничтожать существующие злокачественные клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному, в необходимых дозировках и в течение необходимых периодов времени, для достижения требуемого профилактического результата. Как правило, но не обязательно, поскольку профилактическую дозу используют у индивидов до заболевания или на его ранних стадиях, профилактически эффективное количество будет меньшим, чем терапевтически эффективное количество.

"Ингибирующее рост количество" антитела против CD79b представляет собой количество, способное ингибировать рост клетки, особенно опухолевой, например, злокачественной клетки, либо in vitro, либо in vivo. "Ингибирующее рост количество" антитела против CD79b для целей ингибирования неопластического клеточного роста можно определять эмпирически и общепринятыми способами.

"Цитотоксическое количество" антитела против CD79b представляет собой количество, способное вызывать разрушение клетки, особенно опухолевой, например, злокачественной клетки, либо in vitro, либо in vivo. "Цитотоксическое количество" антитела против CD79b для целей ингибирования неопластического роста клеток можно определять эмпирически и общепринятыми способами.

"Экспрессирующая CD79b клетка" представляет собой клетку, которая экспрессирует эндогенный или трансфицированный полипептид CD79b либо на клеточной поверхности, либо в секретируемой форме. "Экспрессирующая CD79b злокачественная опухоль" представляет собой злокачественную опухоль, содержащую клетки, которые имеют полипептид CD79b, представленный на клеточной поверхности, или которые продуцируют и секретируют полипептид CD79b. "Экспрессирующая CD79b злокачественная опухоль" необязательно продуцирует достаточные уровни полипептида CD79b на поверхности ее клеток, чтобы антитело против CD79b могло связаться с ним и оказывать терапевтический эффект в отношении злокачественной опухоли. В другом варианте осуществления, "экспрессирующая CD79b злокачественная опухоль" необязательно продуцирует и секретирует достаточные уровни полипептида CD79b, так чтобы антитело-антагонист против CD79b могло связываться с ним и иметь терапевтический эффект в отношении злокачественной опухоли. В отношении последнего, антагонист может представлять собой антисмысловой олигонуклеотид, который снижает, ингибирует или предотвращает продукцию и секрецию секретируемого полипептида CD79b опухолевыми клетками. Злокачественная опухоль, которая "сверхэкспрессирует" полипептид CD79b представляет собой опухоль, которая имеет, или продуцирует и секретирует, значительно более высокие уровни полипептида CD79b на своей клеточной поверхности, по сравнению с незлокачественной клеткой ткани того же типа. Такая сверхэкспрессия может быть вызвана амплификацией гена или повышенной транскрипцией или трансляцией. Сверхэкспрессию полипептида CD79b можно определять в анализе для детекции или прогноза путем оценки повышенных уровней белка CD79b, присутствующего на поверхности клетки, или секретируемого клеткой (например, с помощью иммуногистохимического анализа с использованием антител против CD79b, полученных против выделенного полипептида CD79b, который можно получать с использованием технологии рекомбинантных ДНК из выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CD79b; анализа FACS и т.д.). Альтернативно или дополнительно, можно измерять уровни кодирующей полипептид CD79b нуклеиновой кислоты или мРНК в клетке, например, посредством флуоресцентной гибридизации in situ с использованием зонда на основе нуклеиновой кислоты, соответствующего кодирующей CD79b нуклеиновой кислоте или комплементарной ей последовательности; (FISH; см. WO98/45479, опубликованную в октябре 1998 года), Саузерн-блоттинг, Нозерн-блоттинг или способы полимеразной цепной реакции (ПЦР), такие как количественная ПЦР с детекцией в реальном времени (RT-PCR). Также можно исследовать сверхэкспрессию полипептида CD79b путем измерения отделяющегося от клетки антигена в биологической жидкости, такой как сыворотка, например, с использованием анализов на основе антител (также см., например, патент США No. 4933294, выданный 12 июня 1990 года; WO91/05264, опубликованную 18 апреля 1991 года; патент США 5401638, выданный 28 марта 1995 года; и Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Помимо указанных выше анализов, специалисту в данной области доступны различные анализы in vivo. Например, можно воздействовать на клетки в организме пациента антителом, которое необязательно является меченным поддающейся детекции меткой, например, радиоактивным изотопом, и можно оценивать связывание антитела с клетками пациента, например, путем внешнего сканирования на радиоактивность или путем анализа биоптата, взятого у пациента, на которого ранее воздействовали антителом.

Как используют в настоящем документе, термин "иммуноадгезин" означает подобные антителу молекулы, которые сочетают специфичность связывания гетерологичного белка ("адгезин") с эффекторными функциями константных доменов иммуноглобулинов. Структурно иммуноадгезины содержат аминокислотную последовательность с требуемой специфичностью связывания, отличающуюся от участка распознавания антигена и участка связывания антитела (т.е., являющуюся "гетерологичной"), слитую с последовательностью константного домена иммуноглобулина. Часть адгезина в молекуле иммуноадгезина, как правило, представляет собой непрерывную аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере участок связывания рецептора или лиганда. Последовательность константного домена иммуноглобулина в иммуноадгезине может быть получена из любого иммуноглобулина, такого как изотипы IgG-1, IgG-2, IgG-3 или IgG-4, IgA (включая IgA-1 и IgA-2), IgE, IgD или IgM.

Слово "метка", при использовании в настоящем документе, относится к поддающемуся детекции соединению или композиции, которые конъюгированы прямо или непрямо с антителом, с образованием "меченого" антитела. Метка сама может быть поддающейся детекции (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментной метки, она может катализировать химическое изменение соединения или композиции субстрата, которые поддаются детекции.

Термин "цитотоксическое средство", как используют в настоящем документе, относится к веществу, которое ингибирует функционирование клеток, или препятствует ему, и/или вызывает разрушение клеток. Подразумевают, что термин включает радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства, например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие вещества, ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты, антибиотики и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые средства или средства против злокачественной опухоли, как описано ниже. Другие цитотоксические средства описаны ниже. Уничтожающее опухолевые клетки средство вызывает разрушение опухолевых клеток.

"Токсин" представляет собой любое вещество, способное оказывать вредный эффект на рост или пролиферацию клетки.

"Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, полезное при лечении злокачественной опухоли, независимо от механизма его действия. Классы химиотерапевтических средств включают, но не ограничиваются ими: алкилирующие средства, антиметаболиты, ядовитые для веретена деления алкалоиды растений, цитотоксические/противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомеразы, антитела, фотосенсибилизаторы и ингибиторы киназ. Химиотерапевтические средства включают соединения, используемые в "направленной терапии" и в общепринятой химиотерапии. Примеры химиотерапевтических средств включают: эрлотиниб (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), доцетаксел (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (фторурацил, 5-фторурацил, CAS No. 51-21-8), гемцитабин (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS No. 391210-10-9, Pfizer), цисплатин (цис-диамин,дихлорплатина(II), CAS No. 15663-27-1), карбоплатин (CAS No. 41575-94-4), паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), трастузумаб (HERCEPTIN®, Genentech), темозоломид (4-метил-5-оксо-2,3,4,6,8-пентазабицикло[4.3.0]нона-2,7,9-триен-9-карбоксамид, CAS No. 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), тамоксифен ((Z)-2-[4-(1,2-дифенилбут-1-енил)фенокси]-N,N-диметилэтанамин, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), и доксорубицин (ADRIAMYCIN®), Akti-1/2, HPPD и рапамицин.

Другие примеры химиотерапевтических средств включают: оксалиплатин (ELOXATIN®, Sanofi), бортезомиб (VELCADE®, Millennium Pharm.), сутент (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), летрозол (FEMARA®, Novartis), иматиниба мезилат (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (ингибитор Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (ингибитор Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (ингибитор PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (ингибитор PI3K, Novartis), XL-147 (ингибитор PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), фулвестрант (FASLODEX®, AstraZeneca), лейковорин (фолиновая кислота), рапамицин (сиролимус, RAPAMUNE®, Wyeth), лапатиниб (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), лонафарниб (SARASARTM, SCH 66336, Schering Plough), сорафениб (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), гефитиниб (IRESSA®, AstraZeneca), иринотекан (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), типифарниб (ZARNESTRATM, Johnson & Johnson), ABRAXANETM (не содержащий кремофора), сконструированный с альбумином состав паклитаксела в виде наночастиц (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), вандетаниб (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), хлорамбуцил, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), темсиролимус (TORISEL®, Wyeth), пазопаниб (GlaxoSmithKline), канфосфамид (TELCYTA®, Telik), тиотепу и циклофосфамид (CYTOXANE®, NEOSAR®); алкилсульфонаты, такие как бисульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги на основе адозелезина, карзелезина и бизелезина); криптофицины (в частности криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая его синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, иприт урацила; нитрозомочевину, такую как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как эндииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гамма1I и калихеамицин омегаI1 (Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, динемицин A; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также хромофор на основе неокарциностатина и сходные хромопротеиновые хромофоры на основе эндииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, cактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, декторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидинов, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренальные средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; средства для восполнения фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; эльфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангвидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепу; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин (NAVELBINE®); новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; капецитабин (XELODA®, Roche); ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из указанных выше.

Также в определение "химиотерапевтическое средство" включены: (i) антигормональные средства, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормона на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (в том числе NOLVADEX®; тамоксифена цитрат), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и FARESTON® (торемифина цитрат); (ii) ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, который регулирует продукцию эстрогена в надпочечниках, например, такие как 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, MEGASE® (магестрола ацетат), AROMASIN® (экземестан; Pfizer), форместан, фадрозол, RIVISOR® (ворозол), FEMARA® (летрозол; Novartis), и ARIМIDEX® (анастрозол; AstraZeneca); (iii) антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и гозерелин; а также троксацитабин (1,3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); (iv) ингибиторы протеинкиназ, такие как ингибиторы MEK (WO 2007/044515); (v) ингибиторы киназ липидов; (vi) антисмысловые олигонуклеотиды, в частности олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессии генов каскадов передачи сигнала, вовлеченных в измененную пролиферацию клеток, например, PKC-альфа, Raf и H-Ras, такие как облимерсен (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) рибозимы, такие как ингибиторы экспрессии VEGF (например, ANGIOZYME®) и ингибиторы экспрессии HER2; (viii) вакцины, такие как вакцины для генной терапии, например, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® и VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; ингибиторы топоизомеразы 1, такие как LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) антиангиогенные средства, такие как бевацизумаб (AVASTIN®, Genentech); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из указанных выше.

Также в определение "химиотерапевтическое средство" включены антитела, такие как алемтузумаб (Campath), бевацизумаб (АВАСТИН®, Genentech); цетуксимаб (ERBITUX®, Imclone); панитумумаб (VECTIBIX®, Amgen), ритуксимаб (RITUXAN®, Genentech/Biogen Ideс), пертузумаб (OMNITARGTM, 2C4, Genentech), трастузумаб (HERCEPTIN®, Genentech), тозитумомаб (Bexxar, Corixia), и конъюгат антитела и лекарственного средства, гемтузумаб озогамицин (MYLOTARG®, Wyeth).

"Ингибирующее рост средство", при применении в настоящем документе, относится к соединению или композиции, которые ингибируют рост клетки, особенно экспрессирующей CD79b злокачественной клетки, либо in vitro, либо in vivo. Таким образом, ингибирующее рост средство может представлять собой средство, которое значительно снижает процентное количество экспрессирующих CD79b клеток в S-фазе. Примеры ингибирующих рост средств включают средства, которые блокируют прогрессирование клеточного цикла (в месте, отличном от S-фазы), такие как средства, которые индуцируют остановку в G1-фазе и остановку в M-фазе. Классические блокаторы M-фазы включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Те средства, которые вызывают остановку в G1-фазе, также вовлекают остановку в S-фазе, например, алкилирующие ДНК средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дополнительную информацию можно найти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) представляют собой лекарственные средства против злокачественной опухоли, полученные из тисового дерева. Доцетаксел (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), полученный из тиса европейского, представляет собой полусинтетический аналог паклитаксела (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел обеспечивают сборку микротрубочек из димеров тубулина и стабилизируют микротрубочки, препятствуя деполимеризации, что приводит к ингибированию митоза в клетках.

"Доксорубицин" представляет собой антрациклиновый антибиотик. Полное химическое название доксорубицина представляет собой (8S-цис)-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-α-L-ликсогексапиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион.

Термин "цитокин" является общим термином для белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, которые воздействуют на другую клетку в качестве межклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. Цитокины включают гормоны роста, такие как гормон роста человека, гормон роста человека с N-метионилом и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреоидстимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); печеночный фактор роста; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухолей-α и -β; ингибирующее вещество Мюллера; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; ингибин; активин; сосудисто-эндотелиальный фактор роста; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов, такие как NGF-β; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α и TGF-β; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (CSF), такие как макрофагальный CSF (M-CSF); гранулоцитарно-макрофагальный CSF (GM-CSF); и гранулоцитарный CSF (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; фактор некроза опухолей, такой как TNF-α или TNF-β; и другие полипептидные факторы, в том числе LIF и kit-лиганд (KL). Как используют в настоящем документе, термин цитокин включает белки из природных источников или из рекомбинантных клеточных культур и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

Термин "вкладыш в упаковку" используют для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях, и/или предупреждения, касающиеся применения таких терапевтических продуктов.

Термин "внутриклеточный метаболит" относится к соединению, образующемуся при метаболическом процессе или реакции конъюгата антитело-лекарственное средство внутри клетки (ADC). Метаболический процесс или реакция может представлять собой ферментативный процесс, такой как протеолитическое расщепление пептидного линкера в ADC, или гидролиз функциональной группы, такой как гидразон, сложный эфир или амид. Внутриклеточные метаболиты включают, но не ограничиваются ими, антитела и свободное лекарственное средство, которое претерпели внутриклеточное расщепление после проникновения, диффузии, захвата или транспорта в клетку.

Термины "внутриклеточно расщепленный" и "внутриклеточное расщепление" относятся к метаболическому процессу или реакции внутри клетки на конъюгате антитело-лекарственное средство (ADC), посредством которого разрушается ковалентная связь, т.е. линкер, между группой лекарственного средства (D) и антителом (Ab), вызывая диссоциацию свободного лекарственного средства от антитела внутри клетки. Расщепленные группы ADC, таким образом, являются внутриклеточными метаболитами.

Термин "биодоступность" относится к системной доступности (т.е., уровням в крови/плазме) данного количества лекарственного средства, введенного пациенту. Биодоступность представляет собой абсолютный показатель для введенной дозированной формы, который указывает на меру как времени (скорости), так и общего колиества (степени) лекарственного средства, которое достигает

общего кровотока.

Термин "цитотоксическая активность" относится к эффекту уничтожения клеток, цитостатическому или ингибирующему рост эффекту ADC или внутриклеточного метаболита ADC. Цитотоксическая активность может быть выражена в качестве значения IC50, которое представляет собой концентрацию (молярную или массовую) на единицу объема, при которых выживает половина клеток.

Термин "алкил", как используют в настоящем документе, относится к насыщенному линейному или разветвленному одновалентному углеводородному радикалу из одного до двенадцати атомов углерода (C1-C12), где алкильный радикал необязательно может быть замещен независимо одним или несколькими заместителями, описанными ниже. В другом варианте осуществления, алкильный радикал имеет от одного до восьми атомов углерода (C1-C8), или от одного до шести атомов углерода (C1-C6). Примеры алкильных групп включают, но не ограничиваются ими, метил (Me, -CH3), этил (Et, -CH2CH3), 1-пропил (n-Pr, н-пропил, -CH2CH2CH3), 2-пропил (i-Pr, изопропил, -CH(CH3)2), 1-бутил (n-Bu, н-бутил, -CH2CH2CH2CH3), 2-метил-1-пропил (i-Bu, изобутил, -CH2CH(CH3)2), 2-бутил (s-Bu, втор-бутил, -CH(CH3)CH2CH3), 2-метил-2-пропил (t-Bu, трет-бутил, -C(CH3)3), 1-пентил (н-пентил, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-пентил (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-пентил (-CH(CH2CH3)2), 2-метил-2-бутил (-C(CH3)2CH2CH3), 3-метил-2-бутил (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-метил-1-бутил (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-метил-1-бутил (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-гексил (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-гексил (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-гексил (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-метил-2-пентил (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-метил-2-пентил (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-метил-2-пентил (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-метил-3-пентил (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-метил-3-пентил (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-диметил-2-бутил (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-диметил-2-бутил (-CH(CH3)C(CH3)3, 1-гептил, 1-октил и т.п.

Термин "алкенил" относится к линейному или разветвленному одновалентному углеводородному радикалу из от двух до восьми атомов углерода (C2-C8) по меньшей мере с одним участком ненасыщенности, т.е., углерод-углеродной sp2-двойной связью, где алкенильный радикал необязательно может быть замещен независимо одним или несколькими заместителями, описанными в настоящем документе, и включает радикалы, имеющие "цис"- и "транс"-ориентацию, или альтернативно "E"- и "Z"-ориентацию. Примеры включают, но не ограничиваются ими, этиленил или винил (-CH=CH2), аллил (-CH2CH=CH2) и т.п.

Термин "алкинил" относится к линейному или разветвленному одновалентному углеводородному радикалу из от двух до восьми атомов углерода (C2-C8) по меньшей мере с одним участком ненасыщенности, т.е., углерод-углеродной sp-тройной связью, где алкинильный радикал необязательно может быть независимо замещен одним или несколькими заместителями, описанными в настоящем документе. Примеры включают, но не ограничиваются ими, этинил (-C≡CH), пропинил (пропаргил, -CH2C≡CH) и т.п.

Термины "карбоцикл", "карбоциклил", "карбоциклическое кольцо" и "циклоалкил" относятся к одновалентному неароматическому, насыщенному или частично ненасыщенному кольцу, имеющему от 3 до 12 атомов углерода (C3-C12) в виде моноциклического кольца, или от 7 до 12 атомов углерода в виде бициклического кольца. Бициклические карбоциклы, имеющие от 7 до 12 атомов, можно представить, например, как систему бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6], и бициклические карбоциклы, имеющие 9 или 10 атомов в кольце можно представить как систему бицикло [5,6] или [6,6], или как системы с мостиками, такие как бицикло[2.2.1]гептан, бицикло[2.2.2]октан и бицикло[3.2.2]нонан. Примеры моноциклических карбоциклов включают, но не ограничиваются ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1-енил, 1-циклопент-2-енил, 1-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-1-енил, 1-циклогекс-2-енил, 1-циклогекс-3-енил, циклогексадиенил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил, циклоундецил, циклододецил и т.п.

"Арил" означает одновалентный ароматический углеводородный радикал из 6-20 атомов углерода (C6-C20), образованный удалением одного атома водорода от одного атома углерода исходной ароматической кольцевой системы. Некоторые арильные группы представляют в иллюстративных структурах как "Ar". Арил включает бициклические радикалы, содержащие ароматическое кольцо, конденсированное с насыщенным частично ненасыщенным или ароматическим карбоциклическим кольцом. Типичные арильные группы включают, но не ограничиваются ими, радикалы, образованные из бензола (фенила), замещенных бензолов, нафталина, антрацена, бифенила, инденила, инданила, 1,2-дигидронафталина, 1,2,3,4-тетрагидронафтила и т.п. Арильные группы необязательно замещены независимо одним или несколькими заместителями, описанными в настоящем документе.

Термины "гетероцикл", "гетероциклил" и "гетероциклическое кольцо" используют в настоящем документе взаимозаменяемо и они относятся к насыщенному или частично ненасыщенному (т.е., имеющему одну или несколько двойных и/или тройных связей в кольце) карбоциклическому радикалу из от 3 до 20 атомов в кольце, в котором по меньшей мере один атом кольца представляет собой гетероатом, выбранный из азота, кислорода, фосфора и серы, а остальные атомы кольца представляют собой C, где один или несколько атомов кольца необязательно замещены независимо одним или несколькими заместителями, описанными ниже. Гетероцикл может представлять собой моноцикл, имеющий от 3 до 7 членов в кольце (от 2 до 6 атомов углерода и от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S), или бицикл, имеющий от 7 до 10 членов в кольце (от 4 до 9 атомов углерода и от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S), например: система бицикло [4,5], [5,5], [5,6], или [6,6]. Гетероциклы описаны в Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968), в частности, главы 1, 3, 4, 6, 7 и 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, с 1950 по настоящее время), в частности тома 13, 14, 16, 19, и 28; и J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. "Гетероциклил" также включает радикалы, где гетероциклические радикалы являются конденсированными с насыщенным, частично ненасыщенным кольцом или ароматическим карбоциклическим или гетероциклическим кольцом. Примеры гетероциклических колец включают, но не ограничиваются ими, пирролидинил, тетрагидрофуранил, дигидрофуранил, тетрагидротиенил, тетрагидропиранил, дигидропиранил, тетрагидротиопиранил, пиперидино, морфолино, тиоморфолино, тиоксанил, пиперазинил, гомопиперазинил, азетидинил, оксетанил, тиэтанил, гомопиперидинил, оксепанил, тиэпанил, оксазепинил, диазепинил, тиазепинил, 2-пирролинил, 3-пирролинил, индолинил, 2H-пиранил, 4H-пиранил, диоксанил, 1,3-диоксоланил, пиразолинил, дитианил, дитиоланил, дигидропиранил, дигидротиенил, дигидрофуранил, пиразолидинилимидазолинил, имидазолидинил, 3-азабицикло[3.1.0]гексанил, 3-азабицикло[4.1.0]гептанил, азабицикло[2.2.2]гексанил, 3H-индолилхинолизинил и N-пиридильные соединения мочевины. Также в объем этого определения включены спирогруппы. Примерами гетероциклической группы, где 2 атома углерода кольца замещены оксогруппами (=O), являются пиримидинонил и 1,1-диоксотиоморфолинил. Гетероциклические группы, описанные в настоящем документе, необязательно замещены независимо одним или несколькими заместителями, описанными в настоящем документе.

Термин "гетероарил" относится к одновалентному ароматическому радикалу 5-, 6- или 7-членных колец, и включает конденсированные кольцевые системы (по меньшей мере одна из которых является ароматической) из 5-20 атомов, содержащие один или несколько гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы. Примерами гетероарильных групп являются пиридинил (включая, например, 2-гидроксипиридинил), имидазолил, имидазопиридинил, пиримидинил (включая, например, 4-гидроксипиримидинил), пиразолил, триазолил, пиразинил, тетразолил, фурил, тиенил, изоксазолил, тиазолил, оксазолил, изотиазолил, пирролил, хинолинил, изохинолинил, индолил, бензимидазолил, бензофуранил, циннолинил, индазолил, индолизинил, фталазинил, пиридазинил, триазинил, изоиндолил, птеридинил, пуринил, оксадиазолил, триазолил, тиадиазолил, тиадиазолил, фуразанил, бензофуразанил, бензотиофенил, бензотиазолил, бензоксазолил, хиназолинил, хиноксалинил, нафтиридинил и фуропиридинил. Гетероарильные группы необязательно замещены независимо одним или несколькими заместителями, описанными в настоящем документе.

Гетероциклические или гетероарильные группы могут быть связанными атомами углерода (углерод-связанные), или азота (азот-связанные), когда это возможно. В качестве неограничивающего примера, связанные атомами углерода гетероциклы или гетероарилы связаны во 2, 3, 4, 5 или 6 положении пиридина, 3, 4, 5 или 6 положении пиридазина, 2, 4, 5 или 6 положении пиримидина, 2, 3, 5 или 6 положении пиразина, 2, 3, 4 или 5 положении фурана, тетрагидрофурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола, 2, 4 или 5 положении оксазола, имидазола или тиазола, 3, 4 или 5 положении изоксазола, пиразола или изотиазола, 2 или 3 положении азиридина, 2, 3 или 4 положении азетидина, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 положении хинолина или 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 положении изохинолина.

В качестве неограничивающего примера, связанные азотом гетероциклы или гетероарилы связаны в 1 положении азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина, 1H-индазола, 2 положении изоиндола или изоиндолина, 4 положении морфолина, и 9 положении карбазола или β-карболина.

"Алкилен" относится к насыщенному разветвленному или неразветвленному или циклическому углеводородному радикалу из 1-18 атомов углерода, имеющему два центра в виде одновалентных радикалов, образованные удалением двух атомов водорода с одного или с двух различных атомов углерода исходного алкана. Типичные алкиленовые радикалы включают, но не ограничиваются ими: метилен (-CH2-) 1,2-этил (-CH2CH2-), 1,3-пропил (-CH2CH2CH2-), 1,4-бутил (-CH2CH2CH2CH2-) и т.п.

"C1-C10алкилен" представляет собой неразветвленную насыщенную углеводородную группу формулы -(CH2)1-10. Примеры C1-C1Oалкилена включают метилен, этилен, пропилен, бутилен, пентилен, гексилен, гептилен, октилен, нонилен и декален.

"Алкенилен" относится к ненасыщенному разветвленному или неразветвленному или циклическому углеводородному радикалу из 2-18 атомов углерода, имеющему два центра в виде одновалентных радикалов, образованных удалением двух атомов водорода от одного или двух различных атомов углерода исходного алкена. Типичные алкениленовые радикалы включают, но не ограничиваются ими: 1,2-этилен (-CH=CH-).

"Алкинилен" относится к ненасыщенному разветвленному или неразветвленному или циклическому углеводородному радикалу из 2-18 атомов углерода, имеющему два центра в виде одновалентных радикалов, образованных удалением двух атомов водорода от одного или двух различных атомов углерода исходного алкина. Типичные алкиниленовые радикалы включают, но не ограничиваются ими: ацетилен (-C≡C-), пропаргил (-CH2C≡C-), и 4-пентинил (-CH2CH2CH2C≡C-).

"Арилен" представляет собой арильную группу, которая имеет две ковалентные связи и может находиться в орто-, мета- или пара-конфигурации, как показано на следующих структурах:

в которых фенильная группа может быть незамещенной или замещена посредством вплоть до четырех групп, включая, но не ограничиваясь ими, -C1-C8алкил, -O-(C1-C8алкил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN; где каждый R' независимо выбран из H, -C1-C8алкила и арила.

"Арилалкил" относится к ациклическому алкильному радикалу, в котором один из атомов водорода, связанных с атомом углерода, как правило, концевым или sp3-атомом углерода, замещен арильным радикалом. Типичные арилалкильные группы включают, но не ограничиваются ими, бензил, 2-фенилэтан-1-ил, 2-фенилэтен-1-ил, нафтилметил, 2-нафтилэтан-1-ил, 2-нафтилэтен-1-ил, нафтобензил, 2-нафтофенилэтан-1-ил и т.п. Арилалкильная группа содержит от 6 до 20 атомов углерода, например, алкильная группа, включая алканильную, алкенильную или алкинильную группы, арилалкильной группы имеет от 1 до 6 атомов углерода, а арильная группа имеет от 5 до 14 атомов углерода.

"Гетероарилалкил" относится к ациклическому алкильному радикалу, в котором один из атомов водорода, связанных с атомом углерода, как правило, концевым или sp3-атомом углерода, замещен гетероарильным радикалом. Типичные гетероарилалкильные группы включают, но не ограничиваются ими, 2-бензимидазолилметил, 2-фурилэтил и т.п. Гетероарилалкильная группа содержит от 6 до 20 атомов углерода, например, алкильная группа, включая алканильную, алкенильную или алкинильную группы, гетероарилалкильной группы имеет от 1 до 6 атомов углерода, а гетероарильная группа имеет от 5 до 14 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S. Гетероарильная группа гетероарилалкильной группы может представлять собой моноцикл, имеющий от 3 до 7 членов в кольце (от 2 до 6 атомов углерода) или бицикл, имеющий от 7 до 10 членов в кольце (от 4 до 9 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S), например: систему бицикло [4,5], [5,5], [5,6], или [6,6].

Термин "пролекарство", как используют в настоящей заявке, относится к форме предшественника или производного соединения по изобретению, которая может быть менее цитотоксической для клеток по сравнению с исходным соединением или лекарственном средством и может быть ферментативно или гидролитически активирована или превращена в более активную исходную форму. См., например, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) и Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Пролекарства по этому изобретению включают, но не ограничиваются ими, содержащие фосфат пролекарства, содержащие тиофосфат пролекарства, содержащие сульфат пролекарства, содержащие пептид пролекарства, пролекарства с модифицированными D-аминокислотами, гликозилированные пролекарства, содержащие β-лактам пролекарства, содержащие необязательно замещенный феноксиацетамид пролекарства, содержащие необязательно замещенный фенилацетамид пролекарства, пролекарства с 5-фторцитозином и другие пролекарства с 5-фторуридином, которые могут превращаться в более активное цитотоксическое свободное лекарственное средство. Примеры цитотоксических лекарственных средств, которые могут быть преобразованы в форму пролекарства для применения в этом изобретении, включают, но не ограничиваются ими, соединения по изобретению и химиотерапевтические средства, такие как описаны выше.

"Метаболит" представляет собой продукт, образующийся при метаболизме в организме определенного соединения или его соли. Метаболиты соединения можно идентифицировать с использованием общепринятых способов, известных в данной области, и их активность можно определять с использованием тестов, таких как тесты, описанные в настоящем документе. Такие продукты могут образовываться, например, в результате окисления, восстановления, гидролиза, амидации, дезамидации, этерификации, деэтерификации, ферментативного расщепления и т.п., введенного соединения. Таким образом, изобретение включает метаболиты соединений по изобретению, в том числе соединений, образованных путем процесса, включающего контактирование соединения по этому изобретению с млекопитающим в течение периода времени, достаточного для образования его метаболического продукта.

"Липосома" представляет собой небольшую везикулу, состоящую из различных типов липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, которые пригодны для доставки лекарственного средства млекопитающему. Компоненты липосомы обычно образуют двухслойную структуру, сходную с размещением липидов биологических мембран.

"Линкер" относится к химической группе, содержащей ковалентную связь или цепь из атомов, которые ковалентно связывают антитело с группой лекарственного средства. В различных вариантах осуществления, линкеры включают двухвалентный радикал, такой как алкилдиил, арилдиил, гетероарилдиил, группы, такие как: -(CR2)nO(CR2)n-, повторяющиеся элементы алкилокси (например, полиэтиленокси, PEG, полиметиленокси) и алкиламино (например, полиэтиленамино, JeffamineTM); и сложные эфиры и амиды двухосновных кислот, включая сукцинат, сукцинамид, дигликолят, малонат и капроамид.

Термин "хиральный" относится к молекулам, которые обладают свойством несовпадения с аналогами, являющимися их зеркальным отображением, а термин "ахиральный" относится к молекулам, которые совпадают с их аналогами, являющимися их зеркальными отображениями.

Термин "стереоизомеры" относится к соединениям, которые обладают идентичным химическим строением, но отличаются расположением атомов или групп в пространстве.

"Диастереомер" относится к стереоизомеру с двумя или более хиральными центрами, молекулы которого не являются зеркальными отображениями друг друга. Диастереомеры обладают различными физическими свойствами, например температурой плавления, температурой кипения, спектральными свойствами и реакционной способностью. Смеси диастереомеров можно разделять аналитическими способами высокого разрешения, такими как электрофорез и хроматография.

"Энантиомеры" относятся к двум стереоизомерам соединения, которые не являются совпадающими зеркальными отображениями друг друга.

Стереохимические определения и обозначения, используемые в настоящем документе, главным образом, соответствуют S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, т.е., они обладают способностью к вращению плоскости плоскополяризованного света. При описании оптически активного соединения, приставки D и L, или R и S, используют для обозначения абсолютной конфигурации молекулы в области ее хирального центра(ов). Приставки d и l или (+) и (-) используют для обозначения признака вращения плоскополяризованного света соединением, причем (-) или l означает, что соединение является левовращающим. Соединение с приставкой (+) или d является правовращающим. Для данной химической структуры эти стереоизомеры являются идентичными, за исключением того, что они являются зеркальными отображениями друг друга. Конкретный стереоизомер также может быть обозначен как энантиомер, а смесь таких изомеров часто называют энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров 50:50 называют рацемической смесью или рацематом, которая может встречаться, только когда отсутствует стереоселекция или стереоспецифичность в химической реакции или процессе. Термины "рацемическая смесь" и "рацемат" относятся к эквимолярной смеси двух энантиомерных соединений, лишенной оптической активности.

Термин "таутомер" или "таутомерная форма" относится к структурным изомерам с различной энергией, которые являются взаимопревращающимися с низким энергетическим барьером. Например, протонные таутомеры (также известные как прототропные таутомеры) включают взаимопревращения путем миграции протона, такие как кето-енольная и имин-енаминовая изомеризации. Валентные таутомеры включают взаимопревращения путем реорганизации нескольких электронов связи.

Выражение "фармацевтически приемлемая соль", как используют в настоящем документе, относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям соединения по изобретению. Иллюстративные соли включают, но не ограничиваются ими, сульфаты, цитраты, ацетаты, оксалаты, хлориды, бромиды, йодиды, нитраты, бисульфаты, фосфаты, кислые фосфаты, изоникотинаты, лактаты, салицилаты, кислые цитраты, тартраты, олеаты, таннаты, пантотенаты, битартраты, аскорбаты, сукцинаты, малеаты, гентизинаты, фумараты, глюконаты, глюкуронаты, сахараты, формиаты, бензоаты, глутаматы, метансульфонаты "мезилаты", этансульфонаты, бензолсульфонаты, п-толуолсульфонаты и памоаты (т.е., 1,1'-метилен-бис(2-гидрокси-3-нафтоат)). Фармацевтически приемлемая соль может включать другую молекулу, такую как ион ацетата, ион сукцината или другой противоион. Противоион может представлять собой любую органическую или неорганическую группу, которая стабилизирует заряд на исходном соединении. Более того, фармацевтически приемлемая соль может иметь более одного заряженного атома в ее структуре. В случаях, когда множество заряженных атомов являются частью фармацевтически приемлемой соли, может существовать множество противоионов. Таким образом, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или несколько заряженных атомов и/или один или несколько противоионов.

Если соединение по изобретению является основанием, требуемую фармацевтически приемлемую соль можно получать любым подходящим способом, доступным в данной области, например, обработкой свободного основания неорганической кислотой, такой как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, метансульфоновая кислота, фосфорная кислота и т.п., или органической кислотой, такой как уксусная кислота, трифторуксусная кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, миндальная кислота, фумаровая кислота, малоновая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, гликолевая кислота, салициловая кислота, пиранозидильная кислота, такая как глюкуроновая кислота или галактуроновая кислота, альфа-гидроксикислота, такая как лимонная кислота или виннокаменная кислота, аминокислота, такая как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, ароматическая кислота, такая как бензойная кислота или коричная кислота, сульфоновая кислота, такая как п-толуолсульфоновая кислота или этансульфоновая кислота, или сходные с ними.

Если соединение по изобретению является кислотой, требуемую фармацевтически приемлемую соль можно получать любым подходящим способом, например, обработкой свободной кислоты неорганическим или органическим основанием, таким как амин (первичный, вторичный или третичный), гидроксид щелочного металла или гидроксид щелочноземельного металла или сходные с ними. Иллюстративные примеры подходящих солей включают, но не ограничиваются ими, органические соли, образованные из аминокислот, таких как глицин и аргинин, аммиака, первичных, вторичных и третичных аминов и циклических аминов, таких как пиперидин, морфолин и пиперазин, и неорганические соли, образованные из натрия, кальция, калия, магния, марганца, железа, меди, цинка, алюминия и лития.

Выражение "фармацевтически приемлемый" указывает на то, что вещество или композиция должны быть совместимы химически и/или токсикологически с другими ингредиентами, содержащимися в составе, и/или с млекопитающим, подвергаемым лечению ими.

"Сольват" относится к ассоциации или комплексу одной или нескольких молекул растворителя и соединения по изобретению. Примеры растворителей, которые образуют сольваты, включают, но не ограничиваются ими, воду, изопропанол, этанол, метанол, DMSO, этилацетат, уксусную кислоту и этаноламин. Термин "гидрат" относится к комплексу, где молекулой растворителя является вода.

Термин "защитная группа" относится к заместителю, который обычно используют для блокирования или защиты конкретной функциональной группы в ходе реакции других функциональных групп на соединении. Например, "защитная группа для амино" представляет собой заместитель, связанный с аминогруппой, который блокирует или защищает функциональную аминогруппу в соединении. Подходящие защитные группы амино включают ацетил, трифторацетил, трет-бутоксикарбонил (BOC), бензилoксикарбонил (CBZ) и 9-флуоренилметилeноксикарбонил (Fmoc). Аналогично, "защитная группа гидрокси" относится к заместителю гидроксигруппы, который блокирует или защищает функциональную гидроксигруппу. Подходящие защитные группы включают ацетил и силил. "Защитная группа карбокси" относится к заместителю карбоксигруппы, который блокирует или защищает функциональную группу карбокси. Распространенные защитные группы карбокси включают фенилсульфонилэтил, цианоэтил, 2-(триметилсилил)этил, 2-(триметилсилил)этоксиметил, 2-(п-толуолсульфонил)этил, 2-(п-нитрофенилсульфенил)этил, 2-(дифенилфосфино)этил, нитроэтил и т.п. Для общего описания защитных групп и их применения, см. T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.

"Уходящая группа" относится к функциональной группе, которая может быть замещена другой функциональной группой. Определенные уходящие группы хорошо известны в данной области, и их примеры включают, но не ограничиваются ими, галогенид (например, хлорид, бромид, йодид), метансульфонил (мезил), п-толуолсульфонил (тозил), трифторметилсульфонил (трифлат) и трифторметилсульфонат.

Сокращения

ЛИНКЕРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ:

MC = 6-малеимидокапроил

Val-Cit или "vc" = валин-цитруллин (иллюстративный дипептид в расщепляемом протеазой линкере)

Цитруллин = 2-амино-5-уреидопентановая кислота

PAB = п-аминобензилoксикарбонил (пример "самоотщепляющегося" линкерного компонента)

Me-Val-Cit = N-метил-валин-цитруллин (где пептидная связь линкера модифицирована для предотвращения ее расщепления катепсином B)

MC(PEG)6-OH = малеимидокапроилполиэтиленгликоль (может быть связан с остатками цистеина антитела).

ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА:

MMAE = монометилауристатин E (MW 718)

MMAF = вариант ауристатина E (MMAE) с фенилаланином на C-конце лекарственного средства (MW 731,5)

MMAF-DMAEA = MMAF с DMAEA (диметиламиноэтиламин) в амидной связи с C-концевым фенилаланином (MW 801,5)

MMAF-TEG = MMAF с тетраэтиленгликолем, этерифицированным фенилаланином

MMAF-NtBu = N-трет-бутил, связанный в качестве амида с C-концом MMAF

DM1 = N(2')-деацетил-N(2')-(3-меркапто-1-оксопропил)майтанзин

DM3 = N(2')-деацетил-N2-(4-меркапто-1-оксопентил)майтанзин

DM4 = N(2')-деацетил-N2-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)майтанзин

Другие сокращения являются следующими: AE представляет собой ауристатин E, Boc представляет собой N-(трет-бутоксикарбонил), cit представляет собой цитруллин, dap представляет собой долапроин, DCC представляет собой 1,3-дициклогексилкарбодиимид, DCM представляет собой дихлорметан, DEA представляет собой диэтиламин, DEAD представляет собой диэтилазодикарбоксилат, DEPC представляет собой диэтилфосфорилцианидат, DIAD представляет собой диизопропилазодикарбоксилат, DIEA представляет собой N,N-диизопропилэтиламин, dil представляет собой долаизолейцин, DMA представляет собой диметилацетамид, DMAP представляет собой 4-диметиламинопиридин, DME представляет собой диметиловый эфир этиленгликоля (или 1,2-диметоксиэтан), DMF представляет собой N,N-диметилформамид, DMSO представляет собой диметилсульфоксид, doe представляет собой долафенин, dov представляет собой N,N-диметилвалин, DTNB представляет собой 5,5'-дитио-бис(2-нитробензойную кислоту), DTPA представляет собой диэтилентриаминпентауксусную кислоту, DTT представляет собой дитиотреитол, EDCI представляет собой 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид, EEDQ представляет собой 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин, ES-MS представляет собой электрораспылительную масс-спектрометрию, EtOAc представляет собой этилацетат, Fmoc представляет собой N-(9-флуоренилметоксикарбонил), gly представляет собой глицин, HATU представляет собой гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония, HOBt представляет собой 1-гидроксибензотриазол, ВЭЖХ представляет собой высокоэффективную жидкостную хроматографию, ile представляет собой изолейцин, lys представляет собой лизин, MeCN (CH3CN) представляет собой ацетонитрил, MeOH представляет собой метанол, Mtr представляет собой 4-анизилдифенилметил (или 4-метокситритил), nor представляет собой (1S, 2R)-(+)-норэфедрин, PBS представляет собой фосфатно-солевой буфер (pH 7,4), PEG представляет собой полиэтиленгликоль, Ph представляет собой фенил, Pnp представляет собой п-нитрофенил, MC представляет собой 6-малеимидокапроил, phe представляет собой L-фенилаланин, PyBrop представляет собой гексафторфосфат бром-трис-пирролидинофосфония, SEC представляет собой эксклюзионную хроматографию, Su представляет собой сукцинимид, TFA представляет собой трифторуксусную кислоту, TLC представляет собой тонкослойную хроматографию, UV представляет собой ультрафиолет, и val представляет собой валин.

"Свободный остаток аминокислоты цистеина" относится к аминокислотному остатку цистеина, который встроен в исходное антитело, имеет тиольную функциональную группу (-SH) и не является спаренным посредством внутримолекулярного или межмолекулярного дисульфидного мостика.

Термин "величина реакционной способности тиольной группы" представляет собой количественную характеристику реакционной способности свободных остатков аминокислоты цистеина. Величина реакционной способности тиольной группы представляет собой процент свободных остатков аминокислоты цистеина в антителе со встроенными в него остатками цистеина, которые реагируют с реакционно-способным к тиольной группе реагентом, и преобразованную до максимальной величины, составляющей 1. Например, свободный остаток аминокислоты цистеина на антителе со встроенными в него остатками цистеина, которая реагирует со 100% выходом с реакционно-способным к тиольной группе реагентом, таким как биотин-малеимидный реагент, с образованием меченного биотином антитела, имеет величину реакционной способности тиольной группы, составляющую 1,0. Другой остаток аминокислоты цистеина, встроенный в то же или другое исходное антитело, который реагирует с реакционно-способным к тиольной группе реагентом с выходом 80%, имеет величину реакционной способности тиольной группы, составляющую 0,8. Другой остаток аминокислоты цистеина, встроенный в то же или другое исходное антитело, который совсем не реагирует с реакционно-способным к тиольной группе реагентом, имеет величину реакционной способности тиольной группы, составляющую 0. Определение величины реакционной способности тиольной группы для конкретного остатка цистеина можно проводить анализом ELISA, масс-спектрометрией, жидкостной хроматографией, радиоавтографией или другими количественными аналитическими тестами.

"Исходное антитело" представляет собой антитело, содержащее аминокислотную последовательность, в которой один или несколько аминокислотных остатков заменяют одним или несколькими остатками цистеина. Исходное антитело может содержать нативную последовательность или последовательность дикого типа. Исходное антитело может иметь заранее существующие модификации аминокислотной последовательности (такие как вставки, делеции и/или замены) относительно другой нативной формы, формы дикого типа или модифицированной формы антитела. Исходное антитело может быть направлено против представляющего интерес антигена-мишени, например, биологически значимого полипептида. Также предусматриваются антитела, направленные против неполипептидных антигенов (таких как ассоциированные с опухолью гликолипидные антигены; см. US 5091178).

III. Композиции и способы по изобретению

Изобретение относится к антителам против CD79b или их функциональным фрагментам, и к способу их применения для лечения гемопоэтических опухолей.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, которое связывается, предпочтительно специфично, с любым из описанных выше или ниже полипептидов. Необязательно, антитело представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, включая Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагмент, диатело, однодоменное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание антитела против полипептида CD79b с соответствующим ему антигенным эпитопом. Антитела по настоящему изобретению необязательно могут быть конъюгированы с ингибирующим рост средством или цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, ауристатин, майтанзиноид, производное долостатина или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или сходные с ними. Антитела по настоящему изобретению необязательно можно продуцировать в клетках CHO или бактериальных клетках, и предпочтительно они индуцируют гибель клетки, с которой они связываются. Для целей детекции, антитела по настоящему изобретению можно метить поддающейся детекции меткой, связывать с твердой подложкой или сходные с ними.

В одном аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где одновалентная аффинность антитела к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде Fab-фрагмента) является по существу такой же, как и одновалентная аффинность антитела мыши (например, аффинность антитела мыши против CD79b в виде Fab-фрагмента) или химерного антитела (например, аффинность химерного антитела против CD79b в виде Fab-фрагмента), содержащему последовательность вариабельного домена легкой цепи и тяжелой цепи, как представлено на фигуре 7 (SEQ ID NO:10) и фигурах 8A-B (SEQ ID NO:14), состоящему или по существу состоящему из них.

В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где одновалентная аффинность антитела к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде Fab-фрагмента) является ниже, например, по меньшей мере в 1, 2 или 3 раза ниже, чем одновалентная аффинность антитела мыши (например, аффинность антитела мыши против CD79b в виде Fab-фрагмента) или химерного антитела (например, аффинность химерного антитела против CD79b в виде Fab-фрагмента), содержащему последовательность вариабельного домена легкой цепи и тяжелой цепи, как представлено на фигуре 7 (SEQ ID NO:10) и фигурах 8A-B (SEQ ID NO:14), состоящему или по существу состоящему из них.

В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где одновалентная аффинность антитела к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде Fab-фрагмента) превышает, например по меньшей мере в 1, 2 или 3 раз превышает, одновалентную аффинность антитела мыши (например, аффинность антитела мыши против CD79b в виде Fab-фрагмента) или химерного антитела (например, аффинность химерного антитела против CD79b в виде Fab-фрагмента), содержащему последовательность вариабельного домена легкой цепи и тяжелой цепи, как представлено на фигуре 7 (SEQ ID NO:10) и фигурах 8A-B (SEQ ID NO:14), состоящему или по существу состоящему из них.

В одном аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде фрагмента IgG) является по существу такой же, как и аффинность антитела мыши (например, аффинность антитела мыши против CD79b в виде фрагмента IgG) или химерного антитела (например, аффинность химерного антитела против CD79b в виде фрагмента IgG) в его двухвалентной форме, содержащему последовательность вариабельного домена легкой цепи и тяжелой цепи, как представлено на фигуре 7 (SEQ ID NO:10) и фигурах 8A-B (SEQ ID NO:14), состоящему или по существу состоящему из них.

В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде фрагмента IgG) является ниже, например, по меньшей мере в 1, 2 или 3 раза ниже, чем аффинность антитела мыши (например, аффинность антитела мыши против CD79b в виде фрагмента IgG) или химерного антитела (например аффинность химерного антитела против CD79b в виде Fab-фрагмента) в его двухвалентной форме, содержащему последовательность вариабельного домена легкой цепи и тяжелой цепи, как представлено на фигуре 7 (SEQ ID NO:10) и фигурах 8A-B (SEQ ID NO:14), состоящему или по существу состоящему из них.

В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде фрагмента IgG) превышает, например, по меньшей мере в 1, 2 или 3 раза превышает, аффинность антитела мыши (например, аффинность антитела мыши против CD79b в виде фрагмента IgG) или химерного антитела (например аффинность химерного антитела против CD79b в виде Fab-фрагмента) в его двухвалентной форме, содержащему последовательность вариабельного домена легкой цепи и тяжелой цепи, как представлено на фигуре 7 (SEQ ID NO:10) и фигурах 8A-B (SEQ ID NO:14), состоящему или по существу состоящему из них.

В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде IgG) составляет 2,0 нМ. В следующем аспекте, изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде IgG) составляет 2,0 нМ +/- 0,5.

В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде IgG) составляет 1 нМ или выше. В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде IgG) составляет 1,5 нМ или выше. В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде IgG) составляет 2 нМ или выше. В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде IgG) составляет 2,5 нМ или выше. В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде IgG) составляет 3 нМ или выше. В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде IgG) составляет между 1 нМ и 3 нМ. В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде IgG) составляет между 1,5 нМ и 2,5 нМ. В другом аспекте изобретение относится к гуманизированному антителу против CD79b, где аффинность антитела в его двухвалентной форме к CD79b (например, аффинность антитела против CD79b в виде IgG) составляет между 1,75 нМ и 2,25 нМ.

В одном аспекте одновалентная аффинность антитела мыши против CD79b является по существу такой же, как аффинность связывания Fab-фрагмента, содержащего последовательности вариабельных доменов SEQ ID NO:10 (фигура 7) и SEQ ID NO:14 (фигуры 8A-B). В другом аспекте одновалентная аффинность антитела мыши против CD79b является по существу такой же, как аффинность связывания Fab-фрагмента, содержащего последовательности вариабельных доменов антитела, полученного из гибридом, депонированных в ATCC в качестве PTA-7712 11 июля 2006 года, или химерного антитела, содержащего вариабельные домены антитела, полученного из гибридом, депонированных в ATCC в качестве PTA-7712 11 июля 2006 года.

Как установлено в данной области, аффинность связывания лиганда с его рецептором можно определять с использованием любого из множества анализов, и выражать с помощью различных количественных величин. Таким образом, в одном варианте осуществления, аффинность связывания выражают в качестве значений Kd и она отражает собственно аффинность связывания (например, с минимизированными эффектами авидности). Как правило, и предпочтительно, аффинность связывания измеряют in vitro, либо в бесклеточных условиях, либо в связанных с клетками условиях. Как описано более подробно в настоящем документе, кратность отличия аффинности связывания можно количественно определять в значениях отношения величины одновалентной аффинности связывания гуманизированного антитела (например, в Fab-форме) и величины одновалентной аффинности связывания эталонного/сравнительного антитела (например, в Fab-форме) (например, антитела мыши, имеющего донорные последовательности гипервариабельных областей), где величины аффинности связывания определяют в сходных условиях анализа. Таким образом, в одном варианте осуществления, кратную разницу в аффинности связывания определяют как отношение значений Kd гуманизированного антитела в Fab-форме и указанного эталонного/сравнительного Fab-антитела. Например, в одном варианте осуществления, если антитело по изобретению (A) обладает аффинностью, которая в "3 раза ниже" аффинности эталонного антитела (M), тогда, если величина Kd для A составляет 3x, величина Kd для M составляет 1x, и отношение Kd A к Kd M составляет 3:1. Напротив, в одном варианте осуществления, если антитело по изобретению (C) обладает аффинностью, которая в "3 раза превышает" аффинность эталонного антитела (R), тогда, если величина Kd для C составляет 1x, величина Kd для R составляет 3x, и отношение Kd C к Kd R составляет 1:3. Для получения показателей аффинности связывания можно использовать любой из множества анализов, известных в данной области, включая анализы, описанные в настоящем документе, в том числе, например, Biacore, радиоиммунный анализ (RIA) и ELISA.

В одном аспекте предусматривается антитело, которое связывается с CD79b, где антитело содержит: (a) по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из группы, состоящей из:

(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A16 представляет собой KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59)

(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой LVSKLDS (SEQ ID NO:60)

(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61)

(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62)

(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GMIDPSDSETHYNHIFKD (SEQ ID NO:63) и

(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F6, где F1-F10 представляет собой ARNLYL (SEQ ID NO:64).

В одном варианте осуществления, HVR-L1 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:59. В одном варианте осуществления, HVR-L2 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:60. В одном варианте осуществления, HVR-L3 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:61. В одном варианте осуществления, HVR-H1 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:62. В одном варианте осуществления, HVR-H2 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:63. В одном варианте осуществления, HVR-H3 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:64. В одном варианте осуществления, антитело по изобретению, содержащее эти последовательности (в сочетании, как описано в настоящем документе), представляет собой гуманизированное антитело или антитело человека.

В одном аспекте предусматривается антитело, которое связывается с CD79b, где антитело содержит:

(a) по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из группы, состоящей из:

(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A16 представляет собой KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59)

(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой LVSKLDS (SEQ ID NO:60)

(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61)

(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62)

(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18 где E1-E18 представляет собой GMIDPSDSETHYNHIFKD (SEQ ID NO:63) и

(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F6, где F1-F10 представляет собой ARNLYL (SEQ ID NO:64); и

(b) по меньшей мере один вариант HVR, где последовательность варианта HVR содержит модификацию по меньшей мере одного остатка последовательности, представленной в SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, 63 или 64. В одном варианте осуществления, HVR-L1 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:59. В одном варианте осуществления, HVR-L2 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:60. В одном варианте осуществления, HVR-L3 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:61. В одном варианте осуществления, HVR-H1 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:62. В одном варианте осуществления, HVR-H2 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:63. В одном варианте осуществления, HVR-H3 антитела по изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:64. В одном варианте осуществления, антитело по изобретению, содержащее эти последовательности (в сочетании, как описано в настоящем документе), представляет собой гуманизированное антитело или антитело человека.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, где каждая HVR содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, 63 и 64, состоит или по существу состоит из нее, и где SEQ ID NO:59 соответствует HVR-L1, SEQ ID NO:60 соответствует HVR-L2, SEQ ID NO:61 соответствует HVR-L3, SEQ ID NO:62 соответствует HVR-H1, SEQ ID NO:63 соответствует HVR-H2, и SEQ ID NO:64 соответствует HVR-H3. В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая, в этом порядке, содержит SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, 63 и 64.

Варианты HVR в антителе по изобретению могут иметь модификации одного или нескольких остатков в HVR. В одном варианте осуществления, вариант HVR-L3 содержит 1-2 (1 или 2) замены в любом сочетании из следующих положений: C1 (F) и C8 (F). Буква(ы) в скобках после каждого положения указывает на иллюстративную замену (т.е., замещение) аминокислоты; как будет понятно специалисту в данной области, пригодность других аминокислот в качестве аминокислот для замены в контексте, описанном в настоящем документе, можно оценивать с использованием обычных способов, известных в данной области и/или описанных в настоящем документе. В одном варианте осуществления, C1 в варианте HVR-L3 представляет собой F. В одном варианте осуществления, C8 в варианте HVR-L3 представляет собой F. В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариант HVR-L3, где C1 представляет собой F и C8 представляет собой F.

В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит вариант HVR-L3, где C1 представляет собой F. В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит вариант HVR-L3, где C8 представляет собой F. В некоторых вариантах осуществления, указанное антитело с вариантом HVR-L3 далее содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из них содержит, в этом порядке, последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59, 60, 62, 63 и 64. В некоторых вариантах осуществления, эти антитела далее содержат консенсусную последовательность каркасной области тяжелой цепи подгруппы III человека. В одном варианте осуществления этих антител, консенсусная последовательность каркасной области содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах осуществления этих антител, положение 71 представляет собой A, положение 73 представляет собой T и/или положение 78 представляет собой A. В одном из вариантов осуществления этих антител, эти антитела далее содержат консенсусную последовательность каркасной области легкой цепи κI человека.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему последовательность HVR, представленную на фигуре 9 (SEQ ID NO:18).

Лекарственное средство для применения у индивида-хозяина предпочтительно вызывает небольшой иммунногенный ответ, или не вызывает его, против средства у указанного индивида. В одном варианте осуществления, изобретение относится к такому средству. Например, в одном варианте осуществления, изобретение относится к гуманизированному антителу, которое вызывает и/или как ожидается вызывает ответ антител человека против антител мыши (HAMA) по существу на сниженном уровне по сравнению с антителом, содержащим последовательность SEQ ID NO: 10 и 14 у индивида-хозяина. В другом примере, изобретение относится к гуманизированному антителу, которое вызывает и/или предположительно вызывает минимальный ответ антител человека против антител мыши (HAMA), или не вызывает его. В одном примере, антитело по изобретению вызывает ответ против антител мыши, который находится на клинически-приемлемом уровне или ниже.

Гуманизированное антитело по изобретению может содержать одну или несколько последовательностей негипервариабельных областей (например, каркасных областей) человека или консенсусных последовательностей негипервариабельных областей человека в его вариабельном домене тяжелой или легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления, в последовательностях негипервариабельных областей (например, каркасных областей) человека или консенсусных последовательностях негипервариабельных областей человека присутствует одна или несколько дополнительных модификаций. В одном варианте осуществления, вариабельный домен тяжелой цепи антитела по изобретению содержит консенсусную последовательность каркасной области человека, которая в одном варианте осуществления представляет собой консенсусную последовательность каркасной области подгруппы III. В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариант консенсусной последовательности каркасной области подгруппы III, модифицированную по меньшей мере в одном аминокислотном положении. Например, в одном варианте осуществления, вариант консенсусной последовательности каркасной области подгруппы III может содержать замену в одном или нескольких из положений 71, 73 и/или 78. В одном варианте осуществления, указанная замена представляет собой R71A, N73T и/или L78A, в любом их сочетании.

Как известно в данной области, и как более подробно описано в настоящем документе ниже, аминокислотное положение/граница, определяющие гипервариабельную область антитела, могут варьировать, в зависимости от контекста и различных определений, известных в данной области (как описано ниже). Некоторые положения в вариабельном домене можно рассматривать как гибридные гипервариабельные положения в том отношении, что эти положения можно считать относящимися к гипервариабельной области при одном наборе критериев, и считать не относящимися к гипервариабельной области при другом наборе критериев. Одно или несколько из этих положений также могут находиться в удлиненных гипервариабельных областях (как более подробно определено ниже). Изобретение относится к антителам, содержащим модификации в этих гибридных гипервариабельных положениях. В одном варианте осуществления, эти гипервариабельные положения включают одно или несколько из положений 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 и 101-102 в вариабельном домене тяжелой цепи. В одном варианте осуществления, эти гибридные гипервариабельные положения включают одно или несколько из положений 24-29, 35-36, 46-49, 56 и 97 в вариабельном домене легкой цепи. В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит вариант консенсусной последовательности каркасной области человека, модифицированный в одном или нескольких гибридных гипервариабельных положениях.

В одном аспекте антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий вариант консенсусной последовательности каркасной области подгруппы III человека, модифицированный в одном или нескольких из положений 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 и 101.

В одном аспекте антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий вариант консенсусной последовательности каркасной области подгруппы I каппа человека, модифицированный в одном или нескольких из положений 24, 27-29, 56 и 97.

В одном аспекте антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий вариант консенсусной последовательности каркасной области подгруппы III, модифицированный в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или всех из положений 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 и 101. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело по изобретению содержит вариант консенсусной последовательности каркасной области подгруппы III, модифицированный в положении 71, 73 и/или 78. В одном варианте осуществления, указанная замена представляет собой R71A, N73T и/или L78A.

В одном аспекте антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий вариант консенсусной последовательности каркасной области подгруппы I каппа человека, модифицированный в 1, 2, 3, 4, 5 или всех из положений 24, 27-29, 56 и 97.

Антитело по изобретению может содержать любые подходящие последовательности каркасной области легкой цепи человека или консенсусные последовательности каркасной области легкой цепи человека, при условии, что антитело обладает требуемыми биологическими характеристиками (например, требуемой аффинностью связывания). В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит по меньшей мере часть последовательности каркасной области легкой цепи K человека (или всю ее). В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит по меньшей мере часть консенсусной каркасной области K подгруппы I человека (или всю).

В одном аспекте антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, содержащий последовательность каркасной области, представленную в SEQ ID NO:9 (фигура 7) и/или 13 (фигуры 8A-B).

В одном аспекте антитело по изобретению представляет собой гуманизированное антитело против CD79b, конъюгированное с цитотоксическим средством. В одном аспекте гуманизированное антитело против CD79b, конъюгированное с цитотоксическим средством, ингибирует прогрессию опухоли в ксенотрансплантатах.

В одном аспекте как гуманизированное антитело, так и химерное антитело, являются одновалентными. В одном варианте осуществления, как гуманизированное, так и химерное антитело, содержит одну Fab-область, связанную с Fc-областью. В одном варианте осуществления, эталонное химерное антитело содержит последовательности вариабельных доменов, представленные на фигуре 7 (SEQ ID NO:10) и фигурах 8A-B (SEQ ID NO:14), связанные с Fc-областью человека. В одном варианте осуществления, Fc-область человека представляет собой Fc-область IgG (например, IgG1, 2, 3 или 4).

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:31-33). В одном варианте осуществления, вариабельный домен содержит последовательность F1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:27-30). В одном варианте осуществления, антитело содержит последовательность CH1 и/или Fc, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:34-35). В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 13, SEQ ID NO:31-33), и последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC (фигура 13, SEQ ID NO:27-30). В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 13, SEQ ID NO:31-33), и последовательность CH1 и/или Fc, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:34-35). В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 13, SEQ ID NO:31-33), и последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC (фигура 13, SEQ ID NO:27-30), и CH1 и/или Fc (фигура 13, SEQ ID NO:34-35).

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:23-25). В одном варианте осуществления, вариабельный домен содержит последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:19-22). В одном варианте осуществления, антитело содержит последовательность CL1, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:26). В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO:23-25), и последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC (SEQ ID NO:19-22), представленные на фигуре 13. В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO:23-25), и последовательность CL1 (SEQ ID NO:26), представленные на фигуре 13. В одном варианте осуществления, антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO:23-26), и последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC (SEQ ID NO:19-22), представленные на фигуре 13, и последовательность CL1, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO:26).

В одном аспекте антитела по изобретению включают антитела со встроенными в них остатками цистеина, где одна или несколько аминокислот исходного антитела заменены свободным остатком аминокислоты цистеина, как описано в WO2006/034488; US 2007/0092940 (включенных в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме). Таким образом можно конструировать, т.е. подвергать мутации, любую форму антитела против CD79b. Например, исходный Fab-фрагмент антитела можно изменять способами инженерии, чтобы он образовывал Fab со встроенными в него остатками цистеина, обозначаемый в настоящем документе как "тио-Fab". Аналогично, исходное моноклональное антитело можно изменять способами инженерии так, чтобы оно образовывало "тио-Mab". Следует отметить, что мутация в одном участке приводит к одному встроенному остатку цистеина в тио-Fab, в то время как в тио-Mab мутация в одном участке приводит к двум встроенным способами инженерии остаткам цистеина, вследствие димерной структуры антитела IgG. Антитела против CD79b со встроенными в них остатками цистеина по изобретению включают моноклональные антитела, гуманизированные или химерные моноклональные антитела, и антиген-связывающие фрагменты антител, слитые полипептиды и аналоги, которые предпочтительно связывают ассоциированные с клеткой полипептиды CD79b. Антитело со встроенными в него остатками цистеина альтернативно может включать антитело, содержащее цистеин в положении, описанном в настоящем документе, в антителе или Fab, благодаря конструированию последовательности и/или селекции антитела, без обязательного изменения исходного антитела, таких как конструирование и селекция антител с помощью фагового дисплея или конструирования de novo последовательностей каркасной области и константных областей легкой цепи и/или тяжелой цепи. Антитело со встроенными в него остатками цистеина содержит один или несколько свободных остатков аминокислоты цистеина, имеющих величину реакционной способности тиольной группы в диапазоне от 0,6 до 1,0; от 0,7 до 1,0 или от 0,8 до 1,0. Свободный остаток аминокислоты цистеина представляет собой остаток цистеина, который встроен способами инженерии в исходное антитело и не является частью дисульфидного мостика. Антитела со встроенными в них остатками цистеина пригодны для присоединения к ним цитотоксических и/или визуализирующих соединений в участке встроенного цистеина через, например, малеимид или галоацетил. Нуклеофильная реакционная способность тиольной функциональной группы остатка Cys в отношении малеимидной группы приблизительно в 1000 раз выше, чем у функциональной группы любой другой аминокислоты в белке, такой как аминогруппа остатков лизина или N-концевая аминогруппа. Специфичные к тиольной группе функциональные группы в йодоацетильных и малеимидных реагентах могут реагировать с аминогруппами, однако требуются более высокое значение pH (>9,0) и более длительное время реакции (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London).

В одном аспекте, антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина по изобретению содержит встроенный способами инженерии цистеин в любом из следующих положений, где положение пронумеровано согласно Кабат в легкой цепи (см. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) и согласно нумерации EU в тяжелой цепи (включая Fc-область) (см. Kabat et al. (1991), выше), где константный участок легкой цепи, указанный подчеркиванием на фигуре 17A и 18A, начинается в положении 109 (нумерация по Кабат), а константный участок тяжелой цепи, указанный подчеркиванием на фигурах 17B и 18B, начинается в положении 118 (нумерация EU). Также положение может быть обозначено по его положению в нумерации по последовательности для аминокислот полноразмерной легкой цепи и тяжелой цепи, представленных на фигурах 17-18. Согласно одному варианту осуществления изобретения, антитело против CD79b содержит встроенный в него цистеин в LC-V205C (номер по Кабат: Val 205; номер по последовательности 210 на фигуре 18A, измененный способами инженерии на Cys в этом положении). Встроенный цистеин в легкой цепи указан полужирным шрифтом с двойным подчеркиванием на фигуре 18A. Согласно одному варианту осуществления, антитело против CD79b содержит встроенный цистеин в HC-A118C (номер EU: Ala 118; номер по Кабат 114; номер по последовательности 118 на фигуре 17B, измененный способами инженерии на Cys в этом положении). Встроенный цистеин в тяжелой цепи показан полужирным шрифтом с двойным подчеркиванием на фигуре 17B. Согласно одному из вариантов осуществления, антитело против CD79b содержит встроенный цистеин в Fc-S400C (номер EU: Ser 400; номер по Кабат 396; номер по последовательности 400 на фигуре 17-18B, измененный на Cys в этом положении). В других вариантах осуществления, встроенный цистеин тяжелой цепи (включая Fc-область) находится в любом из следующих положений (согласно нумерации по Кабат с нумерацией EU, указанной в скобках): 5, 23, 84, 112, 114 (118 при нумерации EU), 116 (120 при нумерации EU), 278 (282 при нумерации EU), 371 (375 при нумерации EU) или 396 (400 при нумерации EU). Таким образом, изменения аминокислот в этих положения для исходного гуманизированного антитела против CD79b по изобретению представляют собой: V5C, A23C, A84C, S112C, A114C (A118C при нумерации EU), T116C (T120C при нумерации EU), V278C (V282C при нумерации EU), S371C (S375C при нумерации EU) или S396C (S400C при нумерации EU). Таким образом, изменения аминокислот в этих положениях для исходного химерного антитела против CD79b по изобретению представляют собой: Q5C, K23C, S84C, S112C, A114C (A118C при нумерации EU), T116C (T120C при нумерации EU), V278C (V282C при нумерации EU), S371C (S375C при нумерации EU) или S396C (S400C при нумерации EU). В других вариантах осуществления, встроенный цистеин легкой цепи находится в любом из следующих положений (согласно нумерации по Кабат): 15, 110, 114, 121, 127, 168, 205. Таким образом, изменения аминокислот в этих положениях для исходного гуманизированного антитела против CD79b по изобретению представляют собой: V15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C или V205C. Таким образом, изменения аминокислот в этих положениях для исходного химерного антитела против CD79b по изобретению представляют собой: I15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C или V205C.

В одном аспекте изобретение включает антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина, содержащее один или несколько свободных остатков аминокислоты цистеина, где антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина связывается с полипептидом CD79b и получено путем процесса, включающего замену одного или нескольких аминокислотных остатков исходного антитела против CD79b на цистеин, где исходное антитело содержит по меньшей мере одну последовательность HVR, выбранную из:

(a) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A16 представляет собой KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:59)

(b) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой LVSKLDS (SEQ ID NO:60)

(c) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой WQGTHFPYT (SEQ ID NO:61) или FQGTHFPFT (SEQ ID NO:79)

(d) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:62)

(e) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GMIDPSDSETHYNHIFKD(SEQ ID NO:63) и

(f) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F6, где F1-F10 представляет собой ARNLYL (SEQ ID NO:64).

В определенном аспекте, изобретение относится к антителу против CD79b со встроенными в него остатками цистеина, содержащему аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 80% идентичность аминокислотной последовательности, альтернативно по меньшей мере приблизительно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность аминокислотной последовательности с антителом со встроенными в него остатками цистеина, имеющим полноразмерную аминокислотную последовательность, как описано в настоящем документе, или антителом со встроенными в него остатками цистеина, имеющим аминокислотную последовательность лишенную сигнального пептида, как описано в настоящем документе.

В другом аспекте, изобретение относится к выделенному антителу против CD79b со встроенными в него остатками цистеина, содержащему аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с молекулой, комплементарной молекуле ДНК, кодирующей (a) антитело со встроенными в него остатками цистеина, имеющее полноразмерную аминокислотную последовательность, как описано в настоящем документе, (b) антитело со встроенными в него остатками цистеина, имеющее аминокислотную последовательность, лишенную сигнального пептида, как описано в настоящем документе, (c) внеклеточный домен трансмембранного белка антитела со встроенными в него остатками цистеина, с сигнальным пептидом или без него, как описано в настоящем документе, (d) аминокислотную последовательность, кодируемую любой из последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе или (e) любой другой конкретно определенный фрагмент полноразмерной аминокислотной последовательности антитела со встроенными в него остатками цистеина, как описано в настоящем документе.

В конкретном аспекте, изобретение относится к выделенному антителу против CD79b со встроенными в него остатками цистеина без N-концевой сигнальной последовательности и/или без начального метионина, кодируемому нуклеотидной последовательностью, которая кодирует такую аминокислотную последовательность, как описано в настоящем документе. Способы его получения также описаны в настоящем документе, причем эти способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, который содержит соответствующую кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты в условиях, подходящих для экспрессии антитела со встроенными в него остатками цистеина, и выделение антитела со встроенными в него остатками цистеина из клеточной культуры.

Другой аспект изобретения относится к выделенному антителу против CD79b со встроенными в него остатками цистеина, в котором трансмембранный домен либо удален, либо инактивирован. Способы его получения также описаны в настоящем документе, причем эти способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, который содержит соответствующую кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты в условиях, подходящих для экспрессии антитела со встроенными в него остатками цистеина, и выделение антитела со встроенными в него остатками цистеина из клеточной культуры.

В других аспектах, изобретение относится к выделенным химерным антителам против CD79b со встроенными в них остатками цистеина, включающим любое из описанных в настоящем документе антител со встроенными в него остатками цистеина, слитое с гетерологичным полипептидом (не CD79b). Примеры таких химерных молекул включают любое из описанных в настоящем документе антител со встроенными в них остатками цистеина, слитое с гетерологичным полипептидом, например, таким как последовательность эпитопной метки или Fc-область иммуноглобулина.

Антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина может представлять собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание антитела против полипептида CD79b с соответствующим ему антигенным эпитопом. Антитела по настоящему изобретению необязательно могут быть конъюгированы с ингибирующим рост средством или цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, ауристатин, майтанзиноид, производное долостатина или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или сходные с ними. Антитела по настоящему изобретению необязательно можно продуцировать в клетках CHO или бактериальных клетках и предпочтительно они ингибируют рост или пролиферацию клетки, с которой они связываются, или индуцируют ее гибель. Для диагностических целей, антитела по настоящему изобретению можно метить поддающейся детекции меткой, связанной с твердой подложкой, или сходными с ней.

В других аспектах настоящего изобретения, изобретение относится к векторам, содержащим ДНК, кодирующую любое из описанных в настоящем документе антител против CD79b и антител против CD79b со встроенными в них остатками цистеина. Также предусматриваются клетки-хозяева, содержащие любой такой вектор. В качестве примера, клетки-хозяева могут представлять собой клетки CHO, клетки E. coli, или клетки дрожжей. Также предусматривается процесс продукции любого из описанных в настоящем документе полипептидов, и он включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии требуемого полипептида, и выделение требуемого полипептида из клеточной культуры.

Антитела со встроенными в них остатками цистеина могут быть пригодны для лечения злокачественной опухоли и включают антитела, специфичные к рецепторам клеточной поверхности и трансмембранным рецепторам, и ассоциированным с опухолью антигенам (TAA). Такие антитела можно использовать в виде простых антител (неконъюгированных с лекарственным средством или группой метки) или в виде конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC). Антитела со встроенными в них остатками цистеина по изобретению можно сайт-специфично и эффективно связывать с реакционно-способным к тиольной группе реагентом. Реакционно-способный к тиольной группе реагент может представлять собой многофункциональный линкерный реагент, реагент метки для улавливания, реагент флуорофора, или промежуточное соединение лекарственное средство-линкер. Антитело со встроенными в него остатками цистеина можно метить поддающейся детекции меткой, иммобилизовывать на твердофазной подложке и/или конъюгировать с группой лекарственного средства. Реакционная способность тиольной группы может быть общей для любого антитела, где можно проводить замену аминокислот реактивными аминокислотами цистеина в пределах легкой цепи, выбранных из диапазонов аминокислотных остатков: L10-L20, L105-L115, L109-L119, L116-L126, L122-L132, L163-L173, L200-L210; и в пределах тяжелой цепи, выбранных из диапазонов аминокислотных остатков: H1-H10, H18-H28, H79-H89, H107-H117, H109-H119, H111-H121, и в Fc-области в диапазонах, выбранных из H270-H280, H366-H376, H391-401, где нумерация аминокислотных положений начинается в 1 положении согласно системе нумерации Кабат (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) и далее продолжается, как описано в WO2006034488; US 2007/0092940. Реакционная способность тиольной группы также может быть общей для определенных доменов антитела, таких как константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Замены цистеином, приводящие к величинам реакционной способности тиольной группы, составляющим 0,6 и более, можно проводить в константных доменах тяжелой цепи α, δ, ε, γ и μ интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, включая подклассы IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Такие антитела и их применение описаны в WO2006/034488; US 2007/0092940.

Антитела со встроенными в них остатками цистеина по изобретению предпочтительно сохраняют антиген-связывающую способность их аналогов, представляющих исходное антитело дикого типа. Таким образом, антитела со встроенными в них остатками цистеина способны связываться, предпочтительно специфично, с антигенами. Такие антигены включают, например, ассоциированные с опухолью антигены (TAA), белки рецепторов клеточной поверхности и другие молекулы клеточной поверхности, трансмембранные белки, белки передачи сигнала, регуляторные факторы выживания клеток, регуляторные факторы клеточной пролиферации, молекулы, ассоциированные с развитием и дифференцировкой ткани (например, о которых известно или предполагают, что они участвуют в них функционально), лимфокины, цитокины, молекулы, вовлеченные в регуляцию клеточного цикла, молекулы, вовлеченные в образование сосудов, и молекулы, ассоциированные с ангиогенезом (например, о которых известно или предполагают, что они участвуют в нем). Ассоциированный с опухолью антиген может представлять собой кластерный фактор дифференцировки (т.е., белок CD, включая, но не ограничиваясь ими CD79b). Антитела против CD79b со встроенными в них остатками цистеина по изобретению сохраняют антиген-связывающую способность их аналогов, представляющих собой исходное антитело CD79b. Таким образом, антитела против CD79b со встроенными в них остатками цистеина по изобретению способны связываться, предпочтительно специфично, с антигенами CD79b, включая изоформы CD79b бета и/или альфа, в том числе, когда такие антигены экспрессируются на поверхности клеток, включая, но не ограничиваясь ими, B-клетки.

В одном аспекте антитела по изобретению можно конъюгировать с любой группой метки, которая может быть ковалентно связана с антителом через реакционно-способную группу, активированную группу или реакционно-способную тиольную группу цистеина (Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304: 147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL). Присоединенная метка может выполнять функции: (i) обеспечения поддающегося детекции сигнала; (ii) взаимодействия со второй меткой для модификации поддающегося детекции сигнала, обеспечиваемого первой или второй меткой, например, для получения FRET (резонансного переноса энергии флуоресценции); (iii) стабилизации взаимодействий или повышения аффинности связывания с антигеном или лигандом; (iv) влияния на подвижность, например электрофоретическую подвижность или способность проникать в клетки, посредством заряда, гидрофобности, формы или других физических параметров, или (v) обеспечения группы для улавливания, модулирования аффинности к лиганду, связывания антитело/антиген или образования комплексов с ионами.

Меченые антитела со встроенными в них остатками цистеина могут быть пригодны в диагностических анализах, например, для детекции экспрессии представляющего интерес антигена в конкретных клетках, тканях или сыворотке. Для диагностических применений, антитело, как правило, метят поддающейся детекции группой. Доступно множество меток, которые, в общем, можно разделить на следующие категории:

Радиоизотопы (радионуклиды), такие как 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At или 213Bi. Меченые радиоизотопом антитела пригодны в экспериментах с нацеленной на рецепторы визуализацией. Антитело можно метить реагентами лигандов, которые связываются, образуют хелаты или иные комплексы с радиоизотопным металлом, где реагент является реакционно-способным к тиольной группе встроенного цистеина антитела, с использованием способов, описанных в Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991). Хелатирующие лиганды, которые могут образовывать комплекс с ионом металла, включают DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA и TETA (Macrocyclics, Dallas, TX). Радионуклиды можно нацеливать посредством образования комплексов с конъюгатами антитело-лекарственное средство по изобретению (Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146).

Линкерные реагенты, такие как DOTA-малеимид (4-малеимидобутирамидобензил-DOTA), можно получать путем реакции аминобензил-DOTA с 4-малеимидомасляной кислотой (Fluka), активированной изопропилхлорформиатом (Aldrich), с последующим способом Axworthy et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4): 1802-1807). DOTA-малеимидные реагенты реагируют со свободными остатками аминокислоты цистеина антител со встроенными в них остатками цистеина и обеспечивают образующий комплекс с металлом лиганд на антителе (Lewis et al. (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). Хелатирующие линкерные реагенты для мечения, такие как DOTA-NHS (моно-N-гидроксисукцинимидный сложный эфир 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты), коммерчески доступны (Macrocyclics, Dallas, TX). Нацеленная на рецептор визуализация с помощью меченных радионуклидом антител может обеспечить маркер для каскада активации путем детекции и количественного определения постепенного накопления антител в опухолевой ткани (Albert et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 1207-1210). Конъюгированные радиоактивные металлы могут оставаться внутри клетки после лизосомальной деградации.

Комплексы хелат-металл, подходящие в качестве меток антител для экспериментов по визуализации, описаны в: US 5342606; US 5428155; US 5316757; US 5480990; US 5462725; US 5428139; US 5385893; US 5739294; US 5750660; US 5834456; Hnatowich et al. (1983) J. Immunol. Methods 65: 147-157; Meares et al. (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al. (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al. (1990) J. Cancer1990, Suppl. 10:21-26; Izard et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al. (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al. (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg et al. (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al. (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al. (2003) J. Nucl. Med. 44: 1105-1112; Kobayashi et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al. (2004) J. Nucl. Med. 45: 129-137; DeNardo et al. (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend et al. (2003) Cancer Biotherapy & RadioPharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al. (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36; Mardirossian et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al. (1999) Cancer Biotherapy & RadioPharmaceuticals, 14:209-20.

Флуоресцентные метки включают метки, такие как хелаты редкоземельных элементов (хелаты европия), типы флуоресцеина, включая FITC, 5-карбоксифлуоресцеин, 6-карбоксифлуоресцеин; типы родамина, включая TAMRA; дансил; лиссамин; цианины; фикоэритрины; техасский красный; и их аналоги. Флуоресцентные метки можно конъюгировать с антителами с использованием способов, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, выше. Реагенты флуоресцентных красителей и флуоресцентных меток включают реагенты, которые являются коммерчески доступными от Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) и Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL).

Различные фермент-субстратные метки являются доступными или описаны (US 4275149). Фермент, как правило, катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое можно измерить с использованием различных способов. Например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, которое можно измерить спектрофотометрически. Альтернативно фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Способы количественного определения изменения флуоресценции описаны выше. Хемилюминесцентный субстрат становится электронно-возбужденным при химической реакции и он может испускать свет, который можно измерить (с использованием, например, хемилюминометра) или он становится донором энергии акцептору флуоресценции. Примеры ферментных меток включают люциферазы (например, люциферазу светляка и бактериальную люциферазу; US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, мочевиназу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRP), щелочную фосфатазу (AP), β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы сахаридов (например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.п. Способы конъюгации ферментов с антителами описаны в O'Sullivan et al. (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166.

Примеры сочетаний фермент-субстрат включают, например:

(i) Пероксидаза хрена (HRP) с пероксидом водорода в качестве субстрата, где пероксид водорода окисляет предшественник красителя (например, ортофенилендиамин (OPD) или гидрохлорид 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB));

(ii) щелочная фосфатаза (AP) с пара-нитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата; и

(iii) β-D-галактозидаза (β-D-Gal) с хромогенным субстратом (например, п-нитрофенил-β-D-галактозид) или флуорогенным субстратом 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидом.

Специалистам в данной области доступны другие многочисленные сочетания фермент-субстрат. Для общего обзора, см. US 4275149 и US 4318980.

Метку можно непрямо конъюгировать с боковой цепью аминокислоты, активированной боковой цепью аминокислоты, антителом со встроенными в него остатками цистеина и т.п. Например, антитело можно конъюгировать с биотином, а любую из трех широких категорий меток, упомянутых выше, можно конъюгировать с авидином или стрептавидином, или наоборот. Биотин связывается селективно со стрептавидином и, таким образом, метка может быть конъюгирована с антителом таким непрямым образом. Альтернативно для достижения непрямой конъюгации метки с вариантом полипептида, вариант полипептида конъюгируют с небольшим гаптеном (например, дигоксином), и один из различных типов меток, упомянутых выше, конъюгируют с вариантом полипептида против гаптена (например, антителом против дигоксина). Таким образом, можно достигать непрямой конъюгации метки с вариантом полипептида (Hermanson, G. (1996), Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego).

Антитело по настоящему изобретению можно использовать в любом известном способе анализа, таком как ELISA, конкурентные анализы связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы, и анализы иммунопреципитации (Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.).

Детектирующая метка может быть пригодна для локализации, визуализации и количественного определения связывания или распознавания. Меченые антитела по изобретению могут осуществлять детекцию рецепторов клеточной поверхности. Другим применением меченных поддающейся детекции меткой антител является способ иммунного улавливания на гранулах, включающий конъюгацию гранул с флуоресцентно меченным антителом и детекцию флуоресцентного сигнала при связывании лиганда. В сходных способах детекции связывания используется эффект поверхностного плазмонного резонанса (SPR) для измерения и детекции взаимодействий антитело-антиген.

Детектирующие метки, такие как флуоресцентные красители и хемилюминесцентные красители (Briggs et al. (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids", J. Chem. Soc, Perkin-Trans. 1:1051-1058) обеспечивают поддающийся детекции сигнал, и, как правило, применимы для мечения антител, предпочтительно со следующими свойствами: (i) меченное антитело должно продуцировать очень высокий сигнал при низком фоне, так чтобы можно было селективно выявить небольшие количества антител как в бесклеточных, так и в клеточных анализах; и (ii) меченное антитело должно быть фотостабильным, чтобы можно было наблюдать, подвергать мониторингу и регистрировать флуоресцентный сигнал без существенного обесцвечивания светом. Для применений, вовлекающих связывание на клеточной поверхности меченого антитела с мембранами или клеточными поверхностями, особенно живых клеток, метки предпочтительно (iii) обладают хорошей растворимостью в воде для достижения эффективной концентрации конъюгата и чувствительности деткции и (iv) являются нетоксичными для живых клеток, чтобы не нарушать нормальные метаболические процессы клеток или не вызывать преждевременную гибель клеток.

Прямое количественное определение интенсивности флуоресценции клеток и подсчет случаев флуоресцентного мечения, например, для связывания с клеточной поверхностью конъюгатов пептид-краситель, можно проводить на системе (FMAT® 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.), которая автоматизирует смешивание и считывание в нерадиоактивных анализах с живыми клетками или с гранулами (Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204). Применения меченых антител также включают анализы связывания рецепторов клеточной поверхности, иммунные анализы улавливания, связанные с флуоресценцией иммуносорбентные анализы (FLISA), анализы расщепления каспазой (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; US 6372907), анализы апоптоза (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51) и анализы цитотоксичности. Технологию микрообъемного флуорометрического анализа можно использовать для идентификации положительной или отрицательной регуляции посредством молекулы, которая нацелена на клеточную поверхность (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51).

Меченые антитела по изобретению пригодны в качестве биомаркеров для визуализации и зондов в различных способах и технологиях биомедицинской и молекулярной визуализации, таких как: (i) MRI (магнитно-резонансная томография); (ii) MicroCT (компьютерная томография); (iii) SPECT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография); (iv) PET (позитронная эмиссионная томография), Chen et al. (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) биолюминесценция; (vi) флуоресценция; и (vii) ультразвуковое исследование. Иммуносцинтиграфия представляет собой способ визуализации, при котором антитела, меченные радиоактивными веществами, вводят животному или пациенту-человеку и делают снимок областей организма, в которых локализуется антитело (US 6528624). Биомаркеры для визуализации можно объективно измерять и использовать в качестве показателя нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство. Биомаркеры могут быть нескольких типов: биомаркеры типа 0 представляют собой естественные маркеры заболевания и они прямо коррелируют с известными клиническими показателями, например оценкой посредством MRI воспаления синовиальной оболочки при ревматоидном артрите; маркеры типа I дают информацию об эффекте вмешательства в соответствии с механизмом действия, даже хотя этот механизм может не быть ассоциированным с клиническим исходом; маркеры типа II функционируют в качестве заместителей конечных результатов, где изменение биомаркера или сигнал биомаркера предсказывает клиническую пользу для "подтверждения" направленного ответа, такие как измеренная посредством CT эрозия кости при ревматоидном артрите. Маркеры для визуализации, таким образом, могут предоставить фармакодинамическую (PD) терапевтическую информацию о: (i) экспрессии белка-мишени, (ii) связывании лекарственного средства с белком-мишенью, т.е. селективности, и (iii) фармакокинетические данные о выведении и времени полужизни. Преимущества биомаркеров для визуализации in vivo относительно лабораторных маркеров включают: неинвазивное введение, поддающуюся количественному измерению оценку организма, повторяющиеся дозирование и оценку, т.е. оценку в несколько моментов времени, и потенциально переносимые эффекты от доклинических (небольшие животные) до клинических (человек) результаты. Для некоторых применений, биологическая визуализация заменяет или минимизирует ряд экспериментов на животных в доклинических исследованиях.

Способы мечения пептидов хорошо известны. См. Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al. (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin и New York; и Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, FIa.); De Leon-Rodriguez et al. (2004) Chem.Eur. J. 10: 1149-1155; Lewis et al. (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 110-115; Mier et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16: 240-237.

Пептиды и белки, меченные двумя группами, флуоресцентным репортером и тушителем, расположенными достаточно близко, подвергаются резонансному переносу энергии флуоресценции (FRET). Репортерные группы, как правило, представляют собой флуоресцентные красители, которые возбуждаются под действием света при определенной длине волны и переносят энергию на группу акцептора, или тушителя, с соответствующим сдвигом Стокса для испускания при максимальной яркости. Флуоресцентные красители включают молекулы с крупными ароматическими группами, такими как флуоресцеин и родамин, и их производные. Флуоресцентный репортер может частично или в значительной степени тушиться группой тушителя в интактном пептиде. При расщеплении пептида пептидазой или протеазой, можно измерять поддающееся детекции увеличение флуоресценции (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248: 18-34).

Меченые антитела по изобретению также можно использовать в качестве средства для аффинной очистки. В этом процессе, меченое антитело иммобилизуют на твердой фазе, такой как смола Sephadex или фильтровальная бумага, с использованием способов, хорошо известных в данной области. Иммобилизованное антитело контактируют с образцом, содержащим антиген, подлежащий очистке, а затем подложку промывают подходящим растворителем, который удаляет по существу весь материал в образце, за исключением антигена, подлежащего очистке, который связан с иммобилизованным вариантом полипептида. В конце, подложку промывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, pH 5,0, который высвобождает антиген от варианта полипептида.

Реагенты для мечения, как правило, обладают реакционной функциональной группой, которая может реагировать (i) прямо с тиольной группой цистеина в антителе со встроенными в него остатками цистеина с образованием меченого антитела, (ii) с линкерным реагентом с образованием промежуточного соединения линкер-метка, или (iii) с линкерным антителом с образованием меченого антитела. Реактивные функциональные группы реагентов для мечения включают: малеимид, галоацетил, сукцинимидильный сложный эфир йодацетамида (например, NHS, N-гидроксисукцинимид), изотиоцианат, сульфонилхлорид, 2,6-дихлортриазинил, пентафторфениловый сложный эфир и фосфорамидит, хотя также можно использовать другие функциональные группы.

Иллюстративная реактивная функциональная группа представляет собой N-гидроксисукцинимидильный сложный эфир (NHS) заместителя карбоксильной группы в поддающейся детекции метке, например, биотин или флуоресцентный краситель. Сложный эфир NHS и метки можно предварительно получать, выделять, очищать и/или охарактеризовывать, или его можно образовывать in situ и подвергать реакции с нуклеофильной группой антитела. Как правило, карбоксильная форма метки активируется реакцией с некоторым сочетанием карбодиимидного реагента, например, дициклогексилкарбодиимидного, диизопропилкарбодиимидного или уранового реагента, например TSTU (O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторбората, HBTU (O-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата) или HATU (O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата), активатора, такого как 1-гидроксибензотриазол (HOBt), и N-гидроксисукцинимида с получением сложного эфира NHS и метки. В некоторых случаях, метку и антитело можно связывать посредством активации in situ метки и реакции с антителом с образованием конъюгата метка-антитело за одну стадию. Другие активирующие и связывающие реагенты включают TBTU (2-(1H-бензотриазо-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат), TFFH (N,N',N",N'"-тетраметилурония 2-фторгексафторфосфат), PyBOP (бензотриазол-1-илокси-трис-пирролидинoфосфония гексафторфосфат, EEDQ (2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин), DCC (дициклогексилкарбодиимид); DIPCDI (диизопропилкарбодиимид), MSNT (1-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1H-1,2,4-триазол, и арилсульфонилгалогениды, например, триизопропилбензолсульфонилхлорид.

Соединения альбумин-связывающий пептид-Fab по изобретению:

В одном аспекте антитело по изобретению является слитым с альбумин-связывающим белком. Связывание с белком плазмы может быть эффективным способом улучшения фармакокинетических свойств короткоживущих молекул. Альбумин представляет собой наиболее распространенный белок в плазме. Связывающие сывороточный альбумин пептиды (ABP) могут изменять фармакодинамику слитых с активным доменом белков, включая изменение захвата, проникновения и диффузии в ткани. Эти фармакодинамические параметры можно модулировать путем специального выбора соответствующих связывающих сывороточный альбумин пептидных последовательностей (US 20040001827). Ряд альбумин-связывающих пептидов был идентифицирован скринингом фагового дисплея (Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Protrins" J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Соединения по изобретению включают последовательности ABP, описанные: (i) Dennis et al. (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 в таблицах III и IV, стр. 35038; (ii) US 20040001827 в SEQ ID NO:9-22; и (iii) WO 01/45746 на страницах 12-13, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок. Альбумин-связывающий пептид(ABP)-Fab конструируют слиянием альбумин-связывающего пептида с C-концом тяжелой цепи Fab в стехиометрическом соотношении 1:1 (1 ABP/1 Fab). Было показано, что связывание этих ABP-Fab с альбумином повышает время полужизни антитела более чем в 25 раз у кроликов и мышей. Таким образом, описанные выше реактивные остатки Cys можно встраивать в эти ABP-Fab и использовать для сайт-специфической конъюгации с цитотоксическими лекарственными средствами с последующими исследованиями на животных in vivo.

Иллюстративные последовательности альбумин-связывающих пептидов включают, но не ограничиваются ими, аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:80-84:

CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO:80
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO:81
QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO:82
RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO:83
DICLPRWGCLW SEQ ID NO:84

Конъюгаты антитело-лекарственное средство

В другом аспекте изобретение относится к иммуноконъюгатам, или конъюгатам антитело-лекарственное средство (ADC), содержащим антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство, лекарственное средство, ингибирующее рост средство, токсин (например, ферментативно активный токсин бактерий, грибов, растений или животных, или его фрагменты), или радиоактивный изотоп (т.е., радиоконъюгат). В другом аспекте изобретения, кроме того, предусматриваются способы применения иммуноконъюгатов. В одном аспекте иммуноконъюгат содержит любое из указанных выше антител против CD79b, ковалентно связанное с цитотоксическим средством или поддающимся детекции соединением.

В одном аспекте антитело против CD79b по изобретению связывается с тем же эпитопом CD79b, который связывается другим антителом против CD79b. В другом варианте осуществления, антитело против CD79b по изобретению связывается с тем же эпитопом на CD79b, который связывается Fab-фрагментом моноклонального антитела, полученного из гибридом, депонированных в ATCC в качестве PTA-7712 11 июля 2006 года, моноклональным антителом, содержащим вариабельные домены SEQ ID NO:10 (фигура 7) и SEQ ID NO:14 (фигуры 8A-B) или химерным антителом, содержащим либо вариабельные домены антитела, полученного из гибридом PTA-7712, депонированных в ATCC 11 июля 2006 года, и константные домены из IgG1, либо вариабельные домены моноклонального антитела, содержащие последовательности SEQ ID NO:10 (фигура 7) и SEQ ID NO:14 (фигуры 8A-B). В другом варианте осуществления, антитело против CD79b по изобретению связывается с тем же эпитопом на CD79b, который связывается другим антителом против CD79b (т.е., CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC), AT 107-2 (AbD Serotec, каталожный #MCA2209), антителом против CD79b человека (BD Biosciences, каталожный #557592; San Jose, CA)).

В другом аспекте антитело против CD79b по изобретению связывается с эпитопом на CD79b, отличным от эпитопа, связываемого другим антителом против CD79b. В другом варианте осуществления, антитело против CD79b по изобретению связывается с эпитопом на CD79b, отличным от эпитопа, связываемого Fab-фрагментом моноклонального антитела, полученного из гибридом, депонированных в ATCC в качестве PTA-7712 11 июля 2006 года, моноклонального антитела, содержащего вариабельные домены SEQ ID NO:10 (фигура 7) и SEQ ID NO:14 (фигуры 8A-B), или химерного антитела, содержащего либо вариабельные домены антитела, полученного из гибридом PTA-7712, депонированных в ATCC 11 июля 2006 года, и константные домены из IgG1, либо вариабельные домены моноклонального антитела, содержащего последовательности SEQ ID NO:10 (фигура 7) и SEQ ID NO:14 (фигуры 8A-B). В другом варианте осуществления, антитело против CD79b по изобретению связывает эпитоп на CD79b, отличный от эпитопа на CD79b, связываемого другим антителом против CD79b (т.е., CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC), AT 107-2 (AbD Serotec, каталожный #MCA2209), антителом против CD79b человека (BD Biosciences, каталожный #557592; San Jose, CA)).

В другом аспекте антитело против CD79b по изобретению отличается от (т.е., не является им) Fab-фрагмента моноклонального антитела, полученного из гибридом, депонированных в ATCC в качестве PTA-7712 11 июля 2006 года, моноклонального антитела, содержащего вариабельные домены SEQ ID NO:10 (фигура 7) и SEQ ID NO:14 (фигуры 8A-B), или химерного антитела, содержащего либо вариабельные домены антитела, полученного из гибридом PTA-7712, депонированных в ATCC 11 июля 2006 года, и константные домены из IgG1, либо вариабельные домены моноклонального антитела, содержащего последовательности SEQ ID NO:10 (фигура 7) и SEQ ID NO:14 (фигуры 8A-B). В другом варианте осуществления, антитело против CD79b по изобретению отличается от (т.е., не является им) Fab-фрагмента другого антитела против CD79b (т.е., CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec каталожный #MCA2208; Raleigh, NC), AT107-2 (AbD Serotec, каталожный #MCA2209), антителом против CD79b человека (BD Biosciences, каталожный #557592; San Jose, CA)).

В одном аспекте антитело по изобретению специфично связывается с CD79b первого вида животных, и не связывается специфично с CD79b второго вида животных. В одном варианте осуществления, первым видом животных является человек и/или примат (например, яванская макака), а вторым видом животных является вид мышиных (например, мышь) и/или собачьих. В одном варианте осуществления, первым видом животных является человек. В одном варианте осуществления, первым видом животных является примат, например яванский макак. В одном варианте осуществления, вторым видом животного является вид мышиных, например мышь. В одном варианте осуществления, вторым видом животных является вид собачьих.

В одном аспекте изобретение относится к композициям, содержащим одно или несколько антител по изобретению и носитель. В одном варианте осуществления, носитель является фармацевтически приемлемым.

В одном аспекте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитело против CD79b по изобретению.

В одном аспекте изобретение относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту по изобретению.

В одном аспекте изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту или вектор по изобретению. Вектор может представлять собой вектор любого типа, например, рекомбинантный вектор, такой как экспрессирующий вектор. Можно использовать любые из множества клеток-хозяев. В одном варианте осуществления, клеткой-хозяином является прокариотическая клетка, например, E. coli. В одном варианте осуществления, клеткой-хозяином является эукариотическая клетка, например, клетка млекопитающих, такая как клетка яичника китайского хомяка (CHO).

В одном аспекте изобретение относится к способам получения антитела по изобретению. Например, изобретение относится к способу получения антитела против CD79b (которое, как определено в настоящем документе, включает полноразмерное антитело и его фрагменты), причем указанный способ включает экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора по изобретению, кодирующего указанное антитело (или его фрагмент), и выделение указанного антитела.

В одном аспекте изобретение относится к изделию, содержащему контейнер; и к композиции, содержащейся в контейнере, где композиция содержит одно или несколько антител против CD79b по изобретению. В одном варианте осуществления, композиция содержит нуклеиновую кислоту по изобретению. В одном варианте осуществления, композиция, содержащая антитело, дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления, изделие по изобретению дополнительно включает инструкции по введению композиции (например, антитела) индивиду.

В одном аспекте изобретение относится к набору, содержащему первый контейнер, содержащий композицию, содержащую одно или несколько CD79b антител по изобретению; и второй контейнер, содержащий буфер. В одном варианте осуществления, буфер является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления, композиция, содержащая антитело-антагонист дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления, набор дополнительно включает инструкции по введению композиции (например, антитела) индивиду.

В одном аспекте изобретение относится к применению антитела против CD79b по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В одном варианте осуществления, злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей вялотекущей NHL, рефрактерной NHL, рефрактерной вялотекущей NHL, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мелколимфоцитарной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

В одном аспекте изобретение относится к применению нуклеиновой кислоты по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В одном варианте осуществления, злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей вялотекущей NHL, рефрактерной NHL, рефрактерной вялотекущей NHL, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мелколимфоцитарной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

В одном аспекте изобретение относится к применению экспрессирующего вектора по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В одном варианте осуществления, злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей вялотекущей NHL, рефрактерной NHL, рефрактерной вялотекущей NHL, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мелколимфоцитарной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

В одном аспекте изобретение относится к применению клетки-хозяина по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В одном варианте осуществления, злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей вялотекущей NHL, рефрактерной NHL, рефрактерной вялотекущей NHL, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мелколимфоцитарной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

В одном аспекте изобретение относится к применению изделия по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В одном варианте осуществления, злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей вялотекущей NHL, рефрактерной NHL, рефрактерной вялотекущей NHL, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мелколимфоцитарной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

В одном аспекте изобретение относится к применению набора по изобретению для изготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В одном варианте осуществления, злокачественная опухоль, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей вялотекущей NHL, рефрактерной NHL, рефрактерной вялотекущей NHL, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мелколимфоцитарной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования роста клетки, которая экспрессирует CD79b, причем указанный способ включает контактирование указанной клетки с антителом по изобретению, тем самым вызывая ингибирование роста указанной клетки. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу медикаментозного лечения млекопитающего, имеющего злокачественную опухоль, содержащую клетку, которая экспрессирует CD79b, причем указанный способ включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела по изобретению, тем самым эффективно осуществляя лечение указанного млекопитающего. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения или профилактики клеточно-пролиферативного нарушения, ассоциированного с повышенной экспрессией CD79b, причем указанный способ включает введение индивиду, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количество антитела по изобретению, тем самым эффективно осуществляя лечение или профилактику указанного клеточно-пролиферативного нарушения. В одном варианте осуществления, указанное пролиферативное нарушение представляет собой злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования роста клетки, где рост указанной клетки по меньшей мере частично зависит от эффекта CD79b на усиление роста, причем указанный способ включает контактирование клетки с эффективным количеством антитела по изобретению, тем самым ингибируя рост указанной клетки. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу медикаментозного лечения опухоли у млекопитающего, где рост указанной опухоли по меньшей мере частично зависит от эффекта CD79b на усиление роста, причем указанный способ включает контактирование клетки с эффективным количеством антитела по изобретению, тем самым эффективно осуществляя лечение указанной опухоли. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, включающему введение пациенту фармацевтического состава, содержащего иммуноконъюгат, описанный в настоящем документе, приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент. В одном варианте осуществления, злокачественная опухоль выбрана из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей вялотекущей NHL, рефрактерной NHL, рефрактерной вялотекущей NHL, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мелколимфоцитарной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны. В одном варианте осуществления, пациенту вводят цитотоксическое средство в сочетании с соединением конъюгата антитело-лекарственное средство.

В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования пролиферации B-клеток, включающему воздействие на клетку иммуноконъюгатом, содержащим антитело по изобретению, в условиях, позволяющих связывание иммуноконъюгата с CD79b. В одном варианте осуществления, пролиферация B-клеток выбрана из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей вялотекущей NHL, рефрактерной NHL, рефрактерной вялотекущей NHL, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мелколимфоцитарной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны. В одном варианте осуществления, B-клетка представляет собой ксенотрансплантат. В одном варианте осуществления, воздействие происходит in vitro. В одном варианте осуществления, воздействие происходит in vivo.

В одном аспекте изобретение относится к способу определения наличия CD79b в образце, предположительно содержащем CD79b, причем указанный способ включает воздействие на указанный образец антителом по изобретению, и определение связывания указанного антитела с CD79b в указанном образце, где связывание указанного антитела с CD79b в указанном образце указывает на наличие указанного белка в указанном образце. В одном варианте осуществления, образец представляет собой биологический образец. В следующем варианте осуществления, биологический образец содержит B-клетки. В одном варианте осуществления, биологический образец представляет собой образец от млекопитающего, страдающего или предположительно страдающего B-клеточным нарушением и/или B-клеточно-пролиферативным нарушением, включая, но не ограничиваясь ими, лимфому, неходжскинскую лимфому (NHL), агрессивную NHL, рецидивирующую агрессивную NHL, рецидивирующую вялотекущую NHL, рефрактерную NHL, рефрактерную вялотекущую NHL, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелколимфоцитарную лимфому, лейкоз, волосатоклеточный лейкоз (HCL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) и лимфому из клеток мантийной зоны.

В одном аспекте изобретение относится к способу диагностики клеточно-пролиферативного нарушения, ассоциированного с увеличением количества клеток, таких как B-клетки, экспрессирующие CD79b, причем способ включает конактирование тестируемых клеток в биологическом образце с любым из указанных выше антител; определение уровня антител, связавшихся с тестируемыми клетками в образце, посредством детекции связывания антитела с CD79b; и сравнение с уровнем антитела, связавшегося с клетками в контрольном образце, где уровень связавшегося антитела нормализуют относительно количества клеток, экспрессирующих CD79b, в тестируемом и контрольном образцах, и где более высокий уровень связавшегося антитела в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом указывает на наличие клеточно-пролиферативного нарушения, связанного с клетками, экспрессирующими CD79b.

В одном аспекте изобретение относится к способу детекции растворимого CD79b в крови или сыворотке, причем способ включает контактирование тестируемого образца крови или сыворотки от млекопитающего, предположительно страдающего B-клеточно-пролиферативным нарушением, с антителом против CD79b по изобретению и детекцию повышения содержания растворимого CD79b в тестируемом образце относительно контрольного образца крови или сыворотки от здорового млекопитающего. В одном варианте осуществления, способ детекции пригоден в качестве способа диагностики B-клеточно-пролиферативного нарушения, ассоциированного с увеличением содержания растворимого CD79b в крови или сыворотке млекопитающего.

В одном аспекте изобретение относится к способу связывания антитела по изобретению с клеткой, которая экспрессирует CD79b, причем указанный способ включает контактирование указанной клетки с антителом по изобретению. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном варианте осуществления, антитело конъюгировано с ингибирующим рост средством.

Способы по изобретению можно применять для влияния на любое подходящее патологическое состояние, например, на клетки и/или ткани, ассоциированные с экспрессией CD79b. В одном варианте осуществления, клетки, на которые направлен способ по изобретению, представляют собой гемопоэтические клетки. Например, гемопоэтическая клетка может представлять собой клетку, выбранную из группы, состоящей из лимфоцита, лейкоцита, тромбоцита, эритроцита и естественной киллерной клетки. В одном варианте осуществления, клетка, на которую направлен способ по изобретению, представляет собой B-клетку или T-клетку. В одном варианте осуществления, клетка, на которую направлен способ по изобретению, представляет собой злокачественную клетку. Например, злокачественная клетка может представлять собой клетку, выбранную из группы, состоящей из клетки лимфомы, клетки лейкоза или клетки миеломы.

Способы по изобретению, кроме того, могут включать дополнительные стадии лечения. Например, в одном варианте осуществления, способ дополнительно включает стадию, где клетку-мишень и/или ткань-мишень (например, злокачественную клетку) подвергают радиационному облучению или воздействию химиотерапевтического средства.

Как описано в настоящем документе, CD79b представляет собой компонент передачи сигнала B-клеточного рецептора. Таким образом, в одном варианте осуществления способов по изобретению, клетка, на которую осуществляется нацеливание (например, злокачественная клетка) представляет собой клетку, в которой экспрессируется CD79b, по сравнению с клеткой, которая не экспрессирует CD79b. В следующем варианте осуществления, клетка-мишень представляет собой злокачественную клетку, в которой экспрессия CD79b усилена по сравнению с нормальной незлокачественной клеткой ткани того же типа. В одном варианте осуществления, способ по изобретению вызывает гибель клетки-мишени.

В других аспектах настоящего изобретения, изобретение относится к векторам, содержащим ДНК, кодирующую любое из антител, описанных в настоящем документе. Также предусматривается клетка-хозяин, содержащая любой такой вектор. В качестве примера, клетки-хозяева могут представлять собой клетки CHO, клетки E. coli или клетки дрожжей. Кроме того, предусматривается процесс продукции антител, описанных в настоящем документе, и он включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии требуемого антитела и выделения требуемого антитела из клеточной культуры.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей антитело против CD79b, как описано в настоящем документе, в сочетании с носителем. Необязательно, носителем является фармацевтически приемлемый носитель.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению антитела против полипептида CD79b, как описано в настоящем документе, для изготовления лекарственного средства, подходящего для лечения состояния, которое отвечает на антитело против полипептида CD79b.

Другой аспект изобретения относится к композиции, содержащей смесь соединений антитело-лекарственное средство формулы I, где средняя нагрузка лекарственным средством на антитело составляет от приблизительно 2 до приблизительно 5, или от приблизительно 3 до приблизительно 4.

Другой аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей соединение ADC формулы I, смесь соединений ADC формулы I, или их фармацевтически приемлемую соль или сольват, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент.

Другой аспект относится к фармацевтическому сочетанию, включающему соединение ADC формулы I и второе соединение, обладающее свойствами, направленными против злокачественной опухоли, или другими терапевтическими эффектами.

Другой аспект относится к способу уничтожения или ингибирования пролиферации опухолевых клеток или злокачественных клеток, включающий обработку клеток таким количеством конъюгата антитело-лекарственное средство формулы I, или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, которое является эффективным для уничтожения или ингибирования пролиферации опухолевых клеток или злокачественных клеток.

Другой аспект относится к способу лечения злокачественной опухоли, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей ADC формулы I.

Другой аспект относится к изделиям, т.е. к наборам, содержащим конъюгат антитело-лекарственное средство, контейнер и вкладыш в упаковку или ярлык, с указаниями по введению.

Один аспект изобретения относится к способу получения соединения конъюгата антитела-лекарственное средство формулы I, включающему стадии: (a) проведения реакции группы встроенного цистеина антитела со встроенными в него остатками цистеина с линкерным реагентом с образованием промежуточного соединения антитело-линкер Ab-L; и (b) проведения реакции Ab-L с активированной группой лекарственного средства D; тем самым получая конъюгат антитело-лекарственное средство; или включающему стадии: (c) проведения реакции нуклеофильной группы в группе лекарственного средства с линкерным реагентом с образованием промежуточного соединения лекарственное средство-линкер D-L; и (d) проведения реакции D-L с группой встроенного цистеина в антителе со встроенными в него остатками цистеина; тем самым получая конъюгат антитело-лекарственное средство.

Один аспект изобретения относится к анализу для детекции злокачественных клеток, включающему: (a) воздействие на клетки конъюгата антитела против CD79b со встроенными в него остатками цистеина и лекарственного средства; и (b) определение степени связывания соединения конъюгата антитела против CD79b со встроенными в него остатками цистеина и лекарственного средства с клетками.

A. Антитела против CD79b

В одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к антителам против CD79b, которые можно использовать в настоящем документе в качестве лекарственных средств. Иллюстративные антитела включают поликлональные, моноклональные, гуманизированные, биспецифические антитела и гетероконъюгаты антител.

1. Поликлональные антитела

Поликлональные антитела предпочтительно индуцируют у животных многократными подкожными (sc) или внутрибрюшинными (ip) инъекциями соответствующего антигена и адъюванта. Может быть подходящей конъюгация соответствующего антигена (особенно когда используют синтетические пептиды) с белком, который является иммуногенным у видов, подлежащих иммунизации. Например, антиген можно конъюгировать с гемоцианином лимфы улитки (KLH), сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином, или ингибитором трипсина сои, с использованием бифункционального или образующего производное агента, например, сложного эфира малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl2, или R1N=C=NR, где R и R1 являются отличающимися алкильными группами.

Животных иммунизируют против антигена, иммуногенных конъюгатов или производных комбинированием, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и инъекцией раствора внутрикожно в несколько областей. Через один месяц животным проводят повторную иммунизацию от 1/5 до 1/10 от исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда посредством подкожной инъекции в несколько областей. Через от семи до 14 суток, у животных проводят забор крови и сыворотку анализируют в отношении титра антител. Животным проводят повторные иммунизации до достижения титрами плато. Конъюгаты также можно получать в рекомбинантной клеточной культуре в качестве белковых слитых молекул. Также, для усиления иммунного ответа подходящим образом используют вызывающие агрегацию средства, такие как квасцы.

2. Моноклональные Антитела

Моноклональные антитела можно получать с использованием способа гибридом, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или их можно получать способами рекомбинантных ДНК (патент США No. 4816567).

В способе гибридом, мышь или другого подходящего животного-хозяина, такого как хомяк, иммунизируют, как описано выше, для получения лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые специфично связываются с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно лимфоциты можно иммунизировать in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют, а затем подвергают слиянию с миеломной клеточной линией с использованием подходящего средства, вызывающего слияние клеток, такого как полиэтиленгликоль, с получением гибридомных клеток (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых исходных клеток миеломы (также называемых партнерами по слиянию). Например, если исходные клетки миеломы лишены фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазы (HGPRT или HPRT), селективная культуральная среда для гибридом, как правило, включает вещества гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), которые препятствуют росту клеток, дефицитных по HGPRT.

Предпочтительные миеломные клетки-партнеры представляют собой клетки, которые эффективно подвергаются слиянию, которые поддерживают стабильно высокий уровень продукции антител отобранными антителопродуцирующими клетками и являются чувствительными к селективной среде, которая осуществляет селекцию против неслитых исходных клеток. Предпочтительными миеломными клеточными линиями являются линии миеломы мышей, такие как линии, полученные из опухолей мышей MOPC-21 и MPC-11, доступные в Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, и клетки SP-2 и производные, например, X63-Ag8-653, доступные в American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Также для продукции моноклональных антител человека описаны миеломные клеточные линии человека и линии гетеромиеломы мыши-человека (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); и Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Культуральную среду, в которой выращивают гибридомные клетки, оценивают на продукцию моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, определяют посредством иммунопреципитации или анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Аффинность связывания моноклонального антитела можно определять, например, посредством анализа Скэтчарда, описанного в Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела с требуемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны можно субклонировать способами лимитирующих разведений и выращивать стандартными способами (Goding, Monoclonal antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящие для этой цели культуральные среды включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки можно выращивать in vivo у животных в качестве асцитных опухолей, например, посредством инъекции клеток мышам.

Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, подходящим способом выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки общепринятыми способами очистки антител, например, такими как аффинная хроматография (например, хроматография с использованием системы белок A- или белок G-сефароза) или ионообменная хроматография, хроматография с гидроксилапатитом, гель-электрофорез, диализ и т. д.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделяют и секвенируют с использованием общепринятых способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). Гибридомные клетки служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. Для обеспечения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах, после выделения ДНК можно встраивать в экспрессирующие векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые в ином случае не продуцируют белок антитела. Обзорные статьи по рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело, включают Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

В следующем варианте осуществления, моноклональные антитела или фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, созданных с использованием способов, описанных в McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). В Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) описано выделение антител мыши и человека, соответственно, с использованием фаговых библиотек. В более поздних публикациях описана продукция высокоаффинных (нМ-порядок) антител человека посредством перестановки цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и рекомбинации in vivo в качестве стратегии для конструирования очень крупных фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти способы представляют собой приемлемые альтернативы традиционным способам гибридомных моноклональных антител для выделения моноклональных антител.

Также ДНК, которая кодирует антитело, можно модифицировать для получения химерных или слитых полипептидов антител, например, посредством замены последовательностями константного домена тяжелой и легкой цепи (CH и CL) человека гомологичными последовательностями мыши (патент США No. 4816567; и Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci USA, 81:6851 (1984)), или слияния кодирующей иммуноглобулин последовательности со всей кодирующей последовательностью для полипептида, не являющегося иммуноглобулином, или ее частью (гетерологичный полипептид). Последовательностями полипептидов, не являющихся иммуноглобулинами, заменяют константные домены антитела, или ими заменяют вариабельные домены одного антиген-связывающего центра антитела с получением химерного двухвалентного антитела, содержащего один антиген-связывающий центр со специфичностью к одному антигену и другой антиген-связывающий центр со специфичностью к другому антигену.

3. Антитела человека и гуманизированные антитела

Антитела против CD79b, кроме того, могут включать гуманизированные антитела или антитела человека. "Гуманизированные" формы антител не человека (например, мыши) представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антиген-связывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, образованную из иммуноглобулина не человека. Гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменены остатками CDR не относящегося к человеку вида (донорное антитело), такого как мышь, крыса или кролик, имеющими требуемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях, остатки каркасной области Fv иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками не человека. Гуманизированные антитела также могут содержать остатки, которые не встречаются ни в реципиентном антителе, ни в импортных последовательностях CDR или каркасной области. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по существу все по меньшей мере из одного, и как правило, двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все из областей CDR соответствуют CDR иммуноглобулина не человека, и все или по существу все из областей FR представляют собой области FR консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также в оптимальном случае будет содержать по меньшей мере часть константного участка (Fc) иммуноглобулина, как правило, константного участка иммуноглобулина человека [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)].

Способы гуманизации антител, не являющихся человеческими, описаны в данной области. Как правило, гуманизированное антитело обладает одним или несколькими встроенными в него аминокислотными остатками из источника, который не является человеческим. Такие не являющиеся человеческими аминокислотные остатки часто называют "импортными" остатками, которые, как правило, взяты из "импортной" вариабельной области. Гуманизацию, главным образом, можно проводить в соответствии со способом Winter и коллег [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], посредством замены CDR или последовательностями CDR крысы соответствующих последовательностей антитела человека. Таким образом, такие "гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела (патент США No. 4816567), где по существу менее целой вариабельной области человека замещено соответствующей последовательностью вида, не относящегося к человеку. На практике, гуманизированные антитела, как правило, представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки CDR и возможно некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов.

Выбор вариабельных доменов человека, как легких, так и тяжелых цепей, для использования при получении гуманизированных антител является очень важным для снижения антигенности и ответа HAMA (антитела человека против антител мыши), когда антитело предназначено для терапевтического применения у человека. Снижение или устранение ответа HAMA является существенным аспектом клинической разработки подходящих лекарственных средств. См., например, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135: 1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147: 1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495. Как описано в настоящем документе, изобретение относится к антителам, которые являются гуманизированными, так чтобы ответ HAMA снижался или устранялся. Варианты этих антител, кроме того, можно получать с использованием общепринятых способов, известных в данной области, некоторые из которых дополнительно описаны ниже. Согласно так называемому способу "наилучшего соответствия", последовательность вариабельного домена антитела грызуна анализируют относительно целой библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Идентифицируют последовательность V-домена человека, которая является наиболее сходной с последовательностью грызуна, и каркасную область (FR) человека в ней принимают для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). В другом способе используют конкретную каркасную область, полученную из консенсусной последовательности всех антител человека из конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Одну и ту же каркасную область можно использовать для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Например, аминокислотная последовательность из антитела, как описано в настоящем документе, может служить в качестве начальной (исходной) последовательности для обеспечения разнообразия последовательности(ей) каркасной области и/или гипервариабельной последовательности(ей). Выбранную последовательность каркасной области, с которой связывают исходную гипервариабельную последовательность, называют в настоящем документе акцепторной каркасной областью человека. Хотя акцепторные каркасные области могут быть из, или могут быть образованы из, иммуноглобулина человека (его VL- и/или VH-областей), предпочтительно акцепторые каркасные области взяты, или образованы, из консенсусной последовательности каркасной области человека, такой как каркасные области, которые, как показано, обладают минимальной иммуногенностью у пациентов-людей, или не обладают ей.

Когда акцептор образован из иммуноглобулина человека, необязательно можно выбирать последовательность каркасной области человека, которая отобрана на основе ее гомологии с донорной последовательностью каркасной области путем выравнивания донорной последовательности каркасной области с различными последовательностями каркасной области человека в коллекции последовательностей каркасных областей человека, и наиболее гомологичную последовательность каркасной области можно выбирать в качестве акцептора.

В одном варианте осуществления, консенсусная каркасная область человека, описанная в настоящем документе, взята, или образована, из консенсусных последовательностей каркасной области VH подгруппы III и/или VL каппа подгруппы I.

Таким образом, акцепторная каркасная область VH человека может содержать одну, две, три или все из следующих последовательностей каркасных областей:

FR1, содержащая EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:69),

FR2, содержащая WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:70),

FR3, содержащая RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:73), где X1 представляет собой A или R, X2 представляет собой T или N, и X3 представляет собой A или L,

FR4, содержащая WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:72).

Примеры консенсусных каркасных областей VH включают:

консенсусную каркасную область VH подгруппы I человека без CDR по Кабат (SEQ ID NO:36);

консенсусную каркасную область VH подгруппы I человека без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO:37-39);

консенсусную каркасную область VH подгруппы II человека без CDR по Кабат (SEQ ID NO:40);

консенсусную каркасную область VH подгруппы II человека без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO:41-43);

консенсусную каркасную область VH подгруппы III человека без CDR по Кабат (SEQ ID NO:44);

консенсусную каркасную область VH подгруппы III человека без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO:45-47);

акцепторную каркасную область VH человека без CDR по Кабат (SEQ ID NO:48);

акцепторную каркасную область VH человека без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO:49-50);

акцепоторную каркасную область 2 VH человека без CDR по Кабат (SEQ ID NO:51); или

акцепоторную каркасную область 2 VH человека без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO:52-54).

В одном варианте осуществления, акцепторная каркасная область VH человека содержит одну, две, три или все из следующих последовательностей каркасных областей:

FR1, содержащая EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:69),

FR2, содержащая WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:70),

FR3, содержащая RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:71),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:74),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:75),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEQ ID NO:76), или

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO:77)

FR4, содержащая WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:72).

Акцепторная каркасная область VL человека может содержать одну, две, три или все из следующих последовательностей каркасных областей:

FR1, содержащая DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:65),

FR2, содержащая WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:66),

FR3, содержащая GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:67),

FR4, содержащая FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:68).

Примеры консенсусных каркасных областей VL включают:

консенсусную каркасную область VL каппа подгруппы I человека (SEQ ID NO:55);

консенсусную каркасную область VL каппа подгруппы II человека (SEQ ID NO:56);

консенсусную каркасную область VL каппа подгруппы III человека (SEQ ID NO:57); или

консенсусную каркасную область VL каппа подгруппы IV человека (SEQ ID NO:58)

Хотя последовательность акцептора может быть идентична выбранной последовательности каркасной области человека, независимо от того, взята ли она из иммуноглобулина человека или из консенсусной каркасной области человека, настоящее изобретение предусматривает, что акцепторная последовательность может содержать ранее существующие аминокислотные замены относительно последовательности иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасной области человека. Эти ранее существующие замены предпочтительно являются минимальными, как правило, составляя только четыре, три, два или одно отличия в аминокислотах относительно последовательности иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасной области.

Остатки гипервариабельной области антитела, не являющегося антителом человека, включают в акцепторные каркасные области VL и/или VH человека. Например, можно включать остатки, соответствующие остаткам CDR по Кабат, остаткам гипервариабельных петель по Chothia, остаткам Abm и/или контактным остаткам. Необязательно, включают следующие остатки удлиненной гипервариабельной области: 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3), 26-35B (H1), 50-65, 47-65 или 49-65 (H2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (H3).

Хотя "включение" остатков гипервариабельной области рассмотрено в настоящем документе, будет понятно, что его можно обеспечивать различными способами, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую требуемую аминокислотную последовательность, можно получать мутацией нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность вариабельного домена мыши, так чтобы его остатки каркасной области заменялись остатками акцепторной каркасной области человека, или мутацией нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность вариабельного домена человека, так чтобы остатки гипервариабельного домена заменялись остатками, не являющимися человеческими, или синтезом нуклеиновой кислоты, кодирующей требуемую последовательность, и т.д.

В примерах настоящего описания, получали варианты с пересаженной гипервариабельной областью путем мутагенеза способом Kunkel нуклеиновой кислоты, кодирующей акцепторные последовательности человека, с использованием отдельного олигонуклеотида для каждой гипервариабельной области. Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987). Соответствующие изменения можно вносить в каркасную область и/или гипервариабельную область с использованием общепринятых способов, для коррекции и восстановления надлежащих взаимодействий гипервариабельная область-антиген.

Фаговый (фагмидный) дисплей (также называемый в настоящем документе фаговым дисплеем в некоторых контекстах) можно использовать в качестве удобного и быстрого способа получения и скрининга множества различных потенциальных вариантов антител в библиотеке, полученной рандомизацией последовательности. Однако специалисту доступны и другие способы получения и скрининга измененных антител.

Технология фагового (фагмидного) дисплея обеспечивает мощный инструмент для получения и селекции новых белков, которые связываются с лигандом, таким как антиген. Использование способов фагового (фагмидного) дисплея позволяет получить большие библиотеки вариантов белков, которые можно быстро сортировать по тем последовательностям, которые связываются с молекулой-мишенью с высокой аффинностью. Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты полипептидов, как правило, подвергают слиянию с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок вирусной оболочки, такой как белок гена III или белок гена VIII. Были разработаны одновалентные системы фагмидного дисплея, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или полипептид, подвергают слиянию с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей часть белка гена III. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). В одновалентной системе фагмидного дисплея, слитый ген экспрессируется на низких уровнях и также экспрессируются белки гена III дикого типа, так что инфекционность частиц сохраняется. Способы создания пептидных библиотек и скрининга этих библиотек описаны во многих патентах (например, патент США No. 5723286, патент США No. 5432018, патент США No. 5580717, патент США No. 5427908 и патент США No. 5498530).

Библиотеки антител или антиген-связывающих полипептидов получают различными способами, включая изменение отдельного гена встраиванием случайных последовательностей ДНК или клонированием семейства сходных генов. Способы дисплея антител или антиген-связывающих фрагментов с использованием фагового (фагмидного) дисплея описаны в патентах США No. 5750373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 и 5658727. Затем библиотеку подвергают скринингу на экспрессию антител или антиген-связывающих белков с требуемыми характеристиками.

Способы замены выбранных аминокислот в матричной нуклеиновой кислоте хорошо известны в данной области, и некоторые из них описаны в настоящем документе. Например, остатки гипервариабельной области можно заменять с использованием способа Kunkel. См., например, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987).

Последовательность олигонуклеотидов включает один или несколько из сконструированных наборов кодонов для остатков гипервариабельной области, подлежащих изменению. Набор кодонов представляет собой набор различных нуклеотидных триплетных последовательностей, используемых для кодирования требуемых вариантов аминокислот. Наборы кодонов могут быть представлены с использованием символов для обозначения конкретных нуклеотидов или эквимолярных смесей нуклеотидов, как представлено ниже, согласно коду IUB.

КОДЫ IUB

G Гуанин

A Аденин

T Тимин

C Цитозин

R (A или G)

Y (C или T)

M (A или C)

K (G или T)

S (C или G)

W (A или T)

H (A или C или T)

B (C или G или T)

V (A или C или G)

D (A или G или T) H

N (A или C или G или T)

Например, в наборе кодонов DVK, D может представлять собой нуклеотиды A или G или T; V может представлять собой A или G или C; и K может представлять собой G или T. Этот набор кодонов может соответствовать 18 различным кодоном и может кодировать аминокислоты: Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly и Cys.

Наборы олигонуклеотидов или праймеров можно синтезировать с использованием стандартных способов. Можно синтезировать набор олигонуклеотидов, например, с помощью твердофазного синтеза, содержащий последовательности, которые соответствуют всем возможным сочетаниям нуклеотидных триплетов, обеспечиваемых набором кодонов и которые кодируют требуемую группу аминокислот. Синтез олигонуклеотидов с определенной "вырожденностью" нуклеотидов в определенных положениях хорошо известен в данной области. Такие наборы нуклеотидов, имеющих определенные наборы кодонов, можно синтезировать с использованием коммерческих устройств для синтеза нуклеиновых кислот (доступных, например, от Applied Biosystems, Foster City, CA), или их можно получать коммерчески (например, от Life Technologies, Rockville, MD). Таким образом, набор синтезированных олигонуклеотидов, имеющих конкретный набор кодонов, как правило, включает множество олигонуклеотидов с различными последовательностями, причем отличия определяются набором кодонов по всей последовательности. Олигонуклеотиды, используемые согласно изобретению, обладают последовательностями, которые позволяют гибридизацию с матричной нуклеиновой кислотой вариабельного домена, а также могут включать участки для ферментов рестрикции для целей клонирования.

В одном способе последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислоты вариантов, можно создавать олигонуклеотид-опосредуемым мутагенезом. Этот способ хорошо известен в данной области, как описано Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504(1987). В кратком изложении, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислоты вариантов, создают посредством гибридизации набора олигонуклеотидов, кодирующих требуемые наборы кодонов, с ДНК-матрицей, где матрица представляет собой одноцепочечную форму плазмиды, содержащую последовательность матричной нуклеиновой кислоты вариабельного участка. После гибридизации используют ДНК полимеразу для синтеза целой второй цепи, комплементарной матрице, которая таким образом, включает олигонуклеотидный праймер, и содержит наборы кодонов, обеспечиваемые набором олигонуклеотидов.

Как правило, используют олигонуклеотиды длиной по меньшей мере 25 нуклеотидов. Оптимальный олигонуклеотид имеет от 12 до 15 нуклеотидов, которые полностью комплементарны матрице с любой стороны от нуклеотида(ов), кодирующего мутацию(и). Это обеспечивает надлежащую гибридизацию олигонуклеотида с одноцепочечной молекулой ДНК-матрицы. Олигонуклеотиды легко синтезировать с использованием способов, известных в данной области, таких как способы, описанные Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978).

ДНК-матрицу получают либо с помощью векторов, которые образованы из векторов бактериофага M13 (подходящими являются коммерчески доступные векторы M13mpl8 и M13mpl9), либо с помощью векторов, которые содержат ориджин репликации одноцепочечного фага, как описано Viera et al., Meth. Enzymol, 153:3 (1987). Таким образом, ДНК, которая подлежит мутации, можно встраивать в один из этих векторов для получения одноцепочечной матрицы. Получение одноцепочечной матрицы описано в разделах 4.21-4.41 Sambrook et al., выше.

Для изменения нативной последовательности ДНК, олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечной матрицей в подходящих условиях гибридизации. Затем добавляют фермент для полимеризации ДНК, обычно ДНК-полимеразу T7 или фрагмент Кленова ДНК полимеразы I, для синтеза цепи, комплементарной матрице, с использованием олигонуклеотида в качестве праймера для синтеза. Таким образом, образуется гетеродуплексная молекула, так что одна цепь ДНК кодирует мутантную форму гена 1, а другая цепь (исходная матрица) кодирует нативную неизмененную последовательность гена 1. Затем эту гетеродуплексную молекулу трансформируют в подходящую клетку-хозяина, обычно, прокариотическую клетку, такую как E. coli JM101. После выращивания клеток, их высевают на агарозные планшеты и подвергают скринингу с использованием олигонуклеотидного праймера, радиоактивно меченного 32-фосфатом для идентификации бактериальных колоний, которые содержат мутантную ДНК.

Описанный выше способ можно модифицировать так, чтобы образовывалась гомодуплексная молекула, где обе цепи плазмиды содержат мутацию(и). Модификации являются следующими: одноцепочечный олигонуклеотид подвергают отжигу с одноцепочечной матрицей, как описано выше. Смесь трех дезоксирибонуклеотидов, дезоксирибоаденозина (dATP), дезоксирибогуанозина (dGTP) и дезоксириботимидина (dTT), комбинируют с модифицированным тиодезоксирибоцитозином, называемым dCTP-(aS) (который можно получить в Amersham). Эту смесь добавляют в комплекс матрица-олигонуклеотид. При добавлении ДНК-полимеразы к этой смеси, образуется цепь ДНК, идентичная матрице, за исключением мутантных оснований. Кроме того, эта новая цепь ДНК содержит dCTP-(aS) вместо dCTP, который служит для защиты его от рестрикционного расщепления эндонуклеазой. После разрезания матричной цепи двухцепочечного гетеродуплекса соответствующим ферментом рестрикции, матричную цепь можно расщеплять нуклеазой ExoIII или другой подходящей нуклеазой позади области, которая содержит участок(участки), подлежащий мутагенезу. Затем реакцию останавливают, чтобы осталась молекула, которая является только частично одноцепочечной. Затем образуют двухцепочечную гомодуплексную ДНК с использованием ДНК-полимеразы в присутствии всех четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, ATP и ДНК-лигазы. Затем эту гомодуплексную молекулу можно трансформировать в подходящую клетку-хозяина.

Как указано ранее, последовательность олигонуклеотидов в наборе обладает длиной, достаточной для гибридизации с матричной нуклеиновой кислотой, а также может, но не обязательно, содержать участки рестрикции. ДНК-матрицу можно получать с помощью векторов, которые образованы либо из векторов бактериофага M13, либо из векторов, которые содержат ориджин репликации одноцепочечного фага, как описано Viera et al. Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Таким образом, ДНК, которая подлежит мутации, должна быть встроена в один из этих векторов для получения одноцепочечной матрицы. Получение одноцепочечной матрицы описано в разделах 4.21-4.41 Sambrook et al., выше.

Согласно другому способу, можно восстанавливать связывание антигена в процессе гуманизации антител посредством селекции репарированных гипервариабельных областей (см. заявку No. 11/061841, поданную 18 февраля 2005 года). Способ включает встраивание гипервариабельных областей, не являющихся человеческими, в акцепторную каркасную область и, кроме того, внесение одной или нескольких аминокислотных замен в одну или несколько гипервариабельных областей без модификации последовательности акцепторной каркасной области. Альтернативно внесение одной или нескольких аминокислотных замен может сопровождаться модификациями в последовательности акцепторной каркасной области.

Согласно другому способу, библиотеку можно создавать путем предоставления наборов вышерасположенных и нижерасположенных олигонуклеотидов, причем каждый набор имеет множество олигонуклеотидов с различными последовательностями, причем различные последовательности определяются наборами кодонов, представленными в последовательности олигонуклеотидов. Наборы вышерасположенных и нижерасположенных олигонуклеотидов, вместе с последовательностью матричной нуклеиновой кислоты вариабельного домена, можно использовать в полимеразной цепной реакции для создания "библиотеки" продуктов ПЦР. Продукты ПЦР могут называться "кассетами нуклеиновых кислот", поскольку их можно подвергать слиянию с другими родственными или неродственными последовательностями нуклеиновых кислот, например, для белков вирусной оболочки и доменов димеризации, с использованием общепринятых способов молекулярной биологии.

Последовательность праймеров для ПЦР включает один или несколько сконструированных наборов кодонов для доступных для растворителя и высоко разнообразных положений в гипервариабельной области. Как описано выше, набор кодонов представляет собой набор различных последовательностей нуклеотидных триплетов, используемых для кодирования требуемых аминокислот варианта.

Подвергнутые селекции антитела, которые удовлетворяют требуемым критериям, поскольку их отбирают через соответствующие стадии скрининга/селекции, можно выделять и клонировать с использованием стандартных рекомбинантных способов.

Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности к антигену и других положительных биологических свойств. Для достижения этой цели, в соответствии с предпочтительным способом, гуманизированные антитела получают с помощью процесса анализа исходных последовательностей и различных предполагаемых гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются широко доступными и известны специалистам в данной области. Доступными являются компьютерные программы, которые иллюстрируют и выводят на экран возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулинов-кандидатов. Исследование этих выведенных на экран данных позволяет проводить анализ возможной роли остатков в функционировании предполагаемых последовательностей иммуноглобулинов, т.е., анализ остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связывать свой антиген. Таким образом, можно отобрать остатки FR и комбинировать их из реципиентной и импортной последовательностей таким образом, чтобы были достигнуты требуемые свойства антител, такие как повышенная аффинность к антигену(ам)-мишени. Как правило, остатки гипервариабельной области оказывают непосредственное и наиболее значительное влияние на связывание антигена.

Предусмотрены различные формы гуманизированных антител против CD79b. Например, гуманизированное антитело может представлять собой фрагмент антитела, такой как Fab, который необязательно конъюгирован с одним или несколькими цитотоксическим средством(ами) для получения иммуноконъюгата. Альтернативно гуманизированное антитело может представлять собой интактное антитело, такое как интактное антитело IgG1.

В качестве альтернативы гуманизации, можно получать антитела человека. Например, в настоящее время возможным является получение трансгенных животных (например, мышей), которые способны, при иммунизации, продуцировать полный набор антител человека в отсутствии продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена участка соединения тяжелых цепей антител (JH) у химерных мышей и мутантных мышей зародышевой линии приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос системы генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека в таких мутантных мышей зародышевой линии приводит к продукции антител человека при антигенной стимуляции. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); и патенты США No. 5545806, 5569825, 5591669 (все GenPharm), 5545807; и WO 97/17852.

Альтернативно для получения антител человека и фрагментов антител in vitro можно использовать технологию фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)), из наборов генов вариабельных (V) доменов иммуноглобулинов неиммунизированных доноров. В соответствии с этим способом, гены V домена антител клонируют в рамке считывания либо главного, либо второстепенного гена оболочки нитевидного бактериофага, такого как M13 или fd, и они экспонируются в качестве функциональных фрагментов антител на поверхности частицы фага. Вследствие того, что нитевидная частица содержит одноцепочечную копию ДНК генома фага, селекция на основе функциональных свойств антитела также приведет к селекции гена, кодирующего антитело, проявляющее такие свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств B-клетки. Фаговый дисплей можно проводить в различных формах, рассмотренных например, в Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Для фагового дисплея можно использовать несколько источников сегментов V-генов. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), выделили набор разнообразных антител против оксазолона из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенок иммунизированных мышей. Можно сконструировать набор V-генов из неиммунизированных доноров-людей и можно выделять антитела против широкого набора антигенов (в том числе против собственных антигенов), главным образом, в соответствии со способами, описанными Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). См., также, патенты США No. 5565332 и 5573905.

Как рассмотрено выше, антитела человека также можно получать посредством активированных B-клеток in vitro (см. патенты США 5567610 и 5229275).

4. Фрагменты антител

В некоторых случаях преимущественным является использование фрагментов антител, вместо целых антител. Меньший размер фрагментов позволяет быстрое выведение, и может обеспечить улучшенный доступ к солидным опухолям.

Для получения фрагментов антител были разработаны различные способы. Традиционно, эти фрагменты получали посредством протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты в настоящее время можно получать непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Fab-, Fv- и scFv-фрагменты антител могут быть экспрессированы и секретированы в E. coli, таким образом, позволяя простой способ получения больших количеств этих фрагментов. Фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, описанных выше. Альтернативно фрагменты Fab'-SH можно выделять непосредственно из E. coli и химически связывать с получением фрагментов F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом фрагменты F(ab')2 можно выделять непосредственно из рекомбинантной культуры клеток-хозяев. Fab- и F(ab')2-фрагмент с повышенным временем полужизни in vivo, содержащий остатки связывающего рецептор спасения эпитопа, описан в патенте США No. 5869046. Другие способы получения фрагментов антител будут очевидны квалифицированному специалисту. В других вариантах осуществления предпочтительное для выбора антитело представляет собой одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). См. WO 93/16185; патент США No. 5571894; и патент США No. 5587458. Fv и sFv являются единственными типами с интактными антиген-связывающими участками, которые лишены константных участков; таким образом, они подходят для снижения неспецифического связывания в ходе применения in vivo. Можно конструировать слитые с sFv белки с получением эффекторного белка либо на N-, либо на С- конце sFv. См. Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, выше. Фрагмент антитела также может представлять собой "линейное антитело", например, как описано в патенте США 5641870. Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

5. Биспецифические антитела

Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере двух различных эпитопов. Иллюстративные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами полипептида CD79b, описанного в настоящем документе. Другие такие антитела могут сочетать в себе указанный выше участок связывания CD79b и участок(ки) связывания других белков. Альтернативно плечо против CD79b можно комбинировать с плечом, которое связывается с триггерной молекулой на лейкоците, такой как молекула T-клеточного рецептора (например CD3), или Fc-рецепторы для IgG (FcγR), такие как FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), так чтобы сосредоточить и локализовать механизмы клеточной защиты на экспрессирующих CD79b клетках. Биспецифические антитела также можно использовать для локализации цитотоксических средств в клетках, которые экспрессируют CD79b. Эти антитела обладают CD79b-связывающим плечом и плечом, которое связывает цитотоксическое средство (например, сапорин, антитело против интерферона-α, алкалоид барвинка, A-цепь рицина, метотрексат или гаптен с радиоактивным изотопом). Биспецифические антитела можно получать в качестве интактных антител или фрагментов антител (например, F(ab')2-биспецифические антитела).

В WO 96/16673 описано биспецифическое антитело против ErbB2/FcγRIII, и в патенте США No. 5837234 описано биспецифическое антитело против ErbB2/FcγRI. Биспецифическое антитело против ErbB2/Fcα представлено в WO98/02463. В патенте США No. 5821337 описано биспецифическое антитело против ErbB2/CD3.

Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Общепринятый способ получения интактных биспецифических антител основан на совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулинов, где две цепи обладают различной специфичностью (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Вследствие случайной сборки тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, такие гибридомы (квадромы) потенциально продуцируют смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна обладает правильной биспецифичной структурой. Очистка правильных молекул, которую обычно проводят посредством стадий аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой и выход продукта является низким. Аналогичные способы описаны в WO 93/08829, и в Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

В соответствии с другим подходом проводят слияние вариабельных доменов антитела с требуемой специфичностью связывания (участками связывания антитело-антиген) с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. Предпочтительно проводят слияние с константным доменом тяжелой цепи Ig, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, CH2 и CH3. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один из компонентов, предназначенных для слияния, обладал первым константным доменом тяжелой цепи (CH1), содержащим участок, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующую предназначенные для слияния компоненты тяжелых цепей иммуноглобулинов и, если желательно, легкой цепи иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы, и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает значительную гибкость при регулировании соотношений трех полипептидных фрагментов друг с другом в вариантах осуществления, где неравные соотношения трех полипептидных цепей в конструкции обеспечивает оптимальный выход требуемого биспецифического антитела. Однако возможным является встраивание двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высокому выходу продукта или если соотношения не имеют существенного влияния на требуемое сочетание цепей.

В предпочтительном варианте осуществления этого подхода, биспецифические антитела состоят из тяжелой цепи гибридного иммуноглобулина с одной специфичностью связывания на одном плече, и пары тяжелая цепь-легкая цепь гибридного иммуноглобулина (обладающей другой специфичностью связывания) на другом плече. Было обнаружено, что такая ассиметричная структура облегчает разделение требуемого биспецифического соединения и нежелательных сочетаний цепей иммуноглобулинов, поскольку наличие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифичной молекулы обеспечивает легкий способ разделения. Этот подход описан в WO 94/04690. Для более подробного описания получения биспецифических антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

В соответствии с другим подходом, описанным в патенте США No. 5731168, для максимального увеличения процентного количества гетеродимеров, которые выделяют из рекомбинантных клеточных культур можно сконструировать область контакта между парой молекул антител. Предпочтительная область контакта содержит по меньшей мере часть CH3-домена константного домена антитела. В этом способе, одну или несколько небольших боковых цепей аминокислот из области контакта первой молекулы антитела заменяют на более крупные боковые цепи (например, тирозин или триптофан). В области контакта второй молекулы антитела создают компенсирующие "полости" идентичного или сходного с крупной боковой цепью(ями) размера посредством замены крупных боковых цепей аминокислот на цепи меньших размеров (например, аланин или треонин). Это обеспечивает механизм для повышения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Биспецифические антитела включают поперечно-сшитые антитела или "гетероконъюгаты" антител. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Такие антитела, например, были предложены для нацеливания клеток иммунной системы против нежелательных клеток (патент США No. 4676980), и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373, и EP 03089). Гетероконъюгаты антител можно получать с использованием любого подходящего способа поперечного сшивания. Подходящие средства для поперечного сшивания хорошо известны в данной области, и описаны в патенте США No. 4676980, совместно с рядом способов поперечного сшивания.

Способы получения биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела можно получать с использованием образования химических связей. В Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) описан способ, где интактные антитела протеолитически расщепляют с получением F(ab')2-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии вещества, образующего комплексы с дитиолами, арсенита натрия, для стабилизации соседних дитиолов и предотвращения образования межмолекулярного дисульфида. Затем полученные Fab'-фрагменты превращают в производные с тионитробензоатом (TNB). Одно из производных Fab'-TNB затем повторно превращают в Fab'-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB с получением биспецифического антитела. Полученные биспецифические антитела можно использовать в качестве средств для селективной иммобилизации ферментов.

Последние достижения упростили прямое выделение из E. coli фрагментов Fab'-SH, которые можно химически связывать с получением биспецифических антител. В Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) описано получение полностью гуманизированной молекулы F(ab')2 биспецифического антитела. Осуществляли секрецию из E. coli каждого Fab'-фрагмента по отдельности и их подвергали прямому химическому соединению in vitro с образованием биспецифического антитела. Биспецифическое антитело, полученное таким образом, обладало способностью связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор ErbB2, и нормальными T-клетками человека, а также запускать литическую активность цитотоксических лимфоцитов человека против мишеней, представляющих собой рак молочной железы человека.

Также были описаны различные способы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Например, были получены биспецифические антитела с использованием лейциновых молний. Kositelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды лейциновой молнии белков Fos и Jun связывали с Fab'-участками двух различных антител посредством слияния генов. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с получением мономеров, а затем повторно окисляли с получением гетеродимеров антител. Этот способ также можно использовать для получения гомодимеров антител. Способ "димеров антител", описанный Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:6444-6448 (1993) обеспечивает альтернативный механизм получения биспецифических фрагментов антител. Фрагменты содержат VH, связанный с VL посредством линкера, который является слишком коротким для возможности образования пары между двумя доменами на одной и той же цепи. Таким образом, домены VH и VL одного фрагмента вынуждены образовывать пару с комплементарными доменами VL и VH другого фрагмента, таким образом, формируя два антиген-связывающих центра. Также описана другая стратегия для получения фрагментов биспецифических антител с использованием димеров одноцепочечных Fv (sFv). См. Gruber et al., J. Immunol, 152: 5368 (1994).

Также предусмотрены антитела более чем c двумя валентностями. Например, можно получать триспецифичные антитела. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

6. Гетероконъюгаты антител

Гетероконъюгаты антител также относятся к объему настоящего изобретения. Гетероконъюгаты антител состоят из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела, например, были предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки [патент США No. 4676980], и для лечения ВИЧ-инфекции [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Предусматривается, что антитела можно получать in vitro с использованием известных способов химии синтетических белков, включая способы, вовлекающие поперечно-сшивающие агенты. Например, иммунотоксины можно конструировать с использованием реакции дисульфидного обмена или посредством образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат и реагенты, описанные, например, в патенте США No. 4676980.

7. Поливалентные антитела

Поливалентное антитело может интернализовываться (и/или катаболизироваться) быстрее, чем двухвалентное антитело, клеткой, экспрессирующей антиген, с которым антитела связываются. Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой поливалентные антитела (которые могут относиться к классу, отличному от класса IgM) с тремя или более антиген-связывающими участками (например, четырехвалентные антитела), которые можно легко получать посредством рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела. Поливалентное антитело может содержать домен димеризации и три или более антиген-связывающих участков. Предпочтительный домен димеризации содержит (или состоит из них) Fc-участок или шарнирную область. В этом случае, антитело будет содержать Fc-область и три или более антиген-связывающих участка со стороны N-конца Fc-участка. Предпочтительное поливалентное антитело, представленное в настоящем документе, содержит (или состоит из них) от трех до приблизительно восьми, однако предпочтительно четыре, антиген-связывающих участка. Поливалентное антитело содержит по меньшей мере одну полипептидную цепь (и предпочтительно две полипептидные цепи), где полипептидная цепь(и) содержит два или более вариабельных доменов. Например, полипептидная цепь(и) может содержать VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, Fc представляет собой одну полипептидyную цепь Fc-участка, X1 и X2 представляют собой аминокислоту или полипептид, и n равно 0 или 1. Например, полипептидная цепь(и) может содержать: цепь VH-CH1-подвижный линкер-VH-CH1-Fc-участок; или цепь VH-CH1-VH-CH1-Fc-участок. Поливалентное антитело, представленное в настоящем документе, предпочтительно дополнительно содержит по меньшей мере два (и предпочтительно четыре) полипептида вариабельного домена легкой цепи. Поливалентное антитело, представленное в настоящем документе, например, может содержать от приблизительно двух до приблизительно восьми полипептидов вариабельного домена легкой цепи. Полипептиды вариабельного домена легкой цепи, рассматриваемые в настоящем документе, содержат вариабельный домен легкой цепи и, необязательно, дополнительно содержат CL-домен.

8. Изменение эффекторных функций с помощью методов генной инженерии

Может быть желательной модификация антитела по изобретению в отношении эффекторной функции, например, чтобы усилить антигензависимую клеточно-опосредуемую цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) антитела. Этого можно достигать внесением одной или нескольких аминокислотных замен в Fc-участок антитела. Альтернативно, или дополнительно, в Fc-участок можно вносить остаток(и) цистеина, обеспечивая, таким образом, формирование дисульфидной связи между цепями в этом участке. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или усиленным комплемент-зависимым уничтожением клеток и повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). См. Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью также можно получать с использованием гетеробифункциональных поперечносшитых линкеров, как описано в Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернативно можно сконструировать антитело, которое обладает дублированными Fc-участками и, таким образом, может обладать повышенной способностью в отношении лизиса комплементом и ADCC. См. Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Для увеличения времени полужизни антитела в сыворотке, можно встраивать в антитело (особенно во фрагмент антитела) связывающий рецептор спасения эпитоп, как описано, например, в патенте США 5739277. Как используют в рамках настоящей заявки, термин "связывающий рецептор спасения эпитоп" относится к эпитопу Fc-участка молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который отвечает за повышение периода полураспада в сыворотке молекулы IgG in vivo.

9. Иммуноконъюгаты

Изобретение также относится к иммуноконъюгатам (взаимозаменяемо обозначаемым как "конъюгаты антитело-лекарственное средство" или "ADC"), содержащим антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство, ингибирующее рост средство, токсин (например, ферментативно активный токсин бактерий, грибов, растений или животных, или его фрагменты), или радиоактивный изотоп (т.е., радиоконъюгат).

В определенных вариантах осуществления, иммуноконъюгат содержит антитело и химиотерапевтическое средство или другой токсин. Химиотерапевтические средства, подходящие для получения таких иммуноконъюгатов, описаны выше. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают в себя A-цепь дифтерийного токсина, несвязывющие активные фрагменты дифтерийного токсина, A-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), A-цепь рицина, A-цепь абрина, A-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки-диантаны, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены. Для получения радиоконъюгированных антител доступны различные радионуклиды. Их примеры включают 212Bi, 131I, 131In, 90Y и 186Re. Конъюгаты антитела и цитотоксического средства можно получать с использованием множества бифункциональных связывающих белки веществ, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCL), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как 2,6-диизоцианат толуола), и вторичные активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин на основе рицина можно получать, как описано в Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). Меченая углеродом 14 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой иллюстративный хелатирующий агент для конъюгации радионуклеотида с антителом. См. WO94/11026.

Также в настоящем документе предусматриваются конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, пептиды ауристатина, такие как монометилауристатин (MMAE) (синтетический аналог доластатина), майтанзиноиды, такие как DM1, трихотен и CC1065, и производные этих токсинов, которые обладают активностью токсинов.

Иллюстративные иммуноконъюгаты - конъюгаты антитело-лекарственное средство

Иммуноконъюгат (или "конъюгат антитело-лекарственное средство" ("ADC")) по изобретению может иметь формулу I, ниже, где антитело конъюгировано (т.е., ковалентно связано) с одной или несколькими группами лекарственного средства (D) через необязательный линкер (L). ADC могут включать конъюгаты тио-MAb и лекарственного средства ("TDC").

Ab-(L-D) p (I)

Таким образом, антитело может быть конъюгировано с лекарственным средством либо прямо, либо через линкер. В формуле I, p представляет собой среднее количество групп лекарственного средства на антитела, которое может варьировать, например, от приблизительно 1 до приблизительно 20 групп лекарственного средства на антитело, и в определенных вариантах осуществления, от 1 до приблизительно 8 групп лекарственного средства на антитело. Изобретение относится к композиции, содержащей смесь соединений антитело-лекарственное средство соединения формулы I, где средняя нагрузка лекарственным средством на антитело составляет от приблизительно 2 до приблизительно 5, или от приблизительно 3 до приблизительно 4.

a. Иллюстративные линкеры

Линкер может содержать один или несколько линкерных компонентов. Иллюстративные линкерные компоненты включают 6-малеимидокапроил ("MC"), малеимидопропаноил ("MP"), валин-цитруллин ("val-cit" или "vc"), аланин-фенилаланин ("ala-phe"), п-аминобензилоксикарбонил ("PAB"), и линкерные компоненты, получаемые конъюгацией с линкерными реагентами: N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат ("SPP"), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат ("SMCC", также обозначаемый в настоящем документе как "MCC"), и N-сукцинимидил-(4-йодоацетил)аминобензоат ("SIAB"). В данной области известны различные линкерные компоненты, некоторые из которых описаны ниже.

Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", облегчающий высвобождение лекарственного средства в клетке. Например, можно использовать чувствительный к действию кислот линкер (например, гидразон), чувствительный к протеазам (например, чувствительный к пептидазе) линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); патент США No. 5208020).

В определенных вариантах осуществления, линкер является таким, как показано в следующей формуле II:

-A a -W w -Y y - (II)

где A представляет собой удлиняющий элемент, и a представляет собой целое число от 0 до 1; W представляет собой аминокислотный элемент, и w представляет собой целое число от 0 до 12; Y представляет собой спейсерный элемент, и y равен 0, 1 или 2; и Ab, D и p являются такими, как определено выше для формулы I. Иллюстративные варианты осуществления таких линкеров описаны в US 2005-0238649 A1, который включен в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

В некоторых вариантах осуществления, линкерный компонент может содержать "удлиняющий элемент", который связывает антитело с другим линкерным компонентом или с группой лекарственного средства. Иллюстративные удлиняющие элементы представлены ниже (где волнистой линией указаны участки ковалентного присоединения к антителу):

В некоторых вариантах осуществления, линкерный компонент может содержать аминокислотный элемент. В одном таком варианте осуществления, аминокислотный элемент позволяет расщепление линкера протеазой, тем самым облегчая высвобождение лекарственного средства из иммуноконъюгата под воздействием внутриклеточных протеаз, таких как лизосомальные ферменты. См., например, Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 778-784. Иллюстративные аминокислотные элементы включают, но не ограничиваются ими, дипептид, трипептид, тетрапептид и пентапептид. Иллюстративные дипептиды включают: валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe); фенилаланин-лизин (fk или phe-lys); или N-метил-валин-цитруллин (Me-val-cit). Иллюстративные трипептиды включают: глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотный элемент может содержать аминокислотные остатки, которые встречаются в природе, а также минорные аминокислоты и не встречающиеся в природе аналоги аминокислот, такие как цитруллин. Аминокислотные элементы можно конструировать и оптимизировать в отношении их селективности для ферментативного расщепления конкретным ферментом, например, ассоциированной с опухолью протеазой, катепсином B, C и D, или протеазой плазмина.

В некоторых вариантах осуществления, линкерный компонент может содержать "спейсерный" элемент, который связывает антитело с группой лекарственного средства, либо прямо, либо посредством удлиняющего элемента и/или аминокислотного элемента. Спейсерный элемент может быть "самоотщепляющимся" или "не способным к самостоятельному отщеплению". "Не способный к самостоятельному отщеплению" спейсерный элемент представляет собой элемент, в котором часть спейсерного элемента или весь спейсерный элемент остается связанным с группой лекарственного средства при ферментативном (например, протеолитическом) расщеплении ADC. Примеры не способных к самостоятельному отщеплению спейсерных элементов включают, но не ограничиваются ими, глициновый спейсерный элемент и глицин-глициновый спейсерный элемент. Также предусматриваются другие сочетания пептидных спейсеров, чувствительные к специфичному к последовательности ферментативному расщеплению. Например, ферментативное расщепление ADC, содержащего глицин-глициновый спейсерный элемент, ассоциированной с опухолевыми клетками протеазой, может приводить к отсоединению группы глицин-глицин-лекарственное средство от остальной части ADC. В одном из таких вариантов осуществления, группу глицин-глицин-лекарственного средства затем подвергают отдельной стадии гидролиза в опухолевой клетке, таким образом, отщепляя глицин-глициновый спейсерный элемент от группы лекарственного средства.

"Самоотщепляющийся" спейсерный элемент позволяет высвобождение группы лекарственного средства без отдельной стадии гидролиза. В определенных вариантах осуществления, спейсерный элемент линкера содержит п-аминобензильный элемент. В одном таком варианте осуществления, п-аминобензиловый спирт связывают с аминокислотным элементом через амидную связь, и получают карбамат, метилкарбамат или карбонат между бензиловым спиртом и цитотоксическим средством. См., например, Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15: 1087-1103. В одном варианте осуществления, спейсерный элемент представляет собой п-аминобензилоксикарбонил (PAB). В определенных вариантах осуществления, фениленовую часть п-аминобензильного элемента замещают посредством Qm, где Q представляет собой -C1-C8алкил, -O-(C1-C8алкил), -галоген, -нитро или -циано; и m представляет собой целое число в диапазоне 0-4. Примеры самоотщепляющихся спейсерных элементов, кроме того, включают, но не ограничиваются ими, ароматические соединения, которые являются электронно сходными с п-аминобензиловым спиртом (см., например, US 2005/0256030 A1), такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) и орто- или пара-аминобензилацетали. Можно использовать спейсеры, которые подвергаются циклизации при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 223); соответствующим образом замещенные бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] кольцевые системы (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc, 1972, 94, 5815); и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 5867). Удаление амин-содержащих лекарственных средств, которые замещены в a-положении глицина (Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) также является примером самоотщепляющихся спейсеров, подходящих для ADC.

В одном варианте осуществления, спейсерный элемент представляет собой разветвленный бис(гидроксиметил)стирольный (BHMS) элемент, изображенный ниже, который можно использовать для включения и высвобождения множества лекарственных средств.

где Q представляет собой -C1-C8алкил, -O-(C1-C8алкил), -галоген, -нитро или -циано; m представляет собой целое число в диапазоне 0-4; n представляет собой 0 или 1; и p находится в диапазоне от 1 до приблизительно 20.

В другом варианте осуществления, линкер L может представлять собой линкер дендритного типа для ковалентного присоединения более одной группы лекарственного средства посредством ветвящейся многофункциональной линкерной группы к антителу (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768). Дендритные линкеры могут повышать молярное соотношение лекарственного средства и антитела, т.е. нагрузку, которая связана с эффективностью ADC. Таким образом, когда антитело со встроенными в него остатками цистеина обладает только одной реактивной тиольной группой цистеина, множество групп лекарственного средства можно связывать через дендритный линкер.

Иллюстративные линкерные компоненты и их сочетания представлены ниже в контексте ADC формулы II:

Линкерные компоненты, включая удлиняющие, спейсерные и аминокислотные элементы, можно синтезировать способами, известными в данной области, такими как способы, описанные в US 2005-0238649 A1.

b. Иллюстративные группы лекарственного средства

(1) Майтанзин и майтанзиноиды

В некоторых вариантах осуществления, иммуноконъюгат содержит антитело, конъюгированное с одной или несколькими молекулами майтанзиноида. Майтанзиноиды представляют собой ингибиторы митоза, которые действуют, ингибируя полимеризацию тубулина. Майтанзин впервые был выделен из восточно-африканского кустарника Maytenus serrata (патент США No. 3896111). Впоследствии, было открыто, что определенные микроорганизмы также продуцируют майтанзиноиды, такие как майтанзинол и C-3 сложные эфиры майтанзинола (патент США No. 4151042). Синтетический майтанзинол и его производные и аналоги описаны, например, в патентах США No. 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663 и 4371533.

Майтанзиноидные группы лекарственного средства являются привлекательными группами лекарственного средства в конъюгатах антитело-лекарственное средство, поскольку они: (i) относительно доступны для получения ферментацией или химической модификацией или преобразованием в производное продуктов ферментации, (ii) поддаются преобразованию в производные с помощью функциональных групп, подходящих для конъюгации через дисульфидные и недисульфидные линкеры с антителами, (iii) являются стабильными в плазме, и (iv) являются эффективными против различных опухолевых клеточных линий.

Соединения майтанзина, подходящие для применения в качестве майтанзиноидных групп лекарственного средства, хорошо известны в данной области и их можно выделять из природных источников в соответствии с известными способами или получать с использованием способов генетической инженерии и ферментации (US 6790952; US 2005/0170475; Yu et al. (2002) PNAS 99: 7968-7973). Майтанзинол и аналоги майтанзинола также можно получать синтетически известными способами.

Иллюстративные майтанзиноидные группы лекарственного средства включают группы, имеющие модифицированное ароматическое кольцо, такое как: C-19-дехлор (патент США No. 4256746) (получаемый восстановлением с помощью алюмогидрида лития ансамитоцина P2); C-20-гидрокси (или C-20-деметил) +/-C-19-дехлор (патенты США No. 4361650 и 4307016) (получаемый деметилированием с использованием Streptomyces или Actinomyces или дехлорированием с использованием LAH); и C-20-деметокси, C-20-ацилокси (-OCOR), +/-дехлор (патент США No. 4294757) (получаемый ацилированием с использованием ацилхлоридов), и группы, имеющие модификации в других положениях.

Иллюстративные майтанзиноидные группы лекарственных средств также включают группы, имеющие модификации, такие как: C-9-SH (патент США No. 4424219) (получаемый реакцией майтанзинола с H2S или P2S5); C-14-алкоксиметил(деметокси/CH2OR)(US 4331598); C-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (CH2OH или CH2OAc) (патент США No. 4450254) (получаемый от Nocardia); C-15-гидрокси/ацилокси (US 4364866) (получаемый превращением майтанзинола посредством Streptomyces); C-15-метокси (патенты США No. 4313946 и 4315929) (выделяемый из Trewia nudlflora); C-18-N-деметил (патенты США No. 4362663 и 4322348) (получаемый деметилированием майтанзинола посредством Streptomyces); и 4,5-дезокси (US 4371533) (получаемый восстановлением майтанзинола трихлоридом титана/LAH).

Известно, что множество положений соединений майтанзина являются подходящими в качестве положений для связывания, в зависимости от типа связи. Например, для образования сложноэфирной связи, подходят положение C-3, имеющее гидроксильную группу, положение C-14, модифицированное гидроксиметилом, положение C-15, модифицированное гидроксильной группой и положение C-20, имеющее гидроксильную группу (US 5208020; US RE39151; US 6913748; US 7368565; US 2006/0167245; US 2007/0037972).

Майтанзиноидные группы лекарственного средства включают группы, имеющие структуру:

где волнистой линией указано ковалентное присоединение атома серы майтанзиноидной группы лекарственного средства к линкеру на ADC. R может независимо представлять собой H или C1-C6алкил. Алкиленовая цепь, связывающая амидную группу с атомом серы, может представлять собой метанил, этанил или пропил, т.е., m равно 1, 2 или 3 (US 633410; US 5208020; US 7276497; Chari et al. (1992) Cancer Res. 52: 127-131; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 8618-8623).

Для соединений по изобретению предусматриваются все стереоизомеры майтанзиноидной группы лекарственного средства, т.е. любое сочетание R- и S-конфигураций в хиральных углеродах в D. В одном варианте осуществления, майтанзиноидная группа лекарственного средства имеет следующую стереохимию:

Иллюстративные варианты осуществления майтанзиноидных групп лекарственного средства включают: DM1; DM3 и DM4, имеющие структуры:

где волнистой линией указано ковалентное присоединение атома серы лекарственного средства к линкеру (L) конъюгата антитело-лекарственное средство. (WO 2005/037992; US 2005/0276812 A1).

Другие иллюстративные конъюгаты антитело-майтанзиноидное лекарственное средство имеют следующие структуры и сокращения (где Ab представляет собой антитело и p равно от 1 до приблизительно 8):

Иллюстративные конъюгаты антитело-лекарственное средство, где DM1 связан через линкер BMPEO с тиольной группой антитела, имеют следующую структуру и сокращение:

где Ab представляет собой антитело; n равно 0, 1 или 2; и p равно 1, 2, 3 или 4.

Иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноиды, способы их получения, и их терапевтическое применение описаны, например, в Erickson, et al. (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433; патентах США No. 5208020, 5416064, US 2005/0276812 A1, и патенте Европы EP 0 425 235 B1, описания которых включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме.

Конъюгаты антитело-майтанзиноид получают химическим связыванием антитела с молекулой майтанзиноида без существенного снижения биологической активности либо антитела, либо молекулы майтанзиноида. См., например, патент США No. 5208020 (описание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме). Майтанзиноиды можно синтезировать известными способами или выделять из природных источников. Подходящие майтанзиноиды описаны, например, в патенте США No. 5208020 и в других патентах и непатентных публикациях, указанных в настоящем документе выше, такие как майтанзинол и аналоги майтанзинола, модифицированные в ароматическом кольце или в других положениях молекулы майтанзинола, такие как различные сложные эфиры майтанзинола.

Для получения конъюгатов антитело-майтанзиноид существует множество линкерных групп, известных в данной области, включая, например, линкерные группы, описанные в патенте США No. 5208020 или в патенте EP 0 425 235 B1; Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992); и US 2005/016993 A1, описания которых включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме. Конъюгаты антитело-майтанзиноид, содержащие линкерный компонент SMCC, можно получать, как описано в US 2005/0276812 A1, "Antibody-drug conjugates and Methods". Линкеры содержат дисульфидные группы, простые тиоэфирные группы, неустойчивые к действию кислот группы, фотолабильные группы, неустойчивые к пептидазам группы, или неустойчивые к эстеразе группы, как описано в указанных выше патентах. Дополнительные линкеры описаны и проиллюстрированы в настоящем документе.

Конъюгаты антитела и майтанзиноида можно получать с использованием множества бифункциональных средств для присоединения белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол 2,6-диизоцианат), и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). В определенных вариантах осуществления, связывающий агент представляет собой N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) или N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP), обеспечивающие дисульфидную связь.

Линкер можно связывать с молекулой майтанзиноида в различных положениях, в зависимости от типа связи. Например, сложноэфирную связь можно образовывать посредством реакции с гидроксильной группой с использованием общепринятых способов присоединения. Реакция может протекать в положении C-3, имеющем гидроксильную группу, положении C-14, модифицированном гидроксиметилом, положении C-15, модифицированном гидроксильной группой, и положении C-20, имеющем гидроксильную группу. В одном варианте осуществления, связь образуется в положении C-3 майтанзинола или аналога майтанзинола.

(2) Ауристатины и доластатины

В некоторых вариантах осуществления, иммуноконъюгат содержит антитело, конъюгированное с доластатином или с пептидным аналогом или производным доластатина, например, ауристатином (патенты США No. 5635483; 5780588). Было показано, что доластатины и ауристатины нарушают динамику микротрубочек, гидролиз GTP и деление ядер и клеток (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) и обладают активностью против злокачественной опухоли (патент США No.5663149) и противогрибковой активностью (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Группу лекарственного средства в виде доластатина или ауристатина можно связывать с антителом через N(амино)-конец или C(карбоксильный)-конец пептидной группы лекарственного средства (WO 02/088172).

Иллюстративные варианты осуществления ауристатина включают связывающиеся через N-конец группы лекарственного средства в виде монометилауристатина DE и DF (US2005/0238649, описанный в Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, представленный 28 марта 2004 года, описание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме).

Пептидная группа лекарственного средства может быть выбрана из формул DE и DF, ниже:

где волнистой линией в DE и DF указан участок ковалентного связывания с антителом или с группой антитело-линкерный компонент, и независимо в каждом положении:

R2 выбран из H и C1-C8алкила;

R3 выбран из H, C1-C8алкила, C3-C8карбоцикла, арила, C1-C8алкиларила, C1-C8алкил-(C3-C8карбоцикла), C3-C8гетероцикла и C1-C8алкил-(C3-C8гетероцикла);

R4 выбран из H, C1-C8алкила, C3-C8карбоцикла, арила, C1-C8алкиларила, C1-C8алкил-(C3-C8карбоцикла), C3-C8гетероцикла и C1-C8алкил-(C3-C8гетероцикла);

R5 выбран из H и метила;

или R4 и R5 вместе образуют карбоциклическое кольцо и имеют формулу -(CRaRb)n-, где Ra и Rb независимо выбраны из H, C1-C8алкила и C3-C8карбоцикла и n выбран из 2, 3, 4, 5 и 6;

R6 выбран из H и C1-C8алкила;

R7 выбран из H, C1-C8алкила, C3-C8карбоцикла, арила, C1-C8алкиларила, C1-C8алкил-(C3-C8карбоцикла), C3-C8 гетероцикла и C1-C8алкил-(C3-C8гетероцикла);

каждый R8 независимо выбран из H, OH, C1-C8алкила, C3-C8карбоцикла и O-(C1-C8алкила);

R9 выбран из H и C1-C8алкила;

R10 выбран из арила или C3-C8гетероцикла;

Z представляет собой O, S, NH или NR12, где R12 представляет собой C1-C8алкил;

R11 выбран из H, C1-C20 алкила, арила, C3-C8гетероцикла, -(R13O)m-R14, или -(R13O)m-CH(R15)2; m представляет собой целое число в диапазоне 1-1000;

R13 представляет собой C2-C8алкил;

R14 представляет собой H или C1-C8алкил;

каждый встречающийся R15 независимо представляет собой H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H или -(CH2)n-SO3-C1-C8алкил;

каждый встречающийся R16 независимо представляет собой H, C1-C8алкил или -(CH2)n-COOH;

R18 выбран из -C(R8)2-C(R8)2-арила, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8гетероцикла) и -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8карбоцикла); и

n представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 6.

В одном варианте осуществления, R3, R4 и R7 независимо представляют собой изопропил или втор-бутил и R5 представляет собой -H или метил. В иллюстративном варианте осуществления, каждый из R3 и R4 представляет собой изопропил, R5 представляет собой -H, и R7 представляет собой втор-бутил.

В другом варианте осуществления, каждый из R2 и R6 представляет собой метил, и R9 представляет собой -H.

В другом варианте осуществления, каждый встречающийся R8 представляет собой -OCH3.

В иллюстративном варианте осуществления, каждый из R3 и R4 представляет собой изопропил, каждый из R2 и R6 представляет собой метил, R5 представляет собой -H, R7 представляет собой втор-бутил, каждый встречающийся R8 представляет собой -OCH3, и R9 представляет собой -H.

В одном варианте осуществления, Z представляет собой -O- или -NH-.

В одном варианте осуществления, R10 представляет собой арил.

В иллюстративном варианте осуществления, R10 представляет собой -фенил.

В иллюстративном варианте осуществления, когда Z представляет собой -O-, R11 представляет собой -H, метил или трет-бутил.

В одном варианте осуществления, когда Z представляет собой -NH, R11 представляет собой -CH(R15)2, где R15 представляет собой -(CH2)n-N(R16)2, и R16 представляет собой -C1-C8алкил или -(CH2)n-COOH.

В другом варианте осуществления, когда Z представляет собой -NH, R11 представляет собой -CH(R15)2, где R15 представляет собой -(CH2)n-SO3H.

Иллюстративный вариант осуществления ауристатина формулы DE представляет собой MMAE, где волнистой линией указано ковалентное присоединение к линкеру (L) конъюгата антитело-лекарственное средство:

Иллюстративный вариант осуществления ауристатина формулы DF представляет собой MMAF, где волнистой линией указано ковалентное присоединение к линкеру (L) конъюгата антитело-лекарственное средство (см. US 2005/0238649 и Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17: 114-124):

Другие иллюстративные варианты осуществления включают соединения монометилвалина, имеющие карбокси-модификации фенилаланина на C-конце пентапептидной группы лекарственного средства в виде ауристатина (WO 2007/008848), и соединения монометилвалина, имеющие модификации боковой цепи фенилаланина на C-конце пентапептидной группы лекарственного средства в виде ауристатина (WO 2007/008603).

Другие группы лекарственного средства включают следующие производные MMAF, где волнистой линией указано ковалентное присоединение к линкеру (L) конъюгата антитело-лекарственное средство:

и

В одном аспекте, с группой лекарственного средства можно связывать гидрофильные группы, включая, но не ограничиваясь ими, сложные эфиры триэтиленгликоля (TEG), как показано выше, в R11. Без связи с какой-либо конкретной теорией, гидрофильные группы способствуют интернализации и препятствуют агломерации группы лекарственного средства.

Иллюстративные варианты осуществления ADC формулы I, содержащих ауристатин/доластатин или их производное, описаны в US 2005-0238649 и Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17, 114-124, которые включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме. Иллюстративные варианты осуществления ADC формулы I, содержащих MMAE или MMAF и различные линкерные компоненты, имеют следующие структуры и сокращения (где "Ab" представляет собой антитело, p равно от 1 до приблизительно 8, "Val-Cit" или "vc" представляет собой дипептид валин-цитруллин, и "S" представляет собой атом серы. Следует отметить, что в определенных описаниях структуры связанного через серу ADC в настоящем документе, антитело представлено как "Ab-S", только для того, чтобы указать на признак наличия связи через серу, но не для того, чтобы указать на то, что конкретный атом серы несет несколько групп линкер-лекарственное средство. Левая скобка в представленных ниже структурах также может быть помещена слева от атома серы, между Ab и S, что является эквивалентным описанием ADC по изобретению, описанного в настоящем документе.

Иллюстративные варианты осуществления ADC формулы I, содержащих MMAF и различные линкерные компоненты, включают Ab-MC-PAB-MMAF и Ab-PAB-MMAF. Интересно, что, как было показано, иммуноконъюгаты, содержащие MMAF, связанный с антителом через линкер, который не является протеолитически отщепляемым, обладают активностью, сравнимой с иммуноконъюгатами, содержащими MMAF, связанный с антителом посредством протеолитически отщепляемого линкера. См., Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17: 114-124. В таких случаях, полагают, что высвобождение лекарственного средства обеспечивается деградацией антитела в клетке. Там же.

Как правило, группы лекарственного средства на основе пептидов можно получать образованием пептидной связи между двумя или более аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи можно получать, например, способом жидкостного синтеза (см. E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press), который хорошо известен в области химии пептидов. Группы лекарственного средства в виде ауристатина/доластатина можно получать согласно способам: US 2005-0238649 A1; патента США No.5635483; патента США No.5780588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; и Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784.

В частности, группы лекарственного средства в виде ауристатина/доластатина формулы DF, такие как MMAF и его производные, можно получать с использованием способов, описанных в US 2005-0238649 A1 и Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17: 114-124. Группы лекарственного средства в виде ауристатина/доластатина формулы DE, такие как MMAE и его производные, можно получать с использованием способов, описанных в Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784. Группы лекарственное средство-линкер MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, и MC-vc-PAB-MMAE можно удобным образом синтезировать общепринятыми способами, например, как описано в Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784, и публикации патентной заявки No. US 2005/0238649 A1, а затем конъюгировать с представляющим интерес антителом.

(3) Калихеамицин

В других вариантах осуществления, иммуноконъюгат содержит антитело, конъюгированное с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Антибиотики семейства калихеамицина способны образовывать двухцепочечные разрывы ДНК при субпикомолярных концентрациях. Для получения конъюгатов семейства калихеамицина, см. патенты США No. 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (все выданы American Cyanamid Company). Структурные аналоги калихеамицина, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, γ1I, α2I, α3I, N-ацетил-γ1I, PSAG и θI1 (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) и упомянутые выше патенты США, выданные American Cyanamid). Другим противоопухолевым лекарственным средством, с которым можно конъюгировать антитело, является QFA, который представляет собой антифолат. Как калихеамицин, так и QFA, обладают внутриклеточным действием, и они не легко проходят через плазматическую мембрану. Таким образом, клеточный захват этих веществ посредством опосредуемой антителом интернализации значительно повышает их цитотоксические эффекты.

c. Другие цитотоксические средства

Другие противоопухолевые средства, которые можно конъюгировать с антителом, включают BCNU, стрептозоцин, винкристин и 5-фторурацил, семейство средств, совокупно известных как комплекс LL-E33288, описанный в патентах США No. 5053394, 5770710, а также эсперамицины (патент США No. 5877296).

Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают A-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, A-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), A-цепь рицина, A-цепь абрина, A-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки-диантаны, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованный 28 октября, 1993.

Кроме того, настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, образованному между антителом и соединением с нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или эндонуклеазой ДНК, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).

В определенных вариантах осуществления, иммуноконъюгат может содержать радиоактивный атом. Для продукции радиоактивных конъюгированных антител доступны различные радиоактивные изотопы. Их примеры включают At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu. В случае применения иммуноконъюгата для детекции, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например tc99m или I123, или спиновую метку для получения изображения ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного как магнитно-резонансная томография, МРТ), такую как также йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

Радиоактивные или другие метки можно встраивать в конъюгат известными способами. Например, пептид может быть биологически синтезированным или его можно синтезировать посредством химического синтеза аминокислот с использованием подходящих предшественников аминокислот, включающих, например, фтор-19 вместо водорода. Метки, такие как tc99m или I123, Re186, Re188 и In111 можно присоединять через остаток цистеина в пептиде. Иттрий-90 можно присоединять через остаток лизина. Способ с IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) можно использовать для встраивания йода-123. В "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) подробно описаны другие способы.

В определенных вариантах осуществления, иммуноконъюгат может содержать антитело, конъюгированное с активирующим пролекарство ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильное химиотерапевтическое средство, см. WO 81/01145) в активное лекарственное средство, такое как лекарственное средство против злокачественной опухоли. Такие иммуноконъюгаты пригодны в антителозависимой опосредуемой ферментом терапии пролекарством ("ADEPT"). Ферменты, которые можно конъюгировать с антителом, включают, но не ограничиваются ими, щелочные фосфатазы, которые пригодны для превращения содержащих фосфат пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазы, которые пригодны для превращения содержащих сульфат пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндезаминазу, которая пригодна для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в лекарственное средство против злокачественной опухоли, 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза Serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины B и L), которые пригодны для превращения содержащих пептид пролекарств в свободные лекарственные средства; D-аланилкарбоксипептидазы, которые пригодны для превращения пролекарств, которые содержат заместители в виде D-аминокислот; расщепляющие углеводы ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, которые пригодны для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства; β-лактамаза, которая пригодна для превращения лекарственных средств, преобразованных в производное с β-лактамами в свободные лекарственные средства; и пенициллинамидазы, такие как амидаза пенициллина V и амидаза пенициллина G, которые пригодны для превращения лекарственных средств, преобразованных в производные по их атомам азота аминогрупп с помощью феноксиацетильной или фенилацетильной групп, соответственно, в свободные лекарственные средства. Ферменты можно ковалентно связывать с антителами способами рекомбинантных ДНК, хорошо известными в данной области. См., например, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984).

d. Нагрузка лекарственным средством

Нагрузке лекарственным средством соответствует p, среднее число групп лекарственного средства на антитело в молекуле формулы I. Нагрузка лекарственным средством может находиться в диапазоне от 1 до 20 групп лекарственного средства (D) на антитело. ADC формулы I включают коллекции антител, конъюгированных с числом групп лекарственного средства в диапазоне от 1 до 20. Среднее число групп лекарственного средства на антитело в препаратах ADC после реакций конъюгаций может быть охарактеризовано общепринятыми способами, такими как масс-спектрометрия, анализ ELISA и ВЭЖХ. Количественное распределение ADC в значениях p также может быть определено. В некоторых случаях, разделение, очистку и охарактеризацию гомогенного ADC, где p представляет собой определенное значение для ADC с другой нагрузкой лекарственным средством, можно проводить способами, такими как обращено-фазовая ВЭЖХ или электрофорез. Фармацевтические составы конъюгатов антитело-лекарственное средство формулы I, таким образом, могут представлять собой гетерогенную смесь таких конъюгатов, в которых антитела связаны с 1, 2, 3, 4 или более группами лекарственного средства.

Для некоторых конъюгатов антитело-лекарственное средство p может быть ограничено количеством участков на антителе. Например, когда связывание осуществляется через тиольную группу цистеина, в качестве иллюстративного варианта осуществления, представленного выше, антитело может иметь только одну или несколько тиольных групп цистеина, или оно может иметь только одну или несколько достаточно реакционно-способных тиольных групп, через которые может быть присоединен линкер. В определенных вариантах осуществления, более высокая нагрузка лекарственным средством, например p > 5, может приводить к агрегации, нерастворимости, токсичности или утрате способности проникать в клетки определенных конъюгатов антитело-лекарственное средство. В определенных вариантах осуществления, нагрузка лекарственным средством для ADC по изобретению находится в диапазоне от 1 до приблизительно 8; от приблизительно 2 до приблизительно 6; или от приблизительно 3 до приблизительно 5. Действительно, было показано, что для определенных ADC оптимальное отношение групп лекарственного средства к антителу может составлять менее 8, и оно может составлять от приблизительно 2 до приблизительно 5. См. US 2005-0238649 A1.

В определенных вариантах осуществления, в ходе реакции конъюгации происходит конъюгация меньшего количества групп лекарственного средства, чем теоретическое количество. Антитело может содержать, например, остатки лизина, которые не реагируют с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер или линкерным реагентом, как рассмотрено ниже. Как правило, антитела не содержат множества свободных и реакционно-способных тиольных групп цистеина, которые могут быть связаны с группой лекарственного средства; действительно, большинство тиольных остатков цистеина в антителах существуют в качестве дисульфидных мостиков. В определенных вариантах осуществления, антитело можно восстанавливать восстановителем, таким как дитиотреитол (DTT) или трикарбонилэтилфосфин (TCEP), в частично или полностью восстанавливающих условиях, для получения реакционно-способных тиольных групп цистеина. В определенных вариантах осуществления, антитело подвергают денатурирующим условиям для выявления реакционно-способных нуклеофильных групп, таких как лизин или цистеин.

Нагрузку (отношение лекарственное средство/антитело) ADC можно контролировать различными способами, например, путем: (i) ограничения молярного избытка промежуточного соединения лекарственное средство-линкер или линкерного реагента относительно антитела, (ii) ограничения времени или температуры реакции конъюгации, и (iii) частичных или ограничивающих восстанавливающих условий для модификации тиольной группы цистеина.

Следует понимать, что когда более одной нуклеофильной группы реагирует с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер или линкерным реагентом, с последующей реакцией с реагентом лекарственного средства, тогда полученный продукт представляет собой смесь соединений ADC с одной или несколькими распределенными группами лекарственного средства, связанными с антителом. Среднее число групп лекарственного средства на антитело в смеси можно вычислить с помощью двойного анализа ELISA с антителами, которые являются специфичными к антителу и специфичными к лекарственному средству. Отдельные молекулы ADC модно идентифицировать в смеси масс-спектрометрией и разделять посредством ВЭЖХ, например, хроматографии гидрофобного взаимодействия (см., например, McDonagh et al. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7): 299-307; Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, KJ., et al. "Effect of drug loading on the phatmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S. C, et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates", Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). В определенных вариантах осуществления, из смеси конъюгатов можно выделять гомогенный ADC с одним значением нагрузки путем электрофореза или хроматографии.

e. Некоторые способы получения иммуноконъюгатов

ADC формулы I можно получать несколькими способами с использованием реакций, условий и реагентов органической химии, известных специалистам в данной области, включая: (1) реакцию нуклеофильной группы антитела с двухвалентным линкерным реагентом с образованием Ab-L через ковалентную связь, с последующей реакцией с группой лекарственного средства D; и (2) реакцию нуклеофильной группы в группе лекарственного средства с двухвалентным линкерным реагентом, с образованием D-L, через ковалентную связь, с последующей реакцией с нуклеофильной группой антитела. Иллюстративные способы получения ADC формулы I последним способом описаны в US 2005-0238649 A1, который включен в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

Нуклеофильные группы на антителах включают, но не ограничиваются ими: (i) N-концевые аминогруппы, (ii) аминогруппы боковых цепей, например, лизина, (iii) тиольные группы боковых цепей, например, цистеина, и (iv) гидроксилы или аминогруппы сахаров, где антитело является гликозилированным. Амино, тиольная и гидроксильная группы являются нуклеофильными и способны вступать в реакцию с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных группах и линкерных реагентах, включая: (i) активные сложные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галогенформиаты и галогенангидриды; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) группы альдегидов, кетонов, карбоксильные и малеимидные группы. Определенные антитела обладают поддающимися восстановлению дисульфидами между цепями, т.е. цистеиновыми мостиками. Реакционную способность антитела для конъюгации с линкерными реагентами можно обеспечивать посредством обработки восстановителем, таким как DTT (дитиотреитол) или трикарбонилэтилфосфин (TCEP), так чтобы антитело полностью или частично восстанавливалось. Каждый цистеиновый мостик, таким образом, может образовывать, теоретически, два реакционно-способных тиольных нуклеофила. Дополнительныые нуклеофильные группы можно вносить в антитела посредством модификации остатков лизина, например, реакцией остатков лизина с 2-иминотиоланом (реагентом Трота), приводящей к превращению амина в тиол. Реакционно-способные тиольные группы можно вносить в антитело путем встраивания одного, двух, трех, четырех или более остатков цистеина (например, путем получения вариантов антител, содержащих один или несколько ненативных аминокислотных остатка цистеина).

Конъюгаты антитело-лекарственное средство по изобретению также можно получать реакцией между электрофильной группой на антителе, такой как карбонильная группа альдегида или кетона, с нуклеофильной группой на линкерном реагенте или лекарственном средстве. Подходящие нуклеофильные группы на линкерном реагенте включают, но не ограничиваются ими, гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, гидразина карбоксилат и арилгидразид. В одном варианте осуществления, антитело модифицируют внесением электрофильных групп, которые способны реагировать с нуклеофильными заместителями на линкерном реагенте или лекарственном средстве. В другом варианте осуществления, сахара гликозилированных антител можно окислять, например, окисляющими реагентами на основе перйодатов, с образованием групп альдегидов или кетонов, которые могут реагировать с аминогруппой линкерных реагентов или групп лекарственного средства. Полученные иминогруппы основания Шиффа могут образовывать стабильную связь, или их можно восстанавливать, например, боргидридными реагентами, с образованием стабильных связей через амин. В одном варианте осуществления, реакция углеводной части гликозилированного антитела либо с галактозооксидазой, либо с метаперйодатом натрия, может приводить к карбонильным группам (группам альдегидов и кетонов) в антителе, которые могут вступать в реакции с соответствующими группами на лекарственном средстве (Hermanson, Bioconjugate Techniques). В другом варианте осуществления, антитела, содержащие N-концевые остатки серина или треонина могут реагировать с метаперйодатом натрия, что приводит к образованию альдегида вместо первой аминокислоты (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Такой альдегид можно подвергать реакции с группой лекарственного средства или нуклеофилом линкера.

Нуклеофильные группы на группе лекарственного средства включают, но не ограничиваются ими: аминогруппу, тиольную, гидроксильную группы, группы гидразида, оксима, гидразина, тиосемикарбазона, гидразина карбоксилата и арилгидразида, способные вступать в реакции с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных группах и линкерных реагентах, включающих: (i) активные сложные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галоформиаты и галогенангидриды; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы.

Соединения по изобретению полностью предусматривают, но не ограничиваются ими, ADC, полученные со следующими поперечно-сшивающими реагентами: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A; см. страницы 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog).

Иммуноконъюгаты, содержащие антитело и цитотоксическое средство, также можно получать с использованием различных бифункциональных средств для присоединения белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как 2,6-диизоцианат толуола), и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин можно получать, как описано в Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является иллюстративным хелатирующим агентом для конъюгации радионуклида с антителом. См. WO94/11026.

Альтернативно слитый белок, содержащий антитело и цитотоксическое средство, можно получать, например, рекомбинантными способами или пептидным синтезом. Рекомбинантная молекула ДНК может содержать участки, кодирующие часть антитела и часть цитотоксического средства конъюгата, либо расположенные рядом друг с другом, либо разделенные участком, кодирующим линкерный пептид, который не нарушает требуемые свойства конъюгата. В другом варианте осуществления, антитело можно конъюгировать с "рецептором" (таким как стрептавидин) для применения в предварительном нацеливании на опухоль, где конъюгат антитело-рецептор вводят пациенту, с последующим удалением не связавшегося конъюгата из кровотока с использованием средства для выведения, а затем введением "лиганда" (например, авидина), который конъюгирован с цитотоксическим средством (например, радионуклидом).

Иллюстративные иммуноконъюгаты - конъюгаты тио-антитело-лекарственное средство

a. Получение антител против CD79b со встроенными в них остатками цистеина

ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность варианта антител против CD79b со встроенными в них остатками цистеина и исходных антител против CD79b по изобретению, получают различными способами, которые включают, но не ограничиваются ими, выделение из природного источника (в случае встречающихся в природе вариантов аминокислотной последовательности), получение с помощью сайт-направленного (или олигонуклеотид-опосредуемого) мутагенеза (Carter (1985) et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443; Ho et al. (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; Kunkel et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488; Liu et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260), мутагенез посредством ПЦР (Higuchi, (1990) in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al. (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; и Valletta et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733), и кассетный мутагенез (Wells et al. (1985) Gene 34:315-323) ранее полученной ДНК, кодирующей полипептид. Протоколы мутагенеза, наборы и реагенты являются коммерчески доступными, например, QuikChange® Multi Site-Direct Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Единичные мутации также вносят путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием двухцепочечной плазмидной ДНК в качестве матрицы с помощью мутагенеза на основе ПЦР (Sambrook and Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Zoller et al. (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. and Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500). Варианты рекомбинантных антител также можно конструировать путем манипуляции с ферментами рестрикции или посредством ПЦР с перекрывающимся удлинением с синтетическими олигонуклеотидами. Мутагенные праймеры кодируют кодон цистеина для замены(замен). Для получения ДНК, кодирующей такие мутантные антитела со встроенными в них остатками цистеина, можно использовать способы мутагенеза (Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; и Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing и Wiley-Interscience, New York, N. Y., 1993).

Для получения антител человека против CD79b и фрагментов антител in vitro, из наборов генов вариабельных (V) доменов иммуноглобулинов неиммунизированных доноров можно использовать технологию фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)). В соответствии с этим способом, гены V домена антител клонируют в рамке считывания либо главного, либо второстепенного гена оболочки нитевидного бактериофага, такого как M13 или fd, и они экспонируются в качестве функциональных фрагментов антител на поверхности частицы фага. Вследствие того, что нитевидная частица содержит одноцепочечную копию ДНК генома фага, селекция на основе функциональных свойств антитела также приведет к селекции гена, кодирующего антитело, проявляющее такие свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств B-клетки (Johnson et al. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3:564-571; Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; Griffith et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; US 5565332; US 5573905; US 5567610; US 5229275).

Антитела против CD79b можно химически синтезировать с использованием известных способов синтеза олигопептидов или их можно получать и очищать с использованием рекомбинантной технологии. Соответствующую аминокислотную последовательность, или ее части, можно получать путем прямого пептидного синтеза с использованием твердофазных способов (Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969) W.H. Freeman Co., San Francisco, CA; Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154). Синтез белка in vitro можно проводить с использованием способов или с помощью автоматики. Автоматизированный твердофазный синтез можно проводить, например, с использованием защищенных посредством t-BOC или Fmoc аминокислот и с применением an Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) с использованием инструкций изготовителя. Различные части антитела против CD79b или полипептида CD79b можно химически синтезировать по отдельности и объединять с использованием химических или ферментативных способов для получения требуемого антитела против CD79b или полипептида CD79b.

Для получения фрагментов антител были разработаны различные способы. Традиционно, эти фрагменты получали посредством протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; и Brennan et al. (1985) Science, 229:81) или их можно получать непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Fab-, Fv- и scFv- фрагменты антител против CD79b могут быть экспрессированы и секретированы в E. coli, таким образом, обеспечивая простой способ получения больших количеств этих фрагментов. Фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, описанных выше. Альтернативно фрагменты Fab'-SH можно выделять непосредственно из E. coli и химически связывать с получением фрагментов F(ab')2 (Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167), или их можно выделять непосредственно из рекомбинантной культуры клеток-хозяев. Антитело против CD79b может представлять собой одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv) (WO 93/16185; патент США No. 5571894; и патент США No. 5587458). Фрагмент антитела против CD79b также может представлять собой "линейное антитело" (US 5641870). Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

Представленное ниже описание относится, главным образом, к продукции антител против CD79b путем культивирования клеток, трансформированных или трансфицированных вектором, содержащим кодирующую антитело против CD79b нуклеиновую кислоту. ДНК, кодирующую антитела против CD79b, можно получать из библиотеки кДНК, полученной из ткани, предположительно обладающей мРНК антитела против CD79b и экспрессирующей ее на поддающемся детекции уровне. Таким образом, ДНК антитела против CD79b человека или полипептида CD79b можно удобным образом получать из библиотеки кДНК, полученной из ткани человека. Ген, кодирующий антитело против CD79b, также можно получать из геномной библиотеки или известными способами синтеза (например, автоматизированным синтезом нуклеиновых кислот).

Способы конструирования, селекции и получения по изобретению обеспечивают антитела против CD79b со встроенными в них остатками цистеина, которые являются реакционно-способными к электрофильным функциональным группам. Кроме того, эти способы обеспечивают соединения конъюгатов антител, такие как соединения конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC) с молекулами лекарственного средства в определенных, предусмотренных, селективных участках. Реакционно-способные остатки цистеина на поверхности антитела позволяют специфичную конъюгацию с группой лекарственного средства через тиольную реакционно-способную группу, такую как малеимид или галоацетил. Нуклеофильная реакционная способность тиольной фунациональной группы остатка Cys к малеимидной группе приблизительно в 1000 раз превышает реакционную способность к любой другой функциональной группе аминокислоты в белке, такой как аминогруппа остатков лизина или N-концевая аминогруппа. Специфичная к тиольной группе функциональная группа в йодоацетильных и малеимидных реагентах может реагировать с аминогруппами, однако требуются более высокие значение pH (>9,0) и более длительное время реакции (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London). Количество свободных тиольных групп в белке можно оценивать стандартным анализом Элмана. Иммуноглобулин M представляет собой один из примеров связанного дисульфидом пентамера, а иммуноглобулин G является примером белка с внутренними дисульфидными связями, связывающими субъединицы вместе. В белках, таких как эти, требуется восстановление дисульфидных связей таким реагентом, как дитиотреитол (DTT) или селенол (Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304: 147-156) для образования реакционно-способной свободной тиольной группы. Этот подход может приводить к потере третичной структуры антитела и специфичности связывания антигена.

Анализ PHESELECTOR (фаговый ELISA для селекции реакционно-способных тиольных групп) позволяет детекцию реакционно-способных групп цистеина в антителах в фаговом формате ELISA, тем самым облегчая конструирование антител со встроенными в них остатками цистеина (Junutula, J.R. et al. (2008) J Immunol Methods 332:41-52; WO 2006/034488; US 2007/0092940). Антитело со встроенными в него остатками цистеина наносят на поверхности лунок с последующей инкубацией с фаговыми частицами, добавлением меченного HRP вторичного антитела и детекцией поглощения. Мутантные белки, экспонируемые на фаге, можно подвергать скринингу быстрым, надежным и высокопроизводительным образом. Можно получать библиотеки антител со встроенными в них остатками цистеина и повергать их селекции связывания с использованием того же подхода для идентификации соответствующего включения реакционно-способных участков свободного Cys в случайных фаговых белковых библиотеках антител или других белков. Этот способ включает реакцию мутантных белков с цистеином, экспонированных на фаге, с аффинным реагентом или репортерной группой, которая также является реакционно-способной к тиольной группе.

Анализ PHESELECTOR позволяет скрининг реакционно-способных тиольных групп в антителах. Примером является идентификация варианта A121C этим способом. Можно проводить эффективный поиск по целой молекуле Fab в целях идентификации большего количества вариантов тио-Fab с реакционно-способными тиольными группами. Для идентификации и количественного определения доступности растворителя к аминокислотным остаткам в полипептиде использовали параметр, представляющий собой относительную доступность поверхности. Доступность поверхности может быть выражена в площади поверхности (Å2), которая может контактировать с молекулой растворителя, например, воды. Пространство, занимаемое водой, составляет приблизительно сферу с радиусом 1,4 Å. Свободно доступным или лицензируемым является программное обеспечение (Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, United Kingdom, Fax: (+44) 1925 603825, или через интернет: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html) в качестве пакета программ CCP4 Suite для кристаллографии, в котором используются алгоритмы для вычисления доступности поверхности каждой аминокислоты в белке с известными полученными рентгеновской кристаллографией координатами ("The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta. Cryst. D50:760-763). Два иллюстративных модуля программного обеспечения, которые проводят вычисления доступности поверхности, представляют собой "AREAIMOL" и "SURFACE", на основе алгоритмов B. Lee and F.M.Richards (1971) J.Mol. Biol. 55:379-400. AREAIMOL определяет доступную для растворителя поверхность белка в качестве местоположения зондовой сферы (соответствующей молекуле растворителя), по мере того, как она перекатывается по ван-дер-ваальсовой поверхности белка. AREAIMOL вычисляет площадь поверхности, доступную для растворителя, путем создания точек поверхности приблизительно на каждом атоме расширенной сферы (на расстоянии от центра атома, равном сумме радиусов атома и зонда), и устранением тех точек, которые лежат в эквивалентных сферах, ассоциированных с соседними атомами. AREAIMOL находит доступную для растворителя площадь атомов в файле координат PDB, и обобщает доступную площадь для остатка, цепи или целой молекулы. Доступные площади (или разности площадей) для отдельных атомов могут быть записаны в файл результатов pseudo-PDB. AREAIMOL предполагает один радиус для каждого элемента, и распознает только ограниченное число различных элементов.

AREAIMOL и SURFACE выдают абсолютную доступность, т.е. число квадратных Ангстрем (Å). Относительную доступность поверхности вычисляют относительно стандартного состояния, соответствующего аминокислоте в полипептиде. Стандартное состояние представляет собой трипептид Gly-X-Gly, где X представляет собой представляющую интерес аминокислоту, и стандартное состояние должно представлять собой "удлиненную" конформацию, т.е. подобную конформации в бета-цепях. Удлиненная конформация максимизирует доступность X. Вычисленная доступная площадь делится на доступную площадь в стандартном состоянии трипептида Gly-X-Gly и предоставляется доля, которая представляет собой относительную доступность. Процентная доступность представляет собой относительную доступность, умноженную на 100. Другой иллюстративный алгоритм для вычисления доступности поверхности основан на модуле SOLV программы xsae (Broger, C., F. Hoffman-LaRoche, Basel), которая вычисляет относительную доступность аминокислотного остатка для сферы воды на основе рентгеновских координат полипептида. Относительную доступность поверхности для каждой аминокислоты в антителе можно вычислять с использованием доступной информации о кристаллической структуре (Eigenbrot et al. (1993) J Mol. Biol. 229: 969-995).

ДНК, кодирующую антитела со встроенными в них остатками цистеина, легко выделять и секвенировать с использованием общепринятых способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антител мыши). Клетки гибридомы служат в качестве источника такой ДНК. После выделения, ДНК можно помещать в экспрессирующие векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомяка (CHO), или другие клетки-хозяева млекопитающих, такие как клетки миеломы (US 5807715; US 2005/0048572; US 2004/0229310), которые в ином случае не продуцируют белок антитела, обеспечивая синтез моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах.

После конструирования и селекции, антитела со встроенными в них остатками цистеина, например тио-Fab, со встроенными в них высоко реакционно-способными неспаренными остатками Cys, можно получать "свободные остатки аминокислоты цистеина" путем: (i) экспрессии в бактериальной системе, например E. coli (Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262; Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130: 151-188) или клеточной культуральной системе млекопитающих (WO 01/00245), например, в клетках яичника китайского хомяка (CHO); и (ii) очистки с использованием общепринятых способов очистки белков (Lowman et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(17): 10982-10988).

Встроенные тиольные группы Cys реагируют с электрофильными линкерными реагентами и промежуточными соединениями лекарственное средство-линкер с образованием конъюгатов антитела со встроенными в него остатками цистеина и лекарственного средства и других меченных антител со встроенными в них остатками цистеина. Остатки Cys в антителах со встроенными в них остатками цистеина, и остатки Cys, присутствующие в исходных антителах, которые образуют пары и образуют межцепочечные и внутрицепочечные дисульфидные связи, не обладают какими-либо реакционно-способными тиольными группами (пока их не обработать восстановителем) и не реагируют с электрофильными линкерными реагентами или промежуточными соединениями лекарственное средство-линкер. Вновь встроенный остаток Cys, может оставаться неспаренным, и способен реагировать, т.е. образовывать конъюгат, с электрофильным линкерным реагентом или промежуточным соединением лекарственное средство-линкер, таким как лекарственное средство-малеимид. Иллюстративные промежуточные соединения лекарственное средство-линкер включают: MC-MMAE, MC-MMAF, MC-vc-PAB-MMAE и MC-vc-PAB-MMAF. Структурные положения встроенных остатков Cys тяжелой и легкой цепей пронумерованы согласно системе нумерации по последовательности. Эта система нумерации по последовательности коррелирует с системой нумерации Кабат (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), начиная с N-конца, и отличается от системы нумерации Кабат (нижний ряд) вставками, указанными посредством a, b, c. С использованием системы нумерации Кабат, истинная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставке в FR или CDR вариабельного домена. Измененные участки тяжелой цепи со встроенными остатками цистеина указаны с помощью схем нумерации по последовательности и нумерации по Кабат.

В одном варианте осуществления, антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина получено путем процесса, включающего:

(a) замену одного или нескольких аминокислотных остатков исходного антитела против CD79b цистеином; и

(b) определение реакционной способности тиольной группы в антителе против CD79b со встроенными в него остатками цистеина путем реакции антитела со встроенными в него остатками цистеина с реакционно-способным к тиольной группе реагентом.

Антитело со встроенными в него остатками цистеина может быть более реакционно-способным, чем исходное антитело, к реакционно-способному к тиольной группе реагенту.

Свободные аминокислотные остатки цистеина могут быть расположены в тяжелой или легкой цепях, или в константных или вариабельных доменах. Фрагменты антител, например Fab, также можно конструировать с одной или несколькими аминокислотами цистеина, заменяющими аминокислоты фрагмента антитела, с образованием фрагментов антител со встроенными в них остатками цистеина.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу получения (изготовления) антитела против CD79b со встроенными в него остатками цистеина, включающему:

(a) встраивание одного или нескольких остатков аминокислоты цистеина в исходное антитело против CD79b для получения антитела против CD79b со встроенными в него остатками цистеина; и

(b) определение реакционной способности тиольной группы в антителе со встроенными в него остатками цистеина к реакционно-способному к тиольной группе реагенту;

где антитело со встроенными в него остатками цистеина является более реакционно-способным, чем исходное антитело с реакционно-способным к тиольной группе реагентом.

Стадия (a) способа получения антитела со встроенными в него остатками цистеина может включать:

(i) мутагенез последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело со встроенными в него остатками цистеина;

(ii) экспрессию антитела со встроенными в него остатками цистеина; и

(iii) выделение и очистку антитела со встроенными в него остатками цистеина.

Стадия (b) способа получения антитела со встроенными в него остатками цистеина может включать экспрессию антитела со встроенными в него остатками цистеина на вирусной частице, выбранной из фаговой или фагмидной частицы.

Стадия (b) способа получения антитела со встроенными в него остатками цистеина также может включать:

(i) реакцию антитела со встроенными в него остатками цистеина с реакционно-способным к тиольной группе аффинным реагентом с получением аффинно меченого антитела со встроенными в него остатками цистеина; и

(ii) измерение связывания аффинно меченого антитела со встроенными в него остатками цистеина с улавливающим носителем.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу скрининга антител со встроенными в них остатками цистеина с высоко реакционно-способными неспаренными аминокислотами цистеина в отношении реакционной способности тиольной группы, включающему:

(a) встраивание одного или нескольких остатков аминокислоты цистеина в исходное антитело для получения антитела со встроенными в него остатками цистеина;

(b) реакцию антитела со встроенными в него остатками цистеина с реакционно-способным к тиольной группе аффинным реагентом с образованием аффинно меченного антитела со встроенными в него остатками цистеина; и

(c) измерение связывания аффинно меченного антитела со встроенными в него остатками цистеина с улавливающим носителем; и

(d) определение реакционной способности тиольной группы в антителе со встроенными в него остатками цистеина к реакционно-способному к тиольной группе реагенту.

Стадия (a) способа скрининга антител со встроенными в них остатками цистеина может включать:

(i) мутагенез последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело со встроенными в него остатками цистеина;

(ii) экспрессию антитела со встроенными в него остатками цистеина; и

(iii) выделение и очистку антитела со встроенными в него остатками цистеина.

Стадия (b) способа получения антитела со встроенными в него остатками цистеина может включать экспрессию антитела со встроенными в него остатками цистеина на вирусной частице, выбранной из фаговой или фагмидной частицы.

Стадия (b) способа получения антитела со встроенными в него остатками цистеина также может включать:

(i) реакцию антитела со встроенными в него остатками цистеина с реакционно-способным к тиольной группе аффинным реагентом с получением аффинно меченного антитела со встроенными в него остатками цистеина; и

(ii) измерение связывания аффинно меченного антитела со встроенными в него остатками цистеина с улавливающим носителем.

b. Варианты IgG против CD79b со встроенными в него остатками цистеина

Цистеин встраивали в участок 118 тяжелой цепи (нумерация EU) (эквивалентный положению 118 в тяжелой цепи, нумерация по последовательности) интактных химерных исходных моноклональных антител против CD79b или в участок 205 легкой цепи (нумерация по Кабат) (эквивалентный положению 210 в легкой цепи, нумерация по последовательности) интактных химерных исходных моноклональных антител против CD79b способами встраивания цистеина, описанными в настоящем документе.

Полученные антитела со встроенными в них остатками цистеина с цистеином в положении 118 тяжелой цепи (нумерация EU) представляли собой: (a) thio-hu2F2.D7-HC (A118C) с последовательностью тяжелой цепи (SEQ ID NO:85) и последовательностью легкой цепи (SEQ ID NO:86), фигура 17.

Полученные антитела со встроенными в них остатками цистеина с цистеином в положении 205 легкой цепи (нумерация по Кабат) представляли собой: (a) thio-hu2F2.D7-LC (V205C) с последовательностью тяжелой цепи (SEQ ID NO:87) и последовательностью легкой цепи (SEQ ID NO:88), фигура 18.

Эти моноклональные антитела со встроенными в них остатками цистеина экспрессировали в клетках CHO (яичника китайского хомяка) путем временной ферментации в среде, содержащей 1 мМ цистеин.

Согласно одному варианту осуществления, гуманизированные антитела 2F2 против CD79b со встроенными в них остатками цистеина содержат одну или несколько из следующих последовательностей тяжелой цепи со свободным остатком аминокислоты цистеина (SEQ ID NO:91-99, таблица 2).

Таблица 2:
Сравнение нумерации тяжелой цепи по последовательности, по Кабат и по EU для вариантов гуманизированного антитела 2F2 против CD79b со встроенными в него остатками цистеина
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУМЕРАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУМЕРАЦИЯ ПО Кабат НУМЕРАЦИЯ EU SEQ ID NO:
EVQLCESGGG V5C V5C 91
LRLSCCASGYT A23C A23C 92
MNSLRCEDTAV A88C A84C 93
TLVTVCSASTK S112C S112C 94
VTVSSCSTKGP A114C A114C A118C 95
VSSASCKGPSV T116C T116C T120C 96
WYVDGCEVHNA V278C V278C V282C 97
KGFYPCDIAVE S371C S371C S375C 98
PPVLDCDGSFF S396C S396C S400C 99

Согласно одному варианту осуществления, химерные антитела 2F2 против CD79b со встроенными в них остатками цистеина содержат одну или несколько из следующих последовательностей тяжелой цепи со свободным остатком аминокислоты цистеина (SEQ ID NO:100-108, таблица 3).

Таблица 3:
Сравнение нумерации тяжелой цепи по последовательности, по Кабат и по EU для вариантов антитела ch2F2 против CD79b со встроенными в него остатками цистеина
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУМЕРАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУМЕРАЦИЯ ПО KAБAT НУМЕРАЦИЯ EU SEQ ID NO:
QVQLCQPGAE Q5C Q5C 100
VKLSCCASGYT K23C K23C 101
LSSLTCEDSAV S88C S84C 102
TSVTVCLASTK S112C S112C 103
VTVSSCSTKGP A114C A114C A118C 104
VSSASCKGPSV T116C T116C T120C 105
WYVDGCEVHNA V278C V278C V282C 106
KGFYPCDIAVE S371C S371C S375C 107
PPVLDCDGSFF S396C S396C S400C 108

Согласно одному варианту осуществления, гуманизированные антитела 2F2 против CD79b со встроенными в них остатками цистеина содержат одну или несколько из следующих последовательностей легкой цепи со свободным остатком аминокислоты цистеина (SEQ ID NO:109-115, таблица 4).

Таблица 4:
Сравнение нумерации легкой цепи цепи по последовательности и по Кабат для вариантов гуманизированного антитела 2F2 против CD79b со встроенными в него остатками цистеина
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУМЕРАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУМЕРАЦИЯ ПО KAБAT SEQ ID NO:
SLSASCGDRVT V15C V15C 109
EIKRTCAAPSV V115C V110C 110
TVAAPCVFIFP S119C S114C 111
FIFPPCDEQLK S126C S121C 112
DEQLKCGTASV S132C S127C 113
VTEQDCKDSTY S173C S168C 114
GLSSPCTKSFN V210C V205C 115

Согласно одному варианту осуществления, химерные антитела 2F2 против CD79b со встроенными в них остатками цистеина содержат одну или несколько из следующих последовательностей легкой цепи со свободным остатком аминокислоты цистеина (SEQ ID NO:116-122, таблица 5).

Таблица 5:
Сравнение нумерации легкой цепи по последовательности и по Кабат для вариантов антитела 2F2 против CD79b со встроенными в него остатками цистеина
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУМЕРАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУМЕРАЦИЯ ПО KAБAT SEQ ID NO:
TLSVTCGQPAS I15C I15C 116
EIKRTCAAPSV V115C V110C 117
TVAAPCVFIFP S119C S114C 118
FIFPPCDEQLK S126C S121C 119
DEQLKCGTASV S132C S127C 120
VTEQDCKDSTY S173C S168C 121
GLSSPCTKSFN V210C V205C 122

c. Меченые антитела против CD79b со встроенными в них остатками цистеина

Антитела против CD79b со встроенными в них остатками цистеина по изобретению можно сайт-специфично и эффективно связывать с реакционно-способным к тиольной группе реагентом. Реакционно-способный к тиольной группе реагент может представлять собой многофункциональный линкерный реагент, реагент метки для улавливания, т.е. меченый реагент (например, реагент биотин-линкер), поддающуюся детекции метку (например, реагент флуорофора), реагент для твердофазной иммобилизации (например, SEPHAROSETM, полистирол или стекло), или промежуточное соединение лекарственное средство-линкер. Одним примером реакционно-способного к тиольной группе реагента является N-этилмалеимид (NEM). В иллюстративном варианте осуществления, реакция тио-Fab с реагентом биотин-линкер приводит к биотинилированному тио-Fab, по которому можно проводить детекцию наличия и измерение реакционной способности встроенного остатка цистеина. Реакция тио-Fab с многофункциональным линкерным реагентом приводит к тио-Fab с функционализированным линкером, который можно далее подвергать реакции с реагентом группы лекарственного средства или другой меткой. Реакция тио-Fab с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер приводит к конъюгату тио-Fab и лекарственного средства.

Иллюстративные способы, описанные в настоящем документе, можно применять, главным образом, для идентификации и продукции антител, и, в более общем смысле, других белков с использованием стадий конструирования и скрининга, описанных в настоящем документе.

Такой подход можно применять для конъюгации других реакционно-способных к тиольной группе реагентов, в которых реакционно-способная группа представляет собой, например, малеимид, йодоацетамид, пиридилдисульфид или другой реакцинно-способный к тиольной группе партнер для конъюгации (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). Реакционно-способный к тиольной группе реагент может представлять собой группу лекарственного средства, флуорофор, такой как флуоресцентный краситель, такой как флуоресцеин или родамин, хелатирующий агент для визуализации или металл для лучевой терапии, пептидильную или непептидильную метку или поддающуюся детекции метку, или модифицирующее выведение средство, такое как различные изомеры полиэтиленгликоля, пептид, который связывается с третьим компонентом, или другое углеводное или липофильное средство.

d. Применение антител против CD79b со встроенными в них остатками цистеина

Антитела против CD79b со встроенными в них остатками цистеина и их конъюгаты можно применять в качестве терапевтических и/или диагностических средств. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам профилактики, управления течением, лечения или смягчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных со связанным с B-клетками нарушением. В частности, настоящее изобретение относится к способам профилактики, управления течением, лечения или смягчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с клеточно-пролиферативным нарушением, таким как злокачественная опухоль, например, лимфома, неходжкинская лимфома (NHL), агрессивная NHL, рецидивирующая агрессивная NHL, рецидивирующая вялотекущая NHL, рефрактерная NHL, рефрактерная вялотекущая NHL, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелколимфоцитарная лимфома, лейкоз, волосатоклеточный лейкоз (HCL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), и лимфома из клеток мантийной зоны. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам диагностики связанного с CD79b нарушения или предрасположенности к развитию такого нарушения, а также к способам идентификации антител и антиген-связывающих фрагментов антител, которые предпочтительно связывают ассоциированные с B-клетками полипептиды CD79b.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению антитела против CD79b со встроенными в него остатками цистеина для получения лекарственного средства, подходящего для лечения состояния, которое ответственно за связанное с B-клетками нарушение.

e. Конъюгаты антитела со встроенными в него остатками цистеина и лекарственного средства (конъюгаты тио-антитело-лекарственное средство (TDC))

Другой аспект изобретения представляет собой соединение конъюгата антитело-лекарственное средство, содержащее антитело против CD79b со встроенными в него остатками цистеина (Ab), и группу лекарственного средства ауристатина (D), где антитело со встроенными в него остатками цистеина связано через один или несколько свободных остатков аминокислоты цистеина линкерной группой (L) с D; причем соединение имеет формулу I:

Ab-(L-D) p (I)

где p равно 1, 2, 3, или 4; и где антитело со встроенными в него остатками цистеина получено путем процесса, включающего замену одного или нескольких аминокислотных остатков исходного антитела против CD79b одним или несколькими свободными остатками аминокислоты цистеина.

Другой аспект изобретения относится к композиции, содержащей смесь соединений антитело-лекарственное средство формулы I, где средняя нагрузка лекарственным средством на антитело составляет от приблизительно 2 до приблизительно 5, или от приблизительно 3 до приблизительно 4.

На фигурах 17-18 представлены варианты осуществления конъюгатов антитела против CD79b со встроенными в него остатками цистеина и лекарственного средства (ADC), где группа лекарственного средства, представляющего собой ауристатин, связана со встроенной группой цистеина в: легкой цепи (LC-ADC) или тяжелой цепи (HC-ADC).

Потенциальные преимущества конъюгатов антитела против CD79b со встроенными в него остатками цистеина и лекарственного средства включают повышенную безопасность (более высокий терапевтический индекс), улучшенные параметры PK, сохранение внутрицепочечных дисульфидных связей антитела, которые могут стабилизировать конъюгат и сохранять его активную связывающую конформацию, определенные участки конъюгации лекарственного средства, и то, что получение конъюгатов антитела со встроенными в него остатками цистеина и лекарственного средства путем конъюгации антитела со встроенными в них остатками цистеина с реагентами лекарственное средство-линкер приводит к более гомогенному продукту.

Линкеры

"Линкер", "Линкерный элемаент" или "соединение" означает химическую группу, содержащую ковалентную связь или цепь из атомов, которые ковалентно связывают антитело с группой лекарственного средства. В различных вариантах осуществления, линкер обозначают как L. "Линкер" (L) представляет собой бифункциональную или многофункциональную группу, которую можно использовать для связывания одной или нескольких групп лекарственного средства (D) и элемента антитела (Ab) с образованием конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC) формулы I. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) можно удобным образом получать с использованием линкера, имеющего реакционно-способную функциональную группу для связывания с лекарственным средством и с антителом. Тиольная группа цистеина в антителе со встроенными в него остатками цистеина (Ab) может образовывать связь с электрофильной функциональной группой линкерного реагента, группой лекарственного средства или промежуточным соединением лекарственное средство-линкер.

В одном аспекте линкер обладает реакционно-способным участком, который обладает электрофильной группой, которая является реакционно-способной к нуклеофильному цистеину, присутствующему в антителе. Тиольная группа цистеина в антителе является реакционно-способной к электрофильной группе на линкере и образует ковалентную связь с линкером. Подходящие электрофильные группы включают, но не ограничиваются ими, малеимидную и галоацетамидную группы.

Линкеры включают двухвалентный радикал, такой как алкилдиил, арилен, гетероарилен, такие группы, как -(CR2)nO(CR2)n-, повторяющиеся элементы из алкилокси (например, полиэтиленокси, PEG, полиметиленокси) и алкиламино (например, полиэтиленамино, JeffamineTM); и сложные эфиры и амиды двухосновных кислот, включая сукцинат, сукцинамид, дигликолят, малонат и капроамид.

Антитела со встроенными в них остатками цистеина реагируют с линкерными реагентами или промежуточными соединениями лекарственное средство-линкер с электрофильными функциональными группами, такими как малеимид или α-галокарбонил, в соответствии со способом конъюгации на странице 766 Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773, и согласно протоколу примера 6.

Линкер может состоять из одного или нескольких линкерных компонентов. Иллюстративные линкерные компоненты включают 6-малеимидокапроил ("MC"), малеимидопропаноил ("MP"), валин-цитруллин ("val-cit" или "vc"), аланин-фенилаланин ("ala-phe" или "af"), п-аминобензилоксикарбонил ("PAB"), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат ("SPP"), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат ("SMCC"), N-сукцинимидил-(4-йодоацетил)аминобензоат ("SIAB"), этиленокси-CH2CH2O- в качестве одного или нескольких повторяющихся элементов ("EO" или "PEO"). Дополнительные линкерные компоненты известны в данной области и некоторые из них описаны в настоящем документе.

В одном варианте осуществления, линкер L в ADC имеет формулу:

-A a -W w -Y y -

где:

-A- представляет собой удлиняющий элемент, ковалентно связанный с тиольной группой цистеина в антителе (Ab);

a равно 0 или 1;

каждый -W- независимо представляет собой аминокислотный элемент;

w независимо представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 12;

-Y- представляет собой спейсерный элемент, ковалентно связанный с группой лекарственного средства; и

y равно 0, 1 или 2.

Удлиняющий элемент

Удлиняющий элемент (-A-), когда он присутствует, способен связывать элемент антитела с аминокислотным элементом (-W-). В этом отношении, антитело (Ab) обладает функциональной группой, которая может образовывать связь с функциональной группой удлиняющего элемента. Подходящие функциональные группы, которые могут присутствовать на антителе, либо естественным образом, либо посредством химического манипулирования, включают, но не ограничиваются ими, сульфгидрил (-SH), амино, гидроксил, карбокси, аномерную гидроксильную группу углевода и карбоксил. В одном аспекте функциональные группы антитела представляют собой сульфгидрил или амино. Сульфгидрильные группы можно получать восстановлением внутримолекулярной дисульфидной связи антитела. Альтернативно сульфгидрильные группы можно получать реакцией аминогруппы лизина в антителе с использованием 2-иминотиолана (реагент Трота) или другого образующего сульфгидрил реагента. В одном варианте осуществления, антитело (Ab) обладает свободной тиольной группой цистеина, которая может образовывать связь с электрофильной функциональной группой удлиняющего элемента. Иллюстративные удлиняющие элементы в конъюгатах формулы I представлены с помощью формул II и III, где Ab-, -W-, -Y-, -D, w и y являются такими, как определено выше, и R17 представляет собой двухвалентный радикал, выбранный из (CH2)r, C3-C8карбоциклила, O-(CH2)r, арилена, (CH2)r-арилена, -арилен-(CH2)r-, (CH2)r-(C3-C8карбоциклила), (C3-C8карбоциклил)-(CH2)r, C3-C8гетероциклила, (CH2)r-(C3-C8гетероциклила), -(C3-C8гетероциклил)-(CH2)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2)r-, -(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2- и -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r-; где Rb представляет собой H, C1-C6алкил, фенил или бензил; и r независимо представляет собой целое число в диапазоне 1-10.

Арилен включает двухвалентные ароматические углеводородные радикалы из 6-20 атомов углерода, образованные удалением двух атомов водорода из ароматической кольцевой системы. Типичные группы ариленов включают, но не ограничиваются ими, радикалы, образованные из бензола, замещенного бензола, нафталина, антрацена, бифенила и т.п.

Гетероциклильные группы включают кольцевую систему, в которой один или несколько атомов кольца представляют собой гетероатом, например азот, кислород и серу. Гетероциклильный радикал содержит от 1 до 20 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S. Гетероцикл может представлять собой моноцикл, имеющий от 3 до 7 членов в кольце (от 2 до 6 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S) или бицикл, имеющий от 7 до 10 членов в кольце (от 4 до 9 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S), например: систему бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6]. Гетероциклы описаны в Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), в частности, в главах 1, 3, 4, 6, 7, и 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, с 1950 по настоящее время), в частности в томах 13, 14, 16, 19, и 28; и J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566.

Примеры гетероциклов включают, в качестве неограничивающего примера, пиридил, дигидропиридил, тетрагидропиридил (пиперидил), тиазолил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиофенил с окисленный серой, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тетразолил, бензофуранил, тианафталенил, индолил, индоленил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, пиперидинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, 2-пирролидонил, пирролинил, тетрагидрофуранил, бис-тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, бис-тетрагидропиранил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил, декагидрохинолинил, октагидроизохинолинил, азоцинил, триазинил, 6H-1,2,5-тиадиазинил, 2H,6H-1,5,2-дитиазинил, тиенил, тиантренил, пиранил, изобензофуранил, хроменил, ксантенил, феноксатинил, 2H-пирролил, изотиазолил, изоксазолил, пиразинил, пиридазинил, индолизинил, изоиндолил, 3H-индолил, 1H-индазолил, пуринил, 4H-хинолизинил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, птеридинил, 4Ah-карбазолил, карбазолил, β-карболинил, фенантридинил, акридинил, пиримидинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, фуразанил, феноксазинил, изохроманил, хроманил, имидазолидинил, имидазолинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиперазинил, индолинил, изоиндолинил, хинуклидинил, морфолинил, оксазолидинил, бензотриазолил, бензизоксазолил, оксиндолил, бензоксазолинил и изатиноил.

Карбоциклильные группы включают насыщенное или ненасыщенное кольцо, имеющее от 3 до 7 атомов углерода в качестве моноцикла или от 7 до 12 атомов углерода в качестве бицикла. Моноциклические карбоциклы имеют от 3 до 6 атомов в кольце, более конкретно 5 или 6 атомов в кольце. Бициклические карбоциклы имеют от 7 до 12 атомов в кольце, например, располагаемые по порядку как системы бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6], или 9 или 10 атомов в кольце, располагаемые по порядку как системы бицикло [5,6] или [6,6]. Примеры моноциклических карбоциклов включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1-енил, 1-циклопент-2-енил, 1-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-1-енил, 1-циклогекс-2-енил, 1-циклогекс-3-енил, циклогептил и циклооктил.

Следует понимать для всех иллюстративных вариантов осуществления ADC формулы I, таких как II-VI, что даже когда явно не указано, с антителом связаны от 1 до 4 групп лекарственного средства (p=1-4), в зависимости от количества встроенных остатков цистеина.

Иллюстративный удлиняющий элемент формулы II образован из малеимидо-капроила (MC), где R17 представляет собой -(CH2)5-:

Иллюстративный удлиняющий элемент формулы II образован из малеимидо-пропаноила (MP), где R17 представляет собой -(CH2)2-:

Другой иллюстративный удлиняющий элемент формулы II представляет собой удлиняющий элемент, где R17 представляет собой -(CH2CH2O)r-CH2-, и r равно 2:

Другой иллюстративный удлиняющий элемент формулы II представляет собой удлиняющий элемент, где R17 представляет собой -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, где Rb представляет собой H и каждый r равен 2:

Иллюстративный удлиняющий элемент формулы III представляет собой удлиняющий элемент, где R17 представляет собой -(CH2)5:

В другом варианте осуществления удлиняющий элемент связан с антителом против CD79b со встроенными в него остатками цистеина через дисульфидную связь между атомом серы, со встроенным в него цистеином в антителе и атомом серы удлиняющего элемента. Репрезентативный удлиняющий элемент этого варианта осуществления представлен посредством формулы IV, где R17, Ab-, -W-, -Y-, -D, w и y являются такими, как определено выше.

В другом варианте осуществления реакционно-способная группа удлиняющего элемента содержит реакционно-способную к тиольной группе функциональную группу, которая может образовывать связь со свободной тиольной группой цистеина в антителе. Примеры реакционно-способных к тиольной группе функциональных групп включают, но не ограничиваются ими, малеимид, α-галоацетил, активированные сложные эфиры, такие как сукцинимидные сложные эфиры, 4-нитрофенильные сложные эфиры, пентафторфенильные сложные эфиры, тетрафторфенильные сложные эфиры, ангидриды, хлориды кислот, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты. Репрезентативные удлиняющие элементы этого варианта осуществления представлены посредством формул Va и Vb, где -R17-, Ab-, -W-, -Y-, -D, w и y являются такими, как определено выше:

В другом варианте осуществления, линкер может представлять собой линкер дендритного типа для ковалентного присоединения более одной группы лекарственного средства посредством ветвящейся многофункциональной линкерной группы к антителу (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). Дендритные линкеры могут повышать молярное соотношение лекарственного средства и антитела, т.е. нагрузку, которая связана с эффективностью ADC. Таким образом, когда антитело со встроенными в него остатками цистеина обладает только одной реактивной тиольной группой цистеина, множество групп лекарственного средства можно связывать через дендритный линкер.

Аминокислотный элемент

Линкер может содержать аминокислотные остатки. Аминокислотный элемент (-Ww-), когда он присутствует, связывает антитело (Ab) с группой лекарственного средства (D) в конъюгате антитела со встроенными в него остатками цистеина и лекарственного средства (ADC) по изобретению.

-Ww- представляет собой дипептидный, трипептидный, тетрапептидный, пентапептидный, гексапептидный, гептапептидный, октапептидный, нонапептидный, декапептидный, ундекапептидный или додекапептидный элемент. Аминокислотные остатки, которые составляют аминокислотный элемент, включают встречающиеся в природе аминокислотные остатки, а также минорные аминокислоты и не встречающиеся в природе аналоги аминокислот, такие как цитруллин. Каждый элемент -W- независимо имеет формулу, указанную ниже в квадратных скобках, и w представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 12:

где R19 представляет собой водород, метил, изопропил, изобутил, втор-бутил, бензил, п-гидроксибензил, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, - (CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-пиридилметил-, 3-пиридилметил-, 4-пиридилметил-, фенил, циклогексил,

или

Когда R19 является отличным от водорода, атом углерода, с которым связан R19, является хиральным. Каждый атом углерода, с которым связан R19, независимо находится в (S)- или (R)-конфигурации, или представляет собой рацемическую смесь. Аминокислотные элементы, таким образом, могут быть энантиомерно чистыми, рацемическими или диастереомерными.

Иллюстративные аминокислотные элементы -Ww- включают дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Иллюстративные дипептиды включают: валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe). Иллюстративные трипептиды включают: глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотные остатки, которые содержат компонент в виде аминокислотного линкера, включают встречающиеся в природе аминокислотные остатки, а также минорные аминокислоты и не встречающиеся в природе аналоги аминокислот, такие как цитруллин.

Аминокислотный элемент может ферментативно расщепляться одним или несколькими ферментами, включая ассоциированную с опухолью протеазу, высвобождая группу лекарственного средства (-D), которая в одном варианте осуществления протонируется in vivo при высвобождении с образованием лекарственного средства (D). Компоненты в виде аминокислотных линкеров можно конструировать и оптимизировать по их селективности к ферментативному расщеплению конкретными ферментами, например, ассоциированной с опухолью протеазой, катепсином B, C и D или протеазой плазмина.

Спейсерный элемент

Спейсерный элемент (-Yy-), когда он присутствует (y = 1 или 2), связывает аминокислотный элемент (-Ww-) с группой лекарственного средства (D), когда аминокислотный элемент присутствует (w=1-12). Альтернативно, спейсерный элемент связывает удлиняющий элемент с группой лекарственного средства, когда аминокислотный элемент отсутствует. Спейсерный элемент также связывает группу лекарственного средства с элементом антитела, когда как аминокислотный элемент, так и удлиняющий элемент, отсутствуют (w, y = 0). Спейсерные элементы представляют собой элементы двух основных типов: самоотщепляющийся и не способный к самостоятельному отщеплению. Не способный к самостоятельному отщеплению спейсерный элемент представляет собой элемент, в котором часть спейсерного элемента или весь спейсерный элемент остаются связанными с группой лекарственного средства после отщепления, в частности ферментативного, аминокислотного элемента от конъюгата антитело-лекарственное средство или группы лекарственное средство-линкер. Когда ADC, содержащий глицин-глициновый спейсерный элемент или глициновый спейсерный элемент претерпевает ферментативное расщепление ассоциированной с опухолевыми клетками протеазой, ассоциированной с клетками злокачественной опухоли протеазой или ассоциированной с лимфоцитами протеазой, группа глицин-глицин-лекарственное средство или группа глицин-лекарственное средство отщепляется от Ab-A3-Ww-. В одном варианте осуществления, происходит независимая реакция гидролиза в клетке-мишени, расщепляющая связь глицин-группа лекарственного средства и высвобождающая лекарственное средство.

В другом варианте осуществления, -Yy- представляет собой п-аминобензилкарбамоильный (PAB) элемент, фениленовая часть которого замещена Qm, где Q представляет собой -C1-C8алкил, -O-(C1-C8алкил), -галоген, -нитро или -циано; и m представляет собой целое число в диапазоне 0-4.

Иллюстративные варианты осуществления не способного к самостоятельному отщеплению спейсерного элемента (-Y-) представляют собой: -Gly-Gly-; -Gly-; -Ala-Phe-; -Val-Cit-.

В одном варианте осуществления, предусматриваются группа лекарственного средства-линкер или ADC, в которых спейсерный элемент отсутствует (y=0), или их фармацевтически приемлемая соль или сольват.

Альтернативно ADC, содержащий самоотщепляющийся спейсерный элемент, может высвобождать -D. В одном варианте осуществления, -Y- представляет собой группу PAB, которая связана с -Ww- через атом азота аминогруппы в группе PAB, и связана прямо с -D через карбонат, карбамат или простую эфирную группу, где ADC имеет иллюстративную структуру:

где Q представляет собой -C1-C8алкил, -O-(C1-C8алкил), -галоген, -нитро или -циано; m представляет собой целое число в диапазоне 0-4; и p находится в диапазоне от 1 до 4.

Другие примеры самоотщепляющихся спейсеров включают, но не ограничиваются ими, ароматические соединения, которые являются электронно сходными с группой PAB, такой как производные 2-аминоимидазол-5-метанола (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237), гетероциклические аналоги PAB (US 2005/0256030), бета-глюкуронид (WO 2007/011968), и орто- или пара-аминобензилацетали. Можно использовать спейсеры, которые подвергаются циклизации при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223), соответствующим образом замещенные кольцевые системы бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] (Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867). Устранение содержащих амин лекарственных средств, которые замещены по глицину (Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27: 1447), также является примером самоотщепляющегося спейсера, пригодного в ADC.

Иллюстративные спейсерные элементы (-Yy-) соответствуют формулам X-XII:

Дендритные линкеры

В другом варианте осуществления, линкер L может представлять собой линкер дендритного типа для ковалентного присоединения более одной группы лекарственного средства посредством ветвящейся многофункциональной линкерной группы к антителу (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768). Дендритные линкеры могут повышать молярное соотношение лекарственного средства и антитела, т.е. нагрузку, которая связана с эффективностью ADC. Таким образом, когда антитело со встроенными в него остатками цистеина обладает только одной реактивной тиольной группой цистеина, множество групп лекарственного средства можно связывать через дендритный линкер. Иллюстративные варианты осуществления разветвленных дендритных линкеров включают 2,6-бис(гидроксиметил)-п-крезольный и 2,4,6-трис(гидроксиметил)фенольный дендримерные элементы (WO 2004/01993; Szalai et al. (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689; Shamis et al. (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126: 1726-1731; Amir et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499).

В одном варианте осуществления, спейсерный элемент представляет собой разветвленный бис(гидроксиметил)стирол (BHMS), который можно использовать для включения и высвобождения множества лекарственных средств, имеющих структуру:

содержащую 2-(4-аминобензилиден)пропан-1,3-диольный дендримерный элемент (WO 2004/043493; de Groot et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494), где Q представляет собой -C1-C8алкил, -O-(C1-C8алкил), -галоген, -нитро или -циано; m представляет собой целое число в диапазоне 0-4; n равно 0 или 1; и p находится в диапазоне от 1 до 4.

Иллюстративные варианты осуществления соединений конъюгата антитело-лекарственное средство формулы I включают XIIIa (MC), XIIIb (val-cit), XIIIc (MC-val-cit) и XIIId (MC-val-cit-PAB):

Другие иллюстративные варианты осуществления соединений конъюгата антитело-лекарственное средство формулы Ia включают XIVa-e:

где X представляет собой

или

Y представляет собой

или

и R независимо представляет собой H или C1-C6алкил; и n равно от 1 до 12.

В другом варианте осуществления, линкер имеет реакционноспсобную функциональную группу, которая имеет нуклеофильную группу, которая является реакционно-способной к электрофильной группе, имеющейся в антителе. Подходящие электрофильные группы на антителе включают, но не ограничиваются ими, карбонильные группы альдегидов и кетонов. Гетероатом нуклеофильной группы линкера может реагировать с электрофильной группой на антителе и образовывать ковалентную связь в элементом антитела. Подходящие нуклеофильные группы на линкере включают, но не ограничиваются ими, гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, гидразина карбоксилат и арилгидразид. Электрофильная группа на антителе обеспечивает удобный участок для связывания с линкером.

Как правило, линкеры пептидного типа можно получать путем образования пептидной связи между двумя или несколькими аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи могут быть получены, например, в соответствии со способом жидкофазного синтеза (E. Schroder and K. Lubke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press), который хорошо известен в области химии пептидов. Линкерные промежуточные соединения можно получать любым сочетанием или последовательностью реакций, включающих спейсерный, удлиняющий и аминокислотный элементы. В спейсерном, удлиняющем и аминокислотном элементах могут быть использованы реакционно-способные функциональные группы, которые по своим свойствам являются электрофильными, нуклеофильными или свободными. Реакционно-способные функциональные группы включают, но не ограничиваются ими, карбоксилы, гидроксилы, пара-нитрофенилкарбонат, изотиоцианат и уходящие группы, такие как O-мезил, O-тозил, -Cl, -Br, -I или малеимид.

Например, заряженный заместитель, такой как сульфонат (-SO-3) или аммоний, может повышать растворимость в воде реагента и облегчать реакцию связывания линкерного реагента с антителом или группой лекарственного средства, или облегчать реакцию связывания Ab-L (промежуточное соединение антитело-линкер) с D, или D-L (промежуточное соединение лекарственное средство-линкер) с Ab, в зависимости от способа синтеза, используемого для получения ADC.

Линкерные реагенты

Конъюгаты антитела и ауристатина можно получать с использованием множества бифункциональных линкерных реагентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол 2,6-диизоцианат), и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол).

Конъюгаты антитело-лекарственное средство также можно получать с помощью следующих линкерных реагентов: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, и сульфо-SMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4- винилсульфон)бензоат), и включая бис-малеимидные реагенты: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-бис-малеимидодиэтиленгликоль (BM(PEO)2), и 1,11-бис-малеимидотриэтиленгликоль (BM(PEO)3), которые являются коммерчески доступными от Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL, и других поставщиков реагентов. Бис-малеимидные реагенты позволяют присоединение тиольной группы антитела со встроенными в него остатками цистеина к тиол-содержащей группе лекарственного средства, метке или линкерному промежуточному соединению, последовательно или одновременно. Другие функциональные группы, кроме малеимида, которые являются реакционно-способными к тиольной группе антитела со встроенными в него остатками цистеина, группе лекарственного средства, метке или линкерному промежуточному соединению включают йодацетамид, бромацетамид, винилпиридин, дисульфид, пиридилдисульфид, изоцианат и изотиоцианат.

Подходящие линкерные реагенты также можно получать посредством других коммерческих источников, таких как Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), или синтезировать в соответствии со способами, описанными в Toki et al. (2002) J. Org. Chem. 67: 1866-1872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7: 180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; и WO 04/032828.

Удлиняющие элементы формулы (IIIa) можно встраивать в линкер путем реакции следующих линкерных реагентов с N-концом аминокислотного элемента:

где n представляет собой целое число в диапазоне 1-10, и T представляет собой -H или -SO3Na;

где n представляет собой целое число в диапазоне 0-3;

и

Удлиняющие элементы можно встраивать в линкер путем реакции следующих бифункциональных реагентов с N-концом аминокислотного элемента:

где X представляет собой Br или I.

Удлиняющие элементы формулы также можно встраивать в линкер путем реакции следующих бифункциональных реагентов с N-концом аминокислотного элемента:

Иллюстративный дипептидный линкерный реагент валин-цитруллин (val-cit или vc), имеющий малеимидный удлиняющий элемент и пара-аминобензилкарбамоильный (PAB) самоотщепляющийся спейсер, имеет структуру:

Иллюстративный дипептидный линкерный реагент phe-lys(Mtr, моно-4-метокситритил), имеющий малеимидный удлиняющий элемент и самоотщепляющийся спейсерный элемент PAB, можно получать в соответствии с Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60, и он имеет структуру:

Получение конъюгатов антитела против CD79b со встроенными в него остатками цистеина и лекарственного средства

ADC формулы I можно получать несколькими способами, с использованием реакций, условий и реагентов органической химии, известных специалистам в данной области, включая: (1) реакцию группы цистеина в антителе со встроенными в него остатками цистеина с линкерным реагентом с образованием промежуточного соединения антитело-линкер Ab-L, через ковалентную связь, с последующей реакцией с активированной группой лекарственного средства D; и (2) реакцией нуклеофильной группы в группе лекарственного средства с линкерным реагентом, с образованием промежуточного соединения лекарственное средство-линкер D-L, через ковалентную связь, с последующей реакцией с группой цистеина в антителе со встроенными в него остатками цистеина. Для получения конъюгатов антитело-лекарственное средство формулы I способы конъюгации (1) и (2) можно использовать с различными антителами со встроенными в них остатками цистеина, группами лекарственного средства и линкерами.

Тиольные группы цистеина антитела являются нуклеофильными и способны вступать в реакции с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных реагентах и промежуточных соединениях лекарственное средство-линкер, включая: (i) активные сложные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галогенформиаты и галогенангидриды; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) группы альдегидов, кетонов, карбоксильные и малеимидные группы, и (iv) дисульфиды, включая пиридильные дисульфиды, путем сульфидного обмена. Нуклеофильные группы на группе лекарственного средства включают, но не ограничиваются ими: аминогруппу, тиольную, гидроксильную группы, группу гидразида, оксима, гидразина, тиосемикарбазона, карбоксилата гидразина и арилгидразида, способные вступать в реакции с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных группах и линкерных реагентах.

Реакционную способность антитела для конъюгации с линкерными реагентами можно обеспечивать посредством обработки восстановителем, таким как DTT (дитиотреитол, реагент Клеланда) или TCEP (гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина; Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA), с последующим повторным окислением с образованием межцепочечных и внутрицепочечных дисульфидных связей (пример 5). Например, интактные моноклональные антитела со встроенными в них остатками цистеина (тио-Mab), экспрессированные в клетках CHO, восстанавливают посредством приблизительно 50-кратного молярного избытка TCEP в течение 3 ч при 37°С для восстановления дисульфидных связей в аддуктах цистеина, которые могут образовываться между вновь встроенными остатками цистеина и цистеином, присутствующим в культуральной среде. Восстановленное тио-Mab разбавляют и помещают в колонку HiTrap S в 10 мМ ацетате натрия, pH 5, и элюируют посредством PBS, содержащего 0,3 M хлорид натрия. Дисульфидные связи между остатками цистеина исходного Mab повторно устанавливают с помощью разбавленного (200 нМ) водного сульфата меди (CuSO4) при комнатной температуре в течение ночи. Альтернативно дегидроаскорбиновая кислота (DHAA) является эффективным окислителем для повторного восстановления внутрицепочечных дисульфидных групп антитела со встроенными в него остатками цистеина после восстановительного расщепления аддуктов цистеина. Также можно использовать другие окислители, т.е. окисляющие агенты, и условия окисления, которые известны в данной области. Также является эффективным окисление окружающим воздухом. На этой стадии мягкого частичного повторного окисления эффективно образуются внутрицепочечные дисульфиды с высокой точностью и сохраняются тиольные группы вновь встроенных остатков цистеина. Приблизительно 10-кратный избыток промежуточного соединения лекарственное средство-линкер, например MC-vc-PAB-MMAE, добавляли, перемешивали и позволяли стоять в течение приблизительно одного часа при комнатной температуре для обеспечения конъюгации и образования конъюгата антитело против CD79b-лекарственное средство. Смесь для конъюгации фильтровали и помещали в колонку HiTrap S и элюировали из нее для удаления избытка промежуточного соединения лекарственное средство-линкер и других примесей.

На фигуре 16 представлен общий процесс получения антитела со встроенными в него остатками цистеина, экспрессированного из клеточной культуры, для конъюгации. Когда клеточная культуральная среда содержит цистеин, могут образовываться дисульфидные аддукты между вновь встроенной аминокислотой цистеина и цистеином из среды. Эти аддукты цистеина, представленные в качестве окружности в иллюстративном тио-Mab (слева) на фигуре 16, необходимо восстанавливать для получения антител со встроенными в них остатками цистеина, реакционно-способными для конъюгации. Аддукты цистеина, вероятно вместе с различными межцепочечными дисульфидными связями, подвергают восстановительному расщеплению с получением восстановленной формы антитела с помощью восстановителей, таких как TCEP. Межцепочечные дисульфидные связи между спаренными остатками цистеина повторно образуются в условиях частичного окисления с сульфатом меди, DHAA, или под воздействием окружающего кислорода. Вновь встроенные, сконструированные и неспаренные остатки цистеина остаются доступными для реакции с линкерными реагентами или промежуточными соединениями лекарственное средство-линкер с образованием конъюгатов антитела по изобретению. Тио-Mab, экспрессированные в клеточных линиях млекопитающих, приводят к конъюгату находящегося снаружи аддукта Cys со встроенным Cys через образование связи -S-S-. Таким образом, очищенные тио-Mab обрабатывают путем процессов восстановления и повторного окисления, как описано в примере 5 с получением реакционно-способных тио-Mab. Эти тио-Mab используют в конъюгате с содержащими малеимид цитотоксическими лекарственными средствами, флуорофорами и другими метками.

10. Иммунолипосомы

Антитела против CD79b, описанные в настоящем документе, также можно изготавливать в виде иммунолипосом. "Липосома" представляет собой небольшую везикулу, состоящую из различных типов липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, которые подходят для доставки лекарственного средства млекопитающему. Компоненты липосомы обычно образуют двухслойную структуру, сходную с размещением липидов биологических мембран. Липосомы, содержащие антитело, получают способами, известными в данной области, такими как описано в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); патентах США No. 4485045 и 4544545; и WO97/38731, опубликованной 23 октября 1997 года. Липосомы с усиленным временем циркуляции описаны в патенте США No. 5013556.

Особенно подходящие липосомы можно получать способом обращено-фазового выпаривания с липидной композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и производное фосфатидилэтаноламина с PEG (PEG-PE). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор с получением липосомы с требуемым диаметром. Fab'-фрагменты антитела по настоящему изобретению можно конъюгировать с липосомами, как описано в Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) посредством реакции дисульфидного обмена. В липосоме необязательно содержится химиотерапевтическое средство. См. Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989).

B. Определенные способы получения антител

1. Скрининг антитела против CD79b с требуемыми свойствами

Способы получения антител, которые связываются с полипептидами CD79b, описаны выше. Если желательно, можно отбирать антитела с определенными биологическими характеристиками.

Эффекты антитела против CD79b по изобретению на ингибирование роста можно оценивать посредством способов, известных в данной области, например, с использованием клеток, которые экспрессируют полипептид CD79b либо эндогенно, либо после трансфекции гена CD79b. Например, соответствующие клеточные линии опухолей и клетки, трансфицированные CD79b, можно обрабатывать моноклональным антителом против клетки по изобретению в различных концентрациях в течение нескольких суток (например, 2-7 суток) и окрашивать кристаллическим фиолетовым или MTT или анализировать каким-либо другим колориметрическим способом анализа. Другой способ определения пролиферации представляет собой сравнение захвата 3H-тимидина обработанными клетками в присутствии и отсутствии антитела против клетки по изобретению. После обработки антителом клетки собирают и определяют величину радиоактивности полученной ДНК, в сцинтилляционном счетчике. Соответствующие положительные контроли включают обработку выбранной клеточной линии ингибирующим рост антителом, в отношении которого известно, что оно ингибирует рост этой клеточной линии. Ингибирование роста опухолевых клеток in vivo можно определять различными способами, известными в данной области. Клетка опухоли может представлять собой клетку, которая сверхэкспрессирует полипептид CD79b. Антитело против CD79b ингибирует клеточную пролиферацию экспрессирующей CD79b опухолевой клетки in vitro или in vivo приблизительно на 25-100% по сравнению с необработанной опухолевой клеткой, более предпочтительно, приблизительно на 30-100%, и еще более предпочтительно приблизительно на 50-100% или 70-100%, в одном варианте осуществления, при концентрации антитела приблизительно от 0,5 до 30 мкг/мл. Ингибирование роста можно определять при концентрации антитело приблизительно от 0,5 до 30 мкг/мл или приблизительно от 0,5 нМ до 200 нМ в клеточной культуре, где ингибирование роста определяют через 1-10 суток после воздействия на опухолевые клетки антитела. Антитело является ингибирующим рост in vivo, если введение антитела против CD79b в количестве от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг массы тела приводит к снижению размера опухоли и к снижению пролиферации опухолевых клеток в пределах приблизительно от 5 суток до 3 месяцев после первого введения антитела, предпочтительно в пределах приблизительно от 5 до 30 суток.

Для селекции антитела против CD79b, которое вызывают гибель клеток, можно оценивать потерю целостности мембраны, как указано, например, посредством захвата йодида пропидия (PI), трипанового синего или 7AAD, относительно контроля. Анализ захвата PI можно проводить в отсутствии комплемента и иммунных эффекторных клеток. Экспрессирующие полипептид CD79b клетки опухоли инкубируют со средой отдельно или со средой, содержащей соответствующее моноклональное антитело против CD79b (например, в концентрации 10 мкг/мл). Клетки инкубируют в течение 3 суток. После каждой обработки клетки промывают и разделяют на аликвоты в накрытые сеткой 35-мм пробирки 12×75 (1 мл на пробирку, 3 пробирки на обрабатываемую группу) для удаления клеточных комков. Затем в пробирки добавляют PI (10 мкг/мл). Образцы можно анализировать с использованием проточного цитометра FACSCANTM и программного обеспечения FACSCONVERTTM CellQuest (Becton Dickinson). Антитела против CD79b, которые приводят к статистически достоверному уровню клеточной гибели, определенной по захвату PI, можно отбирать в качестве индуцирующих клеточную гибель антител против CD79b.

Для скрининга антител, которые связываются с эпитопом на полипептиде CD79b, связываемом представляющим интерес антителом, можно проводить общепринятый анализ перекрестного блокирования, такой как описан в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Этот анализ можно использовать для определения наличия связывания антитела с тем же участком или эпитопом, с которым связывается известное антитело против CD79b по этому изобретению. Альтернативно, или дополнительно, можно проводить картирование эпитопов способами, известными в данной области. Например, для выявления контактных остатков в последовательность антитела можно вносить мутации, например, сканированием аланином. Мутантное антитело первоначально тестируют на связывание с поликлональным антителом для обеспечения требуемого сворачивания. В другом способе, пептиды, соответствующие различным участкам полипептида CD79b, можно использовать в способах конкурентного анализа с тестируемыми антителами или с тестируемым антителом и антителом с охарактеризованным или известным эпитопом.

2. Некоторые способы скрининга билиотек

Антитела против CD79b по изобретению можно получать с использованием комбинаторных библиотек для скрининга антител с требуемой активностью или видами активности. Например, в данной области известны различные способы создания библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек в отношении антител, обладающих требуемыми характеристиками связывания. Такие способы описаны, главным образом, в Hoogenboom et al. (2001), Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ), и в определенных вариантах осуществления, в Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1073-1093.

По существу, клоны синтетических антител подвергают селекции посредством библиотек фагового дисплея, которые содержат фаг, который экспонирует различные фрагменты вариабельной области (Fv) антитела, слитые с белком оболочки фага. Такие фаговые библиотеки сортируют с помощью аффинной хроматографии против требуемого антигена. Клоны, экспрессирующие Fv-фрагменты, способные связываться с требуемым антигеном, адсорбируются на антиген и, таким образом, их отделяют от несвязывающих клонов в библиотеке. Затем связывающие клоны элюируют от антигена, и их содержание можно далее повышать посредством дополнительных циклов адсорбции/элюирования антигена. Путем разработки подходящего способа скрининга с помощью антигена для селекции представляющего интерес клона фага с последующим конструированием клона интактного антитела против CD79b с использованием последовательностей Fv из представляющего интерес фагового клона и подходящих последовательностей константной области (Fc), описанных в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3, можно получать любые из антител против CD79b по изобретению.

В определенных вариантах осуществления, антиген-связывающий домен антитела образован из двух вариабельных (V) областей приблизительно из 110 аминокислот, по одной из легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей, в обеих из которых присутствуют три гипервариабельные петли (HVR) или определяющие комплементарность области (CDR). Вариабельные домены могут функционально экспонироваться на фаге, либо в качестве одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv), в которых VH и VL ковалентно связаны через короткий подвижный пептид, либо в качестве Fab-фрагментов, в которых они обе являются слитыми с константным доменом и взаимодействуют нековалентно, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Как используют в настоящем документе, фаговые клоны, кодирующие scFv, и фаговые клоны, кодирующие Fab, совместно называют "фаговыми клонами Fv" или "клонами Fv".

Репертуары генов VH и VL можно по отдельности клонировать полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и подвергать случайной рекомбинации в фаговых библиотеках, в которых затем проводят поиск антиген-связывающих клонов, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994). Библиотеки из иммунизированных источников обеспечивают высокоаффинные антитела к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. Альтернативно, можно клонировать наивный репертуар для обеспечения одного источника антител человека к широкому диапазону несобственных, а также собственных антигенов без иммунизации, как описано Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). В заключение, библиотеки с наивным репертуаром также можно получать синтетически путем клонирования не подвергнутых реаранжировке сегментов V-генов из стволовых клеток, и использования праймеров для ПЦР, содержащих случайную последовательность, для кодирования высоко вариабельных областей CDR3 и для проведения реаранжировки in vitro, как описано Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992).

В определенных вариантах осуществления используют нитевидные фаги для экспонирования фрагментов антител путем слияния с минорным белком оболочки pIII. Фрагменты антител могут быть экспонированы в виде одноцепочечных Fv-фрагментов, в которых VH- и VL-домены связаны на одной полипептидной цепи подвижным полипептидным спейсером, например, как описано в Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), или в качестве Fab-фрагментов, в которых одна цепь является слитой с pIII, а другая секретируется в периплазму бактериальной клетки-хозяина, где собирается структура Fab-белок оболочки, которая экспонируется на поверхности фага путем вытеснения некоторых из белков оболочки дикого типа, например, как описано в Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).

Как правило, нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагменты гена антитела, получают из иммунных клеток, полученных от человека или животных. Если является желательной библиотека, смещенная в сторону клонов, направленных против CD79b, индивида иммунизируют посредством CD79b для обеспечения антительного ответа, и выделяют клетки селезенки и/или циркулирующие B-клетки, и другие лимфоциты периферической крови человека (PBL) для конструирования библиотеки. В предпочтительном варианте осуществления, получают библиотеку фрагментов гена антитела человека, смещенную в сторону клонов, направленных против CD79b, путем обеспечения ответа антител против CD79b у трансгенной мыши, обладающей функциональным набором генов иммуноглобулинов человека (и лишенной функциональной эндогенной системы продукции антител), так что иммунизация посредством CD79b приводит к возникновению B-клеток, продуцирующих антитела человека против CD79b. Создание продуцирующих антитела человека трансгенных мышей описано ниже.

Дополнительное повышение содержания популяций клеток, реактивных против CD79b, можно обеспечивать с использованием подходящего способа скрининга для выделения B-клеток, экспрессирующих специфичное к CD79b мембраносвязанное антитело, например, путем разделения клеток с использованием аффинной хроматографии с CD79b или адсорбции клеток на меченный флуорохромом CD79b с последующей активированной флуоресценцией сортировкой клеток (FACS).

Альтернативно применение клеток селезенки и/или B-клеток или других PBL от неиммунизированного донора обеспечивает лучшее представление возможного репертуара антител, и а также позволяет конструирование библиотеки антител с использованием любого вида животных (человека или не относящегося к человеку), в котором CD79b не является антигенным. Для библиотек, включающих конструирование генов антител in vitro, собирают стволовые клетки индивида для получения нуклеиновых кислот, кодирующих не подвергнутые реаранжировке сегменты генов антител. Представляющие интерес иммунные клетки можно получать из различных видов животных, таких как человек, мышь, крыса, виды зайцеобразных, волчьих, собачьих, кошачьих, свиней, крупного рогатого скота, лошадей и птиц и т.д.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельные сегменты генов (включая сегменты VH и VL) выделяют из представляющих интерес клеток и амплифицируют. В случае подвергнутых реаранжировке библиотек генов VH и VL, требуемую ДНК можно получать путем выделения геномной ДНК или мРНК из лимфоцитов с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с праймерами, совпадающими с 5'- и 3'-концами подвергнутых реаранжировке генов VH и VL, как описано в Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), тем самым получая разнообразные репертуары V-генов для экспрессии. V-гены можно амплифицировать из кДНК и геномной ДНК с помощью обратных праймеров на 5'-конце экзона, кодирующего зрелый V-домен, и прямых праймеров, располагающихся в J-сегменте, как описано в Orlandi et al. (1989) и Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). Однако для амплификации из кДНК, обратные праймеры также могут располагаться в лидерном экзоне, как описано в Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), а прямые праймеры могут располагаться в константной области, как описано в Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Для максимального повышения комплементарности, в праймеры можно включать вырожденность, как описано в Orlandi et al. (1989) или Sastry et al. (1989). В определенных вариантах осуществления, разнообразие библиотеки максимально увеличивают с использованием праймеров ПЦР, направленных на каждое семейство V-генов для амплификации всех доступных расположений VH и VL, присутствующих в образце нуклеиновой кислоты иммунных клеток, например, как описано в способе Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) или как описано в способе Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Для клонирования амплифицированной ДНК в экспрессирующие векторы, в праймер для ПЦР можно вносить редкие участки рестрикции в качестве метки на одном конце, как описано в Orlandi et al. (1989), или путем дальнейшей амплификации посредством ПЦР с праймером с меткой, как описано в Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

Репертуары подвергнутых синтетической реаранжировке V-генов можно получать in vitro из сегментов V-генов. Большинство из сегментов VH-генов человека были клонированы и отсеквенированы (как описано в Tomlinson et al., J. Mol. Biol, 227: 776-798 (1992)), и картированы (описано в Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); эти клонированные сегменты (включая все главные конформации петли H1 и H2) можно использовать для получения разнообразных репертуаров VH-генов с помощью праймеров для ПЦР, кодирующих петли H3 с разнообразной последовательностью и длиной, как описано в Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Также можно получать репертуары VH, где все разнообразие последовательности сфокусировано в длинной петле H3 с единой длиной, как описано в Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Сегменты Vκ и Vλ человека были клонированы и отсеквенированы (описано в Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) и их можно использовать для получения синтетических репертуаров легких цепей. Синтетические репертуары V-генов, на основе ряда сборок VH и VL, и длин L3 и H3, кодируют антитела со значительным структурным разнообразием. После амплификации ДНК, кодирующей V-ген, сегменты V-генов зародышевой линии можно подвергать реаранжировке in vitro в соответствии со способами Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992).

Репертуары фрагментов антител можно конструировать, комбинируя репертуары генов VH и VL различными путями. Каждый репертуар можно создавать в отдельных векторах, и векторы подвергать рекомбинации in vitro, например, как описано в Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), или in vivo путем комбинаторной инфекции, например, с помощью системы loxP, описанной в Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). В подходе рекомбинации in vivo используется двухцепочечная структура Fab-фрагментов для преодоления ограничения размера библиотеки, определяемого эффективностью трансформации E. coli. Наивные репертуары VH и VL клонируют по отдельности, один в плазмиду, а другой в фаговый вектор. Затем две библиотеки комбинируют посредством инфекции фагом содержащих фагмиду бактерий, так что каждая клетка содержит отличающееся сочетание, и размер библиотеки ограничивается только числом присутствующих клеток (приблизительно 1012 клонов). Оба вектора содержат сигналы рекомбинации in vivo, так что гены VH и VL рекомбинируют в один репликон и совместно упаковываются в фаговые вирионы. Эти огромные библиотеки обеспечивают большие количества разнообразных антител с высокой аффинностью (Kd-1 приблизительно 10-8 M).

Альтернативно репертуары можно клонировать последовательно в один вектор, например, как описано в Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), или объединять посредством ПЦР, а затем клонировать, например как описано в Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Сборку посредством ПЦР также можно использовать для связывания ДНК VH и VL с ДНК, кодирующей подвижный пептидный спейсер, с образованием репертуаров одноцепочечных Fv (scFv). В другом способе используют "сборку посредством ПЦР в клетках" для объединения генов VH и VL в лимфоцитах посредством ПЦР, а затем клонирования репертуаров связанных генов, как описано в Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).

Антитела, продуцируемые наивными библиотеками (либо природными, либо синтетическими) могут иметь умеренную аффинность (Kd-1 приблизительно от 106 до 107 M-1), однако созревание аффинности также можно имитировать in vitro посредством конструирования и повторной селекции из вторичных библиотек, как описано в Winter et al. (1994), выше. Например, мутацию можно вносить случайным образом in vitro с использованием полимеразы с пониженной точностью (описано Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) в способе Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) или в способе Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Кроме того, созревание аффинности можно проводить путем внесения мутации случайным образом в одну или несколько CDR, например с использованием ПЦР с праймерами, имеющими случайную последовательность, охватывающую представляющую интерес CDR, в выбранных отдельных клонах Fv, и скринингом на клоны с наиболее высокой аффинностью. В WO 9607754 (опубликованной 14 марта 1996 года) описан способ индукции мутагенеза в определяющей комплементарность области легкой цепи иммуноглобулина для создания библиотеки генов легкой цепи. Другим эффективным подходом является рекомбинация VH- или VL-доменов, отобранных посредством фагового дисплея, с репертуарами встречающихся в природе вариантов V-доменов, полученными из неиммунизированных доноров, и скрининг на наиболее высокую аффинность в нескольких раундах повторной перетасовки цепей, как описано в Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Этот способ позволяет продукцию антител и фрагментов антител с аффинностью приблизительно 10-9 M или менее.

Скрининг библиотек можно проводить различными способами, известными в данной области. Например, CD79b можно использовать для нанесения на лунки адсорбционных планшетов, экспрессировать на клетках-хозяевах, фиксированных на адсорбционных планшетах или использовать в сортировке клеток, или конъюгировать с биотином для улавливания покрытыми стрептавидином гранулами, или использовать в любом способе пэннинга библиотек фагового дисплея.

Образцы для фагового дисплея подвергают контактированию с иммобилизованным CD79b в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере части фаговых частиц с адсорбентом. Обычно выбирают, условия, включая pH, ионную силу, температуру и т.п., имитирующие физиологические условия. Фаги, связанные с твердой фазой, промывают, а затем элюируют кислотой, например, как описано в Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), или щелочью, например, как описано в Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), или посредством конкуренции с антигеном CD79b, например в способе, сходным со способом конкуренции с антигеном в Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). За один раунд селекции фаги можно обогащать в 20-1000 раз. Более того, обогащенные фаги можно выращивать в бактериальной культуре и подвергать последующим раундам селекции.

Эффективность селекции зависит от множества факторов, включая кинетику диссоциации при промывании, и возможность одновременной встречи множества фрагментов антител на одном фаге с антигеном. Антитела с быстрой кинетикой диссоциации (и слабой аффинностью связывания) можно задерживать с использованием короткого промывания, поливалентного фагового дисплея и высокой плотностью нанесения антигена на твердую фазу. Высокая плотность не только стабилизирует фаг при поливалентных взаимодействиях, но также способствует повторному связыванию фага, который диссоциировал. Селекция антител с низкой кинетикой диссоциации (и высокой аффинностью связывания) можно обеспечивать, используя длительные промывания и одновалентный фаговый дисплей, как описано в Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) и в WO 92/09690, и низкую плотность нанесения антигена, как описано в Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

Селекцию между фаговыми антителами с различной аффинностью к CD79b можно проводить даже при аффинности, которая отличается немного. Однако, случайная мутация выбранного антитела (например, как происходит в некоторых способах созревания аффинности) может привести к возникновению многих мутантов, большинство из которых связываются с антигеном, и немногие из которых обладают более высокой аффинностью. При ограничении CD79b, редкий высокоаффинный фаг может быть конкурентно устранен. Для сохранения всех мутантов с более высокой аффинностью, фаги можно инкубировать с избытком биотинилированного CD79b, но с биотинилированным CD79b в концентрации с более низкой молярностью, чем предполагаемая молярная аффинность, постоянная для CD79b. Затем связывающие с высокой аффинностью фаги можно улавливать покрытыми стрептавидином парамагнитными гранулами. Такое "равновесное улавливание" позволяет селекцию антител согласно их аффинности связывания, с чувствительностью, которая позволяет выделение мутантных клонов с аффинностью, большей только в два раза, из большого избытка фагов с более низкой аффинностью. Также можно изменять условия, используемые для промывания фагов, связанных с твердой фазой, для различения на основе кинетики диссоциации.

Клоны, направленные против CD79b, можно отбирать на основе активности. В определенных вариантах осуществления, изобретение относится к антителам против CD79b, которые связываются с живыми клетками, которые естественным образом экспрессируют CD79b. В одном варианте осуществления, изобретение относится к антителам против CD79b, которые блокируют связывание между лигандом CD79b и CD79b, но не блокируют связывание между лигандом CD79b и вторым белком. Клоны Fv, соответствующие таким антителам против CD79b, можно подвергать селекции посредством (1) выделения клонов, направленных против CD79b, из фаговой библиотеки, как описано выше, и необязательно размножения выделенной популяции фаговых клонов путем выращивания популяции в подходящем бактериальном хозяине; (2) селекции CD79b и второго белка, против которого является желательной блокирующая и неблокирующая активность, соответственно; (3) адсорбции фаговых клонов, направленных против CD79b, на иммобилизованный CD79b; (4) применения избытка второго белка для элюирования каких-либо нежелательных клонов, которые распознают связывающие CD79b детерминанты, которые перекрываются или являются общими со связывающими детерминантами второго белка; и (5) элюирования клонов, которые остаются адсорбированными после стадии (4). Необязательно, клоны с требуемыми блокирующими/неблокирующими свойствами можно далее обогащать путем повторения процессов селекции, описанных в настоящем документе, один или несколько раз.

ДНК, кодирующую образованные из гибридомы моноклональные антитела или клоны Fv фагового дисплея по изобретению, легко выделять и секвенировать с использованием общепринятых способов (например с использованием олигонуклеотидных праймеров, сконструированных для специфичной амплификации представляющих интерес кодирующих участков тяжелой и легкой цепей из гибридомы или ДНК-матрицы фага). После выделения ДНК можно помещать в экспрессирующие векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомяка (CHO), или клетки миеломы, которые в ином случае не продуцируют белок иммуноглобулина, обеспечивая синтез требуемых моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные статьи по рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело, включают Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).

ДНК, кодирующую клоны Fv по изобретению можно комбинировать с известными последовательностями ДНК, кодирующими константные участки тяжелой цепи и/или легкой цепи (например, соответствующие последовательности ДНК можно получать в соответствии с Kabat et al., выше) с образованием клонов, кодирующих полноразмерные или неполные тяжелые и/или легкие цепи. Будет понятно, что для этой цели можно использовать константные области любого изотипа, включая константные области IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, и что такие константные области можно получать от человека или из любого вида животных. Клон Fv, образованный из ДНК вариабельного домена одного вида животных (такого как человек), а затем слитый с ДНК константной области другого вида животных с образованием кодирующей последовательности(ей) "гибридной" полноразмерной тяжелой цепи и/или легкой цепи, включен в определение "химерного" и "гибридного" антитела, как используют в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления, клон Fv, образованный из ДНК вариабельной области человека, является слитым с ДНК константной области человека с образованием кодирующей последовательности(ей) для полноразмерной или неполной тяжелой и/или легкой цепей.

ДНК, кодирующую антитело против CD79b, происходящую из гибридомы, также можно модифицировать, например, путем замены кодирующей последовательности константными доменами тяжелой и легкой цепей вместо гомологичных последовательностей мыши, происходящих из клона гибридомы (например, как в способе Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). ДНК, кодирующую происходящее из гибридомы или Fv-клона антитело или фрагмент, далее можно модифицировать ковалентным связыванием с кодирующей последовательностью иммуноглобулина всей кодирующей последовательности не являющегося иммуноглобулином полипептида, или ее части. Таким образом, получают "химерные" или "гибридные" антитела, которые обладают специфичностью связывания происходящих из Fv-клона или клона гибридомы антител по изобретению.

C. Антителозависимая опосредуемая ферментом пролекарственная терапия (ADEPT)

Антитела по настоящему изобретению также можно использовать в ADEPT путем конъюгации антитела с активирующим пролекарство ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильное химиотерапевтическое средство, см. WO81/01145) в активное лекарственное средство против злокачественной опухоли. См., например, WO 88/07378 и патент США No. 4975278.

Ферментный компонент иммуноконъюгата, подходящий для ADEPT, включает любой фермент, способный действовать на пролекарство таким образом, чтобы превращать его в более активную цитотоксическую форму.

Ферменты, которые являются подходящими в способе по этому изобретению, включают, но не ограничиваются ими, щелочную фосфатазу, подходящую для превращения фосфат-содержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазу, подходящую для превращения сульфат-содержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндезаминазу, подходящую для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в лекарственное средство против злокачественной опухоли, 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины B и L), которые пригодны для превращения пептид-содержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; D-аланилкарбоксипептидазы, подходящие для превращения пролекарств, которые содержат заместители в виде D-аминокислот; расщепляющие углевод ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, подходящие для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства; β-лактамазу, подходящую для превращения лекарственных средств, преобразованных в производное с β-лактамами, в свободные лекарственные средства; и пенициллинамидазы, такие как амидаза пенициллина V или амидаза пенициллина G, подходящие для превращения лекарственных средств, преобразованных в производное по их азотам аминогрупп посредством феноксиацетильной или фенилацетильной групп, соответственно, в свободные лекарственные средства. Альтернативно антитела с ферментативной активностью, также известные в данной области как "абзимы", можно использовать для превращения пролекарств по изобретению в свободные активные лекарственные средства (см., например, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Конъюгаты антитело-абзим можно получать, как описано в настоящем документе, для доставки абзима в популяцию опухолевых клеток.

Ферменты по этому изобретению можно ковалентно связывать с антителами против CD79b способами, известными в данной области, такими как применение гетеробифункциональных реагентов для сшивания, рассмотренных выше. Альтернативно слитые белки, содержащие по меньшей мере антиген-связывающую область антитела по изобретению, связанную по меньшей мере с функционально активной частью фермента по изобретению, можно конструировать с использованием способов рекомбинантных ДНК, хорошо известных в данной области (см., например, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984).

D. Антитело против CD79b

В дополнение к антителам против CD79b, описанным в настоящем документе, предусматривается, что можно получать варианты антител против CD79b. Варианты антител против CD79b можно получать посредством внесения соответствующих нуклеотидных изменений в кодирующую ДНК, и/или посредством синтеза требуемого антитела или полипептида. Специалисты в данной области поймут, что аминокислотные изменения могут изменять посттрансляционные процессы антитела против CD79b, например, они могут изменять количество или положение участков гликозилирования или изменять характеристики заякоривания на мембране.

Изменения антител против CD79b, описанных в настоящем документе, можно проводить, например, с использованием любого из способов и руководств для консервативных и неконсервативных мутаций, указанных, например, в патенте США No. 5364934. Изменение может представлять собой замену, делецию или вставку одного или нескольких кодонов, кодирующих антитело или пептид, которые приводят к изменению аминокислотной последовательности по сравнению с нативным антителом или полипептидом. Необязательно изменение представляет собой замену по меньшей мере одной аминокислоты другой аминокислотой в одном или нескольких доменах антител против CD79b. Информацию о том, какой аминокислотный остаток может быть вставлен, замещен или удален без неблагоприятного влияния на требуемую активность, можно найти посредством сравнения последовательности антитела против CD79b с последовательностью гомологичной известной белковой молекулы и минимизации количества замен аминокислотной последовательности в участках высокой гомологии. Аминокислотные замены могут быть результатом замены одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей сходные структурные и/или химические свойства, такой как замена лейцина серином, т.е., они могут представлять собой консервативные аминокислотные замены. Размер вставок, делеций или замен необязательно может находиться в диапазоне приблизительно от 1 до 5 аминокислот. Допустимое изменение можно определять систематическим проведением вставок, делеций или замен аминокислот в последовательности и тестированием полученных вариантов в отношении активности, проявляемой полноразмерной или зрелой нативной последовательностью.

В настоящем документе предусмотрены фрагменты антител против CD79b. Такие фрагменты могут быть укорочены с N-конца или C-конца, и